CN102791877A - 使用双链核酸复合物与耐热聚合酶用于合成脱氧核糖核苷酸链的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，更具体而言，涉及用于扩增过程的核酸构建。更确切地，本发明通过借助双链寡核苷酸来提高核酸扩增的特异性，其中使用具有防止双链核酸延长的能力的分子对所述双链寡核苷酸进行修饰。

Description

使用双链核酸复合物与耐热聚合酶用于合成脱氧核糖核苷酸链的组合物和方法

相关申请

本申请要求由Stephen Picone等人在2009年11月6日提交的题为“使用双链核酸复合物与耐热聚合酶用于合成脱氧核糖核苷酸链的组合物和方法”的美国临时申请号61/258,684的优先权。

将上述申请的全部教导以引用方式并入本文。

背景技术

DNA聚合酶为催化脱氧核糖核苷酸聚合为核酸链的酶。在多种DNA技术中使用聚合酶，包括PCR扩增，即复制或扩增DNA链的过程。一些PCR方法的重要问题是非特异性扩增产物的产生（例如，产生不想要的DNA链）。在许多情况下，这是由于非特异性寡核苷酸引发和副反应的非靶寡核苷酸的产生，如背景DNA的错误引发和/或在实际的热循环过程自身之前引物的低聚化以及随后的引物延伸事件。由于耐热DNA聚合酶在环境温度下具有适当的活性，这经常发生。

为了使该问题减少至最低程度，可进行称为“热启动”PCR的方法。在热启动PCR中，将扩增反应所需的一种成分从反应混合物中分离或使其保持非活性状态，直到首次将反应混合物的温度升高。由于聚合酶在这些条件下不能发挥作用，因此在引物能够非特异性结合的时期引物延伸较少。为了达到该效果，已经采用了几种方法：DNA聚合酶的物理分离（例如，使用固体蜡屏障以将DNA聚合酶与反应混合物分离），DNA聚合酶的化学修饰（例如，使DNA聚合酶可逆地失活），聚合酶DNA抗体（polymerase DNA antibody）（例如，在室温环境下结合并在扩增过程中在较高温度下分离的抗体），通过核酸添加物的DNA聚合酶抑制，适体（例如，可充当抗体的形成环、假结体、和复杂三级结构的核苷酸的单链形式），阻断引物等。这些方法中的多种不方便或运行不能达到使非特异性扩增最小化的所需效果。

因此，需要存在独特且可替换的组合物和方法用于扩增反应，其不仅在扩增过程自身之前，而且在热循环过程期间可提供非特异性引发和引物延伸的抑制。更具体而言，需要存在可替换和改进的组合物及方法用于热启动PCR。

发明内容

本发明涉及用于核酸扩增的阻断双链核酸复合物（DSC）。在一个实施方式中，复合物包括分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包括具有包括约9至约40个之间核酸碱基的第一序列的第一核酸链；以及具有包括与第一序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链（核酸第二链），其中所述第一核酸链和第二核酸链各自具有3’端和5’端，并且其中双链核酸分子具有在约50%至约70%之间范围内的胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的百分比。双链核酸复合物也包括阻断分子，其中所述阻断分子共价结合于第一核酸链、第二核酸链、或两者的3’端或5’端。在一个方面，双链核酸分子（例如DNA或RNA）具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度。在一个实施方式中，本发明的DSC进一步包括尿嘧啶碱基的引入。当使用来自古细菌种的DNA聚合酶时，向DSC中加入一个或多个尿嘧啶碱基可进一步降低室温下的聚合酶活性。特别地，DSC的第一序列或第二序列进一步包括一个或多个尿嘧啶碱基。

阻断分子的实例包括脱氧胸苷、双脱氧核苷酸、3’磷酸化（3’phosphorylation）、己二醇、间隔分子、1’2’-双脱氧核糖、2’-O-甲基RNA、和/或锁核酸（LNA）。在一个实施方式中，阻断分子具有以下结构：

反向dT。

本发明还涉及用于核酸扩增的阻断双链核酸复合物；其中所述复合物包括分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包括具有包括约9至约40个之间核酸碱基的第一序列的第一核酸链，以及具有包括与第一序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链，其中所述第一核酸链和第二核酸链各自具有3’端和5’端，并且双链核酸分子具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度。该实施方式包括阻断分子，所述阻断分子共价结合于第一核酸链、第二核酸链、或两者的3’端或5’端。在一个方面，第一序列或第二序列进一步包括一个或多个尿嘧啶碱基。

在又一个实施方式中，本发明的阻断双链核酸复合物具有包括分离的双链核酸分子的复合物，所述分离的双链核酸分子包括具有与下列序列之一有高于或等于约70%同一性的第一核酸序列的第一核酸链：SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或它们的组合；SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或它们的组合的互补物（complement）；与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或它们的组合杂交的序列。所述复合物进一步包括具有包括与第一核酸序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链，其中所述第一核酸链和第二核酸链各自具有3’端和5’端，其中双链核酸分子具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度。所述复合物也具有阻断分子，所述阻断分子共价结合于第一核酸链、第二核酸链、或两者的3’端或5’端。在一个方面，第一和第二核酸链的3’端包括阻断分子，并且当阻断双链核酸复合物与核酸聚合酶相互作用时，所述阻断分子由此可降低非特异性扩增产物。在一个优选实施方式中，所述复合物具有约48.9°C的解链温度。

本发明还包括用于核酸扩增的组合物。在一些实施方式中，所述组合物包括缓冲剂（缓冲液，buffer）、本文所述的阻断双链核酸复合物、以及耐热聚合酶。聚合酶可为DNA聚合酶，如Taq DNA聚合酶；BST DNA聚合酶；PFU DNA聚合酶；Klenow DNA聚合酶；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶；Phi29DNA聚合酶；或RB69DNA聚合酶。浓度范围可以是例如每5,000U/mL聚合酶为约2μΜ核酸复合物至每5,000U/mL聚合酶为2mM核酸复合物。缓冲剂可为TRIS缓冲剂、MOPS、或HEPES缓冲剂。本发明进一步包括扩增靶核酸分子的方法。所述方法包括将靶核酸分子与DNA聚合酶和本文所述的双链核酸复合物接触，其中所述双链核酸复合物在温度范围为约25°C至约90°C下结合于DNA聚合酶。与未与双链核酸复合物接触相比，减少了一种或多种非特异性扩增产物或次级产物的产生。与未与双链核酸复合物接触的靶核酸分子的聚合酶活性相比，室温下（例如，在约20°C至25°C之间）的聚合酶活性降低在约50%至约90%（例如，降低约50%、60%、70%、80%、或90%）之间的范围内。此外，本发明所述方法在一个方面提供了更高的产率。在一个特定实施方式中，与未与双链核酸复合物接触所获得的靶核酸分子的量相比，扩增的靶核酸分子的量升高在约2X至约20X（例如，升高2X、3X、4X、5X、6X、7X，8X、9X、10X、15X或20X）之间的范围内。如本文所述，在其中方法利用来自古细菌种的DNA聚合酶和具有一个或多个尿嘧啶碱基的DSC的又一个实施方式中，室温下的聚合酶活性也降低。

本发明所包括的其它方法包括通过将缓冲剂，靶核酸分子，一种或多种引物，DNA聚合酶，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的供应物，以及本文所述的双链核酸复合物混合来扩增靶核酸分子。所述步骤进一步包括通过在一个或多个循环中升高温度使得靶核酸分子扩增，其中温度范围在约25°C至约90°C之间。该方法使得与未与双链核酸复合物接触相比，一种或多种非特异性扩增产物或次级产物的产生减少。如本文进一步描述，在一个实施方式中，室温下的聚合酶活性降低，和/或获得产率的增加。

本发明进一步包括用于核酸扩增的试剂盒。这样的试剂盒或体系包括本文所述的阻断双链核酸复合物、和聚合酶。所述聚合酶为DNA聚合酶，其可为例如Taq DNA聚合酶；BST DNA聚合酶；PFU DNA聚合酶；KlenowDNA聚合酶；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶；Phi29DNA聚合酶；或RB69DNA聚合酶。

有利地，所要求的发明提供了用于改进热启动PCR扩增过程的组合物和方法。具体而言，本发明提供了可抑制在扩增过程之前和过程中非特异性引发和引物延伸的组合物。此外，本发明惊人地使得PCR反应发生而未产生大量非特异性扩增产物，并且提供了用于进行PCR的改进组合物。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一副以彩色完成的附图。在请求并支付必要费用后，当局将提供具有彩色附图的该专利或专利申请公开的拷贝。

