CN113811610A - 用于改进cDNA合成的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供修饰的模板转换寡核苷酸(TSO)、包含修饰的TSO的组合物、以及使用修饰的TSO自RNA模板合成cDNA的方法,其中cDNA在3’端包含衔接子区域。修饰的TSO在3’退火区域中包含至少一个2’‑氟核糖核苷酸并且与未修饰的TSO相比提供了改进的RNA向全长cDNA的转化,从而提高了产量和复杂性,由此发现了其可用于从RNA输入低的样品产生cDNA。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年提交的名为“用于改进cDNA合成的组合物和方法”的临时专利申请USSN62/845,609的优先权和权益,出于所有目的将其全文以引用方式并入本文。
发明背景
由RNA模板生产全长cDNA对于各种遗传分析都很重要,包括表征基因结构和功能。许多cDNA文库构建方法并非旨在产生全长cDNA产物,通常会缺少RNA模板的5'端。因此,全长RNA模板在许多cDNA文库中的代表性明显不足。改善cDNA文库中全长mRNA表现的一种方法是通过使用模板转换寡核苷酸(TSO),其充当位于原始RNA模板5'末端附近的合成模板区域,从而允许在cDNA模板3'端添加衔接子区域。这些衔接子区域可用于下游过程,以优先分析全长cDNA种类,例如扩增、衔接子连接和测序。
虽然TSO的使用有利于全长cDNA/cDNA文库的生产,但仍然存在局限性。例如,需要提高由输入水平非常低/有限的RNA样品中生产全长cDNA的产量。本公开的方面解决了这个和其他需要。
发明概述
本公开提供修饰的模板转换寡核苷酸(TSO)、包含修饰的TSO的组合物、以及使用修饰的TSO自RNA模板合成cDNA的方法,其中cDNA在3’端包含衔接子区域。修饰的TSO在3’退火区域中包含至少一个2’-氟核糖核苷酸并且与未修饰的TSO相比提供了改进的RNA向全长cDNA的转化,从而提高了产量和复杂性,由此发现了其可用于从RNA输入低的样品产生cDNA。
本公开的方面包括用于产生具有3'衔接子区域的互补DNA(cDNA)链的方法,该方法包括:在cDNA合成条件下将RNA模板与cDNA合成引物(有时称为逆转录(RT)引物)、模板转换寡核苷酸(TSO)、和逆转录酶结合,其中TSO包括5’衔接子区域和包含至少一个2’-氟核糖核苷酸的3’退火区域,其中(i)cDNA合成引物退火至RNA模板且逆转录酶从退火的cDNA合成引物产生RNA-cDNA中间体,其中RNA-cDNA中间体的cDNA链包括3’突出端;以及(ii)TSO的3’退火区域退火至RNA-cDNA中间体的3’突出端且逆转录酶使用退火的TSO作为模板延伸RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’端;从而产生包含3’衔接子区域的cDNA链。
在某些实施方式中,3’退火区域包含核糖核苷酸残基。在某些实施方式中,3’退火区域包含一个2’-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中,3’退火区域包含两个2’-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中,3’退火区域包含三个2’-氟核糖核苷酸。
在某些实施方式中,至少一个2’-氟核糖核苷酸是2’-氟核鸟嘌呤(2’fG)。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域中的任意的非-2’fG核糖核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸。在某些实施方式中,3’退火区域包含通用核苷酸碱基。在某些实施方式中,通用核苷酸碱基选自核糖苷(rI)和5’5-硝基吲哚(5’NI)。在某些实施方式中,3’退火区域包含简并核糖核苷酸碱基(rN)。
在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向上,选自:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向,为:rG-2’fG-2’fG。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向,为:2’fG-2’fG-2’fG。
在某些实施方式中,所述方法进一步包括扩增包括3’衔接子区域的cDNA链。
在某些实施方式中,TSO的5’衔接子区域进一步包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
在某些实施方式中,cDNA合成引物包括第二5’衔接子区域和3’RNA退火区域。
在某些实施方式中,cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
在某些实施方式中,TSO的5’衔接子区域包括第一扩增引物序列且cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括第二扩增引物序列,该方法还包括使用对第一和第二扩增引物序列有特异性的引物对,来对cDNA进行PCR。在某些实施方式中,第一和第二扩增引物序列相同。在某些实施方式中,第一和第二扩增引物序列不同。
在某些实施方式中,所述RNA模板选自:mRNA、包含miRNA的非编码RNA、siRNA、piRNA、lncRNA、和核糖体RNA。在某些实施方式中,所述RNA模板是mRNA。在某些实施方式中,所述mRNA具有连接在5'端的7-甲基鸟苷帽子结构。在某些实施方式中,所述mRNA模板在’端具有聚A尾。
在某些实施方式中,cDNA合成引物包括与聚A尾互补的3’聚T序列。在某些实施方式中,cDNA合成引物包括与至少一个目标RNA互补的3’序列。
在某些实施方式中,cDNA合成引物和TSO同时与RNA模板结合。
在某些实施方式中,cDNA合成引物和逆转录酶在cDNA合成条件下与RNA模板结合,形成预延伸混合物,以在与TSO结合之前产生RNA-cDNA中间体。
在某些实施方式中,在与TSO结合之前,孵育预延伸混合物10分钟至4小时。在某些实施方式中,在与TSO结合之前,孵育预延伸混合物30分钟至2小时。在某些实施方式中,在与TSO结合之前,孵育预延伸混合物约1小时。
本发明的方面包括一种用于从包含mRNA的样品生成包含衔接子的cDNA的方法,该方法包括:(a)获得包括具有3’聚A尾的mRNA的样品;(b)通过在cDNA合成条件下使样品与cDNA合成引物和逆转录酶接触,产生cDNA合成反应,其中cDNA合成引物包括3’聚T退火区域且逆转录酶在cDNA的3’端上添加3’末端核苷酸突出端;(c)使cDNA合成反应持续10分钟至4小时,以产生具有3'突出端的cDNA;(d)将模板转换寡核苷酸(TSO)添加到cDNA合成反应中,其中TSO包含5'衔接子区域和包含三个核糖核苷酸的3'退火区域,其中核糖核苷酸中的至少一个是2'-氟核糖鸟嘌呤(2'fG)核苷酸;并且(e)在允许TSO的3'退火区域退火至cDNA的3'突出端并且允许使用退火的TSO作为模板延伸cDNA的3'端的条件下孵育cDNA合成反应,从而产生含有衔接子的cDNA。
在某些实施方式中,3’退火区域包括一个2’fG核苷酸。在某些实施方式中,3’退火区域包括两个2’fG核苷酸。在某些实施方式中,3’退火区域包括三个2’fG核苷酸。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域中的任意的非2’fG核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核苷酸。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向上,选自:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向,为:rG-2’fG-2’fG。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向,为:2’fG-2’fG-2’fG。
在某些实施方式中,TSO的5’衔接子区域进一步包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
在某些实施方式中,cDNA合成引物包括第二5’衔接子区域和3’RNA退火区域。在某些实施方式中,cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
在某些实施方式中,TSO的5’衔接子区域包括第一扩增引物序列且cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括第二扩增引物序列,该方法还包括使用对第一和第二扩增引物序列有特异性的引物对,来对步骤(e)中产生的cDNA进行PCR。
在某些实施方式中,允许进行步骤(c)30分钟至2小时。在某些实施方式中,允许进行步骤(c)约1小时。
本公开的方面包含包括5’衔接子区域和3’退火区域的模板转换寡核苷酸(TSO),其中3’退火区域被配置为退火至RNA-cDNA中间体的cDNA链的3'突出端,其中TSO能够用作cDNA链3'端延伸的模板,其中3'退火区域包含至少一个2'-氟核糖核苷酸。
在某些实施方式中,3’退火区域包含核糖核苷酸残基。在某些实施方式中,3’退火区域包含一个2’-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中,3’退火区域包含两个2’-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中,3’退火区域包含三个2’-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中,至少一个2’-氟核糖核苷酸是2’-氟核鸟嘌呤(2’fG)。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域中的任意的非-2’fG核糖核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸。
