BR112012017152A2

BR112012017152A2 - aparelho de convecção térmica de dois estágios e usos do mesmo.

Info

Publication number: BR112012017152A2
Application number: BR112012017152-6A
Authority: BR
Inventors: Hyun Jin Hwang
Original assignee: Ahram Biosystems, Inc.
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2011-01-11
Publication date: 2020-10-06
Also published as: US10086375B2; CN102803465A; AU2016206392A1; KR20120116473A; JP2016039836A; EP2524027A2; CN102803465B; KR20180136004A; EP2524027A4; KR101931235B1; US20190210028A1; WO2011086498A2; JP6427483B2; AU2016206392B2; WO2011086498A3; JP5865261B2; KR102032523B1; CN104630056A; AU2011206360A1; JP2013516976A

Abstract

APARELHO DE CONVENÇÃO TÉRMICA DE DOIS ESTÁGIOS E USOS DO MESMO. A presente invenção refere-se a um aparelho de convecção térmica de múltiplos estágios tal como um aparelho de convecção térmica em dois estágios e usos do mesmo. Em uma modalidade, o aparelho de convecção térmica em dois estágios inclui um elemento de formação de temperatura que ajuda a reação de cadeia de polimerase mediada a convecção térmica (PCR). A presente invenção tem uma grande variedade de aplicações incluindo amplificação de ácido nucleico sem equipamento inconveniente e antieconômico associado com muitos dispositivos da técnica anterior. Em uma modalidade típica, o aparelho pode se encaixar na palma da mão do usuário para uso como um dispositivo de amplificação de PCR portátil, simples de operar e de baixo custo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "APARELHO DE CONVECÇÃO TÉRMICA DE DOIS ESTÁGIOS E USOS DO MESMO".

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO O presente pedido reivindica prioridade ao pedido provisório US 5 No. 61/294,446 como depositado em 12 de Janeiro de 2010, a descrição do qual se encontra aqui incorporada por referência. Campo da Invenção A presente invenção caracteriza um aparelho de convecção tér- mica de múltiplos estágios, particularmente um aparelho de convecção tér- mica de dois estágios e usos do mesmo. O aparelho inclui pelo menos um elemento de formação de temperatura que ajuda uma reação de cadeia de polimerase (PCR). A presente invenção tem uma grande variedade de apli- cações incluindo amplificar uma matriz de DNA sem o hardware inconveniente e com frequência antieconômica associado com os dispositivos da técnica an- terior. Em uma modalidade, o aparelho pode se adaptar na palma da mão do usuário para uso como um dispositivo de amplificação de PCR portátil.

ANTECEDENTES A reação de cadeia de polimerase (PCR) é uma técnica que am- plifica uma sequência de polinucleotídeo a cada momento em que o ciclo de mudança de temperatura é concluído. Vide, por exemplo, PCR: A Practical Approach, por M. J. McPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, por Innis, et al., Academic Press (1990), e PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989). PCR é também descrito em muitas patentes, incluindo Patentes US Nos. 4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; 4,889,818; 5,075,216; 5,079,352; 5,104,792; 5,023,171; 5,091,310; e 5,066,584. Em muitas aplicações, PCR envolve desnaturar a polinucleotí- deo de interesse ("matriz"), seguido por recozimento de um oligonucleotídeo de iniciador desejado ("iniciador") para a matriz desnaturada. Após o recozi- mento, a polimerase catalisa a síntese da nova fita de polinucleotídeo que incorpora e estende o iniciador. Esta série de etapas: desnaturação, recozi-

mento do iniciador, e extensão do iniciador, constitui um único ciclo de PCR.

As referidas etapas são repetidas muitas vezes durante amplificação de PCR.

Na medida em que os ciclos são repetidos, a quantidade de po- linucleotídeo recém sintetizado aumenta geometricamente.

Em muitas mo- 5 dalidades, iniciadores são selecionados em pares que pode recozer em fitas opostas de um determinado polinucleotídeo de dupla fita.