图1描绘了pUC19质粒的1.1kb区域的扩增。第1泳道和第2泳道分别包括在PCR缓冲剂I和II中与3’端帽化引物的反应，其显示了掺入寡核苷酸3’端的抑制分子有效地防止由DNA聚合酶引起的延伸。第3泳道和第4泳道描绘了与未修饰引物的反应，产生了扩增产物。第M泳道描绘了DNA标准标记。

图2描绘了当在具有与反应引物相同序列的具有阻断剂的双链核酸分子存在或不存在的情况下，pUC19质粒的1.1kb区域的PCR产物的扩增。第1泳道和第2泳道包括在缓冲剂I中进行的反应，第3泳道和第4泳道在PCR缓冲剂II中进行。第M泳道描绘了DNA标准标记。

图3示出了在DSC分子存在的情况下的PCR扩增。所有反应包含1ng大肠杆菌基因组DNA作为竞争性外源DNA。奇数泳道包含λ模板DNA（第11泳道除外），而偶数泳道不包含模板DNA。反应11为阴性对照，具有缓冲剂I，DNTP但没有DSC分子，没有模板以及没有酶。第M泳道描绘了DNA标准标记。

图4描绘了来自λDNA的1.9kb区域的扩增的比较。在DSC分子存在的情况下，第1-4泳道包含Taq（Enzymatics,Inc.（Beverly，MA））和Taq-B DNA聚合酶（在储存缓冲剂中-和+稳定剂）。第5-7泳道包含市售的热启动DNA聚合酶。所有PCR反应在λDNA和1ng污染性大肠杆菌基因组DNA存在的情况下进行。第M泳道描绘了DNA标准标记。

图5A和图5B强调了在DSC分子存在的情况下，λDNA的1.9kb区域的扩增。使用正向5’CTGGCTGACATTTTCG-3’（SEQ ID NO:17）和反向5’TATCGACATTTCTGCACC-3’（SEQ ID NO:18）引物在A中进行PCR扩增；使用正向5’GAAGTCAACAAAAAGGAGCTGGCTGACATTTTCG-3’（SEQ ID NO:19）和反向5’CAGCAGATACGGGATATCGACATTTCTGCACC-3’（SEQ ID NO:20）引物在B中进行PCR扩增。使用0.523pg的λDNA和1ng的大肠杆菌基因组DNA进行PCR扩增。反应一式两份地进行（图5A中的第1泳道和第2泳道，第3泳道和第4泳道；图5B中的第1泳道和第3泳道，第2泳道和第4泳道）。

图6描绘了在具有不同解链温度（第1-10泳道）和抑制阻断分子（第15-17泳道）的DSC分子存在的情况下，人胎盘DNA的β-肌动蛋白基因的653-bp片段的扩增。

图7A和图7B描绘了使用寡核苷酸混合物B扩增来自DNA B的100-bp产物。第1-3泳道显示在不同DSC分子存在的情况下的PCR扩增。第4泳道显示在本发明的DSC分子不存在的情况下的扩增结果。使用市售的化学修饰的热启动Taq聚合酶进行第5泳道的扩增。第M泳道描绘了DNA标准标记。所有泳泳道包含DNA B的1000个拷贝。在每个反应中DSC分子的最终浓度为0.4μΜ。在构建后立即进行图7A中的PCR扩增，而无需在台顶预温育。在23°C的环境温度下温育24小时后进行图7B中的PCR扩增。

图8显示使用寡核苷酸混合物B扩增来自DNAB的100-bp产物。第1-4泳道显示在不同DSC分子存在的情况下的PCR扩增。第5泳道显示在本发明的DSC分子不存在的情况下的扩增结果。使用市售的化学修饰的热启动Taq聚合酶进行第6泳道的扩增。第M泳道描绘了DNA标准标记。所有泳泳道包含DNA B的5个拷贝。在第1和第3泳道中DSC分子的最终浓度为0.4μΜ，而在第2和第4泳道中DSC的最终浓度为4μΜ。在构建后立即进行PCR扩增，而无需在台顶预温育。

图9示出了使用寡核苷酸混合物B扩增来自DNA B的100-bp产物。第1-5泳道显示在不同DSC分子存在的情况下的PCR扩增。第6泳道显示在本发明的DSC分子不存在的情况下的扩增结果。使用市售的化学修饰的热启动Taq聚合酶进行第7泳道中的扩增。第M泳道描绘了DNA标准标记。所有泳泳道包含DNA B的5个拷贝。在第1-5泳道中DSC分子的最终浓度为4μΜ。在23°C的环境温度下温育24小时后进行PCR扩增。

图10A-C描绘了分别使用寡核苷酸混合物A、B和C扩增来自DNAA、B和C的100-120-bp产物。第1-5泳道显示在不同DSC分子存在的情况下的PCR扩增。第6泳道显示在本发明的DSC分子不存在的情况下的扩增结果。使用市售的化学修饰的热启动Taq聚合酶进行第7泳道中的扩增。第M泳道描绘了DNA标准标记。所有PCR扩增反应包含DNA B的5个拷贝。每个反应中DSC分子的最终浓度为4μΜ。在构建后立即进行PCR扩增，而无需在台顶预温育。

图11A-C描绘了分别使用寡核苷酸混合物A、B和C扩增来自DNAA、B和C的100-bp产物。第1-5泳道显示在不同DSC分子存在的情况下的PCR扩增。第6泳道显示在本发明的DSC分子不存在的情况下的扩增结果。使用市售的化学修饰的热启动Taq聚合酶进行第7泳道中的扩增。第M泳道描绘了DNA标准标记。所有泳道包含DNA B的5个拷贝。每个反应中DSC分子的最终浓度为4μΜ。在23°C的环境温度下温育24小时后进行图7B中的PCR扩增。

图12描绘了使用通过CY5荧光染料的检测对来自DNA C的100-bp产物的形成的实时PCR分析。包含来自DNA C的1280-5个拷贝的反应一式四份地进行。显示了每个拷贝水平的平均Ct值±标准偏差。0.6以上的标准偏差为黑体。也显示了方程线的整体PCR效率与R平方值。结果以阴影标记示出。

图13描绘了使用HBB2寡混合物对来自人胎盘DNA的100-bp产物的形成的实时PCR分析。包含来自DNA C的1280-5个拷贝的反应一式四份地进行。显示了每个拷贝水平的平均Ct值±标准偏差。0.6以上的标准偏差为黑体。也显示了方程线的整体PCR效率与R平方值。结果以阴影标记示出。

图14A和图14B示出了使用通过HEX荧光染料的检测对来自DNA B的100-bp产物的形成的实时PCR分析。包含DNA B的1000、100、和10个拷贝的反应一式四份地进行。显示了每个拷贝水平的平均Ct值±标准偏差。图14A代表在使用2.5U Taq-B和最终浓度为0.4μΜ的DSC1的25μL反应中产物的扩增。图14B显示在使用2.5U Taq-B和最终浓度为0.2μΜ的DSC1的50μL反应中产物的扩增曲线。

图15A-C示出了使用通过HEX荧光染料的检测对来自DNA B的100-bp产物的形成的实时PCR分析。包含DNA B的1000、100、和10个拷贝的反应一式四份地进行。注意到反应中DSC5分子的最终浓度为1x-20x，其中1x为0.2μΜ，而20x为4μΜ。示出了反应中1x，0.2μΜ最终浓度下的DSC1。也显示了无DSC分子和快速启动（快速起始，Fast Start）的Taq-B。图15A描绘了每个类别中的每种拷贝水平的平均Ct值。显示了整体PCR效率。图15B示出了每种Taq-B DSC组合以及仅有Taq-B和快速启动（快速起始，FastStart）的扩增曲线。图15C显示了每个类别中的每种拷贝水平的最终增幅。结果以阴影标记描绘。

具体实施方式

对本发明优选实施方式的描述如下。

本发明涉及用于扩增反应的核酸复合物、使用核酸复合物的方法、包含聚合酶和核酸复合物的缓冲剂、以及包含核酸复合物和聚合酶的试剂盒。如本文中所述，本发明包括可改善扩增反应的核酸复合物。核酸复合物为包括阻断分子的双链寡核苷酸。本发明的核酸复合物也称为双链复合物（DSC）。

特别地，本发明使用由较短的双链寡核苷酸构成的核酸复合物，所述双链寡核苷酸在每条链的末端共价连接于阻断分子。在其它实施方式中，阻断分子可散布或连接于核酸复合物的任意部分（例如，中间部分）。核酸复合物结合于聚合酶并提高扩增反应的性能。仔细设计核酸配体以提高扩增反应的性能，而其自身在反应中不能充当用于扩增靶序列或另一个非特异性序列的引物。

