JP6338221B2 - 核酸生成物を生成するための、テンプレートスイッチに基づく方法 - Google Patents

核酸生成物を生成するための、テンプレートスイッチに基づく方法 Download PDF

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Description

ポリメラーゼ連鎖反応（PCR ）及び配列決定のような核酸操作方法は典型的には既知の配列の領域を必要とする。しかしながら、対象の試料中の核酸の同一性及び配列が未知であることが多い。試料中の核酸に既知の配列の領域を共有結合するように付加するなど、この問題を解決するための方法が開発されている。更に研究者は、対象のクローニング核酸のようなDNA 分子をベクタに融合させることを望む場合がある。共通する方法として、DNA リガーゼ又はRNA リガーゼを使用して共有結合するようにDNA 分子の連結反応を行う方法がある。連結反応は、マイクロホモロジー（例えば「粘着末端」）の領域の有無にかかわらず行われ得る。
試料中の核酸に既知の配列の領域を付加するために現在使用されている方法として、連結反応に基づく方法、例えば、平滑末端連結反応、「粘着末端」への連結反応、「Ａテーリング」及びその後の連結反応、RNA リガーゼを用いた一本鎖連結反応などがある。第２の方法として、テンプレート化されていないヌクレオチドの付加に適切なターミナルトランスフェラーゼ又は他の酵素によりホモポリマーの端部を付加する方法がある。第３の共通する方法として、定められた5'配列とランダム又は擬似ランダムの3'末端とを有するプライマを用いてランダム又は擬似ランダムに増幅する方法がある。試料中の核酸にアダプタを付加するための、リコンビナーゼに基づく方法が更に採用されている。
米国特許出願公開第2008／0145844 号明細書
上記の方法の欠点は方向性を欠いていることであり、このため、核酸の異なる端部に異なるアダプタを有することが困難になる。これらの方法の第２の欠点は感受性であり、少量の試料のみが利用可能な場合にはこれらの方法は適切ではない。
核酸生成物を生成するための方法を提供する。本方法では、テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）、ポリメラーゼ、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を結合して反応混合物にする。ポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチド三リン酸から重合した領域を有する１つの核酸生成物の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートDNA 及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含む核酸生成物を生成するのに十分な条件下で、これらの要素を結合して反応混合物にする。本発明の態様は組成物及びキットを更に含んでいる。
本開示の一実施形態に係る核酸生成物を生成するための、テンプレートスイッチに基づく方法を概略的に示す図である。
核酸生成物を生成するための方法を提供する。本方法では、テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）、ポリメラーゼ、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を結合して反応混合物にする。ポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチド三リン酸から重合した領域を有する１つの核酸生成物の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートDNA 及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含む核酸生成物を生成するのに十分な条件下で、これらの要素を結合して反応混合物にする。本発明の態様は組成物及びキットを更に含んでいる。
本開示の方法を更に詳細に説明する前に、本方法は、言うまでも無くそれ自体が変わり得るように、説明された特定の実施形態に限定されないことを理解すべきである。更に、本方法の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用されている用語は単に特定の実施形態を説明するために用いられており、限定することを意図していないことを理解すべきである。
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈が別段に明示しない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が本方法の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本方法の範囲内に更に包含される。記載された範囲が限度のうちの一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も本方法に更に包含される。
ある範囲は、本明細書では用語「約」から始まる数値と共に示されている。用語「約」は、本明細書では「約」から始まる正確な数、及び「約」から始まる数に近い数又は「約」から始まる数に近似した数のための文字通りのサポートを提供するために用いられている。数が具体的に述べられた数に近いか否か又は近似しているか否かを判断する際に、述べられていない近い数又は近似した数は、その数が示されている文脈では、具体的に述べられた数に略相当する数であってもよい。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本方法が属する技術分野の当業者によって共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等である全ての方法を、本方法の実施又は試験に更に使用することができるが、代表的な実例となる方法及び材料を本明細書に記載している。
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれると示されているかのように参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して記載すべく、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであって、先行発明を理由として、本方法がそのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであるとみなされるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があるかもしれない。
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が、本明細書及び添付の特許請求の範囲に用いられている場合、文脈が別段に明示しない限り、複数の指示対象を含むことを留意すべきである。更に、特許請求の範囲がいかなる選択的な要素も排除して記載されていることを留意すべきである。従って、この記述は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（solely）」、「のみの（only）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（negative）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
明瞭化のために別々の実施形態の内容に述べられている本方法の特徴が、１つの実施形態に組み合わせて提供されてもよいことが認識される。逆に、簡潔さのために１つの実施形態の内容に述べられている本方法の様々な特徴が、別々に又はあらゆる適切なサブ組み合わせで更に提供されてもよい。本実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含されており、各々の及びあらゆる組み合わせが個別に且つ明示的に開示されているかのように、このような組み合わせが操作可能な工程及び／又はデバイス／システム／キットを包含する範囲まで本明細書に開示されている。更に、このような可変性について述べている実施形態に記載されている全てのサブ組み合わせも、本方法によって具体的に包含されており、各々の及びあらゆるこのようなサブ組み合わせが個別に且つ明示的に本明細書に開示されているかのように、本明細書に開示されている。
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態は夫々、別々の構成要素及び特徴を有しており、別々の構成要素及び特徴は、本方法の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、又はいずれかの特徴と容易に組み合わされてもよい。全ての記載された方法は、記載された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
方法
核酸生成物を生成するための方法を提供する。本方法は、重合のためのテンプレートとして第１核酸鎖を使用して「テンプレートスイッチ」して、その後、重合反応を継続しながら（「テンプレートスイッチ核酸」又は「受容体テンプレート」と称されてもよい）第２テンプレート核酸鎖にスイッチするある核酸ポリメラーゼの能力を利用する。その結果、第１テンプレート核酸鎖に相補的な5'領域と、テンプレートスイッチ核酸に相補的な3'領域とを有するハイブリッド核酸鎖が合成される。ある態様では、新しく合成されたハイブリッド核酸鎖が対象の下流側の一若しくは複数の適用、例えばPCR 増幅、クローニング、配列決定、及び／又はあらゆる他の対象の下流側の一若しくは複数の適用に有用な3'端部にヌクレオチド配列を有するように、テンプレートスイッチ核酸の全て又は一部（例えば5'領域）のヌクレオチド配列が本方法を実行する者によって定められてもよい。
本方法では、テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）、ポリメラーゼ、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を結合して反応混合物にする。ポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチド三リン酸から重合した領域を有する１つの核酸生成物の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートDNA 及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含む核酸生成物を生成するのに十分な条件下で反応混合物の要素を結合する。