Neste caso, a re- gião entre os dois campos de recozimento pode ser amplificado.

Há uma necessidade de variar a temperatura da mistura de rea- ção durante um experimento de PCR de múltiplos ciclos.

Por exemplo, a desnaturação de DNA tipicamente ocorre em cerca de 90°C a cerca de 98°C ou uma temperatura mais elevada, o recozimento de um iniciador para o DNA desnaturado é tipicamente realizado em cerca de 45°C a cerca de 65°C, e a etapa de estender os iniciadores recozido s com a polimerase é tipicamente realizada em cerca de 65°C a cerca de 7 5°C.

As referidas eta- pas de temperatura devem ser repetidas, em sequência, para PCR para progredir de modo ótimo.

Para satisfazer a referida necessidade, uma variedade de dispo- sitivos comercialmente oferecidos foram desenvolvidos para realizar PCR.

Um componente significativo de muitos dispositivos é um "ciclizador" térmico no qual um ou mais elementos do controle de temperatura (algumas vezes chamados "blocos de aquecimento") mantêm uma amostra de PCR.

A tem- peratura do bloco de aquecimento é variada em um período de tempo para suportar a ciclagem térmica.

Infelizmente, os referidos dispositivos sofrem de inconvenientes significativos.

Por exemplo, a maioria dos dispositivos são grandes, inconveni- entes, e tipicamente onerosos.

Grandes quantidades de energia elétrica é em geral necessária para aquecer e resfriar o bloco de aquecimento para suportar a ciclagem térmica.

Usuários com frequência precisam de extenso treinamento.

Assim sendo, os referidos dispositivos não são em geral ade- quados para uso em campo.

Tentativas de se superar os referidos problemas não foram intei- ramente bem sucedidas.

Por exemplo, uma tentativa envolveu o uso de múl-

tiplos blocos de aquecimento do controle de temperatura no qual cada bloco é mantido na temperatura desejada e a amostra é movida entre blocos de aquecimento.

Entretanto, os referidos dispositivos sofrem de outros inconve- nientes tais como a necessidade de maquinário complicado para mover a 5 amostra entre os diferentes blocos de aquecimento e a necessidade de aquecer ou resfriar um ou poucos blocos de aquecimento de cada vez.

Houve algum esforço para usar convecção térmica em alguns Processos de PCR.

Vide Krishnan, M. et al. (2002) Science 298: 793; Whee- ler, E.K. (2004) Anal.

Chem. 76: 4011-4016; Braun, D. (2004) Modern Physics Letters 18: 775-784; e WO02/072267. Entretanto, nenhuma das re- feridas tentativas produziu um dispositivo da convecção térmica de PCR que seja compacto, portátil, mais acessível e com a menos necessidade signifi- cativa de energia elétrica.

Adicionalmente, os referidos dispositivos de con- vecção térmica com frequência sofrem de baixa eficiência de amplificação de PCR e limitação no tamanho de amplicon.

Sumário A presente invenção proporciona um aparelho de convecção térmica de múltiplos estágios, particularmente um aparelho de convecção térmica de dois estágios e usos do mesmo.

O aparelho em geral inclui pelo menos um elemento de formação de temperatura para ajudar uma reação de cadeia de polimerase (PCR). Como descrito abaixo, um elemento típico de formação de temperatura é uma característica estrutural e/ou de posiciona- mento do aparelho que suporta PCR por convecção térmica.

A presença do elemento de formação de temperatura aumenta a eficiência e a velocidade da amplificação de PCR, suporta miniaturização, e reduz a necessidade de energia significativa.

Em uma modalidade, o aparelho prontamente se encai- xa na palma da mão do usuário e tem baixa necessidade de energia o sufi- ciente para a operação da bateria.

Na referida modalidade, o aparelho é me- nor, menos oneroso e mais portátil do que muitos dispositivos de PCR da técnica anterior.