在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向上,选自:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向,为:rG-2’fG-2’fG。在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向,为:2’fG-2’fG-2’fG。
在某些实施方式中,TSO的5’衔接子区域进一步包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
本公开的方面包含包括如本文所述的模板转换寡核苷酸(TSO)(例如,包括5’衔接子区域和3’退火区域的TSO,其中3’退火区域被配置为退火至RNA-cDNA中间体的cDNA链的3'突出端,其中TSO能够用作cDNA链3'端延伸的模板,其中3'退火区域包含至少一个2'-氟核糖核苷酸)的试剂盒。在某些实施方式中,所述试剂盒进一步包括cDNA合成引物。在某些实施方式中,cDNA合成引物包括5’衔接子区域和3’RNA退火区域。在某些实施方式中,cDNA合成引物的5’衔接子区域包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。在某些实施方式中,cDNA合成引物的3’RNA退火区域包括聚T序列。在某些实施方式中,cDNA合成引物的3’RNA退火区域包括与至少一个目标RNA互补的序列。在某些实施方式中,所述试剂盒进一步包括用于进行cDNA合成反应的试剂。
附图说明
图1示意性说明了使用模板转换方法将3'衔接子添加到聚A mRNA模板的cDNA的一般方法。
图2描述并入核酸的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、LNA核苷酸类似物、2'-O-甲基核糖核苷酸和2'-氟核糖核苷酸的一般结构。波浪线表示每个核苷酸连接到多核苷酸链中先前或后续碱基的位置。
图3示意性地描绘了具有5'衔接子区域和3'退火区域的示例性TSO,其包括核糖核苷酸和2'-氟核糖核苷酸的各种组合。
图4的上图显示了比较使用不同TSO生成的cDNA总量结果的图表。下图显示得到的cDNA的序列分析结果。
图5说明了改变向cDNA合成反应中添加TSO的时间的效果。上图显示了从实验中产生的总cDNA图,其中在0、30、45或60分钟后添加三种不同TSO中的一种。下图显示用不同TSO在各个时间点获得的全长非嵌合(FLNC)读数百分比。
图6显示了在扩增前清洗cDNA的效果。上图显示了在使用和不使用cDNA清理的情况下进行的反应的cDNA产量。上图显示FLNC读数的百分比,以及5'-5'TSO和3'-3'RT引物读数的百分比(表示不需要的产物)。
示意图不一定按比例绘制。
发明详述
除非另有说明,否则本发明的实施可采用本领域技术范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术和描述。这类常规技术包括聚合物阵列合成、杂交、连接、噬菌体展示和用标记检测杂交。可以通过参考下面的示例来获得适当技术的具体说明。然而,当然,也可以使用其他等效的常规方法。这些常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到,如《基因组分析:实验室手册》(GenomeAnalysis:A Laboratory Manual)第1-4卷,《使用抗体:实验室手册》(Using Antibodies:Alaboratory Manual),《细胞:实验室手册》(Cells:A laboratory Manual),《PCR引物:实验室手册》(PCR Primer:A Laboratory Manual)(均来自冷泉港实验室出版社);Stryer,L.(1995)生物化学(第四版)Freeman,纽约,Gait;《寡核苷酸合成:一种实用的方法》(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)1984,IRL出版社,伦敦;Nelson和Cox(2000);Lehninger,《生物化学原理》(Principles of Biochemistry)第三版,W.H.Freeman出版社,纽约州纽约;Sambrook等《分子克隆:实验室手册》(MolecularCloning-A Laboratory Manual)第三版,第1-3卷,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,2000;以及Ausubel等编的《分子生物学试验指南》(Current Protocols in Molecular Biology),F.M.,John Wiley&Sons出版公司(补充至2020年),出于所有目的,通过引用将其全部并入本文。
注意,如本文和所附权利要求中所使用,单数形式的“一”、“一个”以及“该”包括复数引用,除非上下文另外明确地指出。应注意到,本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义,除非另有明确说明。因此,例如,提到“一种聚合酶”可以指一种试剂或试剂的混合物,而提到“一种方法”可包括引用本领域技术人员已知的等价步骤和方法等。
除非另外定义,否则,本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。本文提及的所有出版物通过引用并入本文中,以描述和公开在出版物中描述的并且可结合本发明使用的装置、组合物、制剂和方法。
应理解,提供数值范围时,除非上下文中另有明确说明,该范围上下限之间、以下限单位的十分之一为间隔的各间插数值,以及所述范围的任何其它所述或间插数值均包括在本发明范围内。这些较小范围的上下限可独立地包括在所述较小范围中,也包括在本发明范围中,除非所述范围中存在任何明确排除的界限。所述范围包括一个或两个限值时,排除这一个或两个所包括限值的范围也包括在本发明范围中。
在以下描述中,阐述了许多具体细节以便更好地理解本发明。然而,对于本领域技术人员来说显而易见的是,可以在没有这些特定细节中的一个或多个的情况下实施本发明。在其它情况下,为了避免混淆本发明,并没有描述本领域技术人员熟知的公知特征和方法。
如本文所用,术语“包括”意指组合物和方法包括所述元件,但不排除其它元件。“基本上由……构成”用于定义成分和方法时,应指排除对成分或方法具有任何重要意义的其他元件。“由……构成”是指排除所声称的组合物和实质性方法步骤中超出痕量元件的其他成分。由这些过渡术语中的每一个所定义的实施例在本发明的范围内。因此,所述方法和组合物可以包括附加步骤和组合物(包括),或者可选地包括无意义的步骤和组合物(基本上由……构成),或者可选地仅意图说明所述方法步骤或组合物(由……构成)。
所有数字名称,如pH值、温度、时间、浓度和分子量,包括范围,均为近似值,除非另有说明,否则可变化±0.1个单位。应理解的是,尽管并非总是明确说明,但所有数字名称前面都有“约”一词。除了“X”的微小增量(如“X+0.1”或“X–0.1”)之外,术语“约”还包括精确值“X”。还应理解,尽管并非总是明确说明,但本文所述试剂仅为示例性试剂,且本领域已知此类试剂的等效物。
本文中的“核酸”或“多核苷酸”或语法上的等价物指至少两个共价连接在一起的核苷酸。本发明的核酸通常包含磷酸二酯键,尽管在某些情况下,包括可能具有替代骨架的核酸类似物,其包括例如磷酰胺、硫代磷酸、二硫代磷酸和肽核酸骨架和连接。其他类似核酸包括具有带正电骨架、非离子骨架和非核糖骨架的核酸,包括美国专利第5235033及5034506号中所述的核酸。
“模板转换寡核苷酸”或“TSO”(也称为“模板开关寡核苷酸”)是指在核酸聚合反应期间聚合酶从初始模板(例如,如本文所述的模板mRNA)转换到的寡核苷酸模板。TSO可包括一个或多个经修饰或非天然存在的核苷酸(或其类似物)。例如,模板转换寡核苷酸可包含一种或多种核苷酸类似物(例如,LNA,FANA,2'-O-甲基核糖核苷酸,2'-氟核糖核苷酸等),连接修饰(例如,硫代磷酸酯,3'-3'和5'-5'反向连接),5'和/或3’端修饰(例如,5'和/或3'氨基,生物素,DIG,磷酸盐,硫醇,染料,淬灭剂等),一个或多个荧光标记的核苷酸,或为模板转换寡核苷酸提供所需功能的任何其他特征。
如本文所述,“寡核苷酸”是长度为2至500个核苷酸、例如2至200个核苷酸的核苷酸的单链多聚体。寡核苷酸可以被合成或被酶促制备,并且,在一些实施方式中,长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可包括核糖核苷酸单体或其修饰的形式,脱氧核糖核苷酸单体或其修饰的形式,或核糖核苷酸单体和脱氧核糖核苷酸单体或其修饰形式的组合,例如,如本文所述的某些TSO。寡核苷酸的长度例如可以为10至20,21至30,31至40,41至50,51-60,61至70,71至80,80至100,100至150或150至200,多至500或更多个核苷酸。
如本文所述,“基本相同”的核酸是与参考核酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核酸。比较的长度优选为核酸的全长,但通常至少为20个核苷酸、30个核苷酸、40个核苷酸、50个核苷酸、75个核苷酸、100个核苷酸、125个核苷酸或更多。
如本文所用,术语“逆转录酶”定义为催化从RNA模板形成DNA的酶。在本公开的许多方面,逆转录酶是可用于从RNA模板合成第一链cDNA的DNA聚合酶。可以使用任何RNA模板,包括信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小核RNA(snRNA)、小非编码RNA(sncRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、循环游离RNA(cfRNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)、核糖体RNA(rRNA)、病毒RNA、总RNA等。