「核酸生成物を生成するのに十分な条件」とは、テンプレートDNA にハイブリッド形成した核酸鎖の3'端部におけるポリメラーゼ媒介の伸長と、ポリメラーゼのテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドへのテンプレートスイッチングと、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの5'端部への伸長反応の継続とを可能にする反応条件を意味する。適切な反応条件を実現するために、反応混合物の要素、それらの濃度及び反応温度を選択して、ポリメラーゼが活性を有し且つ反応中の関連する核酸が所望の方法で相互に作用する（例えば、ハイブリッド形成する）環境を作ってもよい。例えば、伸長反応及びテンプレートスイッチングを行うために、反応混合物は、テンプレートDNA 、ポリメラーゼ、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸に加えて、適切なpH、塩濃度（例えばKCl の濃度）、金属補因子濃度（例えばMg2+又はMn2+の濃度）などを定める緩衝要素を含んでもよい。他の要素として、一又は複数のヌクレアーゼ阻害剤（例えば、RNA 分解酵素阻害剤及び／又はDNA 分解酵素阻害剤）、GCリッチな配列の増幅／複製を容易にするための一又は複数の添加物（例えば、GC-Melt （登録商標）試薬（クロンテック・ラボラトリーズ社（Clontech Laboratories, Inc.）（マウンテンビュー，カリフォルニア州））、ベタイン、DMSO、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール又はこれらの組み合わせ）、一又は複数の分子密集剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）、一又は複数の酵素安定化要素（例えば、最終濃度が１〜10mM（例えば５mM）のDTT ）、並びに／或いはポリメラーゼ媒介の伸長反応及びテンプレートスイッチングを容易にするのに有用なあらゆる他の反応混合物の要素が含まれてもよい。
反応混合物は、プライマの伸長反応及びテンプレートスイッチングに適切なpHを有することが可能である。ある実施形態では、反応混合物のpHは、８〜９、例えば８〜8.5 を含む７〜９のような５〜９の範囲内である。場合によっては、反応混合物はpH調整剤を含む。対象のpH調整剤は、水酸化ナトリウム、塩酸、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを含むが、これらに限定されない。例えば、反応混合物のpHは、適切な量のpH調整剤を加えることにより、所望の範囲に調整され得る。
核酸生成物の生成に適切な温度範囲は、採用される特定のポリメラーゼ、採用されるあらゆる任意のプライマの融解温度などの要因に応じて異なってもよい。一実施形態によれば、ポリメラーゼは逆転写酵素（例えばMMLV逆転写酵素）であり、核酸生成物を生成するのに十分な反応混合物の条件として、42度を含む40〜45度のような、例えば37度〜50度である16〜70度のような４〜72度の温度に反応混合物の温度を設定することが含まれる。
テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）は、デオキシリボヌクレオチドから構成されたある長さのポリマーであってもよく、その長さは、例えば10以上の塩基、20以上の塩基、50以上の塩基、100 以上の塩基、500 以上の塩基、1000以上の塩基、2000以上の塩基、3000以上の塩基、4000以上の塩基、5000以上の塩基、10,000以上の塩基、50,000以上の塩基又は更に多くの塩基である。テンプレートDNA は、二本鎖DNA テンプレート（dsDNA テンプレート）又は一本鎖DNA テンプレート（ssDNA テンプレート）であってもよい。
テンプレートDNA を含むDNA 試料を、核酸生成物の生成に十分な量で反応混合物に加えてもよい。一実施形態によれば、反応混合物中のDNA の最終濃度が、0.1 μg/μL 〜0.25μg/μL を含む0.01μg/μL 〜0.5 μg/μL のような0.005 μg/μL 〜１μg/μL のような0.001 μg/μL 〜2.5 μg/μL のような１pg/ μL 〜５μg/μL のような１fg/ μL 〜10μg/μL の範囲内にあるように、DNA 試料を反応混合物に加える。ある態様では、テンプレートDNA を含むDNA 試料を単細胞から単離する。他の態様では、テンプレートDNA を含むDNA 試料を２，３，４，５，６，７，８，９，10，20，50，100 ，500 又はそれ以上の細胞から単離する。
テンプレートDNA は、単細胞、複数の細胞（例えば培養細胞）、組織、器官又は生物（例えばバクテリア、酵母など）から単離される核酸試料を含むがこれに限定されない対象のあらゆる核酸試料中に存在してもよい。ある態様では、一若しくは複数の細胞、組織、器官及び／又は哺乳動物（例えばヒト、齧歯動物（例えばマウス）若しくはあらゆる他の対象の哺乳動物）等から核酸試料を単離する。他の態様では、バクテリア、酵母、昆虫（例えばショウジョウバエ）、両生動物（例えばカエル（例えばツメガエル））、ウイルス、植物のような哺乳動物以外の試料源、又はあらゆる他の非哺乳類の核酸試料源から核酸試料を単離する。
テンプレートDNA は、本方法を実行する者が興味を示すあらゆるタイプのDNA であってもよく、ゲノムDNA 又はその断片、相補的DNA （つまり対象のあらゆるRNA 又はDNA から合成された「cDNA」）、組換DNA （例えばプラスミドDNA ）などを含むが、これらに限定されない。
このような試料源からDNA を単離するための手法、試薬及びキットは、本技術分野では公知である。例えば、対象の試料源からゲノムDNA を単離するためのキット、例えばクロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュー，カリフォルニア州）によりNucleoMag（登録商標）、NucleoSpin（登録商標）及びNucleoBond（登録商標）のゲノムDNA 単離キットが市販されている。ある態様では、固定された生体試料、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織からゲノムDNA を単離する。市販のキット、例えばクロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュー、カリフォルニア州）によるNucleoSpin（登録商標）FFPE DNAキットを用いてFFPE組織からゲノムDNA を単離してもよい。
ある態様における本方法では、前駆体DNA （例えば前駆体二本鎖DNA（dsDNA ）又は前駆体一本鎖DNA （ssDNA ））からテンプレートDNA を生成する。例えば、反応混合物に加えるテンプレートDNA のサイズを制御することが望ましいとき、例えば、元の試料中の剪断されていない前駆体DNA （例えばゲノムDNA ）と比較して長さがより短いテンプレートDNA を生成するために、対象の試料源から単離されたDNA 試料に剪断／断片化を施してもよい。テンプレートDNA を剪断／断片化方法によって生成してもよく、このような方法として、マイクロピペットの先端部又は精密規格の針に試料を一又は複数回通過させる方法、試料を霧状にする方法、（例えば、コバリス（Covaris ）社（ウーバン（Woburn），マサチューセッツ州）による集束超音波処理装置を使用して）試料を超音波処理する方法、ビーズによる剪断、（例えば、一又は複数のDNA 剪断、例えば制限酵素を使用した）酵素剪断、例えば２価カチオンを使用した化学に基づいた断片化、（熱と組み合わせて使用されてもよい）断片化緩衝剤、或いは、前駆体DNA を剪断／断片化してより短いテンプレートDNA を生成するためのあらゆる他の適切な手法が含まれるが、これらに限定されない。ある態様では、最初の核酸試料の剪断／断片化によって生成されるテンプレートDNA は、50〜10,000のヌクレオチド、100 〜5000のヌクレオチド、150 〜2500のヌクレオチド、200 〜1000のヌクレオチド、例えば250 〜500 のヌクレオチドの長さを有する。ある実施形態によれば、最初の核酸試料の剪断／断片化によって生成されるテンプレートDNA は、例えば、選択された配列決定プラットフォームに適切なように、10〜20のヌクレオチド、20〜30のヌクレオチド、30〜40のヌクレオチド、40〜50のヌクレオチド、50〜60のヌクレオチド、60〜70のヌクレオチド、70〜80のヌクレオチド、80〜90のヌクレオチド、90〜100 のヌクレオチド、100 〜150 のヌクレオチド、150 〜200 のヌクレオチド、200 〜250 のヌクレオチド、200 〜1000のヌクレオチド、又は1000〜10,000のヌクレオチドの長さを有する。
前駆体DNA からテンプレートDNA を生成するための更なる方法を採用してもよい。例えば、前駆体dsDNA がその端部の一方又は両方にオーバーハングを有する場合、前駆体DNA を処理して平滑末端を有するテンプレートdsDNA を生成することが望ましい場合がある。平滑末端を有するdsDNA を生成するための方法は本技術分野では公知である。例えば、DNA ポリメラーゼI の大きな（クレノウ）断片を5'オーバーハングの埋め込みのために使用してもよい一方、T4 DNAポリメラーゼを3'オーバーハングの削り込みのために使用してもよい。
他の態様では、前駆体dsDNA は平滑末端を有してもよく、オーバーハング（例えば3'オーバーハング）をその端部の一方又は両方に有するテンプレートDNA を生成して採用することが望ましい場合がある。「オーバーハング」とは、二本鎖DNA 分子の端部における一又は複数の不対のヌクレオチドを意味する。このようなオーバーハングは、例えば、ポリメラーゼにテンプレート−プライマ基質を与えるために有用である場合がある。つまり、テンプレートDNA がその端部の内の一端部にオーバーハングを有するとき、その一端部でより長い鎖がDNA テンプレートとして機能し得る一方、その一端部でより短い鎖が、核酸重合反応を開始するためのプライマとして効率的に機能し得る。従って、第１鎖の合成反応が、ポリメラーゼにテンプレート−プライマ基質を与えるオーバーハングによって生じ得るので、テンプレートDNA がその端部の内の一方（又は両方）にオーバーハングを有するとき、反応混合物へのプライマの付加が必要ではない。
オーバーハングを有するDNA を生成するための方法は公知であり、このような方法として、前駆体dsDNA （例えばゲノムDNA 、cDNAなど）を制限エンドヌクレアーゼと接触させる／制限エンドヌクレアーゼを用いて消化させることにより、テンプレートDNA の一端部又は両端部にオーバーハング（又は「粘着末端」）を有するテンプレートDNA を生成する方法がある。本方法を実行して所望のタイプのオーバーハングを有するテンプレートDNA を生成することにより、制限エンドヌクレアーゼ及び制限エンドヌクレアーゼによって生成されるオーバーハングのタイプをよく特徴付けて、選択することができる。