还使用多种下述的组合进行在实施例部分中所描述的详细实验：DSC及其衍生物、多种DNA聚合酶、多种阻断分子、以及多浓度的核酸复合物。可使用其它核酸复合物和其它聚合酶改变本发明的方法和组合物，以提高核酸扩增反应的性能。

根据本发明，核酸复合物可以具有可达到约90°C的解链温度。核酸复合物的解链温度可高于约25°C，例如约45°C至约75°C，或例如约45°C至约55°C（例如，在约25°C至约90°C之间的范围）。在最优选的实施方式中，核酸复合物具有约48.9°C的解链温度。该解链温度范围可用于本领域技术人员已知的和本文所阐述的各种扩增反应。

使用由Integrated DNA Technologies，1710Commercial Park，Coralville，IA 52241USA提供的最近邻热力学参数，使用由Owczarzy,R.等人的Biochemistry,2004Mar 30;43(12):3537-54和Owczarzy,R.等人的Biochemistry,2008May 13;47(19):5336-53所描述的计算对核酸复合物的解链温度（T_m）进行计算，将其内容以引用方式并入本文中。

核酸复合物可具有一定的浓度范围以用于各种应用中。核酸复合物的浓度范围可高于每5,000U/mL聚合酶为约2μΜDSC，可达到每5,000U/mL聚合酶为2mM DSC。更优选地，范围为每5,000U/mL聚合酶为约20μΜDSC，可达到每5,000U/mL聚合酶为200μΜDSC。在一个实施方式中，最优选的DSC比聚合酶浓度为约5,000U/mL Taq比200μΜDSC。

使用2倍连续稀释法测定Taq DNA聚合酶的特异性活性。在含有还原型甘油（5%）的Taq-B DNA聚合酶储备溶液（[Taq-B]f=0.009-0.0001μg/μL）中进行酶的稀释，并加至含有12.5μg小牛胸腺DNA，25mM TAPS（pH 9.3），50mM KCl，1mM DTT，4mCi/mL 3H-dTTP和200μΜdNTP的50μL反应物中。在75°C下温育反应物10分钟，投入冰上，并使用Sambrook和Russell的方法进行分析（Molecular Cloning,v3,2001,pp.A8.25-A8.26）。

本发明提供了来源于例如具有阻断分子的双链DNA寡核苷酸的新型分离的核酸复合物，见表1。核酸复合物显示抑制由副反应如背景DNA的错误引发和/或引物的低聚化引起的非特异性扩增产物的生成或非靶寡核苷酸的扩增的能力。发现含有核酸复合物的扩增反应可提高靶寡核苷酸的产生。此外，表1的核酸复合物互相之间具有30%的序列同一性。

表1

在一个实施方式，本发明包括的优选核酸复合物的序列显示在表1中。在表中使用的缩写为：“InvT”=反向脱氧胸苷（dT）；“Phospho”=磷酸基。核酸复合物显示出与许多序列的相似性，使用BLAST进行相似性搜索确定E值在1以下（Altschul,S.F.等人的J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)）。

本文所使用的术语“核酸复合物”和“双链复合物”（DSC）具有相同含义并且可互换使用。

本发明进一步涉及核酸复合物，其中长度为约16个核苷酸的双链寡核苷酸利用连接于任一端的阻断分子构成，其具有最佳解链温度的序列，并且在双链核酸的任一端具有高的GC核苷酸百分比。本发明涉及经一种或多种下列方式修饰的核酸复合物：防止它们在扩增反应中延伸，具有可防止非特异性扩增产物生成的解链温度，在任一端具有高GC百分比，其具有比AT键更高的解链温度，因此能够更好地将核酸复合物保持为双链。本发明进一步涉及含有具有阻断分子的双链核酸和聚合酶的储备缓冲剂；还涉及包括核酸复合物的反应缓冲剂。

由于双链核酸复合物在高温下不被不可逆变性，因此提高的双链核酸复合物的稳定性可使它们在其它热启动方法被抑制的条件下应用，从而增加能够采用核酸复合物降低非特异性扩增产物的机会。例如，在使用多个特异性引物的多元PCR中的扩增，非特异性扩增产物的可能性对反应产率具有负面影响，而化学修饰型和抗体型热启动方法在初始热变性步骤后大部分失效，本发明的核酸复合物可在反应混合物最易发生非特异性引发时的前几个扩增循环期间持续相互作用。此外，核酸复合物可用于，但不限于等温扩增反应、可变数串联重复（Variable Number Tandem Repeat）（VNTR）PCR、不对称PCR、长PCR、巢式PCR、定量PCR、降落PCR、组装PCR、菌落PCR、逆转录PCR、连接介导PCR、和甲基化特异性PCR。

双链核酸复合物在热启动PCR反应中的应用可惊人地提高所需靶序列的扩增产率，同时可显著降低不需要的序列的脱靶扩增。与不采用本文所公开的DSC技术的典型热启动PCR反应相比，两者均可通过降低室温下聚合酶的活性来实现（参见实施例5和图14-15）。在一个实施方式中，在热启动PCR反应中使用DSC提供了产率的至少两倍（2X）的提高。在另一个实施方式中，这样的使用提供了产率的至少五倍（5X）的提高，而在另一个实施方式中，这样的使用提供了产率的七倍（7X）或十倍（10X）以上的提高。在一个实施方式中，与未经受本发明所述方法或组合物的扩增的靶核酸分子的量相比，产率的提高量在约2X提高至约20X提高的范围内（例如2X、3X、4X、5X、6X、7X、8X、9X、10X、15X或20X）。类似地，在一个实施方式中，在热启动PCR反应中使用DSC提供了室温下（例如，在约20°C至约25°C之间）聚合酶活性的至少百分之五十（50%）降低。在又一个实施方式中，这样的使用提供了室温下聚合酶活性的至少百分之七十（70%）降低，而在又一个实施方式中，这样的使用提供了室温下聚合酶活性至少百分之八十（80%）以上的降低。在一个方面，与其中靶核酸分子未经受本发明的DSC的聚合酶活性相比，本发明提供了在约20°C至25°C之间温度下聚合酶活性的降低，其中降低范围在约50%至约90%之间（例如，降低约50%、60%、70%、80%或90%）。用于评估聚合酶活性的方法在本领域中是熟知的，并且包括标记的核苷酸掺入法。简言之，将可检测到的标记物掺入核酸分子中，并且可以例如在自动的基于荧光的测序仪上进行试验以测定聚合酶的活性，例如来自AppliedBiosystems（Life Technologies Corporation，Carlsbad，加利福尼亚）的自动的基于荧光的测序仪。可检测到的标记物的实例包括荧光染料、链霉亲和素共轭物（streptavidin conjugate）、磁珠、树枝状聚合物（dendrimer）、放射性标记物、酶、比色标记物、洋地黄毒苷元、生物素、纳米颗粒、和/或纳米晶体。本领域已知用于掺入标记物的方法。存在多种用于测量聚合酶活性的实验。如上所述，一个实例包括标记的核苷酸掺入法，其中DNA聚合酶实验利用DNA依赖性DNA聚合酶的能力以将修饰的核苷酸掺入新合成的DNA中。一些实验可为放射性的，而其它使用非放射性标记物（例如，Cat.No.1669885Roche Molecular Biochemicals，印第安纳波利斯，印第安纳州）。通过DNA聚合酶的活性使标记的核苷酸以最佳比率掺入相同的DNA分子中。可使用任意数量的检测方法来评估作为DNA聚合酶活性参数的所合成DNA的检测和定量。

类似地，用于评估PCR反应产率的方法在本领域中是熟知的，并且包括定量PCR（qPCR）法。例如，也可对产率进行标记，并且在每次PCR循环之后，实时PCR仪可测量标记物（例如，荧光）的水平。可通过将结果与标准曲线相比来测定产量，其中所述标准曲线由已知量的连续稀释（例如，未稀释的、1:4、1:16、1:64）的实时PCR产生。Nolan,Tania等人的Nature Protocols 1:1559-1582(2006)。

术语“引物”是指在可诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，能够充当DNA合成的起始点的寡核苷酸。

本发明的核酸复合物可以为DNA或RNA，包括双链RNA或DNA。在本发明的另一个实施方式中，核酸复合物的寡核苷酸可以由修饰核苷酸或合成核酸分子构成。修饰包括但不限于作为整体向核酸或向核酸复合物提供并入了额外电荷、极化性、氢键、静电相互作用和流变性（立体易变性，fluxionality）的其它化学基团的修饰。修饰包括但不限于骨架修饰、甲基化、3’和5’修饰。在一个方面中，阻断分子包括一个或多个具有修饰碱基、修饰糖和/或修饰磷酸基的核苷酸类似物。