如本文所述,如果两个序列(或两个更大序列的亚区)能够彼此杂交以形成反平行的双链核酸结构,其中双链核酸结构的第一链的每个碱基与其第二链的相应碱基形成氢键,则称两个序列彼此“完全互补”或“完美互补”。例如,对于天然存在的DNA,dA与dT互补,dC与dG互补。因此,DNA序列5'-AGCT-3'与DNA序列5'-AGCT-3'完全互补。需要注意的是,两个序列不需要完全互补才能彼此杂交。两条核酸链杂交所需的条件(温度、孵育时间和缓冲液成分,通常称为杂交反应的“严格度”)通常由本领域技术人员确定并且部分基于杂交区域的长度、杂交区域内两条链之间的互补水平以及样品的复杂性。
在描述本文公开的方法的方面时,将参考附图。应当理解,附图仅图示了所公开方法的具体实施例并且不旨在进行限制。
通用的模板转换方法
本公开内容涉及使用模板转换寡核苷酸(TSO)改善从RNA模板产生cDNA的组合物和方法。得到的cDNA包括一个3'衔接子序列。在某些实施方式中,本文详述的组合物和方法可用于从含有少量总RNA或聚A+RNA的样品产生聚A mRNA模板的全长cDNA拷贝,包括来自含有1皮克(pg)至5微克(μg)总RNA的样品。在一些实施方式中,来自单个细胞的RNA用作RNA模板。通常可以使用文献中描述的方案和方法(例如,Sambrook和Ausubel)以及市售的mRNA分离试剂盒从几乎任何来源中分离mRNA,所述mRNA分离试剂盒例如有RNeasy Mini试剂盒(凯捷公司(Qiagen)),mRNA-ONLYTM原核mRNA分离试剂盒和the mRNA-ONLYTM真核mRNA分离试剂盒(艾比森得生物技术公司(Epicentre Biotechnologies)),FastTrack 2.0mRNA分离试剂盒(英杰公司(Invitrogen)),和Easy-mRNA试剂盒(生物链公司(Biochain))。此外,来自各种来源(例如牛、小鼠和人)和组织(例如脑、血液和心脏)的mRNA可从例如生物链公司(加利福尼亚州海沃德)、安碧公司(Ambion)(德克萨斯州奥斯汀)和克隆泰克公司(Clontech)(加利福尼亚州山景城)商购获得。
图1示出了使用模板转换方法将3'衔接子添加到聚A mRNA模板的cDNA、例如用于cDNA文库制备的一般方法的示意图。制备此类cDNA的一般方法可以在例如题为“使用模板转换寡核苷酸进行全长cDNA克隆的方法和组合物”的美国专利第5,962,272号;题为“用于生产产品核酸的基于模板转换的方法”的美国专利第9,410,173号,和题为“用于在模板转换期间防止串联的方法和组合物”的美国专利申请公开号2018/0037884中找到;每一个在此通过引用整体并入本文。
在图1的步骤1中,提供含有聚A mRNA101的样品,并在允许cDNA合成引物与mRNA模板中的关联位点杂交并从杂交的cDNA合成引物合成cDNA链103的条件下与cDNA合成引物102结合。通常,mRNA/cDNA合成引物混合物将包括逆转录酶、dNTP(dATP、dCTP、dTTP和dGTP的组合)和促进逆转录的缓冲液成分。图1中的cDNA合成引物包括两个结构域:(i)5'衔接子区域104,和(ii)3'mRNA杂交区域105(有时称为引发区域)。在此注意,在某些实施方式中,cDNA合成引物不包括结构域104、5'衔接子区域,因此可以由引发区域构成或仅包含引发区域。因此,5'衔接子区域104是由用户自行决定采用的任选的元件。此外,虽然图1中的mRNA杂交区域105显示为设计为与样品中mRNA的聚A尾杂交的聚T序列,但可以使用设计为与样品中一个或多个RNA模板中的其他已知区域杂交的其他序列。逆转录酶将第一链cDNA合成到mRNA模板的5'端,并且在本实例中,将三个非模板化的dC残基添加到第一链cDNA的3'端,从而产生3'突出端区域106(值得注意的是,在一些实施方式中,聚合酶可能能够并入任何数量的非模板化碱基,包括在新生cDNA链3'端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或多个额外核苷酸)。这个过程产生了第一mRNA/cDNA复合物107。各种具有逆转录酶活性和末端转移酶活性的DNA聚合酶都可用于这一步骤。实例包括源自生物体的DNA聚合酶,例如嗜热细菌和古细菌、逆转录病毒、酵母、脉孢菌、果蝇、灵长类动物和啮齿动物。在一些实施方式中,DNA聚合酶分离自莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)(例如,如美国专利号4,943,531中所述,在此通过引用整体并入)或缺乏RNaseH活性的M-MLV逆转录酶(例如,如美国专利第5,405,776号中所述,在此通过引用全文并入)、人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)、牛白血病病毒(BLV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、水生栖热菌(Taq)或嗜热栖热菌(Tth)(例如,如美国专利第5,322,770号中所述,在此通过引用全文并入)。这些DNA聚合酶可以从生物体本身中分离出来,或者在某些情况下,可以从商业上获得。适用于本发明的DNA聚合酶也可以从表达编码聚合酶的克隆基因的细胞中获得。使用各种逆转录酶的合适反应条件是本领域公知的。
这里要注意的是,虽然可以使用单个DNA聚合酶来产生cDNA链103和突出端区域106,但在本公开的某些实施方式中,cDNA链103的合成是由DNA聚合酶进行的,而突出端区域106的添加由具有3'端转移酶活性的单独酶进行。这样的酶的实例包括但不限于:末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)、DNA聚合酶θ、Klenow片段(3'→5'exo-)、Taq DNA聚合酶等。
在图1的步骤2中,模板转换寡核苷酸(TSO)108与包含以下的mRNA/cDNA复合物结合:(i)3'-端核苷酸序列(也称为退火区域),此处以三个核糖鸟嘌呤残基(rGrGrG)109为例,它可以与mRNA/cDNA复合物107的cDNA链的3'突出端106退火以及(ii)5’衔接子区域110。一旦TSO 108与3'突出端106退火,反转录酶就会从复制mRNA模板101“转换”到复制TSO108,其间还包括3'突出端106的非模板化核苷酸。这产生了一条连续的cDNA链111,在5'到3'方向包含:(i)衔接子区域104,(ii)聚T区域,(iii)mRNA模板的互补物,(iv)非模板化的核苷酸,以及(v)衔接子区域110的互补物(该互补物可称为cDNA上的3’衔接子区域)。该cDNA链111可以保持与第二mRNA/cDNA复合体112中的模板mRNA杂交。
如上所述,虽然图1所示实施方式中的起始RNA是mRNA,但任何感兴趣的RNA都可以用作起始模板。在这些实施方式中的一些中,3’聚A区域不存在,因此需要设计使用的cDNA合成引物以在不同的所需位置(例如,RNA模板3'末端的序列或RNA模板的其他所需内部序列)进行引发。在进一步的实施方式中,可以将核苷酸添加到RNA模板的3'端以产生cDNA合成引物退火的区域。可以使用任何方便的方法将已知序列的区域添加到模板RNA的3'端,例如,使用一种或多种不依赖模板的聚合酶(参见,Georges Martin和Walter Keller 2007“RNA-specific ribonucleotide transferases”RNA 13:1834-1849,其全部内容通过引用整体并入本文)或通过连接合成寡核苷酸来添加所需的多核苷酸。不意图在这方面进行限制。
虽然图1中的实施方式显示的是单个RNA模板,但该过程最常用于包含一组RNA模板的样品,例如,来自一个或多个感兴趣来源的一组RNA模板(如本文别处所讨论)。
一旦获得,cDNA链111可用于用户感兴趣的任何下游过程。
例如,在某些实施方式中,cDNA链111经历扩增反应,例如使用一种或多种对衔接子区域104和110中的序列有特异性的扩增引物。这样的扩增过程,例如PCR(聚合酶链式反应)、等温扩增等,可以产生对下游应用(例如测序(在本文别处进一步详细讨论))有用的产物。
修饰的模板转换寡核苷酸(TSO)和使用方法
本公开提供了修饰的TSO和使用其从RNA模板生成含有3'衔接子的cDNA的方法。具体地,本公开的修饰的TSO在3'退火区域中包括至少一个2'-氟核糖核苷酸。在某些实施方式中,使用此类修饰的TSO的方法包括在孵育期例如约10分钟至4小时或更长时间后将它们添加到cDNA合成反应中。如本文所述,在修饰的TSO的3'退火区域中包含一个或多个2'-氟核糖核苷酸导致反应中产生的含有3'衔接子的cDNA产物的量增加。这对于具有低输入水平的RNA的样品特别有用,例如,从大约1pg到1μg或来自单个细胞的RNA。
鉴于上述,本公开内容的方面包括通过在cDNA合成条件下将RNA模板与cDNA合成引物、本公开内容的TSO和逆转录酶结合来产生具有3'衔接子区域的互补DNA(cDNA)链的方法。TSO包括一个5'衔接子区域和一个3'退火区域,该区域包含至少一个2'-氟核糖核苷酸。反应中的cDNA合成引物被设计为与RNA模板(通过cDNA合成引物中的3'引发区域)退火,逆转录酶延伸退火的cDNA合成引物,从而产生RNA-cDNA中间体。反应中使用的逆转录酶可以是将非模板化的核苷酸添加到新合成的cDNA的3'端的逆转录酶,因此RNA-cDNA中间体的cDNA链具有3'突出端。然而,在一些实施方式中,反应混合物中包含第二种酶(例如,TdT、DNA聚合酶θ、Klenow片段(3'→5'exo-)、TaqDNA聚合酶等),其作用是将非模板化的碱基添加到cDNA链的3'端。cDNA链的3'突出端可以具有不同的碱基组成,例如dA、dG、dT和dC碱基的任意组合,并且可以具有不同的长度。然而,通常,cDNA链上的3'突出端长度为2到6个碱基,例如2、3、4、5或6个碱基,并且主要由dC残基组成。虽然对于许多实施方式,3’突出端将被认为具有3个dC碱基(dC-dC-dC),但也涵盖将cDNA中3’突出端构型的变化考虑在内的修饰TSO。在产生具有3'突出端的cDNA链后,修饰的TSO(即,包含至少一个2'-氟核糖核苷酸)的3'退火区域与RNA-cDNA中间体的3'突出端退火,并且逆转录酶使用退火的TSO作为模板延伸RNA-cDNA中间体的cDNA链的3'端。虽然不受理论的束缚,但似乎在TSO的退火区域中至少一个2'-氟核糖核苷酸的存在改善了TSO与cDNA链的3'突出端的退火,从而提高了cDNA产量。
修饰的TSO的实例