Assim sendo, e em um aspecto, a presente invenção caracteriza um aparelho de convecção térmica de dois estágios adaptado para realizar amplificação de PCR por convecção térmica ("aparelho"). Preferivelmente, o aparelho tem pelo menos um de e preferivelmente todos dos elementos a seguir como componentes operacionalmente ligados: (a) uma primeira fonte de calor para aquecer ou resfriar um ca- 5 nal e compreendendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo, o canal sendo adaptado para receber um recipiente de reação para realizar PCR, (b) uma segunda fonte de calor para aquecer ou resfriar o canal e compreendendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo, a su- perfície de fundo voltada para a superfície de topo da primeira fonte de calor, em que o canal é definido por uma extremidade de fundo que entra em con- tato com a primeira fonte de calor e um orifício perfurado contíguo com a superfície de topo da segunda fonte de calor, e adicionalmente em que os pontos centrais entre a extremidade de fundo e o orifício perfurado formam um eixo de canal sobre o qual o canal é disposto, (c) pelo menos um elemento de formação de temperatura adap- tado para ajudar PCR por convecção térmica; e (d) um orifício receptor adaptado para receber o canal dentro da primeira fonte de calor.

Também proporcionado é um método de produzir o aparelho an- terior cujo método inclui montar cada de (a)-(d) em uma combinação operá- vel suficiente para realizar PCR por convecção térmica como descrito aqui.

Em outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma centrífuga de PCR de convecção térmica ("Centrífuga de PCR") adaptada para realizar PCR usando pelo menos um aparelho como descrito aqui.

Adicionalmente proporcionado pela presente invenção é um mé- todo para realizar uma reação de cadeia de polimerase (PCR) por convec- ção térmica.

Em uma modalidade, o método inclui pelo menos uma de e pre- ferivelmente todas as etapas a seguir: (a) manter uma primeira fonte de calor compreendendo um orifí- cio receptor em uma faixa de temperatura adequada para desnaturar uma molécula de ácido nucleico de dupla fita e formar uma matriz de uma fita,

(b) manter uma segunda fonte de calor em uma faixa de tempe- ratura adequada para recozer pelo menos um iniciador de oligonucleotídeo para a matriz de uma fita, e (c) produzir convecção térmica entre o orifício receptor e a se- 5 gunda fonte de calor sob condições suficientes para produzir o produto de extensão de iniciador. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona recipientes de reação adaptados para serem recebidos por um aparelho da presente invenção. Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 é um desenho esquemático mostrando uma vista su- perior de uma modalidade do aparelho. Planos seccionados através do apa- relho (A-A e B-B) são ilustrados. As figuras 2A-C são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de uma modalidade do aparelho tendo uma primeira câmara

100. As figuras 2A-C são vistas transversais seccionadas tomadas ao longo de A-A (figuras 2A, 2B) e planos B-B (Figura 2C). As figuras 3A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho tomadas ao longo do plano A-A. cada aparelho tem uma primeira 100 e uma segunda 110 câmara de largu- ras desiguais com relação ao eixo de canal 80. As figuras 4A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada (A-A) de uma modalidade do aparelho. A figura 4B mostra uma vista expandida da região (identificada pelo círculo pontilhado na figura 4A). O aparelho tem uma primeira 100 e uma segunda 110 câmara. A região entre as primeira e segunda câmaras inclui um primeiro freio térmico 130. As figuras 5A-C são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de uma modalidade do aparelho. As figuras 5A-C são vistas transversais seccionadas tomadas ao longo de A-A (figuras 5A-B) e planos B-B (Figura 5C). A segunda fonte de calor 30 compreende uma primeira câ- mara 100 e uma primeira protuberância 33 dispostas simetricamente sobre o eixo de canal 80 que estende o comprimento da primeira câmara 100. A pri-