或いは、又は加えて、DNA 「テーリング」反応を行って、所望のオーバーハングを有するテンプレートDNA を生成してもよい。一実施形態によれば、本方法では、所望のオーバーハングを有するDNA テンプレートを生成するのに十分な条件下で、且つ一又は複数タイプのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下で前駆体DNA をターミナルトランスフェラーゼと接触させる。デオキシリボヌクレオチド三リン酸の付加速度、ひいてはオーバーハングの長さは、デオキシリボヌクレオチド三リン酸の濃度に対する3'DNA 端部の比率の関数であり、どのデオキシリボヌクレオチド三リン酸が使用されるかによっても決まる。ターミナルトランスフェラーゼ反応は、ターミナルトランスフェラーゼが活性を有する温度、例えば37度を含む30度〜50度の温度で実行される。ターミナルトランスフェラーゼ反応中のデオキシリボヌクレオチド三リン酸は、0.1 mMを含む0.05mM〜0.5 mMのような（４タイプのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の内の２以上が使用される場合には夫々）0.01mM〜１mMの最終濃度で存在してもよい。前駆体DNA は、ターミナルトランスフェラーゼ反応中、例えば５pmolであり１〜25pmolを含む0.5 〜50pmolのような0.05〜500 pmolの濃度で存在してもよい。ターミナルトランスフェラーゼ緩衝液及びあらゆる他の有用な要素（例えば、Coなどの金属補因子）が、ターミナルトランスフェラーゼ反応中に更に含まれてもよい。ターミナルトランスフェラーゼ反応の結果、前駆体dsDNA の一方又は両方の鎖の3'端部にヌクレオチドが付加され、１つ又は２つの3'オーバーハングを有するテンプレートDNA が生成される。その後、得られたテンプレートDNA を反応混合物に加えて、本方法に従って核酸生成物を生成してもよい。
本開示の方法では、反応混合物にポリメラーゼを加える。本方法を実行するとき、様々なポリメラーゼを採用してもよい。反応混合物に加えるポリメラーゼは、テンプレートスイッチングが可能であり、ポリメラーゼは重合のためのテンプレートとして第１核酸鎖を使用し、その後、同一の重合反応を継続するために第２テンプレート核酸鎖の3'端部にスイッチする。ある態様では、反応混合物に加えるポリメラーゼは逆転写酵素である。本方法を実行する際に使用される、テンプレートスイッチングを行うことが可能な逆転写酵素は、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、レトロプラスミド逆転写酵素、レトロン逆転写酵素、バクテリア逆転写酵素、グループIIイントロン由来の逆転写酵素、突然変異体、変種、誘導体又はこれらの機能的断片を含むが、これらに限定されない。例えば、逆転写酵素はモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MMLV RT ）、又はカイコ逆転写酵素（例えば、カイコR2非LTR 型要素逆転写酵素）であってもよい。本方法を実行する際に使用されるテンプレートスイッチングを行うことができるポリメラーゼは市販されており、クロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュー，カリフォルニア州）から販売されているSMARTScribe（登録商標）逆転写酵素を含む。ある態様では、２以上の異なるポリメラーゼの混合物を、例えば高い処理能力、プルーフリーディング及び／又はその他の目的のために反応混合物に付加する。
ポリメラーゼの最終濃度が所望の量の核酸生成物を生成するのに十分であるように、ポリメラーゼを反応混合物に加える。ある態様では、ポリメラーゼ（例えばMMLV RT 又はカイコRTのような逆転写酵素）が、例えば20ユニット／μL （U/μL ）であり５〜25U/μL を含む１〜50U/μL 、0.5 〜100 U/μL のような0.1 〜200 U/μL の最終濃度で反応混合物中に存在する。
反応混合物に加えるポリメラーゼは、テンプレートスイッチング能力に加えて、核酸生成物の生成を容易にするために他の有用な機能性を含んでもよい。例えば、ポリメラーゼはターミナルトランスフェラーゼ活性を有してもよく、ポリメラーゼは、DNA 分子の3'ヒドロキシル末端へのデオキシリボヌクレオチドの付加を触媒することができる。ある態様では、ポリメラーゼがテンプレートDNA の5'端部に達すると、ポリメラーゼは、テンプレートによってコードされない新生鎖の3'端部に一又は複数の付加的ヌクレオチドを組み込むことができる。例えば、ポリメラーゼがターミナルトランスフェラーゼ活性を有するとき、ポリメラーゼは、１，２，３，４，５，６，７，８，９，10又はそれ以上の付加的ヌクレオチドを新生DNA 鎖の3'端部に組み込み可能であってもよい。ヌクレオチドの全てが（例えば、新生鎖の3'端部にホモヌクレオチド伸長体を生成して）同一であってもよく、又は、ヌクレオチドの少なくとも１つが一又は複数の他のヌクレオチドとは異なってもよい。ある態様では、ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性により、２，３，４，５，６，７，８，９，10又はそれ以上の同一のヌクレオチド（例えば、全てdCTP、全てdGTP、全てdATP又は全てdTTP）のホモヌクレオチド伸長体が付加される。例えば、一実施形態によれば、ポリメラーゼはMMLV逆転写酵素（MMLV RT ）である。MMLV RT は、新生DNA 鎖の3'端部に付加的ヌクレオチド（主にdCTP、例えば３つのdCTP）を組み込む。本明細書の他の箇所でより詳細に説明しているように、このような付加的ヌクレオチドは、例えば、テンプレートDNA からテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドまでのポリメラーゼによるテンプレートスイッチングを容易にするために、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの3'端部と新生DNA 鎖の3'端部との間でのハイブリダイゼーションを可能にするために有用であってもよい。
上述したように、本方法では、反応混合物にテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを加える。「テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド」とは、核酸重合反応中にポリメラーゼが最初のテンプレート（例えば本方法におけるテンプレートDNA ）からスイッチするオリゴヌクレオチドテンプレートを意味する。この点に関して、テンプレートDNA は「ドナーテンプレート」と称されてもよく、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは「受容体テンプレート」と称されてもよい。本明細書で使用されているように、「オリゴヌクレオチド」は、２〜500 のヌクレオチド、例えば２〜200 のヌクレオチドの一本鎖多量体である。オリゴヌクレオチドは合成物質であってもよく、又は酵素的に生成されてもよく、ある実施形態では10〜50のヌクレオチドの長さを有する。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド単量体（つまり、オリゴリボヌクレオチド若しくは「RNA オリゴヌクレオチド」であってもよい）、又はデオキシリボヌクレオチド単量体（つまり、オリゴデオキシリボヌクレオチド若しくは「DNA オリゴヌクレオチド」であってもよい）を含有してもよい。オリゴヌクレオチドは、例えば、10〜20、21〜30、31〜40、41〜50、51〜60、61〜70、71〜80、80〜100 、100 〜150 、150 〜200 、500 まで又はそれ以上のヌクレオチドの長さを有してもよい。
反応混合物は、テンプレートDNA からテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドへのポリメラーゼのテンプレートスイッチングを容易に可能にするのに十分な濃度のテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含む。例えば、１〜２μM （例えば1.2 μM ）を含む0.5 〜５μM 、0.1 〜10μM のような0.01〜100 μM の最終濃度でテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを反応混合物に加えてもよい。
テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、修飾されるか又は非天然に存在する一若しくは複数のヌクレオチド（又はその類似体）を含んでもよい。例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、一又は複数のヌクレオチド類似体（例えば、LNA 、FANA、2'-O-Me RNA、2'-フルオロRNAなど）、連鎖修飾体（例えば、ホスホロチオエート、3'−3'及び5'−5'の逆連鎖体）、5'及び／又は3'端部の修飾体（例えば、5'及び／又は3'アミノ、ビオチン、DIG 、リン酸塩、チオール、色素、消光剤など）、一又は複数の蛍光標識されたヌクレオチド、或いはテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに所望の機能性を与えるあらゆる他の特徴を含んでもよい。
ある態様では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、3'ハイブリダイゼーション領域及び／又は5'アダプタ配列を有する。3'ハイブリダイゼーション領域の長さは変わってもよく、場合によっては、３〜７nts のような２〜10nts の範囲内である。一実施形態によれば、反応混合物に加えるポリメラーゼ（例えば、MMLV RT のような逆転写酵素）は、ホモヌクレオチド伸長体（例えば、C-C-C のようなホモトリヌクレオチド）が新生鎖の3'端部に付加され得るようなターミナルトランスフェラーゼ活性を有し、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの3'ハイブリダイゼーション領域が、新生鎖の3'端部のホモヌクレオチド伸長体に相補的なホモヌクレオチド伸長体（例えばG-G-G のようなホモトリヌクレオチド）を含む。他の態様では、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼが新生鎖の3'端部にヌクレオチド伸長体（例えばトリヌクレオチド伸長体）を付加するとき、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの3'ハイブリダイゼーション領域は、シトシンを有するヌクレオチドとグアニンを有するヌクレオチドとを含むヘテロトリヌクレオチド（例えばr(C/G)3 オリゴヌクレオチド）を含んでおり、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドのヘテロトリヌクレオチド伸長体が新生鎖の3'端部に相補的である。3'ハイブリダイゼーション領域及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの例が米国特許第5962272 号明細書に更に記載されており、その開示は参照によって本明細書に組み込まれる。