如上所述,用于生成具有3'衔接子区域的cDNA的TSO包括至少两个区域:(i)5’衔接子区域和(ii)3’退火区域(分别为元件110和109,如图1所描述)。本公开的修饰的TSO的3’退火区域在3’退火区域中包含至少一个2’-氟核糖核苷酸。
图2显示了本公开中讨论的几种核苷酸种类的结构:脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸类似物、2’-O-甲基核糖核苷酸、和2’-氟核糖核苷酸。波浪线表示当存在于多核苷酸链中时,每个核苷酸连接到前一个碱基(通过连接到5'C的氧)或后续碱基(通过连接到3'C的磷酸盐)的位置。
图3显示了具有5'衔接子区域110和3'退火区域109的示例性TSO结构。虽然TSO的退火区域可包括例如3至6个核苷酸残基,如上所述,但图3中的TSO具有3'退火区域,包含三个核糖核苷酸残基,以5'到3'方向命名为N1-N2-N3。N1到N3中的至少一个是2'-氟核糖核苷酸。因此,图3的退火区域109可具有一个2’-氟核糖核苷酸、两个2’-氟核糖核苷酸、或三个2’-氟核糖核苷酸。图3显示了退火区域中核糖核苷酸(图3中的r)和2'-氟核糖核苷酸(图3中的2'fr)相对于N1到N3的可能方向。如图所示,图3中所示的3核苷酸退火区域可以具有一个2'-氟核糖核苷酸(N1、N2或N3是2'-氟核糖核苷酸)、两个2'-氟核糖核苷酸(N1和N2、N1和N3、或N2和N3是2'-氟核糖核苷酸)或三个2'-氟核糖核苷酸(N1、N2和N3是2'-氟核糖核苷酸)。
在某些实施方式中,退火区域中的2'-氟核糖核苷酸是2'-氟-核糖鸟嘌呤(2'fG)残基(也称为2'-氟-核糖鸟苷)。在某些实施方式的一些中,TSO的3’退火区域中的任意的非-2’fG核糖核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸(也称为核糖鸟苷)。
虽然在一些实施方式中优选在退火区域使用2'fG和rG残基,但也可以使用其他2'-氟核糖核苷酸和核糖核苷酸。例如,3'退火区域可以包括核糖腺嘌呤(rA)、核糖胞嘧啶(rC)和/或核糖尿嘧啶(rU),或其2'-氟修饰的对应物。在一些实施方式中,3’退火区域包含通用核苷酸碱基,例如核糖肌苷(rI)和/或5’5-硝基吲哚(5’NI)。在更进一步的实施方式中,可以合成TSO使得3'退火区域包括简并核糖核苷酸碱基(rN),从而产生其中rN是所需核糖核苷酸选择(例如,rA、rC、rG和rU,或其任何所需的组合)之一的TSO群体。
在某些实施方式中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向,为以下之一:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。
除了3'退火区域之外,TSO还包括一个5'衔接子区域。该区域可以包括用户希望使用本文所述方法连接到cDNA 3'端的任何序列。类似地,在某些实施方式中,在cDNA合成反应中使用的cDNA合成引物可以包括用户希望连接到cDNA5'端的任何所需序列/修饰。无意限制该结构域的序列或其中存在的修饰。
在某些实施方式中,TSO的5’衔接子区域包括以下的一个或多个:条形码序列、唯一分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、纳米孔测序衔接子、捕获引物序列(或其他捕获部分)、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。在一些实施方式中,5’衔接子区域至少包含条形码序列和扩增引物序列。5’衔接子区域任选地包含至少两个核苷酸,例如2-100个核苷酸或5-50个核苷酸。
一般而言,条形码序列是一种核苷酸序列,用于对衍生特定核酸或其拷贝的样品(在这种情况下为RNA模板/cDNA)进行阳性鉴定。例如,如果对5个不同的RNA样品进行如本文所述的5个不同的cDNA合成反应,则用于5个不同反应中的每一个的TSO可以在5'衔接子区域包含一个条形码序列,该序列不同于其他4个TSO中的所有条形码序列。示例性的有用的条形码是本领域已知的(例如,参见github(dot)com/PacificBiosciences/Bioinformatics-Training/wiki/Barcoding上的384个条形码序列),并且如果需要可以设计额外的条形码。
通常,唯一分子标识符(UMI)是用于将单个核酸分子彼此区分开的核苷酸序列。UMI可以与它们相关联的核酸分子一起被测序(或以其他方式检测)以确定读取序列是一种源DNA分子的序列还是另一种。
通常,扩增引物序列是设计用于提供位点的核酸序列,核酸合成引物与该位点退火以启动聚合酶的核酸合成,例如用于核酸的线性或非线性扩增,例如在PCR中。扩增引物序列或其互补物和其同源扩增引物因此具有足够的互补性以在进行的扩增反应的条件下杂交。对于图1所示的实例,可以进行PCR,例如使用包含来自衔接子区域110(与cDNA链111互补,其中包括衔接子区域110的互补物)的序列的正向引物和包含来自衔接子区域104的序列的反向引物。
一般而言,测序引物序列是设计用于提供测序引物退火以启动边合成边测序(SBS)反应的位点的核酸序列。测序引物序列或其互补物和其同源测序引物因此具有足够的互补性以在进行的测序反应的条件下杂交。
一般而言,纳米孔测序衔接子是用于纳米孔测序过程中的核酸序列,并且可以包括促进纳米孔测序反应的附加结合组分,例如结合酶(例如解旋酶、聚合酶或其他马达蛋白)、膜结合部分(例如,胆固醇)等。
通常,捕获引物序列是设计用于提供捕获引物退火到的位点的核酸序列,目的是将衔接子相关核酸与非衔接子相关核酸分离,例如通过将捕获引物固定到固体表面或基质上。捕获引物序列或其互补物和其同源捕获引物因此具有足够的互补性以在进行的捕获程序的条件下杂交。值得注意的是,基于非核酸的捕获部分可以连接到TSO(或其他寡核苷酸,例如cDNA合成引物)以用于分离连接到其上的核酸,其中在一些实施方式中,捕获部分是结合对(例如,生物素、亲和素、链霉亲和素、地高辛、抗体结合域、抗原等)的成员。例如,捕获部分可以以生物素化核苷酸的形式位于衔接子区域中;然后可以通过与亲和素或链霉亲和素结合来分离得到的含有衔接子的cDNA。
通常,序列特异性核酸酶切割位点是一种核酸序列,它是同源核酸酶的识别位点,可识别该序列并切割该核酸(一条或两条链),例如限制性内切酶、切口酶、在尿嘧啶碱基位点产生单核苷酸缺口的尿嘧啶特异性切除试剂(USER),或工程化核酸酶/切口酶。工程化核酸酶/切口酶的实例包括但不限于RNA导向的核酸内切酶(例如,CRISPR-Cas系统,例如Cas9和Cpf1DNA核酸内切酶)、人工限制酶(例如,TAL效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN))及其变体。
通常,修饰的核苷酸是一种与DNA或RNA核苷酸相比具有修饰的化学结构的核苷酸(例如,甲基化碱基、PNA(肽核酸)核苷酸、LNA(锁核酸)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸等)。
通常,5'修饰是对TSO衔接子区域的5'末端的任何修饰。例如,可以修饰5'末端以保护其免受核酸酶降解或允许其检测,例如通过连接至可检测部分,例如荧光染料。
这里要注意的是,类似于本公开的TSO,在其中cDNA合成引物(除了其3'RNA退火区域之外)还包括其自己的5'衔接子区域的实施方式中,该第二5'衔接子区域也可以包括以下一种或多种:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、纳米孔测序衔接子、捕获引物序列(或其他捕获部分)、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰(类似于TSO的5'衔接子区域)。cDNA合成引物的任何此类条形码序列、引物序列和/或其他特征可以独立地与TSO上的那些相同或不同。
在一些实施方式中,TSO的5'衔接子区域包括第一扩增引物序列且cDNA合成引物的5'衔接子区域(第二5'衔接子区域)包括第二扩增引物序列。在此类实施方式中,可以通过使用对第一和第二扩增引物序列有特异性的引物对进行PCR来扩增TSO反应中产生的cDNA,其在其3'端包括TSO的5'衔接子区域的互补物。虽然第一和第二扩增引物序列位于cDNA合成反应产物的相对末端,但它们可以被设计为允许使用单个扩增引物进行扩增,例如通过进行PCR。在其他实施方式中,第一和第二扩增引物序列被设计为与具有不同序列的扩增引物退火,因此需要两种不同的扩增引物来通过PCR扩增产物。调整这样的序列取决于用户的需要。
在一些实施方案中,TSO包括防止聚合酶在合成TSO 5'端(例如TSO的5'衔接子序列)的互补物后从TSO转换为不同模板核酸的修饰。有用的修饰包括但不限于无碱基损伤(例如,四氢呋喃衍生物)、核苷酸加合物、异核苷酸碱基(例如,异胞嘧啶、异鸟嘌呤和/或类似物)及其任何组合。
在另外的实施方式中,TSO包括3'修饰或修饰的核苷酸,使其不能用作核酸合成引物(即,当与模板多核苷酸退火时,它不能启动核酸合成)。例如,TSO可以包括3'-脱氧核苷酸种类(例如,双脱氧核苷酸、2'-氟-3'-脱氧核苷酸,例如2'-氟-3'-脱氧核糖鸟苷等)。
寡核苷酸,包括用作TSO或引物的寡核苷酸,可以使用本领域公知的技术合成或可以从多种商业供应商中的任一个购买。
RNA模板
根据本文所述的方法,可以使用任何感兴趣的RNA模板来产生cDNA产物。RNA模板的实例包括但不限于:信使RNA(mRNA)、非编码RNA、微小RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、Piwi相互作用RNA(piRNA)、小核RNA(snRNA)、小非编码RNA(sncRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、循环游离RNA(cfRNA)、循环肿瘤RNA(ctRNA)、核糖体RNA(rRNA)、病毒RNA和总RNA。