在另一个实施方式中，复合物的核酸为例如但不限于修饰的核酸，其具有脱碱基部分（abasic moiety）、反向脱碱基部分、反向核苷酸基团、3’至3’连接的反向脱氧核苷酸、二糖核苷酸、锁核酸、2’-氨基嘧啶、2’-氟嘧啶、2’-O-甲基核苷酸、硼烷磷酸酯核苷酸间键合、5-修饰嘧啶、4’-硫嘧啶、硫代磷酸酯核苷酸间键合。

在另一个实施方式中，核酸复合物的核苷酸为合成寡核苷酸。合成寡核苷酸广泛用于各个领域如分子生物学，包括基因工程；用于治疗，例如用于反义寡核苷酸；用于诊断及制备作为核酶的催化剂。例如，PCR技术通常采用寡核苷酸作为引物以扩增基因材料，并且为了各种目的而制备合成基因，包括为了有效表达而对密码子使用进行优化。有用的合成寡核苷酸包括含有天然核糖核苷酸和脱氧核苷酸的聚合物，以及含有修饰核苷酸如碱基修饰、糖修饰和磷酸基修饰的核苷酸的聚合物。

优选地，核酸复合物由长度为约9至40个核苷酸，并且甚至更优选长度为约14至20个核苷酸的双链寡核苷酸构成。在最优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸长度为16至19个核苷酸。

当在其阅读的核苷酸序列中遇到尿嘧啶（U）碱基时，分离自古细菌种的DNA聚合酶（例如，PFU DNA聚合酶）通常发生（活性）延滞（stall）。参见例如Hogrefe等人的Proc.Natl.Acad.Sci.USA,99:596-602(2002)；Fogg等人的Nat.Struct.Biol.,9(12):922-927(2002)。因此，根据本发明，当采用来自古细菌种的DNA聚合酶时，在本文所公开的双链核酸复合物中引入一个或多个尿嘧啶（U）碱基可显著降低室温下（在PCR反应启动之前）不期望的聚合酶活性。因此，在本发明的一个实施方式中，提供了如本文所公开的双链核酸复合物，但进一步包括至少一个尿嘧啶（U）碱基。在另一个实施方式中，本文所公开的方法采用包括上述尿嘧啶碱基的DSC和至少一种来源于古细菌种的耐热DNA聚合酶。在一个实施方式中，在热启动PCR反应中含有尿嘧啶的DSC的上述使用提供了室温下聚合酶活性的至少百分之五十（50%）降低。在又一个实施方式中，上述使用提供了室温下聚合酶活性的至少百分之七十（70%）降低；而在又一个实施方式中，上述使用提供了室温下聚合酶活性的百分之八十（80%）以上的降低。在一个方面，与其中靶核酸分子未经受本发明的DSC的聚合酶活性相比，本发明使用含有尿嘧啶的DSC提供了在约20°C至25°C之间的温度下聚合酶活性的降低，其中范围在约50%至约90%之间（例如，降低约50%、60%、70%、80%或90%）。用于评估聚合酶活性的方法在本领域中是熟知的，并且包括标记的核苷酸掺入法。

认为本发明的DSC具有至少两种抑制方法。第一，DSC自身有效地充当DNA聚合酶的抑制剂而无需反向的dT。在具有DNA聚合酶的溶液中，虽然一些双链DNA序列似乎可提供比其它序列更有效的抑制，但DNA聚合酶会自然结合于本发明的DSC，参见Kainz等人的BioTechniques28:278-282(February 2000)。第二，当PCR反应开始其第一轮循环时，当每条链由于反应温度超过DSC的解链温度而分离时，DSC可从DNA聚合酶上脱落（移出，dislodge）。在冷却后，DSC的每条链通常会重组以便与其互补物杂交，其中其抑制了DNA聚合酶的聚合活性。然而，如果DSC意外地与靶模板DNA杂交，那么由于反向dT缺少对于DNA聚合酶添加其它核苷酸所必需的3’羟基，因此反向dT的存在可有效地抑制DNA聚合酶延伸和形成竞争性次级产物。此外，反向dT可免受外切核酸酶的作用。由于其具有不寻常的结构，因此外切核酸酶不能去除反向dT，否则其降解可使DSC非特异性退火并充当DNA延伸的引物。

在一个实施方式中，本发明的核酸分子为“分离的”；如本文所使用，“分离的”核酸分子或核苷酸序列用于指核酸分子或核苷酸序列，其侧面不存在通常（实质上）在基因或核苷酸序列（如在基因组序列中）侧面的核苷酸序列，和/或完全或部分由其它转录序列纯化。例如，相对于其天然存在的复杂的细胞环境可基本上分离本发明的分离核酸。在一些情况下，分离的材料可形成部分组合物、缓冲体系或试剂混合物。因此，分离的核酸分子或核酸复合物的核苷酸序列可包括化学合成或通过重组手段合成的核酸分子或核苷酸序列。此外，分离的核苷酸序列包括溶液中的部分或基本纯化的核酸分子。

在一个实施方式中，本发明包括分离的核酸分子，所述分离的核酸分子具有包括共价连接的阻断分子的SEQ ID NO:1-16的任一个中的核酸序列；具有SEQ ID NO:1-16的任一个中的约80%至约100%之间连续核苷酸的核酸序列；具有SEQ ID NO:1-16的任一个中的约7至约20个之间连续核苷酸的核酸序列；它们的互补物；以及它们的任意组合。

如本文所使用，术语“DNA分子”或“核酸分子”包括正义链和反义链，cDNA，互补DNA，重组DNA，RNA，完全或部分合成的核酸分子，PNA和其它合成DNA同系物。核苷酸“变体”或“衍生物”是在具有一个或多个核苷酸缺失、取代或添加方面与所述的核苷酸序列不同的序列，只要分子在PCR过程中阻断了非特异性扩增。

本发明还包括与DNA序列基本上互补的核酸序列，DNA或RNA，PNA或其它DNA类似物。如本文中所定义的，基本上互补的类似物或衍生物是指核酸无需反映本发明所述序列的准确顺序，但序列必须足够相似以允许与本发明的核酸序列在高度严格的条件下杂交。例如，可以将非互补碱基散布在核苷酸序列中，或序列可比本发明的核酸序列更长或更短，条件是序列具有足够数量的碱基以在PCR过程中降低非特异性扩增。

在另一个实施方式中，本发明包括含有本文所述的任意核酸分子优选SEQ ID NO:1-16的长度为至少约7至约20个连续核苷酸或更长（例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20）的分子。可替换地，本发明的分子包括具有本文所述的任意一个序列优选SEQ ID NO:1-16的长度为约60%至约100%的连续核苷酸的核酸序列。

本发明还涉及与本文所述的核酸复合物的序列具有基本同一性的核酸复合物；特别优选与本文所述的核苷酸序列具有至少约10%，优选至少约20%，更优选至少约30%，更优选至少约40%，甚至更优选至少约50%，还更优选至少约70%，仍然更优选至少约80%，甚至更优选至少约90%同一性，并且还更优选95%同一性的核苷酸序列。在该情况下特别优选具有本文所述的核酸复合物活性的核酸复合物。

为了测定两种核酸复合物的百分比同一性，出于最佳比较的目的对序列进行比对（例如，可将间隙引入第一核苷酸序列的序列中）。然后对在相应核苷酸位置的核苷酸进行比较。当在第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则在该位置的分子是相同的。两个序列之间的百分比同一性是由序列共享的相同位置的数量的函数（即，%同一性=相同位置的数量/位置的总数量×100）。

本文所述的核酸复合物（例如，如表1所示的核酸复合物）用于在扩增反应例如PCR中降低非特异性扩增。通常参见PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification(ed.H.A.Erlich,FreemanPress,NY，N.Y.,1992)；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(eds.Innis等人的Academic Press,San Diego,Calif.,1990)；Mattila等人的Nucleic Acids Res.19,4967(1991)；Eckert等人的PCR Methods andApplications 1,17(1991);PCR(eds.McPherson等人的IRL Press,Oxford)；和美国专利号4,683,202。

术语“扩增”是指增加特异性或靶多核苷酸的拷贝数。例如，PCR是使用聚合酶和两个寡核苷酸引物来扩增多核苷酸序列的方法，所述引物之一与在待扩增序列一端的两条多核苷酸链之一互补，而另一个与在另一端的两条多核苷酸链的另一个互补。由于新合成的DNA链随后可充当相同引物序列的另外的模板，因此连续几轮的引物退火（primer annealing）、链延伸和解离可产生快速和高特异性的所需序列的扩增。PCR也可用于检测DNA样品中指定序列的存在。在一个实施方式中，使用PCR对样品的DNA进行扩增或复制。PCR的方法在本领域中是已知并例如描述在Mullis,K.B.Scientific American 256:56-65(1990)中。