一実施形態によれば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの5'端部の補体（例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの5'アダプタ配列）を合成した後、ポリメラーゼがテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドから異なるテンプレート核酸にスイッチすることを防止する修飾体を含む。有用な修飾体は、脱塩基損傷（例えばテトラヒドロフラン誘導体）、ヌクレオチド付加物、イソヌクレオチド塩基（例えば、イソシトシン、イソグアニン及び／又は同様のものなど）及びこれらのあらゆる組み合わせを含むが、これらに限定されない。
テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが5'アダプタ配列（例えば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの3'ハイブリダイゼーション領域の定められたヌクレオチド配列5'）を含むとき、5'アダプタ配列は、例えば、テンプレートとして新しく合成された核酸生成物を使用して第２鎖の合成及び／又はPCR 増幅を行なうために有用なその3'端部に（5'アダプタ配列に相補的な）プライマ結合部位を有する核酸生成物を生成するためのテンプレートとして機能してもよい。従って、本方法では、5'アダプタ配列を有するテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの5'端部まで核酸生成物を合成して、その後、（テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの5'アダプタ配列に相補的な）核酸生成物の3'端部を、ハイブリダイゼーション条件下で該3'端部に結合するように構成された第２鎖プライマと接触させてもよい（例えば、ハイブリッド形成してもよい）。
本明細書で使用されている「相補的な」という用語は、標的核酸の全て又はある領域（例えば核酸生成物の領域）に非共有結合によって塩基対を形成するヌクレオチド配列を指す。標準的なワトソン・クリック型の塩基対形成では、DNA 内のアデニン(A) がチミン(T) と塩基対を形成し、グアニン(G) がシトシン(C) と塩基対を形成する。RNA では、チミンがウラシル(U) と置き換えられる。そのため、A はT に相補的であり、G はC に相補的である。RNA では、A はU に相補的であり、逆の場合も同様である。一般的には、「相補的な」という用語は、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列を指す。「相補的な」という用語は、一本鎖のあらゆるヌクレオチドが他方の鎖の対応する位置におけるあらゆるヌクレオチドに相補的であるように完全に相補的な二本鎖を包含してもよい。ある場合には、ヌクレオチド配列が標的に部分的に相補的であってもよく、全てのヌクレオチドが標的核酸の全ての対応する位置におけるあらゆるヌクレオチドに相補的であるとは限らない。例えば、プライマは、標的核酸に完全に（つまり100 ％）相補的であってもよく、又は、プライマ及び標的核酸が完全ではないある程度（例えば70％、75％、85％、90％、95％、99％）の相補性を共有してもよい。２つのヌクレオチド配列の同一性パーセントが、最適な比較のために配列を並べることにより決定され得る（例えば、最適に並べるために第１配列の配列に間隙を導入し得る）。その後、対応する位置のヌクレオチドを比較して、２つの配列間の同一性パーセントがそれらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（つまり、同一性パーセント＝同一位置の数／位置の総数×100 ）。一方の配列における位置が他方の配列における対応する位置と同一のヌクレオチドによって占められるとき、分子はその位置で同一である。このような数学的アルゴリズムの非制限例が、Karlin他著，「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United states of America（米国科学アカデミー紀要）」，90，p.5873−5877，1993年に記載されている。このようなアルゴリズムは、Altschul他著，「Nucleic Acids Research」，25，p.389 −3402，1997年に記載されているように、NBLASTプログラム及びXBLASTプログラム（バージョン2.0 ）に組み込まれている。BLAST プログラム及びGapped BLASTプログラムを利用するとき、夫々のプログラム（例えばNBLASTプログラム）のデフォルトパラメータを使用することができる。一態様では、配列比較のためのパラメータをscore ＝100 ，wordlength＝12として設定することができ、又は変えることができる（例えば、wordlength＝５若しくはwordlength＝20）。
本明細書で使用されているように、「ハイブリダイゼーション条件」という用語は、プライマが標的核酸（例えば核酸生成物）の領域に特定的にハイブリッド形成する条件を意味する。プライマが標的核酸に特定的にハイブリッド形成するか否かは、ポリマーと標的核酸との相補性の程度、プライマの融解温度（TM）によって知らされてもよい、ハイブリダイゼーションが生じる温度のような因子によって決定される。融解温度は、プライマ−標的核酸の二本鎖の半分がハイブリッド形成されたままであり、二本鎖の半分が一本鎖に解離する温度を指す。二本鎖のTmは実験的に決定されてもよく、又は式Tm＝81.5＋16.6(log10[Na+])＋0.41(fraction G＋C)−(60/N)を用いて予測されてもよい。ここで、N は鎖の長さであり、[Na+] は1M未満である。Sambrook及びRussell著，2001年，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，第３版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor N.Y.，第10章参照。様々なハイブリダイゼーション条件によって決まるプライマ／標的の二本鎖のTmを予測するために、様々なパラメータによって決まる他の更に進化したモデルを使用してもよい。特定の核酸ハイブリダイゼーションを達成するための手法が、例えばTijssen 著，「Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes」，第Ｉ部，第２章，「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」，Elsevier，1993年に記載されている。
上述したように、本方法では、核酸生成物を合成して、（5'アダプタ配列に相補的な）核酸生成物の3'端部を第２鎖プライマにハイブリッド形成してもよい。このような実施形態における本方法では更に、反応混合物に（例えば、本明細書の他の箇所に述べられているような）核酸重合条件を施して、核酸生成物に相補的な第２鎖DNA を生成してもよい。
上述したように、本方法ではデオキシリボヌクレオチド三リン酸を結合して反応混合物にする。ある態様では、４つの天然に存在するデオキシリボヌクレオチド三リン酸（dATP，dGTP，dCTP及びdTTP）を夫々反応混合物に加える。例えば、夫々のデオキシリボヌクレオチド三リン酸の最終濃度が0.5 〜５mM（例えば１mM）を含む0.1 〜10mMのような0.01〜100 mMの範囲内であるようにdATP、dGTP、dCTP及びdTTPを反応混合物に加えてもよい。一実施形態によれば、反応混合物に加えられる少なくとも１つのタイプのヌクレオチドは非天然に存在するヌクレオチドであり、例えば、結合部分又は他の部分（例えば蛍光部分）が付着された修飾済のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、或いは、本方法又は下流側の対象の適用に使用されるあらゆる他のタイプの非天然に存在するヌクレオチドである。
反応混合物へのプライマの付加は、テンプレートDNA が第１鎖の合成を開始するのに適切な基質を与えるときには必要ではない。例えば、テンプレートDNA がその端部の一方又は両方にオーバーハングを有する二本鎖DNA であるとき、dsDNA の「突出していない」鎖が、突出している鎖がテンプレートとして機能する第１鎖の合成反応を刺激することができる。このように、オーバーハングを「埋め込んで」、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドにスイッチして、受容体テンプレートとしてテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを使用して第１鎖の合成を完了して核酸生成物を生成するためにポリメラーゼを使用してもよい（ポリメラーゼによるターミナルトランスフェラーゼ反応が任意には本明細書の他の箇所に述べられているようにテンプレートスイッチの前に起こる）。従って、例えば、テンプレートDNA が二本鎖であり、端部の一方又は両方にオーバーハングを含んでいるとき、プライマの付加を除く。
しかしながら、ある状況では、プライマを反応混合物に付加して第１鎖の合成反応を刺激することが望ましい場合がある。例えば、テンプレートDNA が一本鎖である場合、又はテンプレートDNA が平滑末端を有する二本鎖DNA である場合、プライマが第１鎖の合成を開始するために有用であってもよい。更に、核酸生成物を生成するために、例えば、既知の配列を有する対象のテンプレートDNA に対応する核酸生成物を生成して（試料中の他のDNA 種から核酸生成物を生成しない）ことが望ましい場合、プライマを使用することにより、本方法を実行する者が、DNA 試料中のいずれの一又は複数のDNA が一又は複数のテンプレートDNA として機能するのかについて更に制御することが可能になる。
従って、ある態様における本方法では更に、テンプレートDNA を第１のプライマと接触させる。接触は、プライマがテンプレートDNA にハイブリッド形成するのに十分な条件下で行なわれ、この条件は本明細書の他の箇所に述べられている。一実施形態によれば、プライマの配列全体は任意であり、例えばプライマは、ランダムな六量体又は適切な長さのあらゆる他のランダムなプライマ（又はこれらの混合物）であってもよい。他の態様では、プライマは定められた配列を有しており、例えば、プライマの配列は、本方法を実行して対象のテンプレートDNA 中の既知の相補的な配列に特定的にハイブリッド形成することにより設計されてもよい。