在某些实施方式中,在执行本公开的方法之前富集RNA模板。可以在用于本文公开的方法之前富集上面列出的任何RNA模板。此外,可以使用这些不同RNA模板的任何方便的富集过程,包括阳性或阴性选择方法。富集可以基于RNA模板的任何所需特征,包括模板的大小/长度(通常称为大小选择)和/或特定核苷酸序列、结构域或模板中修饰的存在或不存在。例如,可以使用对序列、结构域或修饰有特异性的捕获部分来富集或消耗来自母体样品的特定RNA模板。捕获部分包括序列特异性RNA结合蛋白、与特定RNA序列互补的寡核苷酸引物、适体、抗体等。在这方面不意图进行限制。在一些实施方式中,可以使用一种或多种核酸酶消化或降解RNA样品中不需要的RNA模板。
在许多实施方式中,所述RNA模板是mRNA模板。mRNA可以存在于直接从来源获得的RNA样品中,因此存在大量其他类型的RNA(例如rRNA)。或者,mRNA可以来自已富集mRNA的样品,例如通过选择具有3'聚A尾或具有特定大小或编码序列的RNA。在许多实施方式中,所述mRNA在3’端具有聚A尾。在其它实施方式中,所述mRNA在5'端具有7-甲基鸟苷帽子结构。
还考虑到可以在任何下游分析(例如序列分析)之前富集根据本文描述的方法(即,使用如所述的经修饰的TSO)产生的cDNA。可以采用任何方便的富集方法,包括与上文概述的用于富集感兴趣的RNA模板的方法类似的方法(例如,使用捕获部分、核酸酶、大小选择等)。
使用修饰的TSO的方法
本公开描述了使用在其3'退火区域中具有至少一个2'-氟核糖核苷酸的TSO产生cDNA链的改进方法,如上文详细描述。
在一些实施方式中,该方法包括在cDNA合成条件下将RNA模板与cDNA合成引物(如上所述)和逆转录酶结合,使得cDNA合成引物与RNA模板退火,逆转录酶从退火的cDNA合成引物生成RNA-cDNA中间体。RNA-cDNA中间体的cDNA链包括由逆转录酶(或任选地由反应混合物中的第二酶,也如上所述)添加的3'突出端。TSO(优选如本文所述的经修饰的TSO)与反应结合,与cDNA合成引物同时或在预延伸期之后,通过TSO上的3'退火区域与RNA-cDNA中间体的3'突出端退火,逆转录酶使用退火的TSO作为模板延伸RNA-cDNA中间体的cDNA链的3'端。因此,将TSO上5'衔接子区域的互补物添加到cDNA链的3'端,以生成具有3'衔接子区域的cDNA。
如所指出的,在某些实施方式中,cDNA合成引物和TSO同时与RNA模板和逆转录酶结合。在替代实施方式中,cDNA合成引物和逆转录酶在cDNA合成条件下与RNA模板结合,形成预延伸混合物,以在与TSO结合之前产生RNA-cDNA中间体。在与TSO结合之前,可以将预延伸混合物孵育所需的任何时间(例如,5分钟至24小时,包括10分钟至4小时,30分钟至2小时,或约1小时),以完成cDNA合成(产生RNA-cDNA中间体)。
本公开的一个特定实施方式包括获得包含具有3'聚A尾的mRNA的样品,在cDNA合成条件下,通过将样品与具有3'聚T退火区域的cDNA合成引物和逆转录酶接触,产生cDNA合成反应,使cDNA合成反应进行5分钟到24小时,以产生具有3'突出端的cDNA,添加具有5'衔接子区域和具有至少一个2'-氟-核糖鸟嘌呤(2'fG)核苷酸的三核苷酸3'退火区域的TSO,在允许TSO的3'退火区域与cDNA的3'突出端退火并使用退火的TSO作为模板延伸cDNA的3'端的条件下孵育cDNA合成反应,从而产生含有衔接子的cDNA。
在本文所述的任何方法中,TSO的3’退火区域可包括一个2’fG核苷酸、两个2’fG核苷酸或三个2’fG核苷酸。另外,在一些实施方式中,TSO的3’退火区域中的任何非2’fG核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核苷酸。虽然在一些实施方式中优选在退火区域使用2'fG和rG残基,但也可以使用其他2'-氟核糖核苷酸和核糖核苷酸。例如,3'退火区域可以包括核糖腺嘌呤(rA)、核糖胞嘧啶(rC)和/或核糖尿嘧啶(rU),或其2'-氟修饰的对应物。在一些实施方式中,3’退火区域包含通用核苷酸碱基,例如核糖肌苷(rI)和/或5’5-硝基吲哚(5’NI)。在更进一步的实施方式中,可以合成TSO使得3'退火区域包括简并核糖核苷酸碱基(rN),从而产生其中rN是所需核糖核苷酸选择(例如,rA、rC、rG和rU,或其任何所需的组合)之一的TSO群体。本文描述的TSO的3'退火区域的实例在5'到3'方向上包括:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。
如上所述,TSO的5'衔接子区域还可以包括在下游应用中对用户有用的序列。非限制性实例包括以下一项或多项:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、纳米孔测序衔接子、捕获引物序列(或其他捕获部分)、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。除了3'RNA退火区域外,cDNA合成引物还可以包括一个5'衔接子区域(“第二”5'衔接子区域,TSO的5'衔接子区域是“第一”5'衔接子区域)。与第一5'衔接子区域一样,第二5'衔接子区域可以包括以下一个或多个:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、纳米孔测序衔接子、捕获引物序列(或其他捕获部分)、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。第二5'衔接子区域的任何此类条形码序列、引物序列和/或其他特征可以独立地与第一5'衔接子区域上的那些相同或不同。
在本公开的某些实施方式中,模板转换反应在单个细胞或小细胞群上进行,例如,在设计用于分析单细胞或小细胞群水平的基因表达的测定中。这些细胞可以与反应组分分开以任何方便的方式进行模板转换反应,例如,分离或以其他方式分类(例如,通过流式细胞术)到微量滴定板的孔或单独的管中,分离到乳液中的微流体液滴等。此类方法在转让给10X基因组学公司(10XGenomics,Inc.)的题为“Methods of Analyzing Nucleic Acidsfrom Individual Cells or Cell Populations”美国专利公开No.US20150376609和题为“Droplet-Based Method and Apparatus for Composite Single-Cell Nucleic AcidAnalysis”美国专利公开No.US20180030515中有所描述,这两个专利均通过引用整体并入本文。这些公开物还讨论了使用条形码和/或UMI来帮助分析单个细胞(或不同的小细胞群)的基因表达。因此,在这些实施方式中可以使用具有如本文所述的条形码和/或UMI序列的cDNA合成引物和/或TSO。
例如,来自单个细胞的mRNA可以通过将细胞与(i)连接有条形码cDNA合成引物的珠子、(ii)本公开的修饰的TSO、(iii)逆转录酶、和(iv)其他试剂(例如用于进行DNA合成)共同分配到一个分区(例如,乳液中的液滴)中进行分析。一旦被分配,细胞就会被裂解,同时条形码cDNA合成引物从珠子中释放出来(例如,通过分区中包含的还原剂的作用)。然后将分配的混合物置于cDNA合成引物的聚T片段与从细胞释放的mRNA的聚A尾杂交、且模板转换反应可以进行的条件下,如本文所详述,结果产生含有衔接子的合成产物(示意图示于图1)。该分区中单个mRNA分子的所有cDNA转录本将包含一个共同的条形码序列,即cDNA合成引物中的条形码。使用一组珠子的1:1对应对这种分配/模板转换反应进行多路复用,每个珠子都有一个具有独特条形码的cDNA合成引物,以及一个细胞群(即,单个细胞被单个珠分割)允许在逐个细胞的基础上分析mRNA表达。此外,用户可以在cDNA合成引物或修饰的TSO中包含UMI,以便在给定分区内由不同mRNA分子制成的cDNA将在这个独特的序列中发生变化。此外,在一些实施方式中,修饰的TSO不包括在乳液液滴中,而是在乳液破裂后(在cDNA合成后)添加,使得由不同细胞制成的cDNA具有相同的3'衔接子区域。
除了上述分配反应中cDNA合成引物和/或修饰的TSO中的条形码和/或UMI序列之外,可以存在其他功能序列,包括用于执行NGS测序反应的序列、例如Illumina测序反应,或有助于为特定测序平台生成模板的序列、例如促进测序衔接子连接的位点,例如用于SMRTTM测序(单分子实时测序)的发夹衔接子或用于纳米孔测序的衔接子。
下游过程和分析
根据本公开内容产生的cDNA可根据用户的需要用于任何数量的下游过程和/或分析。因此,不意图在这方面进行限制。以下实例仅用于说明目的。
在一些实施方式中,本公开的方法包括例如线性地或指数地(例如,使用PCR)扩增包含3'衔接子区域的cDNA链。因此,在一些实施方式中,进行第二链cDNA合成反应以产生单条双链DNA,其包括TSO和cDNA合成引物的5'衔接子区域,每端一个。该过程可能包括降解原始RNA模板(例如,使用具有RNaseH活性的酶)。在一些实施方式中,TSO和/或cDNA合成引物的5'衔接子区域可包括用作一种或多种扩增引物的结合位点的扩增引物序列。在该方法包括对生成的cDNA进行PCR的情况下,可以使用对这些扩增引物序列(也称为“第一”和“第二”扩增引物序列)有特异性的引物对。如PCR需要两个不同的扩增引物,则第一和第二扩增引物序列可以不同,或者如PCR只需要一个扩增引物,则可以相同。不意图在这方面进行限制。
在一些实施方式中,可将cDNA产物(在扩增或第二链合成之前或之后)连接到常规载体(包括质粒、粘粒、噬菌体或逆转录病毒载体等)或衔接子上,这些载体或衔接子可用于下游分析或过程,例如测序反应、转化到宿主细胞、体外复制等。在一些实施方式中,例如在第二链合成/扩增之后,(例如用于产生SMRTbellTM模板的)发夹衔接子(具有双链中央区域和两个发夹末端的环状核酸;加利福尼亚太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences ofCalifornia,Inc.))被连接到cDNA产物的末端。例如,在USPN 8,153,375“Compositionsand Methods for Nucleic Acid Sequencing”和Travers et al.(2010)Nucl.AcidsRes.38(15):e159中描述了通过连接茎-环衔接子来生产此类环状核酸,出于所有目的,每个都以全文引用的方式并入本文中。在衔接子与cDNA产物(或其扩增子)连接的情况下,末端可以被处理成与连接相容,例如,变成平端,用限制性酶消化,留下与衔接子的末端相容的末端等,如本领域公知的。不意图在这方面进行限制。