简言之，使用DNA聚合酶进行PCR，包括例如分离自基因工程菌的聚合酶。优选的聚合酶来源于耐热生物，如栖热水生菌（Taq）。本文描述了其它聚合酶，包括耐热古细菌聚合酶。提供了聚合酶、以及引物、本发明的DSC复合物、以及四种核苷酸碱基的供应物（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶）。在一些条件下（例如，95°C下30秒），DNA变性使得链分离。当DNA溶液冷却时，引物与DNA链结合，随后加热溶液以促进Taq聚合酶生效。Mullis,K.B.Scientific American 256:56-65(1990)。

其它合适的扩增方法包括连接酶链式反应（LCR）（参见Wu和Wallace,Genomics,4:560(1989),Landegren等人的Science,241:1077(1988),transcription amplification(Kwoh,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173(1989)，和自主序列复制（Guatelli等人的Proc.Nat.Acad.Sci.USA,87:1874(1990)）和基于核酸的序列扩增（NASBA）。后两种扩增方法涉及基于等温转录的等温反应，其可分别以约30或100比1的比率产生单链RNA（ssRNA）和双链DNA（dsDNA）作为扩增产物。

可对扩增的DNA进行放射性标记并用作用于筛选文库或其它合适载体的探针，以确定核苷酸序列的同源性。可分离相应的克隆，体内切除后可获得DNA，可通过本领域认可的方法在任一方向或两个方向上对克隆的插入物进行测序，以确定编码合适分子量的蛋白的正确的阅读框架。例如，可使用双脱氧链终止法或Maxam Gilbert法来实现对本发明的同源核酸分子的核苷酸序列的直接分析（参见Sambrook等人的Molecular Cloning,A Laboratory Manual (2nd Ed.,CSHP，New York 1989)；Zyskind等人的Recombinant DNA Laboratory Manual,(Acad.Press,1988)）。使用这些或类似方法，可以分离、测序并进一步表征一种或多种蛋白和编码蛋白的DNA。

本发明的核酸复合物也可用于RNA的扩增，如用于扩增mRNA的方法，包括相应cDNA的合成。

在另外的实施方式中，DNA聚合酶选自Taq DNA聚合酶、BST DNA聚合酶、PFU DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶，T7DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、Phi29DNA聚合酶、RB69DNA聚合酶。来自古细菌种的耐热DNA聚合酶有市售（例如New England Biolabs,Inc.；Stratagene,Inc.），并包括9°N DNA聚合酶和Vent DNA聚合酶。

在一个实施方式中，核酸复合物可结合于耐热DNA聚合酶。在第二个实施方式中，核酸复合物仅暂时与DNA聚合酶结合，DNA聚合酶迅速变成未结合并重新结合于相同核酸复合物或另一个核酸复合物。在另一个实施方式中，在温度低于核酸解链温度的扩增反应中，核酸复合物可降低非特异性扩增产物的量。在另一个实施方式中，核酸复合物为可抑制扩增反应中耐热DNA聚合酶活性的DNA结构，其中所述DNA结构具有约51.5°C的解链温度，或DNA结构可降低非特异性扩增产物的量。

此外，核酸复合物的核酸包括阻断分子。在一个优选的实施方式中，阻断分子可防止由聚合酶引起的核酸复合物的延伸。在一个可替换的实施方式中，阻断分子可防止由特定聚合酶如DNA聚合酶引起的延伸。阻断分子可连接于核酸的5’或3’端。在另一个优选的实施方式中，阻断分子可提供对5’和/或3外切核酸酶消化的抵抗性。在最优选的实施方式中，阻断分子为共价连接于3’端的反向脱氧胸苷，并且可防止由耐热DNA聚合酶引起的延伸，并提供对3’外切核酸酶活性的抵抗性。

在一个实施方式中，方法和试剂使用在3’羟基端阻断的双链寡核苷酸。在优选的实施方式中，Taq DNA聚合酶与使用阻断分子帽化的双链寡核苷酸结合。阻断分子共价连接于寡核苷酸。在高温下通过在扩增反应中温育不能除去阻断分子。双链寡核苷酸和阻断分子的组合在本文中称为双链复合物（DSC）。在一个实施方式中，由于阻断分子，DSC不会被任何污染3’外切核酸酶降解，核酸也不能被聚合酶延伸。如果DSC单链意外地与反应引物或模板发生杂交，则阻断分子可防止DSC充当非预期的引物并形成竞争性的污染产物。因此，本发明提供了用于提高核酸扩增反应性能的手段。本发明涉及但不限于由双链寡核苷酸构成的核酸复合物，其结合于DNA聚合酶并防止非特异性扩增产物的产生。双链核酸复合物的每条链包括阻断分子，其保护核酸复合物免受外切核酸酶降解，还可防止核酸复合物自身成为非特异性寡核苷酸引发的来源。

阻断分子定义为包括任何可防止由聚合酶引起的核酸复合物延伸的分子。阻断分子也可抵抗外切核酸酶的降解。在另外优选的实施方式中，阻断分子可防止由聚合酶引起的延伸以及防止外切核酸酶的切除。阻断分子可位于核酸复合物的3’或5’端。在最优选的实施方式中，阻断分子为反向dT。反向dT为脱氧胸苷的合成性核苷酸，其在核糖结构和胸苷碱基之间的键处于与标准脱氧胸苷相反的位置：

反向dT。

阻断分子的实例包括但不限于脱氧胸苷、双脱氧核苷酸、3’磷酸化，己二醇、间隔分子、1’2’-双脱氧核糖、2’-O-甲基RNA、锁核酸（LNA）、和可防止核酸复合物延伸和/或可抵抗外切核酸酶切除的合成或天然分子。

本发明还涉及在具有储存缓冲剂的溶液中包括如本发明的分离的核酸分子的DNA结构。这样的储存缓冲剂例如包括TRIS缓冲剂、MOPS、或HEPES缓冲剂。此外，本发明涉及包括本发明的核酸复合物和DNA聚合酶的储存缓冲剂。

因此，在一个实施方式中，本发明的核酸分子为连接阻断分子的双链核酸结构，其选自由下述组成的组：

a）由脱氧核糖核酸构成的核酸；

b）在核酸中部具有阻断分子的核酸；

c）阻断分子连接于核酸任一端的核酸；

d）阻断分子连接于核酸3’端的核酸；

e）可降低非特异性扩增的核酸；

f）核酸序列为来自表1的任意序列的核酸；

g）解链温度约为48.9°C至51.5°C的核酸；

h）GC含量约为64.3%的核酸；

i）其中核酸具有一个或多个修饰核苷酸的核酸；

j）在其中含有一个或多个人工核酸的核酸；

k）其中阻断分子为间隔分子的核酸；

m）其中阻断分子为反向核苷酸的核酸；

n）a）、b）、c）、d）、e）、f）、g）、h）、i）、j）、k）、l）、m）的片段或衍生物。

在另一个实施方式中，本发明涉及单独和在各种组合物中的分离的核酸，如：

a）包括DSC1序列的核酸；

b）包含DSC1核酸的储存缓冲剂；

c）包含DSC1核酸的反应缓冲剂；或

d）与DSC1的核酸序列具有至少90%序列同一性的DNA结构；和e）a）、b）或c）的片段或衍生物。

实施例1（图1）描述了PCR扩增，其显示本发明的DSC可有效防止由DNA聚合酶引起的延伸。掺入寡核苷酸的3’端的抑制分子可帽化自由羟基端，导致无产物扩增。

实施例1（图2）也描述了PCR扩增，其显示本发明的DSC未抑制pUC19质粒的1.1kb区域的成功扩增。与正向和反向反应引物序列相同的具有帽化3’端的双链分子的存在未抑制反应结果。

实施例2描述了PCR扩增的数量，包括标准PCR、市售的热启动PCR、和无需手动热启动条件的在本发明的双链复合物存在的情况下的PCR。实施例2描述了在大肠杆菌基因组DNA作为竞争性外源DNA存在的情况下，λ噬菌体DNA的1.9kb区域的检测。

图3示出了在DSC1、DSC2、DSC3、DSC3-1分子存在的情况下，PCR扩增的结果。在奇数泳道中使用λ噬菌体DNA的10,000个拷贝进行PCR扩增。所有反应包含1ng的大肠杆菌基因组DNA作为竞争性外源DNA。在未加入DSC分子的反应中，未实现产物的扩增。当在第1、第5、第7泳道中加入DSC分子时，可实现产物的扩增，并且产量不包括非特异性扩增。DSC分子的存在有利于在不损害产量的情况下检测靶带。