一実施形態によれば、プライマは２以上の領域を有する。例えば、プライマは、テンプレートDNA にハイブリッド形成する第１の（例えば3'）領域とテンプレートDNA にハイブリッド形成しない第２の（例えば5'）領域とを有してもよい。第１及び第２の領域の配列は独立して定められてもよく、又は任意であってもよい。ある態様では、第１の領域は定められた配列を有しており、第２の領域の配列は定められているか、又は任意である。他の態様では、第１の領域は任意の配列（例えば、ランダムな六量体の配列のようなランダムな配列）を有しており、第２の領域の配列は定められているか、又は任意である。一実施形態によれば、第２の領域は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有する。例えば、DNA に隣接する同一の配列（例えば同一の「アダプタ」配列）を有することにより、対象の下流側の適用（例えばクローニング、配列決定など）が容易になるとき、本実施形態が使用される。或いは、又は加えて、第２の領域は、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに存在しないヌクレオチド配列を有してもよい。例えば、第２の領域は第１のアダプタ配列を構成してもよく、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの領域が第２のアダプタ配列を構成してもよく、第１及び第２のアダプタ配列は異なる（例えば、図１に示されている実施形態のアダプタ配列A/A'及びアダプタ配列B/B'参照）。例えば、アダプタ配列を有する第１の端部と異なるアダプタ配列を有する第２の端部とを有するDNA を生成することが望ましい場合、本実施形態が使用される。例えば、後のクラスタ生成のためにゲノムDNA のライブラリを調製して、必要に応じてIllumina（登録商標）に基づいた配列決定プラットフォーム又はあらゆる他の適切な配列決定プラットフォームを用いてDNA の配列決定を行うために、両端部に異なるアダプタ配列を有することは有用である。
本方法では、核酸生成物が生成されると、核酸生成物を対象の下流側の適用（例えばクローニング、配列決定など）に直接導入してもよい。他の態様では、本方法では、第２鎖の合成及び／又はPCR 増幅のために核酸生成物をテンプレートとして使用してもよい。一実施形態によれば、本開示の方法では更に、核酸生成物に核酸増幅条件を施す。このような条件として、核酸生成物の全て又は所望の部分を増幅するように構成された順方向プライマ及び逆方向プライマと、デオキシリボヌクレオチド三リン酸と、増幅をもたらすのに適切なポリメラーゼ（例えば、耐熱性ポリメラーゼ）とを付加してもよい。増幅を実行するための最初の工程として、核酸生成物を変性させて、核酸生成物からテンプレートDNA 及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを解離することにより、核酸生成物をプライマの結合に利用可能にしてもよい。
本開示の一実施形態に係る方法が、図１に概略的に示されている。図示されているように、テンプレートDNA102、ポリメラーゼ104 、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド106 及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸（不図示）を、核酸生成物の生成に十分な条件下で結合して反応混合物100 にする。任意ではあるが、図１に示されている実施形態では、第１鎖を合成するためにポリメラーゼによって伸長される第１のプライマであるプライマ108 が採用されている。プライマ108 は、テンプレートDNA にハイブリッド形成する第１の(3')領域110 とテンプレートDNA にハイブリッド形成しない第２の(5')領域112 とを有する。第１の領域110 のヌクレオチド配列は任意であってもよく（例えば、ランダムな六量体の配列のようなランダムな配列）、又は、第１の領域の配列が定められてもよい（例えば、対象の特定のテンプレートDNA の特定の領域にハイブリッド形成すべく特定的に選択される配列）。この例では、プライマ108 の第１の領域110 はテンプレートDNA102内の配列114 に相補的である。
テンプレートDNA102へのプライマ108 のハイブリダイゼーションの際に、ポリメラーゼ104 がテンプレートDNA102に沿ってプライマ108 を伸長するときに第１鎖の合成が進行する。この例では、伸長反応がテンプレートDNA の5'端部に達すると、ポリメラーゼが伸長生成物にホモヌクレオチド伸長体（例えば、XXX として図１に示されているホモトリヌクレオチド）を付加するように、ポリメラーゼはターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。本実施形態によれば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、伸長生成物の3'端部でホモヌクレオチド伸長体に相補的な（XXX として示されている）ホモトリヌクレオチドを含む3'ハイブリダイゼーション領域を有する。この相補性により、伸長生成物の3'端部へのテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの3'ハイブリダイゼーション領域のハイブリダイゼーションが促進される。このハイブリダイゼーションにより、ポリメラーゼが受容体テンプレート領域にテンプレートスイッチしてテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの5'ターミナルヌクレオチドへの伸長反応を継続するように、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの受容体テンプレート（又は「アダプタ配列」(B')）領域（3'ハイブリダイゼーション領域の位置付けられた5'）がポリメラーゼの十分近くに運ばれる。それによって、１つの核酸生成物の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートDNA 及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含む核酸生成物が生成される。
この例では、本方法は第２鎖の合成ステップを更に有し、第２鎖の合成ステップでは、核酸生成物の3'領域(B) に相補的な配列(B')を有するプライマが核酸生成物の3'領域にハイブリッド形成して、核酸生成物をテンプレートとして使用してポリメラーゼによって核酸生成物の5'端部に伸長する。この第２鎖の合成ステップの結果、核酸生成物及びその相補鎖を含む二本鎖DNA が生成される。
図１に示されている実施形態によれば、第２鎖の合成により得られた二本鎖DNA は、様々な対象の下流側の適用に有用であってもよい（図１にA/A'及びB/B'として示されている）アダプタ配列を有する。下流側の適用として、PCR 増幅、クローニング、配列決定、及び定められた配列をDNA 分子の端部に有することが有利なあらゆる他の適用が含まれるが、これらに限定されない。
以下の部分に、本発明の異なる実施形態を更に述べる。一実施形態によれば、定められた配列を有するテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸と二本鎖テンプレートDNA を結合する。dsDNA テンプレートの3'端部が、テンプレートとしてdsDNA テンプレートを用いて次に、定められた配列を有するテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼによって伸長する。続いて、定められた配列の全て又は一部に相補的なプライマを用いて、得られた核酸生成物を増幅してもよい。
別の実施形態によれば、一本鎖テンプレートDNA 又は二本鎖テンプレートDNA は、定められた5'配列を有する第１のプライマ、第１のプライマの定められた5'配列と同一の5'配列を有するテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸と結合する。定められた5'配列を有する第１のプライマは、（ハイブリダイゼーションの前に変性させられてもよい）テンプレートDNA にハイブリッド形成し、その3'端部が、テンプレートとしてテンプレートDNA を用いて次にテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼによって伸長する。得られた核酸生成物は、その5'端部及び3'端部に定められた配列を有する。その後、定められた配列の全て又は一部に相補的なプライマを用いてこの核酸を増幅してもよい。ある態様では、ランダムなプライミング及びテンプレートスイッチング付加の両方によってこの核酸を増幅してもよい。
更なる実施形態では、3'オーバーハングを有するテンプレートDNA を生成する酵素を用いて、平滑末端を有する前駆体二本鎖DNA を前処理する。例えば、前駆体二本鎖DNA をターミナルトランスフェラーゼ酵素及び／又は制限酵素を用いて処理して、3'オーバーハングを有するテンプレートDNA を生成してもよい。次に、ポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を使用することにより、テンプレートとして突出している鎖を用いてテンプレートDNA の突出していない鎖を伸長する。ポリメラーゼが突出している鎖の端部に達すると、ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性により、テンプレート化されていないヌクレオチドの付加（例えば、ホモヌクレオチド伸長体（例えばCCC のようなホモトリヌクレオチド伸長体）、ヘテロトリヌクレオチド伸長体などの付加）によりヌクレオチドの伸長体が付加される。本実施形態によれば、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、テンプレート化されていないヌクレオチドを付加することによってポリメラーゼにより付加される伸長体に相補的な3'端部を有する。テンプレート化されていないヌクレオチドを付加することによって付加される伸長体へのテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの際に、ポリメラーゼは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドにテンプレートスイッチして、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの5'領域の補体を合成することにより伸長反応を継続することが可能である。本方法に制限酵素を採用して3'オーバーハングを生成するとき、伸長反応が制限部位を破壊して、一又は複数の3'オーバーハング生成制限酵素、ポリメラーゼ、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及びあらゆる他の望ましい反応要素を適切な緩衝剤に含む１つの管に断片化機能及びタギング機能を備え得るように、本方法を設計することができる。