在任何下游过程或分析之前,可对根据本文所述方法产生的cDNA产物进行纯化步骤。此步骤可以去除多余的可能会对所需的下游过程或分析产生负面影响的引物、核苷酸、缓冲液成分等。一个例子是使用大小选择性纯化系统(普洛麦格公司(Promega)),这是一种基于磁性树脂的纯化系统,用于选择双链DNA。
组合物和试剂盒
本公开还提供了包含如本文所述的修饰的TSO的组合物,包括反应混合物。因此,主题组合物可以进一步包括,例如,一种或多种以上关于主题方法描述的任何反应混合物组分。例如,组合物可以进一步包括一种或多种模板RNA(例如mRNA)、逆转录酶、dNTP、缓冲液和辅助因子(例如盐、金属辅助因子等)、一种或多种酶稳定成分(例如DTT)和/或任何其他所需的反应混合物组分。
在某些方面,主题组合物包含模板核糖核酸(RNA)和本公开内容的修饰的TSO,其各自与核酸链(例如,由逆转录酶合成的cDNA链)的相邻区域杂交。模板RNA可以是任何感兴趣的模板RNA,例如,如上所述的mRNA。
主题组合物可以存在于任何合适的环境中。根据一个实施方式,该组合物存在于反应管(例如,0.2mL管、0.6mL管、1.5mL管等)或孔中。在某些方面,组合物存在于两个或更多个(例如,多个)反应管或孔(例如,板,例如96孔板)中。管和/或板可由任何合适的材料制成,例如聚丙烯等。在某些方面,其中存在组合物的管和/或板为组合物提供有效的热传递(例如,当放置在加热块、水浴、热循环仪等中时),使得组合物的温度可以在短时间内改变,例如根据发生特定酶促反应所必需的。根据某些实施方案,组合物存在于薄壁聚丙烯管或具有薄壁聚丙烯孔的板中。在某些实施方式中,反应在固体表面或珠子上发生可能是方便的。在这种情况下,可以通过本领域已知的方法(例如生物素连接或共价连接)将修饰的TSO或一种或多种引物连接到固体支持物或珠子上,并允许在支持物上进行反应。
本发明组合物的其他合适环境包括例如微流体芯片(例如“芯片实验室装置”)。组合物可存在于配置成使组合物达到所需温度的仪器中,例如温控水浴、加热块等。配置为使组合物达到所需温度的仪器可配置为使组合物达到一系列不同的所需温度,每个温度具有合适的时间段(例如,仪器可以是热循环仪)。
本发明还包括试剂盒,其包括一种或多种如本文所述的修饰的TSO。在某些实施方式中,主题试剂盒是cDNA文库构建试剂盒,其中在某些实施方式中,该试剂盒包括修饰的TSO和一种或多种用于进行cDNA合成反应的额外试剂。因此,主题试剂盒可以包括,例如,一种或多种以上关于主题方法描述的任何反应混合物组分。例如,试剂盒可包括模板RNA(例如,mRNA)、cDNA合成引物(如本文所述,例如,具有5'衔接子区域和3'RNA退火区域、例如聚T序列或与至少一种感兴趣的目标RNA互补的序列)、逆转录酶、dNTP、缓冲液和辅助因子(例如,盐、金属辅助因子等)、一种或多种酶稳定成分(例如,DTT)和/或用于进行cDNA合成反应的任何其他所需试剂中的一种或多种。此外,主题试剂盒可包括用于执行任何所需下游过程或分析的试剂和/或酶,包括PCR引物对、扩增引物(例如,用于线性扩增)、衔接子、测序引物、DNA聚合酶(例如,用于PCR的热稳定聚合酶)、限制性核酸内切酶、连接酶、或其任何组合。还可以包括其他所需的试剂盒组件,例如容器和/或固体支持物,例如管、珠、微流体芯片等。
根据一个实施方式,主题试剂盒包括逆转录酶、具有5'衔接子区域和3'聚TRNA退火区域的cDNA合成引物、dNTP、以及具有5'衔接子区域和3'退火区域的修饰的TSO(其中包括至少一个2'-氟核糖鸟嘌呤)。
根据另一个实施方式,主题试剂盒包括逆转录酶、具有5'衔接子区域和3'聚T RNA退火区域的cDNA合成引物、dNTP、以及具有5'衔接子区域和3'退火区域的修饰的TSO(其中包括至少一个2'-氟核糖鸟嘌呤),以及对cDNA合成引物和修饰的TSO的5'衔接子区域中的合成引物位点有特异性的PCR引物对。
根据又一个实施方式,主题试剂盒包括逆转录酶、具有5'衔接子区域和3'聚T RNA退火区域的cDNA合成引物、dNTP、以及具有5'衔接子区域和3'退火区域的修饰的TSO(其中包括至少一个2'-氟核糖鸟嘌呤),以及对cDNA合成引物和修饰的TSO的5'衔接子区域中的合成引物位点有特异性的PCR引物对,一个或多个衔接子,和连接酶。在这些实施方式的一些中,衔接子是发夹衔接子,例如,如在来自加利福尼亚太平洋生物科学公司的SMRTTM测序(单分子实时测序)中所采用的。在其他实施方式中,衔接子是用于纳米孔测序的衔接子,例如用于在牛津纳米孔测序平台上测序的衔接子,例如MinION、PromethION、GridION等。
如上文详细描述的,主题试剂盒中的修饰的TSO和/或cDNA合成引物可以在5'衔接子区域中包含一个或多个有用的结构域/序列,例如用于在实施主题方法或任何感兴趣的下游应用时使用。在某些方面,TSO和/或cDNA合成引物的5'衔接子区域可包括用于例如第二链合成反应、PCR扩增、克隆、测序、条形码、分子鉴定等的序列。因此,TSO和/或cDNA合成引物的5'衔接子区域任选地包含以下一种或多种:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、纳米孔测序衔接子、捕获引物序列(或其他捕获部分)、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
在某些实施方式中,试剂盒包括用于从核酸来源分离RNA的试剂。该试剂可适用于从多种来源分离RNA,包括单细胞、培养细胞、组织、器官或生物体。主题试剂盒可包括用于从固定细胞、组织或器官,例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中分离RNA样品的试剂。此类试剂盒可包括一种或多种脱蜡剂、一种或多种适用于使核酸去交联的试剂和/或类似物。
主题试剂盒的组分可以存在于单独的容器中,或者多种组分可以存在于单个容器中。例如,cDNA合成引物和逆转录酶缓冲液可以在不同的容器中提供,或者可以在单个容器中提供。在某些实施方式中,一种或多种试剂盒组分以冻干形式提供,使得这些组分随时可用并且可以方便地在室温下储存。
除了上述组分之外,主题试剂盒还可包括使用试剂盒组分的说明书,例如,用于实施主题方法。实施本发明方法的说明书通常记录在合适的记录媒介上。例如,说明书可以印刷在基材上,例如纸或塑料等。因此,说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒或其组件的容器标签中(即,与包装或子包装相关联)等。在其他实施方式中,说明书作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质上,例如CD-ROM、磁盘、硬盘驱动器(HDD)等。在其他实施方式中,试剂盒中不存在实体说明书,但提供了从远程来源(例如通过互联网)获得说明书的方式。该实施方式的实例是包括可以查看说明书和/或可以从其下载说明书的网址的试剂盒。就说明书而言,获得说明书的手段记录在合适的基材上。
实施例
通过说明的方式,而非限制性方式提供以下实施例。
实施例1:修饰的TSO的评估
在本实施例中,在SMRTTM测序(单分子实时测序)反应中,就其总cDNA生产和全长序列的产生而言,比较了七种不同的TSO。七个TSO具有七个不同的3'退火区域和相同的5'衔接子区域。3'退火区域各有三个核苷酸,具有不同的修饰核苷酸组成。3’退火区域的序列如下(从5’到3’方向):(i)rG-rG-rG;(ii)rG-rG-+G;(iii)rG-rG-fG;(iv)fG-fG-fG;(v)rG-rG-mG;(vi)rG-mG-mG;和(vii)mG-mG-mG;其中rG是核鸟嘌呤(无修饰),+G是锁核酸(LNA)鸟嘌呤,fG是2’-氟核鸟嘌呤,并且mG是2’-O-甲基鸟嘌呤(参见图2中的结构)。TSO的5'衔接子区域包括正向PCR引物序列,而cDNA合成引物(RT引物)包括一个带有反向PCR引物序列的5'衔接子区域。这些序列允许使用同源正向和反向PCR引物(如下所述)进行扩增。
下面以5'到3'方向提供了不同核酸试剂的序列。RT引物和反向PCR引物来自单细胞/低输入cDNA合成和扩增模块(新英格兰生物实验室公司(New EnglandBiolabs Inc.),伊普斯威奇,马萨诸塞州)。下面显示的TSO序列包括未修饰的退火区域(核糖核苷酸由“rG”表示);上面列出的每个修饰的TSO中的修饰碱基替换了这三个碱基。
RT引物:
5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3′(SEQ IDNO:1)
TSO(未修饰;rG是核糖鸟嘌呤):
5′-GCAATGAAGTCGCAGGGTTrGrGrG-3′(SEQ ID NO:2)
反向PCR引物(RT引物区域特异性):
5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′(SEQ ID NO:3)
正向PCR引物(TSO区域特异性):
5′-GCAATGAAGTCGCAGGGTTG-3′(SEQ ID NO:4)
方法
1.逆转录酶(RT)引物(本文也称为cDNA合成引物)的退火。
对于每个反应,将以下组分添加到TempAssure条的单个PCR管中:
将管混合并使用热循环仪在70℃下孵育5分钟,然后保持在4℃。
2.逆转录和模板转换反应
为了制备逆转录/模板转换(RT/TS)预混液,在4℃下按所列顺序添加组分(以下体积乘以反应数加1)。
混合RT/TS预混液。将11μl RT/TS预混液添加到步骤1(每个含有9μl反应混合物1)的每个管中并混合。将管置于42℃的热循环仪中,在52℃下加盖90分钟,然后在70℃下加盖在80℃下放置10分钟。
3.通过PCR扩增cDNA。
使用下面列出的成分和体积,在4℃下制备PCR预混液(以下体积乘以反应数加1)。正向PCR引物对应于TSO衔接子中的一个位点,反向PCR引物对应于cDNA合成引物(来自NEB)中的一个位点。
向每个RT/TS样品(共20μl)中加入80μl PCR预混物并混合。将管置于热循环仪中并按照以下程序运行(盖105℃):
4.扩增的cDNA的纯化。
PCR反应完成后,将82μl重悬的室温大小选择珠加入每个管中,通过移液混合,室温孵育5分钟。将管置于磁力架(由珠子的制造商提供)中直至上清液变清。弃去上清液,用200μl新鲜制备的80%乙醇洗涤珠子2次。