图4描绘了λDNA的1.9kb区域的扩增比较。在λDNA和1ng污染性大肠杆菌基因组DNA存在的情况下进行所有PCR反应。第1-4泳道示出了在DSC分子存在的情况下，使用Taq和Taq-B DNA聚合酶进行的产物扩增。Taq-B具有在其储存缓冲剂中的稳定剂。在第5-7泳道中，使用市售的化学修饰的热启动DNA聚合酶进行扩增。在DSC分子存在的情况下，扩增产物的产率与使用化学修饰的Taq获得的产率相当或更高。

图5A和图5B强调在DSC分子存在的情况下，λDNA的1.9kb区域的扩增。在图5A中，使用解链温度低于图3和图4中使用的引物的正向5’CTGGCTGACATTTTCG-3’（SEQ  ID  NO:17）和反向5’TATCGACATTTCTGCACC-3’（SEQ ID NO:18）引物进行PCR扩增。在图5B中，使用解链温度高于图3和图4中使用的引物的正向5’GAAGTCAACAAAAAGGAGCTGGCTGACATTTTCG-3’（SEQ ID NO:19）和反向5’CAGCAGATACGGGATATCGACATTTCTGCACC-3’（SEQ IDNO:20）引物进行PCR扩增。使用0.523pg的λDNA和1ng大肠杆菌基因组DNA进行PCR扩增。反应条件为在95°C下初始变性5min，接着进行在95°C下持续40s，在48°C或61°C下持续30s，在72°C下持续2min，最终在72°C下延伸7min的40个循环。结果显示在DSC1分子存在的情况下可实现产物的扩增。反应引物的解链温度和在较低/较高温度下退火不会对Taq-B DSC的性能有影响。

实施例3描述了在标准PCR、手动热启动PCR、热启动PCR、和在DSC分子存在的情况下的PCR中，人胎盘DNA的β-肌动蛋白基因的653-bp片段的扩增（图6）。在通常的PCR下，所需的带的产率被非特异性带的扩增折衷（图6，第11泳道）。

在手动热启动的条件下，产率升高但PCR特异性未升高（图6，第12和13泳道）。化学修饰的聚合酶具有特异性并且其扩增稳定的带（图6，第14泳道）。在第1-10泳道中，每个连续泳道中的DSC分子的解链温度升高约5°C。在解链温度较低的DSC分子存在的情况下进行的扩增得到的所需带产率较低（图6，第1-4泳道）。在解链温度居中的DSC分子存在的情况下进行的扩增结果与在手动热启动下的扩增所获得的结果相似（图6，第5-7泳道）。加入解链温度较高的DSC分子使反应的特异性升高，并且产生稳定的所需带（图6，第8-10泳道）。阻断分子的差异也会影响所需带的扩增。使用在3’端可能干扰反应成功扩增的不同阻断分子来帽化在图6中的第16和17泳道中所使用的DSC分子。

实施例4描述了在1000个拷贝至5个拷贝下扩增DNAA、B和C的100-120bp片段的一系列PCR反应。在本发明的DSC分子存在的情况下，在标准PCR、具有化学修饰酶的热启动PCR、和非热启动条件下进行PCR扩增。将在构建后立即运行的PCR扩增反应与在环境温度下温育24小时时间段后运行的PCR扩增反应进行比较。

图7A描绘了使用寡核苷酸混合物B进行的来自DNA B的100-bp产物的扩增。所有PCR扩增包含DNA B的1000个拷贝。在构建后立即进行图7A中的PCR扩增而无需在台顶预温育。存在于反应中的DNA的量足以使聚合酶特异性扩增而不会使产率折衷（图7A，第1-5泳道）。在所有泳道中存在与所需产物的扩增相对应的单一带。在图7A的构建下，无需在热启动条件下进行PCR扩增。

在图7B中，在23°C的环境温度下温育24小时后进行PCR扩增。与图7A中第4泳道的相同扩增相比，在通常的PCR条件下所需带的扩增大大降低。当在反应中加入本发明的DSC分子时，结果明显不同。反应中DSC分子的存在可提高扩增产率（图7B，第1-3泳道）。

图8示出了来自DNA B的100-bp产物的扩增。使用DNA的5个拷贝进行所有PCR扩增。在构建后立即进行PCR扩增，而无需在台顶预温育。在第1和第3泳道中，DSC分子的最终浓度为0.4μΜ，而在第2和第4泳道中，DSC的最终浓度为4μΜ。较高的DSC浓度未抑制扩增结果。含有两种DSC浓度的反应可扩增大量产物。

图9示出了来自DNA B的100-bp产物的扩增。使用DNA B的5个拷贝进行所有PCR扩增。在环境温度下台顶温育24小时后进行PCR扩增。在标准PCR条件下，温育期间可防止所需产物的成功扩增（图9，第6泳道）。第1-5泳道显示在4μΜ最终浓度下在不同DSC分子存在下的PCR扩增结果。在DSC1存在的情况下的扩增产率（图9，第1泳道）与使用化学修饰的酶所获得的产率（图9，第7泳道）相当。使用DSC 5和DSC12所获得的产率（图9，第2和3泳道）大于使用化学修饰的酶所获得的产率（图9，第7泳道）。在DSC13和DSC14存在的情况下进行的扩增结果与标准条件下通过PCR所获得的结果相似。

图10A-C分别示出了来自DNAA-C的100-120-bp产物的扩增。使用DNA的5个拷贝进行所有PCR扩增。在构建后立即进行PCR扩增，而无需在台顶预温育。DSC分子的最终浓度为4μΜ（图10A-C，第1-5泳道）。较高的DSC浓度未抑制扩增结果（图10A-C，第1-3泳道）。在那些反应中，存在与所需产物的扩增相对应的单一带。在DSC13和DSC14存在的情况下进行的PCR结果未导致产物的扩增，可能是由于它们的长度。在标准PCR条件下，存在与所需产物的扩增相对应的单一带（图10A-C，第6泳道）。由于在构建后立即进行PCR扩增，因此不需要在热启动条件下进行PCR（图10A-C）。

图11A-C分别描绘了来自DNAA-C的100-120-bp产物的扩增。使用DNA的5个拷贝进行所有PCR扩增。在23°C下台顶温育24小时后进行PCR扩增。DSC分子的最终浓度为4μΜ（图11A-C，第1-5泳道）。在DSC分子不存在的情况下进行的PCR扩增的结果为产物未发生扩增（图11A-C，第6泳道）。在DSC13和DSC14存在的情况下进行的扩增结果与热启动条件下通过PCR所获得的结果相似（图11A-C，第5和6泳道）。

在图11A中，在DSC1和DSC12存在的情况下的扩增产率与使用化学修饰的聚合酶所获得的产率相似（图11A，第1、3和7泳道）。在DSC5存在的情况下所获得的产率提高（图11A，第2泳道）。

在图11B中，在DSC1存在的情况下的扩增导致无产物形成（图11B，第1泳道）。然而，在DSC5和DSC12存在的情况下的扩增导致可检测到与靶产物相对应的单一带（图11B，第2和3泳道）。

在图11C中，在DSC1、DSC5和DSC12存在的情况下的扩增导致与使用化学修饰的聚合酶所获得的相当产率的产物形成（图11C，第1-3泳道）。然而，在DSC5和DSC12存在的情况下的扩增导致可检测到与靶产物相对应的单一带。

在图10和图11中所示出的试验中，在本发明的DSC5存在的情况下的扩增可得到最好的整体结果。

实施例5描述了一系列qPCR反应，其在1280个拷贝至5个拷贝下扩增DNAA、B、C和人胎盘DNA的100-120-bp片段。在本发明的DSC分子存在的情况下，在标准PCR、使用化学修饰酶的热启动PCR、和在非热启动条件下进行PCR扩增。

图12描绘了使用通过CY5荧光染料的检测进行的来自DNA C的120-bp产物形成的实时PCR分析。进行并行比较以评价Taq-B DSC1与市售的化学修饰的Taq。在每个反应中，DSC的最终浓度为0.4μΜ。一式四份地进行含有DNA C的1280-5个拷贝的qPCR扩增。在每个拷贝水平下，Taq DSC1的平均Ct值低于使用化学修饰Taq所获得的值。TaqDSC1的标准偏差稍高，在10个拷贝水平下最高。Taq DSC1和化学修饰的Taq的整体PCR效率和R平方值相当。