核酸がその5'端部及び3'端部にアダプタ配列を有する核酸のライブラリを生成するために、本方法を採用してもよい。核酸はその5'端部及び3'端部に同一のアダプタ配列を有してもよく、又は、5'端部及び3'端部におけるアダプタ配列が異なってもよい。ある適用、例えばある次世代の配列決定の手法（例えば、Illumina（登録商法）に基づいた配列決定プラットフォームを使用したゲノム配列決定）のために、投入されるDNA がDNA の異なる端部に異なるアダプタ配列を有することが必要とされる。従って、本明細書の他の箇所に述べられている適合性のある実施形態のいずれかを、抑制PCRと組み合わせて「Ａ」受容体及び「Ｂ」受容体の混合物を用いて行って、一端部に「Ａ」アダプタを有して他端部に「Ｂ」アダプタを有するDNA を生成する。例えば、抑制要素、適切なポリメラーゼ及びデオキシリボヌクレオチド三リン酸を夫々有する「Ａ」受容体及び「Ｂ」受容体とテンプレートDNA を結合して、一端部に「Ａ」アダプタを有して他端部に「Ｂ」アダプタを有する核酸生成物を生成することができる。「Ｂ」受容体を有するテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド及び抑制要素との反応中に、一本鎖DNA 又は二本鎖DNA のプライミング（例えば、ランダムプライミング又は非ランダムプライミング）を、「Ａ」配列を有するプライマ及び抑制要素を用いて行い得る本実施形態の変形例が更に提供される。ここで、ポリメラーゼは「Ａ」プライマを伸長して、その後、テンプレートを「Ｂ」受容体にスイッチし、5'端部に「Ａ」アダプタを有して3'端部に「Ｂ」アダプタを有する核酸生成物が得られる。
その端部に同一のアダプタ又は異なるアダプタを有する核酸生成物が生成される実施形態の内のいずれかでは、テンプレートDNA が、二本鎖テンプレートDNA が3'オーバーハングを有するように、例えばターミナルトランスフェラーゼ酵素及び／又は制限酵素で処理された前駆体DNA から生成された二本鎖テンプレートDNA であってもよい。突出している鎖をテンプレートとして使用してテンプレートDNA の突出していない鎖を伸長するために、ポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を使用してもよい。ポリメラーゼが突出している鎖の端部に達すると、ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性は、テンプレート化されていないヌクレオチドの付加（例えば、ホモヌクレオチド伸長体（例えばCCC のようなホモトリヌクレオチド伸長体）、ヘテロトリヌクレオチド伸長体などの付加）によりヌクレオチドの伸長体を付加する。本実施形態によれば、テンプレート化されていないヌクレオチドの付加によってポリメラーゼにより付加された伸長体に相補的な3'端部を有するテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドとＡアダプタ配列又はＢアダプタ配列との混合物が提供される。テンプレート化されていないヌクレオチドを付加することによって付加される伸長体へのテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの際に、ポリメラーゼは、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドにテンプレートスイッチして、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドのＡアダプタ配列又はＢアダプタ配列の補体を合成することにより伸長反応を継続することが可能である。3'オーバーハングが制限酵素の消化によって生成されるとき、制限酵素の混合物を使用して消化が行われ得る。
ある態様における本方法では、テンプレートスイッチングポリメラーゼに加えて、耐熱性ポリメラーゼを反応混合物に加える。或いは、テンプレートスイッチングポリメラーゼは耐熱性ポリメラーゼであってもよい。例えば、１つの管でアダプタを付加して核酸生成物を増幅することが望ましいとき、これらの実施形態の内のいずれかが使用される。ここで再度、テンプレートDNA は、受容体テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの3'端部に相補的な3'オーバーハングを有する二本鎖テンプレートDNA であってもよい。
（端部の一方又は両方に一又は複数のアダプタ配列を有する、本明細書の他の箇所に述べられている新たな分子に加えて）新たなDNA 分子を例えば遺伝子シャフリングによって構築する際に、本方法を更に使用する。例えば、「Ａ」配列を有する第１のDNA 分子及び「Ｂ」配列を有する第２のDNA 分子から始まる「ＡＢ」配列を有する核酸を生成するために本方法を使用してもよい。一実施形態によれば、「Ａ」配列を有するテンプレートDNA をポリメラーゼを用いて伸長して、その後、「Ｂ」配列を有する受容体テンプレートスイッチ核酸にテンプレートスイッチすることによって、連続的な「ＡＢ」配列を有する第１の核酸生成物を生成してもよい。ある態様では、本方法が１つのステップで（例えばあらゆる一又は複数の別個の連結反応ステップ無しで）「Ａ」配列のクローニングを行う方法であるように、「Ｂ」配列を有する受容体テンプレートスイッチ核酸はベクタであってもよい。
組成物
本開示によって組成物が更に提供される。対象の組成物は、例えば本方法に関して上述した反応混合物の要素のいずれかの一又は複数を含んでもよい。例えば、組成物は、テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）、ポリメラーゼ（例えばテンプレートスイッチングを行うことができるポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ若しくはこれらの組み合わせなど）、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、塩、金属補因子、一若しくは複数のヌクレアーゼ阻害剤（例えばDNA 分解酵素阻害剤）、一若しくは複数の酵素安定化要素（例えばDTT ）、前駆体dsDNA から3'オーバーハングを有するdsDNA を生成することができる酵素（例えば制限エンドヌクレアーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ若しくはこれらの組み合わせ）、又はあらゆる他の所望の反応混合物の一若しくは複数の要素の内の一又は複数を含んでもよい。
ある態様では、対象の組成物は、核酸鎖の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含んでいる。テンプレートDNA はあらゆる対象のテンプレートDNA であってもよく、例えばゲノムDNA 若しくはその断片、cDNA若しくはその断片及び／又はその同様のものであってもよい。対象の核酸源からDNA 試料を単離するための手法、及び前駆体DNA からテンプレートDNA を生成するための手法が本明細書の他の箇所に述べられている。
例えば、本方法を実行するとき、又は核酸鎖が使用されるあらゆる下流側の適用（例えばPCR 増幅、クローニング、配列決定及び／又はあらゆる他の対象の下流側の適用）に有用な一又は複数の領域／配列をテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドが有してもよい。ある態様では、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、3'ハイブリダイゼーション領域（例えばホモヌクレオチド伸長体（例えばホモトリヌクレオチド）又はヘテロヌクレオチド伸長体（例えばr(C/G)3））及び5'アダプタ配列（例えばテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの3'ハイブリダイゼーション領域の定められたヌクレオチド配列5'）を有する。
対象の組成物はあらゆる適切な環境に存在してもよい。一実施形態によれば、組成物は、反応管（例えば0.2 mlの管、0.6 mlの管、1.5 mlの管など）又はウェルに存在する。ある態様では、組成物は、２以上（例えば複数）の反応管又はウェル（例えば、96ウェルプレートのようなプレート）に存在する。管及び／又はプレートはあらゆる適切な材料、例えばポリプロピレンなどから形成されてもよい。ある態様では、組成物が存在する管及び／又はプレートにより、（例えば、ヒートブロック、水槽、サーモサイクラ及び／又はその同様なものなどに置かれたとき）熱が組成物に効率的に伝達され、そのため、組成物の温度が、例えば特定の酵素反応が生じるために必要な短時間で変更され得る。ある実施形態によれば、組成物は、壁が薄いポリプロピレン管、又は壁が薄いポリプロピレンウェルを有するプレートに存在する。ある実施形態では、反応が固体表面又はビーズで生じることが便利であり、このような場合、ビオチン連鎖のような本技術分野で公知の方法によって、又は支持体上で進めることが可能な共有結合及び反応によってテンプレートスイッチオリゴヌクレオチド又は一若しくは複数のプライマを固体支持体又はビーズに取り付けてもよい。
対象の組成物のための他の適切な環境として、例えばマイクロ流体チップ（例えば「ラブオンチップデバイス」）がある。組成物は、組成物の温度を所望の温度にすべく構成された機器、例えば温度制御された水槽、ヒートブロックなどに存在してもよい。組成物の温度を所望の温度にすべく構成された機器は、組成物の温度を一連の異なる所望の温度に夫々適切な時間で設定すべく構成されてもよい（例えば、機器はサーモサイクラであってもよい）。
キット