从磁力架上取下试管后,通过移液管在50μl EB中混合重新悬浮磁珠,并在37℃下孵育5分钟。将管置于磁力架上以将珠子与上清液分离,并将上清液转移至新管中。
使用定量试剂盒对DNA量进行定量,每个样品使用1μl。定量后,使用高灵敏度DNA试剂盒(DNA稀释至1ng/μl)在安捷伦生物分析仪上运行1.5ng,以确保扩增的cDNA材料具有与实验预期一致的分布。
5.DNA损伤修复、末端修复和A-加尾。
对于要处理的每个样品,将以下组分添加到TempAssure条的单个PCR管中,通过移液混合并离心沉淀。标明来自PacBio的试剂来自加利福尼亚太平洋生物科学公司(加州门洛帕克)提供的SMRTbellTM快速模板制备试剂盒2.0。
这些反应在热循环仪中在37℃下孵育30分钟,然后保持在4℃。将试管置于冰上,加入3μl最终制备混合物(PacBio)并通过移液混合。使用热循环仪将管在20℃下孵育30分钟,在65℃下孵育30分钟,并保持在4℃。此步骤引入3'dA核苷酸,使末端与下一步中的衔接子连接兼容。
6.衔接子连接。
使用SMRTbellTM快速模板制备试剂盒(加利福尼亚太平洋生物科学公司,加州门洛帕克)如下将发夹衔接子连接到来自每个样品的补平、扩增的cDNA,并按所列顺序添加试剂。
通过移液(~10次)混合样品并旋转以从管的侧面收集所有液体。使用热循环仪将管在20℃下孵育60分钟,然后保持在4℃。
7.清理cDNA文库。
连接反应完成后,将93μl重悬的室温大小选择珠加入每个管中,通过移液混合(~10次),室温孵育5分钟。将试管置于磁力架(由珠子的制造商提供)中直至上清液变清。弃去上清液,用200μl新鲜制备的80%乙醇洗涤珠子2次。
从磁力架上取下试管后,通过移液管在20μl EB中混合重新悬浮磁珠,并在37℃下孵育5分钟。将管置于磁力架上以将珠子与上清液分离,并将上清液转移至新管中。
使用定量试剂盒对DNA量进行定量,每个样品使用1μl。定量后,使用高灵敏度DNA试剂盒(DNA稀释至1ng/μl)在安捷伦(Agilent)生物分析仪上运行1.5ng,以估计iTube形成和扩散加载到SMRTTM Cell 1M测序芯片(加利福尼亚太平洋生物科学公司,加州门洛帕克)上的文库大小。根据制造商的说明,在SequelTM测序仪上进行SMRTTM测序(单分子实时测序)。
结果
图4的上图显示了使用每种不同TSO生成的cDNA总量。带有未修饰的rG核糖核苷酸(rGrGrG)的TSO产生了大约100ng的cDNA。与rGrGrG TSO相比,具有包含2'-氟核糖鸟嘌呤核苷酸的3'退火区域的TSO显示出增加的cDNA产量,其中3'退火区域rGrGfG(一个2'-氟代核糖鸟嘌呤)将产生的cDNA量增加了大约2倍(~200ng),而3'退火区域fGfGfG(三个2'-氟核糖鸟嘌呤)将cDNA量增加了大约5倍(~500ng)。相比之下,与rGrGrG TSO(具有单个2'-O-甲基鸟嘌呤的3'TSO;rGrGmG)相比,具有包含2'-O-甲基核糖鸟嘌呤残基的3'退火区域的TSO要么没有影响,要么与rGrGrG TSO(具有一个或两个2'-O-甲基鸟嘌呤残基的3'TSO;rGmGmG和mGmGmG)相比减少了产生的cDNA量。具有单个LNA核苷酸(rGrG+G)的TSO也显示出cDNA产量增加。
图4下图显示了上图中产生的cDNA的序列分析结果。显示了总读数和全长非嵌合读数(FLNC读数)。
虽然fGfGfG TSO产生了明显更多的产物,但仍有大量不完整和/或嵌合cDNA产物(非FLNC读数)对转录组分析无用(参见图4的下图)。我们遇到的主要非FLNC读数包括那些在每端具有相同引物序列(例如,两端都是cDNA合成引物序列或两端都是TSO序列)的读数,以及其中TSO在mRNA模板内的某个位点而不是在mRNA 5'端的3'突出端核苷酸处退火的那些读数。我们尝试了两种方法来减少这些脱靶产物:时序分离RT和TSO反应(实施例2)并在cDNA扩增之前执行cDNA清理步骤(实施例3)。
实施例2:RT和TSO添加的时序分离
我们进行了实验,其中TSO添加到cDNA合成反应的时间不同。不受任何特定机理的限制,我们假设在TSO添加之前允许第一链cDNA合成完成将有利于TSO退火到3'突出端区域而不是内部mRNA位点。
分析了以下修饰的TSO:(i)rG-rG-+G(LNA);(ii)rG-rG-fG(rrF);(iii)fG-fG-fG(FFF)。对于这些修饰的TSO中的每一个,进行单独的cDNA合成反应,其中在cDNA合成反应开始时(0分钟;即,与实施例1中描述的反应相同)或在cDNA合成反应开始后30分钟、45分钟、60分钟或75分钟添加修饰的TSO。对这些反应进行处理以确定产生的cDNA量和/或在执行过程中的后续步骤后产生的全长非嵌合(FLNC)读数的百分比(如上所述)。
结果
图5的上图显示了0、30、45和60分钟时间点的总cDNA产量(以纳克为单位;ng)。如图4所示,在所有时间点,使用FFF修饰的TSO的cDNA合成反应生成的cDNA明显多于使用LNA或rrF TSO的反应(通常至少多2倍)。此外,对于使用的所有三种修饰的TSO,产生的cDNA量随着TSO添加时间的增加而减少。
图5的下图显示了从LNA、rrF和重复FFF反应的0、45和60分钟时间点以及FFF反应之一的75分钟时间点获得的FLNC读数百分比。如图所示,LNA和rrF TSO的FLNC读数百分比仅略有增加(从大约80%到大约87%)。然而,随着修饰TSO添加时间的增加,两个重复的FFFTSO反应的FLNC读数百分比显著增加。具体而言,FLNC读数百分比从时间0的大约43%FLNC读数增加到60分钟时间点的大约80%FLNC读数以及75分钟时间点的85%FLNC读数。鉴于FFF TSO产生的总cDNA明显多于LNA或rrF,因此估计在这些较晚的时间点FLNC读数的总数明显更高。
实施例3:cDNA扩增前的cDNA清理
我们接下来进行了一项实验,比较了标准测定(如上所述)和其中在PCR扩增步骤之前清理了cDNA样品的测定中的总cDNA产量和FLNC读数。不受任何特定机理的限制,该步骤有望通过从PCR反应中去除cDNA合成和修饰的TSO引物来减少非FLNC读数的产生,而这些可能有助于背景扩增产物。除了清理步骤外,还使用增加浓度的修饰的TSO(0.6M、2.4M、0.6M)进行反应。比较清理步骤对rG-rG-fG TSO影响的实验在0.6M浓度下进行,而使用rG-fG-fG TSO进行的实验则在所有三种浓度下进行。
在RT/TS反应完成后(如实施例1中所述),将30μl洗脱缓冲液(EB;10mM Tris-Cl,pH 8.5)添加到每个反应中,然后添加52μl 珠子(来自普洛麦格公司的磁性树脂,用于核酸大小的选择)。将反应轻轻移液混合并在室温下孵育5分钟。将试管置于磁力架(由普洛麦格公司提供)中,直至上清液变清。弃去上清液,用200μl新鲜制备的80%乙醇洗涤珠子2次。
从磁力架上取下试管后,通过移液管在46μl EB中混合重新悬浮磁珠,快速旋转以收集管侧面的所有液体,并在37℃下孵育5分钟。将管置于磁力架上以将珠子与上清液分离,并将45.5μl的上清液转移至新管中。这些上清液按照实施例1中步骤3-10中的描述进行处理(通过序列分析进行PCR扩增)。
图6的上图显示了在不使用(标准操作程序;SOP)和使用cDNA珠子清理的情况下进行的所有反应的cDNA产量,以纳克(ng)为单位。在0.6mM和2.4mM TSO浓度下,与cDNA珠子清理样品相比,SOP导致cDNA量增加。在4.8mM浓度下,cDNA水平大致相当。此外,与最低浓度的rG-rG-fG TSO相比,使用rG-fG-fG TSO的总cDNA产量更高。此外,rG-fG-fG TSO的总产量随着其在RT/TS反应中的浓度增加而增加。
图6的下图显示了rGfGfG TSO样品的FLNC、5'-5'TSO和3'-3'RT引物读数(后两个代表不需要的产物)的百分比。对于所有TSO浓度,清理样品显示出比非清理读数显著更高的FLNC读数,产量增加了6-8%。
鉴于此数据,增加修饰的TSO的浓度会导致cDNA产量增加,同时在RT/TS反应后执行清理步骤会导致FLNC产物(所需产物)的百分比增加。
结论
鉴于以上实施例中提供的数据,包含至少一种2'-氟核糖核苷酸的修饰的TSO可提高cDNA产量。除了使用这种修饰的TSO以外,延迟TSO添加到cDNA合成反应的时间(即,在cDNA合成开始后的某个时间)、在随后的扩增反应之前清理cDNA样品、以及增加修饰的TSO的浓度也可以提高这些反应中所需cDNA产物(例如,FLNC cDNA)的产量。这些发现允许对具有低量RNA的样品(例如低或单细胞样品、具有稀释RNA种类(例如循环RNA)的样品等)实施改进的分析。
虽然为了清楚和理解的目的已经对上述发明进行了一些详细的描述,通过阅读本公开内容,本领域技术人员将清楚,在不脱离本发明的真实范围的情况下,可以对形式和细节进行各种改变。例如,上述所有的技术和设备都可以用于各种组合。本申请中提到的所有公开出版物、专利、专利申请和/或文献都通过引用全文纳入本文中,相当于所述各单独的公开出版物、专利、专利申请和/或文献都独立并分别地通过引用纳入本文用于所有目的。
Claims (63)
1.用于产生具有3'衔接子区域的互补DNA(cDNA)链的方法,该方法包括:
在cDNA合成条件下将RNA模板与cDNA合成引物、模板转换寡核苷酸(TSO)、和逆转录酶结合,其中TSO包括5’衔接子区域和包含至少一个2’-氟核糖核苷酸的3’退火区域,其中:
(i)cDNA合成引物退火至RNA模板且逆转录酶从退火的cDNA合成引物产生RNA-cDNA中间体,其中RNA-cDNA中间体的cDNA链包括3’突出端;以及
(ii)TSO的3’退火区域退火至RNA-cDNA中间体的3’突出端且逆转录酶使用退火的TSO作为模板延伸RNA-cDNA中间体的cDNA链的3’端;
从而产生包含3’衔接子区域的cDNA链。
2.如权利要求1所述的方法,其中,所述3’退火区域包含三个核糖核苷酸残基。
3.如权利要求2所述的方法,其中,所述3’退火区域包含一个2’-氟核糖核苷酸。
4.如权利要求2所述的方法,其中,所述3’退火区域包含两个2’-氟核糖核苷酸。
5.如权利要求2所述的方法,其中,所述3’退火区域包含三个2’-氟核糖核苷酸。