meira fonte de calor 20 compreende uma primeira protuberância 23. As figuras 6A-C são desenhos esquemáticos de uma modalida- de do aparelho tomadas ao longo de A-A (figuras 6A-B) e planos B-B (Figura 6C). As primeira 20 e segunda 30 fontes de calor incluem protuberâncias 5 (23, 24, 33, 34) que são cada uma das quais posicionadas simetricamente sobre o eixo de canal 80. A segunda fonte de calor 30 compreende uma pri- meira câmara 100. As figuras 7A-D são desenhos esquemáticos mostrando as mo- dalidades de canal do aparelho (plano A-A). As figuras 8A-J são desenhos esquemáticos mostrando as mo- dalidades de canal do aparelho.

O plano de seção é perpendicular ao eixo de canal 80. As figuras 9A-I são desenhos mostrando várias modalidades de câmara do aparelho.

O plano de seção é perpendicular ao eixo de canal 80. As partes hachuradas representam a segunda ou primeira fonte de calor.

As figuras 10A-P são desenhos mostrando várias câmaras e modalidades de canal do aparelho.

O plano de seção é perpendicular ao eixo de canal 80. As partes hachuradas representam a segunda ou a primei- ra fonte de calor.

As figuras 11A-B são desenhos esquemáticos mostrando várias modalidades de posicionamento.

A figura 11A mostra uma modalidade de posicionamento do aparelho mostrado na figura 5A.

O aparelho é inclinado (em um ângulo definido por θg) com relação à direção de gravidade.

A figura 11B mostra uma modalidade do aparelho na qual o canal 70 e a primeira câmara 100 são inclinados com relação à direção de gravidade dentro da segunda fonte de calor 30. A direção de gravidade permanece perpendicular com relação às fontes de calor.

As figuras 12A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas (plano A-A) de modalidades do aparelho.

A primeira câmara 100 é afunilada.

As figuras 13A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas (plano A-A) de uma modalidade do aparelho tendo um primeiro freio térmico 130 localizado entre as primeira 100 e segunda 110 câmaras dentro da segunda fonte de calor 30. As larguras das primeira e segunda câmaras são mostradas sendo diferentes.

A figura 13B mostra uma vista expandida da região identificada pelo círculo pontilhado mostrada na figura 5 13A para ilustrar os detalhes estruturais do primeiro freio térmico 130. As figuras 14A-D são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas (plano A-A) de modalidades do aparelho tendo um primeiro freio térmico 130 localizado no fundo da primeira câmara 100 (isto é, no fun- do da segunda fonte de calor 30). As figuras 14B e D mostram vistas expan- didas da região identificada pelo círculo pontilhado mostrada na figura 14A e D, respectivamente, para ilustrar os detalhes estruturais do primeiro freio térmico 130. A primeira câmara 100 tem uma parede retilínea nas figuras 14A-B e uma parede afunilada nas figuras 14C-D.

A figura 15 é um desenho esquemático mostrando uma vista seccionada (A-A) de uma modalidade do aparelho.

O orifício receptor 73 é assimetricamente disposto em torno do eixo de canal 80 e forma um espaço de orifício receptor 74. As figuras 16A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho tomadas ao longo do plano A-A.

A primeira fonte de calor 20 inclui um espaço de orifício receptor 74. Na moda- lidade mostrada pela figura 16B, o espaço de orifício receptor 74 inclui uma superfície de topo que é inclinada com relação ao eixo de canal 80. As figuras 17A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho tomadas ao longo do plano A-A.

A primeira fonte de calor 20 caracteriza a protuberância 23 disposta assimetri- camente em torno do orifício receptor 73. Na figura 17A, a protuberância 23 próxima ao orifício receptor 73 tem múltiplas superfícies de topo uma das quais tem uma maior altura e é mais próxima da primeira câmara 100. Na figura 17B, a protuberância 23 tem uma superfície de topo que é inclinada com relação ao eixo de canal 80 de modo que um lado tem uma maior altura e é mais próximo da primeira câmara 100 do que outro lado oposto ao orifí- cio receptor 73.