图13描绘了来自人胎盘DNA的HBB2的100-bp产物形成的实时PCR分析。进行并行比较以评价Taq-B DSC1与市售的化学修饰的Taq。在每个反应中，DSC1的最终浓度为0.4μΜ。一式四份地进行含有人胎盘DNA的1280-5个拷贝的qPCR扩增。在每个拷贝水平下，Taq-B DSC1的平均Ct值低于使用化学修饰的Taq所获得的值。Taq-B DSC1的标准偏差也稍低。在10个拷贝下，化学修饰的Taq的标准偏差高于可接受的值0.6，而对于Taq-B DSC1则在5个拷贝下发生。Taq-B DSC1和化学修饰的Taq的整体PCR效率和R平方值相当。

图14A和图14B示出了使用通过HEX荧光染料的检测进行的来自DNA B的100-bp产物形成的实时PCR分析。图14A示出了在使用2.5U的Taq-B和最终浓度为0.4μΜ的DSC1的25μL反应中的产物扩增。图14B显示在使用2.5U的Taq-B和最终浓度为0.2μΜ的DSC1的50μL反应中产物的扩增曲线。一式四份地进行含有DNA B的1000、100和10个拷贝的扩增反应。通过升高反应体积，Taq-B DSC1和化学修饰的Taq的最终幅度在每个拷贝水平下均升高，表明应使用较低单位/mL的酶。在10个拷贝水平下，Taq-B DSC1的增加更加急剧。与图14B中可测量的值相比，在那些反应中（图14A）没有可检测到的Ct值（扩增在阈值以下）。

图15A-C示出了使用通过HEX荧光染料的检测的进行来自DNA B的100-bp产物形成的实时PCR分析。一式四份地进行包含DNA B的1000、100、和10个拷贝的反应。在该试验中，对使用Taq-B、Taq-B DSC1、Taq-B DSC5、和化学修饰的Taq进行的qPCR扩增进行了比较。注意到反应中DSC5分子的最终浓度为1x-20x，其中1x为0.2μΜ，而20x为4μΜ。DSC1的最终浓度为0.2μΜ。

图15A描绘了使用每种酶组合在每种拷贝水平下所获得的平均Ct值。在没有DSC分子的情况下，Taq-B在10个拷贝水平下具有无法检测的Ct值。与使用化学修饰的Taq获得的值相比，在DSC分子存在的情况下进行的qPCR扩增具有可测量的Ct值。Ct值也会随着DSC浓度的升高而下降。在升高的DSC浓度的情况下可实现更高的PCR效率。

图15B示出了每种Taq-B DSC组合以及仅有Taq-B和快速启动（快速起始，FastStart）的扩增曲线。在升高的DSC浓度的情况下可实现更高的幅度。在10x下的Taq-B DSC5配方可超过化学修饰的Taq的性能。

图15C显示每种组合在每个拷贝水平下的最终幅度。总而言之，在浓度为10x的DSC5分子存在的情况下可实现最佳性能。

短语“基本由……组成”或“基本上由……构成”是指在本文所描述的任意实施方式中，所要求的发明生效或起作用所必需或需要的在所要求的发明中的要素。例如，在一个实施方式中，本发明的阻断双链核酸复合物基本上由如本文所述的双链核酸复合物和阻断分子两者组成。类似地，本发明的组合物、方法、试剂盒或体系基本上由本文所述的DSC，以及DNA聚合酶，缓冲剂，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的供应物、和也如本文所述的引物构成。

实施例

实施例1

使用扩增pUC19质粒的1.1kb区域的体系进行Taq-B聚合酶催化的PCR（图1和2）。使用有或没有3’OH修饰的引物进行PCR扩增。一个引物集包括具有游离3’OH基团的5’-AACAATTTCACACAGGAACAGCT-3’（SEQ ID NO:21）和5’-GTTTTCCCAGTCACGACGT-3’（SEQ ID NO:22）。在第二个引物集中，5’AACAATTTCACACAGCAACAGC/反向T/-3’（SEQ ID NO:23）和5’-GTTTTCCCAGTCACGACG/反向T/-3’（SEQ IDNO:24）的3’OH基团的有效性被反向dT修饰阻断。反应含有1x PCR缓冲剂I（在25°C下，50mM KCl，1.5mM MgCl₂,20mM Tris-HCl，pH8.6）或lx PCR缓冲剂II（在25°C下，10mM(NH₄)₂SO₄，10mM KCl，2mM MgSO₄，0.01%Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚），50%甘油，20mM Tris-HCl，pH 8.8）。每个反应包含0.2mM dNTP，0.2μΜ的每种引物，4ng的pUC19DNA，和5U的Taq-B聚合酶。在2720PCR热循环仪（Applied Biosystems）上以100μL体积进行所有PCR反应。反应条件如下：95°C下初始变性3min，接着进行在95°C下持续20s，在55°C下持续20s，在68°C下持续1分钟15秒，最后在68°C下延伸7min的35个循环。在PCR后，将20μL的每种样品载于1%琼脂糖凝胶上并使用Alpha Innotech Corporation AlphaImager HP，2401Merced St.SanLeandro，CA 94577USA在紫外线下显影。料号（part number）为P725L的Taq-B聚合酶购自Enzymatics,Inc.100Cummings Center，Suite 336H，Beverly，MA 01915USA。DNA标准标记为编号为#N3232S的1kb DNA梯状带，购自New England Biolabs，240County Road Ipswich，MA 01938USA。

实施例2

在图3-5描绘的实验中所使用的PCR扩增方案包括以100μL反应体积的1x PCR缓冲剂I（在25°C下，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，20mMTris-HCl，pH 8.6），0.2mM dNTP，和5U的Taq聚合酶。在作为竞争性外源DNA的1ng大肠杆菌基因组DNA存在的情况下，在1000拷贝下，使用扩增λ噬菌体DNA的1.9kb区域的正向5’AAGGAGCTGGCTGACATTTTCG-3’（SEQ ID NO:25）和反向5’CGGGATATCGACATTTCTGCACC-3’（SEQ ID NO:26）引物各0.2μΜ进行PCR扩增。在AppliedBiosystems 2720热循环仪上进行PCR实验。反应条件为在95°C下初始变性5min，接着进行在95°C下持续40s，在56°C下持续30s，在72°C下持续2min，最后在72°C下延伸7min的40个循环。在PCR后，将20μL的每种样品载于1%琼脂糖凝胶上并使用Alpha Innotech CorporationAlphaImager HP在紫外线下显影。所使用的市售的热启动DNA聚合酶包括料号为N8080246的金牌酶（Amplitaq Gold），购自Applied Biosystems，Life Technologies Corp.5791Van Allen Way PO Box 6482，Carlsbad，CA92008USA的一个部门。编号为12032902001的快速启动Taq DNA聚合酶（快速起始Taq DNA聚合酶，FastStart Taq DNA polymerase）购自RocheDiagnostics Corporation，P.O.Box 50414，9115Hague Road，Indianapolis，IN 46250-0414USA。λPCR方案改编自Koukhareva和Lebedev (2009)Anal.Chem.81:12，并且将其全部内容以引用方式并入。

实施例3

在图6中对来自人胎盘DNA的β-肌动蛋白基因的653-bp片段进行扩增。所有100μLPCR反应含有1x PCR缓冲剂I（在25°C下，50mMKCl，1.5mM MgCl₂，20mM Tris-HCl,pH 8.6），0.2mM dNTP，各0.5μΜ的正向5’AGAGATGGCCACGGCTGCTT-3’（SEQ ID NO:26）和反向5’-ATTTGCGGTGGACGATGGAG-3’（SEQ ID NO:26）引物，100ng的模板，和5U的Taq聚合酶。热循环条件为在94°C下初始变性2min，接着进行在94°C下持续30s，在60°C下持续30s，在72°C下持续45s，最后在72°C下延伸7min的35个循环。在PCR后，将20μL的每种样品载于1%琼脂糖凝胶上并使用Alpha Innotech Corporation AlphaImagerHP在紫外线下显影。β-肌动蛋白的PCR方案采用自Lebedev等人的(2008)Nucleic Acid Research 31:20，将其内容以引用方式并入。