6.如权利要求1~5中任一项所述的方法,其中,至少一个2’-氟核糖核苷酸是2’-氟核鸟嘌呤(2’fG)。
7.如权利要求6所述的方法,其中,TSO的3’退火区域中的任意的非-2’fG核糖核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸。
8.如权利要求1~7中任一项所述的方法,其中,所述3’退火区域包含通用核苷酸碱基。
9.如权利要求8所述的方法,其中,所述通用核苷酸碱基选自:核糖苷(rI)和5’5-硝基吲哚(5’NI)。
10.如权利要求1~9中任一项所述的方法,其中,所述3’退火区域包含简并核糖核苷酸碱基(rN)。
11.如权利要求1所述的方法,其中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向上,选自:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。
12.如权利要求11所述的方法,其中,TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为:rG-2’fG-2’fG。
13.如权利要求7所述的方法,其中,TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为:2’fG-2’fG-2’fG。
14.如权利要求1~13中任一项所述的方法,其进一步包括扩增包括3’衔接子区域的cDNA链。
15.如权利要求1~14中任一项所述的方法,其中TSO的5’衔接子区域进一步包括以下的一个或多个:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
16.如权利要求1~15中任一项所述的方法,其中,所述cDNA合成引物包括第二5’衔接子区域和3’RNA退火区域。
17.如权利要求16所述的方法,其中,所述cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括以下的一个或多个:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
18.如权利要求16或17所述的方法,其中,TSO的5’衔接子区域包括第一扩增引物序列且cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括第二扩增引物序列,该方法还包括使用对第一和第二扩增引物序列有特异性的引物对,来对包括3’衔接子区域的cDNA链进行PCR。
19.如权利要求18所述的方法,其中,第一和第二扩增引物序列相同。
20.如权利要求18所述的方法,其中,第一和第二扩增引物序列不同。
21.图权利要求1~20中任一项所述的方法,其中,所述RNA模板选自:mRNA、非编码RNA、miRNA、siRNA、piRNA、lncRNA、和核糖体RNA。
22.如权利要求21所述的方法,其中,所述RNA模板是mRNA。
23.如权利要求22所述的方法,其中,所述mRNA具有连接在5'端的7-甲基鸟苷帽子结构。
24.如权利要求22或23所述的方法,其中,所述mRNA模板在3’端具有聚A尾。
25.如权利要求24所述的方法,其中,所述cDNA合成引物包括与聚A尾互补的3’聚T序列。
26.如权利要求1所述的方法,其中,所述cDNA合成引物包括与至少一个目标RNA互补的3’序列。
27.如权利要求1~26中任一项所述的方法,其中,所述cDNA合成引物和TSO同时与RNA模板结合。
28.如权利要求1~26中任一项所述的方法,其中,所述cDNA合成引物和逆转录酶在cDNA合成条件下与RNA模板结合,形成预延伸混合物,以在与TSO结合之前产生RNA-cDNA中间体。
29.如权利要求28所述的方法,其中,在与TSO结合之前,孵育预延伸混合物10分钟至4小时。
30.如权利要求29所述的方法,其中,在与TSO结合之前,孵育预延伸混合物30分钟至2小时。
31.如权利要求30所述的方法,其中,在与TSO结合之前,孵育预延伸混合物约1小时。
32.用于从包含mRNA的样品生成包含衔接子的cDNA的方法,该方法包括:
(a)获得包括具有3’聚A尾的mRNA的样品;
(b)通过在cDNA合成条件下使样品与cDNA合成引物和逆转录酶接触,产生cDNA合成反应,其中cDNA合成引物包括3’聚T退火区域且逆转录酶在cDNA的3’端上添加3’末端核苷酸突出端;
(c)使cDNA合成反应持续10分钟至4小时,以产生具有3'突出端的cDNA;
(d)将模板转换寡核苷酸(TSO)添加到cDNA合成反应中,其中TSO包含5'衔接子区域和包含三个核糖核苷酸的3'退火区域,其中核糖核苷酸中的至少一个是2'-氟核糖鸟嘌呤(2'fG)核苷酸;以及
(e)在允许TSO的3'退火区域退火至cDNA的3'突出端并且允许使用退火的TSO作为模板延伸cDNA的3'端的条件下孵育cDNA合成反应,从而产生含有衔接子的cDNA。
33.如权利要求32所述的方法,其中,所述3’退火区域包括一个2’fG核苷酸。
34.如权利要求32所述的方法,其中,所述3’退火区域包括两个2’fG核苷酸。
35.如权利要求32所述的方法,其中,所述3’退火区域包括三个2’fG核苷酸。
36.如权利要求32~35中任一项所述的方法,其中,TSO的3’退火区域中的任意的非2’fG核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核苷酸。
37.如权利要求32所述的方法,其中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向上,选自:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。
38.如权利要求37所述的方法,其中,TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为:rG-2’fG-2’fG。
39.如权利要求37所述的方法,其中,TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为:2’fG-2’fG-2’fG。
40.如权利要求32~39中任一项所述的方法,其中TSO的5’衔接子区域进一步包括以下的一个或多个:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
41.如权利要求32~40中任一项所述的方法,其中,所述cDNA合成引物包括第二5’衔接子区域和3’RNA退火区域。
42.如权利要求41所述的方法,其中,所述cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括以下的一个或多个:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
43.如权利要求41或42所述的方法,其中,TSO的5’衔接子区域包括第一扩增引物序列且cDNA合成引物的第二5’衔接子区域包括第二扩增引物序列,该方法还包括使用对第一和第二扩增引物序列有特异性的引物对,来对步骤(e)产生的cDNA进行PCR。
44.如权利要求32所述的方法,其中,允许进行步骤(c)30分钟至2小时。
45.如权利要求32所述的方法,其中,允许进行步骤(c)约1小时。
46.包括5’衔接子区域和3’退火区域的模板转换寡核苷酸(TSO),其中3’退火区域被配置为退火至RNA-cDNA中间体的cDNA链的3'突出端,其中TSO能够用作cDNA链3'端延伸的模板,其中3'退火区域包含至少一个2'-氟核糖核苷酸。
47.如权利要求46所述的TSO,其中,所述3’退火区域包含三个核糖核苷酸残基。
48.如权利要求47所述的TSO,其中,所述3’退火区域包含一个2’-氟核糖核苷酸。
49.如权利要求47所述的TSO,其中,所述3’退火区域包含两个2’-氟核糖核苷酸。
50.如权利要求47所述的TSO,其中,所述3’退火区域包含三个2’-氟核糖核苷酸。
51.如权利要求46~50中任一项所述的TSO,其中,至少一个2’-氟核糖核苷酸是2’-氟核鸟嘌呤(2’fG)。
52.如权利要求51所述的TSO,其中,TSO的3’退火区域中的任意的非-2’fG核糖核苷酸是核鸟嘌呤(rG)核糖核苷酸。
53.如权利要求47所述的TSO,其中,TSO的3’退火区域,在5’到3’方向上,选自:rG-rG-2’fG;rG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG;2’fG-2’fG-2’fG-2’fG;rN-2’fG-2’fG;rI-2’fG-2’fG;和5’NI-2’fG-2’fG。
54.如权利要求53所述的TSO,其中,TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为:rG-2’fG-2’fG。
55.如权利要求53所述的TSO,其中,TSO的3’退火区域在5’到3’方向上为:2’fG-2’fG-2’fG。
56.如权利要求46~55中任一项所述的TSo,其中TSO的5’衔接子区域进一步包括以下的一个或多个:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
57.一种试剂盒,其包括根据权利要求46~56中任一项所述的模板转换寡核苷酸(TSO)。
58.如权利要求57所述的试剂盒,其进一步包括cDNA合成引物。
59.如权利要求58所述的试剂盒,其中,所述cDNA合成引物包括5’衔接子区域和3’RNA退火区域。
60.如权利要求59所述的试剂盒,其中,所述cDNA合成引物的5’衔接子区域包括以下的一个或多个:条形码序列、独特的分子标识符(UMI)、扩增引物序列、测序引物序列、捕获引物序列、序列特异性核酸酶切割位点、修饰的核苷酸、生物素化核苷酸、和5’修饰。
61.如权利要求59或60所述的试剂盒,其中,cDNA合成引物的3’RNA退火区域包括聚T序列。
62.如权利要求59或60所述的试剂盒,其中,cDNA合成引物的3’RNA退火区域包括与至少一个目标RNA互补的序列。
63.如权利要求56~62中任一项所述的试剂盒,其进一步包括用于进行cDNA合成反应的试剂。
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