As figuras 18A-D são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho tomadas ao longo do plano A-A. Nas referidas modalidades, As primeira 20 e segunda 30 fontes de calor ca- racterizam protuberâncias 23 e 33 dispostas assimetricamente sobre o eixo 5 de canal 80. As protuberâncias 23 e 33 têm uma maior altura em um lado do que outro lado oposto ao eixo de canal 80. A extremidade de topo da protu- berância 23 e a extremidade de fundo da protuberância 33 têm múltiplas su- perfícies (figuras 18A e 18C) ou são inclinadas com relação ao eixo de canal 80 (figuras 18B e 18D). Nas figuras 18A e 18B, a primeira câmara 100 carac- teriza uma extremidade de fundo 102 na qual uma porção é mais próxima a um lado da protuberância 23 do que a outra porção oposta ao eixo de canal

80. Nas figuras 18C e 18D, a extremidade de fundo 102 da primeira câmara 100 é localizada essencialmente a uma distância constante a partir da super- fície de topo da protuberância 23. As figuras 19A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho tomadas ao longo do plano A-A. Nas referidas modalidades, a primeira fonte de calor 20 caracteriza a protu- berância 23 disposta simetricamente em torno do orifício receptor 73 e a se- gunda fonte de calor 30 caracteriza a protuberância 33 disposta assimetri- camente sobre o eixo de canal 80. Na figura 19A, a extremidade de fundo 102 da primeira câmara 100 caracteriza múltiplas superfícies de modo que uma porção da extremidade de fundo 102 que é mais próxima a um lado da protuberância 23 do que outra porção oposta ao eixo de canal 80. Nas figu- ras 19B, a extremidade de fundo 102 da primeira câmara 100 é inclinada com relação ao eixo de canal 80 de modo que uma porção da extremidade de fundo 102 é mais próxima à protuberância 23 do que outra porção oposta ao eixo de canal 80. As figuras 20A-C são desenhos esquemáticos mostrando várias modalidades do aparelho. A figura 20A mostra uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho na qual a primeira câmara 100 está dentro da se- gunda fonte de calor 30 e é disposta assimetricamente (descentralizada) sobre o canal 70. As figuras 20B-C mostram vistas seccionadas de uma mo-

dalidade do aparelho ao longo do plano A-A.

A primeira câmara 100 é dis- posta assimetricamente sobre o canal 70. Como mostrado na figura 20C, o freio térmico 130 é mostrado disposto assimetricamente sobre o canal 70 com a parede 133 que entra em contato com o canal 70 em um lado. 5 A figura 21 é um desenho esquemático mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho tomadas ao longo do plano A-A mostrando as primeira 100 e segunda 110 câmaras dispostas assimetrica- mente sobre o eixo de canal 80 dentro da segunda fonte de calor 30. A figura 22 é um desenho esquemático mostrando uma vista seccionada tomada ao longo do plano A-A de uma modalidade do aparelho na qual a primeira câmara 100 inclui uma parede 103 disposta em um ângu- lo com relação ao eixo de canal 80. As figuras 23A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho tomada isoladamente a partir do plano A-A com a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 dentro da segunda fonte de calor 30. Como mostrado na figura 23B, o apare- lho caracteriza um primeiro freio térmico 130 assimetricamente disposto so- bre o canal 70 e entre as primeira 100 e segunda 110 câmaras com a pare- de 133 que entra em contato com o canal 70 em um lado.

As figuras 24A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30. As primeira 100 e segunda 110 câmaras são dispostas assime- tricamente sobre o eixo de canal 80. Em uma vista expandida mostrada na figura 24B, o freio térmico 130 é mostrado disposto simetricamente sobre o canal 70 entre as primeira 100 e segunda 110 câmaras.