本開示の態様はキットを更に含む。対象のキットは、例えば本方法に関して上述した反応混合物の要素のいずれかの一又は複数を含んでもよい。例えば、キットは、テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）、ポリメラーゼ（例えばテンプレートスイッチングを行うことができるポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、これらの組み合わせなど）、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、塩、金属補因子、一若しくは複数のヌクレアーゼ阻害剤（例えば、RNA 分解酵素阻害剤及び／若しくはDNA 分解酵素阻害剤）、GCリッチな配列の増幅／複製を容易にするための一若しくは複数の添加物（例えば、GC-Melt （登録商標）試薬（クロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュー，カリフォルニア州））、ベタイン、DMSO、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール若しくはこれらの組み合わせ）、一若しくは複数の分子密集剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）、 一若しくは複数の酵素安定化要素（例えばDTT ）、前駆体dsDNA から3'オーバーハングを有するdsDNA を生成することができる酵素（例えば制限エンドヌクレアーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ若しくはこれらの組み合わせ）、又は容器及び／若しくは固体支持体、例えば管、ビーズ、マイクロ流体チップなどのあらゆる他の所望の一若しくは複数のキット要素の内の一又は複数を含んでもよい。
一実施形態によれば、対象のキットは、3'オーバーハングを生成する酵素と、ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼと、テンプレート化されていないヌクレオチドを付加することによってポリメラーゼにより生成されるヌクレオチド伸長体に相補的な3'端部を有するテンプレートスイッチ核酸とを備えている。前駆体二本鎖DNA から3'オーバーハングを生成することができるあらゆる酵素が対象のキットに含まれてもよい。例えば、酵素は、テンプレートDNA の一端部又は両端部に3'オーバーハングを有するDNA （例えば本方法を実行するときに採用されるテンプレートDNA ）を生成することができる制限エンドヌクレアーゼであってもよい。本方法を実行して所望のタイプのオーバーハングを有するDNA を生成することにより、制限エンドヌクレアーゼ及び制限エンドヌクレアーゼによって生成されるオーバーハングのタイプをよく特徴付けて、選択することができる。ある態様では、3'オーバーハングを生成する酵素はターミナルトランスフェラーゼであり、ターミナルトランスフェラーゼは、所望の3'オーバーハングを生成するために一又は複数タイプのデオキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でdsDNA の3'端部のテンプレート化されていない伸長を可能にする。
対象のキットがテンプレートスイッチ核酸を含んでいるとき、テンプレートスイッチ核酸は、例えば、本方法を実行するとき、又はあらゆる対象の下流側の適用に有用な一又は複数の領域／配列を有してもよい。ある態様では、テンプレートスイッチ核酸は定められた配列を3'オーバーハングの5'領域に有する。この定められた領域は、例えば第２鎖の合成反応、PCR 増幅、クローニング、配列決定及び／又はその同様のものに有用なアダプタ配列であってもよい。3'オーバーハングの5'領域におけるこのように定められた配列がテンプレートスイッチ核酸に存在するとき、対象のキットは、（例えば、定められた配列に相補的な配列を有する核酸種の増幅のために）定められた配列を有するプライマを備えてもよい。
ある態様では、テンプレートスイッチ核酸はクローニングベクタ要素を含む。クローニングベクタ要素は、選択可能なマーカ（例えば選択剤に対する宿主生物耐性を与える遺伝要素）、レポータ遺伝子（例えば蛍光蛋白質（例えばGFP 、RFP など）をコードする遺伝子、ベータガラクトシダーゼ、ベータグルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT ）若しくはあらゆる他の有用なレポータ遺伝子）、プロモータ（例えばT7、T3若しくは他のプロモータ）、複製起点（例えばoriC）、多重クローニング部位又はクローニングベクタ要素のあらゆる組み合わせであってもよい。
ある実施形態では、キットは、核酸源から核酸試料を単離するための試薬を備えている。試薬は、単細胞、培養細胞、組織、器官又は生物を含む様々な試料源から核酸試料を単離するのに適切であってもよい。対象のキットは、固定細胞、組織又は器官、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織から核酸試料を単離するための試薬を備えてもよい。このようなキットは、一若しくは複数の脱パラフィン剤、解架橋核酸に適切な一若しくは複数の薬剤、及び／又はその同様のものを備えてもよい。
対象のキットの要素は別々の容器に存在してもよく、又は、複数の要素が１つの容器に存在してもよい。例えば、3'オーバーハングを生成する酵素とテンプレートスイッチ核酸とが別々の容器で提供されてもよく、又は１つの容器で提供されてもよい。ある実施形態では、一又は複数のキット要素が即時使用可能であって、室温で便利に格納され得るように、要素が凍結乾燥された形態で提供される。
上述した要素に加えて、対象のキットは、例えば本方法を実行するためにキットの要素を使用するための説明書を更に備えている。本方法を実行するための説明書は一般に、適切な記録媒体に記録されている。例えば、説明書は紙又はプラスチックのような基材に印刷されてもよい。従って、説明書は、キット内に添付文書としてキット又はその要素の容器のラベルなどに（つまり包装体又は補助包装体に付随して）存在してもよい。他の実施形態では、説明書は、例えばCD-ROM、ディスケット、ハードディスクドライブ（HDD ）などの適切なコンピュータ可読記憶媒体に存在する電子保存データファイルとして存在する。更に他の実施形態では、実際の説明書がキット内に存在しないが、リモートソースから、例えばインターネット経由で説明書を得る手段が設けられている。本実施形態の一例は、説明書を閲覧及び／又はダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るこの手段が適切な基材に記録されている。
有用性
例えば、核酸の一端部又は両端部に既知の配列の領域を有する核酸の使用が有効な様々な適用に本方法は使用される。このような適用は、基礎研究及び診断（例えば臨床診断）の分野にあり、核酸クローニング、増幅、検出、ライブラリ生成／増幅、アレイハイブリダイゼーション、全ゲノム増幅、全ゲノム配列決定、及び本方法に従って生成される核酸生成物が使用されるあらゆる他の適用を含むが、これらに限定されない。本方法の重要な態様は、例えばハイブリッド核酸分子を生成するための従来の連結反応に基づく手法に関連した追加のステップなしで、テンプレートDNA を用いて、その端部の一方又は両方に既知の配列の一又は複数の領域を有する核酸種が１つのステップで生成されることである。従って、本方法は更に効率的であり、コスト効率が良く、従来の手法より更に適応性がある。
以下の例は例示のために提供されており、制限のために提供されているわけではない。
実験
Ｉ．２つの別個のDNA からの１つの核酸生成物の生成
この実験では、6-FAM でその5'端部に標識された20塩基対DNA を、その3'端部で20塩基対DNA に相補的な40塩基対テンプレートDNA にハイブリッド形成した。SMARTer（登録商標）IIA テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド（クロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュー，カリフォルニア州））の存在下で又は無しで、野生型MMLV逆転写酵素又はSMARTScribe （登録商標）RNAseH低減逆転写酵素（クロンテック・ラボラトリーズ社（マウンテンビュー，カリフォルニア州））を使用して、ハイブリッド形成された20塩基対DNA を伸長した。反応生成物をTBE-UREAアクリルアミドゲル上で分解して、ポリメラーゼによって伸長してテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの存在下のときのみ、より大きな長さの追加のバンドが観察された。
添付の特許請求の範囲に関わらず、本開示は下記の付記により更に定義される。
付記１．テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）、
ポリメラーゼ、
テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、及び
デオキシリボヌクレオチド三リン酸を
前記ポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチド三リン酸から重合した領域を有する１つの核酸生成物の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートDNA 及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含む核酸生成物を生成するのに十分な条件下で結合して反応混合物にすることを特徴とする方法。
付記２．前記ポリメラーゼは逆転写酵素であることを特徴とする付記１に記載の方法。
付記３．前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは3'ハイブリダイゼーション領域及び5'アダプタ配列を有することを特徴とする付記１又は２に記載の方法。
付記４．前記3'ハイブリダイゼーション領域はホモトリヌクレオチドを有することを特徴とする付記３に記載の方法。
付記５．前記3'ハイブリダイゼーション領域はヘテロトリヌクレオチドを有することを特徴とする付記３に記載の方法。
付記６．前記ヘテロトリヌクレオチドは、シトシンを有するヌクレオチドとグアニンを有するヌクレオチドとを含むことを特徴とする付記５に記載の方法。
付記７．5'アダプタ配列の補体を合成した後、前記ポリメラーゼが前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドから異なるテンプレート核酸にスイッチングすることを防止する修飾体を前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは含むことを特徴とする付記１〜６のいずれかに記載の方法。
付記８．前記修飾体は、脱塩基損傷、ヌクレオチド付加物、イソヌクレオチド塩基及びこれらの組み合わせから成る群から選ばれることを特徴とする付記７に記載の方法。
付記９．前記核酸生成物を生成して、
5'アダプタ配列に相補的な１つの核酸生成物の3'領域を該3'領域に結合すべく構成された第２鎖プライマとハイブリダイゼーション条件下で接触させることを特徴とする付記１に記載の方法。
付記１０．前記5'アダプタ配列に相補的な１つの核酸生成物の3'領域を前記第２鎖プライマと接触させた後、前記反応混合物に核酸重合条件を施すことを特徴とする付記９に記載の方法。
付記１１．前記テンプレートDNA を第１のプライマと接触させることを特徴とする付記１に記載の方法。
付記１２．前記第１のプライマは、前記テンプレートDNA にハイブリッド形成する第１の領域と、前記テンプレートDNA にハイブリッド形成しない第２の領域とを有することを特徴とする付記１１に記載の方法。