实施例4

在图7-11中描绘的实验中所使用的PCR扩增方案包括以25μL反应体积的1x qPCR缓冲剂、0.4mM dNTP、和2.5U的Taq聚合酶。可在1000个拷贝至5个拷贝下分别使用可扩增DNAA、B和C的100-120-bp片段的寡混合物、A-FAM、B-HEX、和C-CY5各1x进行PCR扩增。在qPCR反应缓冲剂中制备DNA靶系列稀释液。首先制备最终体积为5μL的含有dNTP、海藻糖、Taq酶和寡混合物的试验混合物，在其中加入20μL的靶混合物。在Applied Biosystems 2720热循环仪上进行PCR实验。反应条件为在95°C下初始变性10min，接着进行在95°C下持续30s，在56°C下持续1min的40个循环。在PCR后，将20μL的每种样品载于3%琼脂糖凝胶上并使用Alpha Innotech Corporation AlphaImager HP在紫外线下显影。DNA标准标记为编号为#N3231S的100bp DNA梯状带，购自New England Biolabs，240County Road Ipswich，MA 01938USA。

使用

探针检测进行的实时PCR实验

实施例5

在图12-15中描绘的实验中所使用的PCR扩增包括以25μL反应体积（在图14B中为25和50μL反应体积）的1x qPCR缓冲剂，0.4mMdNTP，和2.5U的Taq聚合酶。在1280个拷贝至5个拷贝下分别使用可扩增DNAA、B、C和人胎盘DNA的100-120-bp片段的寡混合物、A-FAM、B-HEX、C-CY5和HBB2各1x进行PCR扩增。在qPCR反应缓冲剂中制备DNA靶系列稀释液。首先制备最终体积为5μL的含有dNTP、海藻糖、Taq酶和寡混合物的试验混合物，在其中加入20μL的靶混合物。反应条件为在95°C下初始变性10min，接着进行在95°C下持续30s，在56°C下持续1min的40个循环。

将本文中所引用的所有参考文献、专利和/或专利申请的相关教导的全部内容以引用方式并入本文中。

虽然参照其优选的实施方式对本发明进行具体示出和描述，但本领域技术人员应当理解，在未偏离所附权利要求包括的本发明的范围的条件下可在其中进行形式和细节中的各种变化。

Claims (29)

1.一种用于核酸扩增的阻断双链核酸复合物，其中，所述复合物包括：

a.分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包括：

i.具有包括约9至约40个之间核酸碱基的第一序列的第一核酸链，和

ii.具有包括与所述第一序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链各自具有3’端和5’端，

其中，所述双链核酸分子具有在约50%至约70%之间范围内的胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）的百分比；以及

b.阻断分子，其中，所述阻断分子共价结合于所述第一核酸链、所述第二核酸链、或两者的所述3’端或所述5’端。

2.根据权利要求1所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述双链核酸分子具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度。

3.根据权利要求1所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述复合物包括DNA、或RNA。

4.根据权利要求1所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述阻断分子选自由脱氧胸苷、双脱氧核苷酸、3’磷酸化、己二醇、间隔分子、1’2’-双脱氧核糖、2’-O-甲基RNA、和锁核酸（LNA）组成的组。

5.根据权利要求1所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述阻断分子包括：

反向dT。

6.根据权利要求1所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述第一序列或所述第二序列进一步包括一个或多个尿嘧啶碱基。

7.一种用于核酸扩增的阻断双链核酸复合物，其中，所述复合物包括：

a.分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包括：

i.具有包括约9至约40个之间核酸碱基的第一序列的第一核酸链，和

ii.具有包括与所述第一序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链各自具有3’端和5’端，

其中，所述双链核酸分子具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度；

b.阻断分子，其中所述阻断分子共价结合于所述第一核酸链、所述第二核酸链、或两者的所述3’端或所述5’端。

8.根据权利要求7所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述阻断分子选自由脱氧胸苷、双脱氧核苷酸、3’磷酸化、己二醇、间隔分子、1’2’-双脱氧核糖、2’-O-甲基RNA、和LNA组成的组。

9.一种用于核酸扩增的阻断双链核酸复合物，其中，所述复合物包括：

a.分离的双链核酸分子，所述分离的双链核酸分子包括：

i.第一核酸链，所述第一核酸链具有与下述序列有高于或等于约70%同一性的第一核酸序列，下述序列包括：

a.SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或它们的组合，

b.SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或它们的组合的互补物，或

c.与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或它们的组合杂交的序列；以及

ii.具有包括与所述第一核酸序列互补的约9至约40个之间核酸碱基的第二序列的第二核酸链，其中所述第一核酸链和所述第二核酸链各自具有3’端和5’端，

其中，所述双链核酸分子具有在约25°C至约90°C之间范围内的解链温度；

b.阻断分子，其中所述阻断分子共价结合于所述第一核酸链、所述第二核酸链、或两者的所述3’端或所述5’端。

10.根据权利要求9所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述第一和第二核酸链的所述3’端包括下述阻断分子，其中当所述阻断双链核酸复合物与核酸聚合酶相互作用时，由此降低非特异性扩增产物。

11.根据权利要求9所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述复合物具有约48.9°C的解链温度。

12.根据权利要求9所述的阻断双链核酸复合物，其中，所述第一序列或所述第二序列进一步包括一个或多个尿嘧啶碱基。

13.一种用于核酸扩增的组合物，所述组合物包括：

a.缓冲剂；

b.根据权利要求1所述的阻断双链核酸复合物；以及

c.耐热聚合酶。

14.根据权利要求13所述的用于核酸扩增的组合物，其中，所述聚合酶为由下述组成的组中的DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶；BST DNA聚合酶；PFU DNA聚合酶；Klenow DNA聚合酶；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶；Phi29DNA聚合酶；以及RB69DNA聚合酶。

15.根据权利要求13所述的用于核酸扩增的组合物，其中，浓度范围在每5,000U/mL聚合酶为约2μΜ核酸复合物至每5,000U/mL聚合酶为2mM核酸复合物之间。

16.根据权利要求13所述的用于核酸扩增的组合物，其中，所述缓冲剂包括TRIS缓冲剂、MOPS、或HEPES缓冲剂。

17.一种扩增靶核酸分子的方法，所述方法包括：

将所述靶核酸分子与DNA聚合酶和根据权利要求1所述的双链核酸复合物接触，其中所述双链核酸复合物在约25°C至约90°C范围的温度下结合于所述DNA聚合酶；

其中，获得扩增的靶核酸分子，并且与未与所述双链核酸复合物接触相比，减少了一种或多种非特异性扩增产物或次级产物的产生。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，与未与所述双链核酸复合物接触的靶核酸分子的聚合酶活性相比，降低了在约20°C至25°C之间温度下的聚合酶活性。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，在约20°C至25°C之间温度下的聚合酶活性降低在约50%至约90%之间的范围内。

20.根据权利要求17所述的方法，其中，与未与所述双链核酸复合物接触时获得的靶核酸分子的量相比，扩增的靶核酸分子的量增加。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，获得的扩增靶核酸的量增加在约2X至约20X之间的范围内。

22.一种扩增靶核酸分子的方法，所述方法包括：

将所述靶核酸分子与来自古细菌种的DNA聚合酶和根据权利要求6所述的双链核酸复合物接触，其中，所述双链核酸复合物在约25°C至约90°C范围的温度下结合于所述DNA聚合酶；

其中，获得扩增的靶核酸分子，并且与未与所述双链核酸复合物接触相比，减少了一种或多种非特异性扩增产物或次级产物的产生。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，与未与所述双链核酸复合物接触的靶核酸分子的聚合酶活性相比，降低了在约20°C至25°C之间温度下的聚合酶活性。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，在约20°C至25°C之间温度下的聚合酶活性降低在约50%至约90%之间的范围内。

25.一种扩增靶核酸分子的方法，所述方法包括：

a.将缓冲剂，所述靶核酸分子，一种或多种引物，DNA聚合酶，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的供应物，以及根据权利要求1所述的双链核酸复合物混合；

b.通过在一个或多个循环中升高温度使得所述靶核酸分子扩增，其中温度范围在约25°C至约90°C之间，

其中，获得扩增的靶核酸分子，并且与未与所述双链核酸复合物接触相比，减少了一种或多种非特异性扩增产物或次级产物的产生。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，与未与所述双链核酸复合物接触的靶核酸分子的聚合酶活性相比，降低了在约20°C至25°C之间温度下的聚合酶活性。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，与未与所述双链核酸复合物接触的靶核酸分子相比，增加了扩增的靶核酸分子的量。

28.一种用于核酸扩增的试剂盒；所述试剂盒包括：

a.根据权利要求1所述的阻断双链核酸复合物；以及

b.聚合酶。

29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中，所述聚合酶为由下述组成的组中的DNA聚合酶：Taq DNA聚合酶；BST DNA聚合酶；PFU DNA聚合酶；Klenow DNA聚合酶；T7DNA聚合酶；T4DNA聚合酶；

Phi29DNA聚合酶；以及RB69DNA聚合酶。

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