付記１３．前記第１の領域は定められた配列を有することを特徴とする付記１２に記載の方法。
付記１４．前記第１の領域は任意の配列を有することを特徴とする付記１２に記載の方法。
付記１５．前記第２の領域は、前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに存在するヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有することを特徴とする付記１２乃至１４のいずれかに記載の方法。
付記１６．前記第２の領域は、前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに存在しないヌクレオチド配列を有することを特徴とする付記１２乃至１４のいずれかに記載の方法。
付記１７．前記１つの核酸生成物に核酸増幅条件を施すことを特徴とする付記１に記載の方法。
付記１８．前記１つの核酸生成物はその5'端部にアダプタ配列を有して、その3'端部にアダプタ配列を有し、
5'アダプタ配列及び3'アダプタ配列に相補的なプライマで前記１つの核酸生成物を増幅することにより、前記１つの核酸生成物にPCR 増幅条件を施すことを特徴とする付記１７に記載の方法。
付記１９．前記１つの核酸生成物を耐熱性ポリメラーゼと接触させることにより、前記１つの核酸生成物に核酸増幅条件を施すことを特徴とする付記１７に記載の方法。
付記２０．前記テンプレートDNA は一本鎖であることを特徴とする付記１乃至１９のいずれかに記載の方法。
付記２１．前記テンプレートDNA は二本鎖であることを特徴とする付記１乃至１９のいずれかに記載の方法。
付記２２．二本鎖のテンプレートDNA は3'オーバーハングを含むことを特徴とする付記２１に記載の方法。
付記２３．前記テンプレートDNA を前駆体二本鎖DNA から生成することを特徴とする付記２２に記載の方法。
付記２４．前記テンプレートDNA を生成するのに十分な条件下で前記前駆体二本鎖DNA をターミナルトランスフェラーゼと接触させることを特徴とする付記２３に記載の方法。
付記２５．前記前駆体二本鎖DNA を制限酵素と接触させて前記テンプレートDNA を生成することを特徴とする付記２３に記載の方法。
付記２６．核酸鎖の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする組成物。
付記２７．前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは3'ハイブリダイゼーション領域及び5'アダプタ配列を有することを特徴とする付記２６に記載の組成物。
付記２８．前記3'ハイブリダイゼーション領域はホモトリヌクレオチドを有することを特徴とする付記２７に記載の組成物。
付記２９．反応管に存在することを特徴とする付記２６乃至２８のいずれかに記載の組成物。
付記３０．3'オーバーハングを生成する酵素、
ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼ、及び
テンプレート化されていないヌクレオチドを付加することによって前記ポリメラーゼにより生成されるヌクレオチド伸長体に相補的な3'端部を有するテンプレートスイッチ核酸
を備えていることを特徴とするキット。
付記３１．前記3'オーバーハングを生成する酵素は制限エンドヌクレアーゼであることを特徴とする付記３０に記載のキット。
付記３２．前記3'オーバーハングを生成する酵素はターミナルトランスフェラーゼであることを特徴とする付記３０に記載のキット。
付記３３．前記テンプレートスイッチ核酸は定められた配列を3'オーバーハングの5'領域に有することを特徴とする付記３０乃至３２のいずれかに記載のキット。
付記３４．定められた配列を前記3'オーバーハングの5'領域に有するプライマを更に備えていることを特徴とする付記３３に記載のキット。
付記３５．前記テンプレートスイッチ核酸はクローニングベクタ要素を含むことを特徴とする付記３０乃至３４のいずれかに記載のキット。
付記３６．前記クローニングベクタ要素は、選択可能なマーカ、リポータ、プロモータ、複製起点、多重クローニング部位及びこれらの組み合わせから成る群から選ばれることを特徴とする付記３５に記載のキット。
上記の発明は、理解の明瞭化のために、図示及び例示によりある程度詳しく説明されているが、ある変更及び調整が、本発明の趣旨又は添付の特許請求の範囲から逸脱することなく本発明になされてもよいことが、本発明の教示を考慮すると当業者に容易に明らかとなる。
従って、前述の内容は本発明の本質を単に示しているに過ぎない。本明細書に明示的に説明されていないか又は示されていないが、本発明の本質を具体化して本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者が考案することが可能であることが明らかである。更に、本明細書に述べられている全ての例及び条件的な用語は、本発明の本質と、本技術分野を進展させるために本発明者により与えられた概念とを理解する際に読者を支援することを本質的に意図するものであり、このように具体的に述べられた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の本質、態様及び実施形態だけでなく、本発明の具体的な例を述べている本明細書における全ての記載は、本発明の構造的且つ機能的な等価物の両方を含むことを意図するものである。加えて、このような均等物は、現時点で既知の均等物及び今後開発される均等物の両方、すなわち構造に関わらず同一の機能を有する開発された全ての要素を含むことを意図するものである。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に制限されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲により具体化される。

Claims (16)

  1. テンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）、
    ポリメラーゼ、
    テンプレートスイッチオリゴヌクレオチド、及び
    デオキシリボヌクレオチド三リン酸を
    前記ポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチド三リン酸から重合した領域を有する１つのハイブリッド核酸の隣の領域に夫々ハイブリッド形成した前記テンプレートDNA 及び前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含むハイブリッド核酸を生成するのに十分な条件下で結合して反応混合物にし、
    前記ポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチド三リン酸から重合した領域は、前記テンプレートDNA の5'末端に相補的な領域を有することを特徴とする方法。
  2. 前記ポリメラーゼは逆転写酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは3'ハイブリダイゼーション領域及び5'アダプタ配列を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  4. 5'アダプタ配列の補体を合成した後、前記ポリメラーゼが前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドから異なるテンプレート核酸にスイッチすることを防止する修飾体を前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記ハイブリッド核酸を生成して、
    5'アダプタ配列に相補的な１つのハイブリッド核酸の3'領域を該3'領域に結合すべく構成された第２鎖プライマとハイブリダイゼーション条件下で接触させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記テンプレートDNA を第１のプライマと接触させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
  7. 前記１つのハイブリッド核酸に核酸増幅条件を施すことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
  8. 前記テンプレートDNA は一本鎖であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
  9. 前記テンプレートDNA は二本鎖であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
  10. 二本鎖のテンプレートDNA は3'オーバーハングを含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. １つのハイブリッド核酸の隣の領域に夫々ハイブリッド形成したテンプレートデオキシリボ核酸（DNA ）及びテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドを含み、
    前記１つのハイブリッド核酸は、前記テンプレートDNA の5'末端に相補的な、ポリメラーゼによってデオキシリボヌクレオチド三リン酸から重合した領域を有することを特徴とする組成物。
  12. 前記テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドは、前記１つのハイブリッド核酸のテンプレート化されていない領域に相補的な3'ハイブリダイゼーション領域、及び5'アダプタ配列を有することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。
  13. 前記3'ハイブリダイゼーション領域はホモトリヌクレオチドを有することを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
  14. 3'オーバーハングを生成する酵素、
    ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼ、及び、
    テンプレート化されていないヌクレオチドを付加することによって前記ポリメラーゼにより生成されるヌクレオチド伸長体に相補的な3'端部を有するテンプレートスイッチ核酸
    を備えていることを特徴とするキット。
  15. 前記3'オーバーハングを生成する酵素は、制限エンドヌクレアーゼ又はターミナルトランスフェラーゼであることを特徴とする請求項１４に記載のキット。
  16. 前記3'オーバーハングを生成する酵素、及び前記ターミナルトランスフェラーゼ活性を有するポリメラーゼは、別々の容器に存在することを特徴とする請求項１４又は１５に記載のキット。
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