A parede 133 do freio térmico 130 entra em contato com o canal 70. As figuras 24C-D são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30. As primeira 100 e segunda 110 câmaras são dispostas assime- tricamente sobre o eixo de canal 80. A largura da primeira câmara 100 per-

pendicular ao eixo de canal 80 é menor do que a largura da segunda câmara 110 ao longo do eixo de canal 80. Em uma vista expandida mostrada na fi- gura 24D, o primeiro freio térmico 130 é mostrado disposto assimetricamente sobre o canal 70 com a parede 133 que entra em contato com o canal 70 em 5 um lado.

As figuras 25A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30. As primeira 100 e segunda 110 câmaras são dispostas assime- tricamente sobre o eixo de canal 80 em direções opostas ao longo do plano A-A.

O freio térmico 130 é mostrado disposto simetricamente sobre o canal 70 com a parede 133 que entra em contato com o canal 70. As figuras 26A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30. As primeira 100 e segunda 110 câmaras são dispostas assime- tricamente sobre o eixo de canal 80. Como mostrado na figura 26B, o primei- ro freio térmico 130 é também disposto assimetricamente sobre o canal 70 com a parede 133 que entra em contato com o canal 70 em um lado.

As figuras 26C-D são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30 e são dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal 80. Co- mo mostrado na figura 26D, o primeiro freio térmico 130 é também assime- tricamente disposto sobre o canal 70 com a parede 133 que entra em conta- to com o canal 70 em um lado.

As figuras 27A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30 e são dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal 80 em direções opostas ao longo do plano A-A.

Em uma vista expandida mostrada na figura 27B, o primeiro freio térmico 130 é mostrado disposto assimetrica-

mente com a parede 133 que entra em contato com o canal 70 em um lado dentro da primeira câmara 100. Um segundo freio térmico 140 é também mostrado disposto assimetricamente com a parede 143 que entra em conta- to com o canal 70 em um lado dentro da segunda câmara 110. A extremida- 5 de de topo 131 do primeiro freio térmico 130 é posicionada essencialmente na mesma altura que a extremidade de fundo 142 do segundo freio térmico

140. As figuras 27C-D são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30 e são dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal 80 em direções opostas ao longo do plano A-A. Em uma vista expandida mostrada na figura 27D, o primeiro 130 e segundo 140 freios térmicos são mostrados dispostos assimetricamente com as paredes (133, 143) cada uma das quais entra em contato com o canal 70 em um lado. A extremidade de topo 131 do primeiro freio térmico 130 é posicionada mais alta do que a extremidade de fundo 142 do segundo freio térmico 140. As figuras 27E-F são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30 e são dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal 80 em direções opostas ao longo do plano A-A. Em uma vista expandida mostrada na figura 27F, o primeiro 130 e segundo 140 freios térmicos são mostrados dispostos assimetricamente com as paredes (133, 143) cada uma das quais entra em contato com o canal 70 em um lado. A extremidade de topo 131 de um primeiro freio térmico 130 é mostrada posicionada mais baixa do que a extremidade de fundo 142 do segundo freio térmico 140. As figuras 28A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma vista seccionada de uma modalidade do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30 e são dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal 80. A extremidade de topo 101 da primeira câmara 100 e a extremidade de fundo

112 da segunda câmara 110 são inclinadas (inclinada) com relação ao eixo de canal 80. A parede 103 da primeira câmara 100, a parede 113 da segun- da câmara 110 são cada uma essencialmente paralela ao eixo de canal 80. Em uma vista expandida mostrada na figura 28B, o primeiro freio térmico 5 130 é mostrado inclinado (inclinado) com relação ao eixo de canal 80 e a parede 133 entra em contato com o canal 70. As figuras 29A-D são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho ao longo do plano A-A no qual as primeira 100 e segunda 110 câmaras estão dentro da segunda fonte de calor 30 e são dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal 80. Nas figuras 29A-D, a parede 103 da primeira câmara 100 e a parede 113 da segunda câmara 110 são mostradas inclinadas (inclinada) com relação ao eixo de canal 80. Em uma vista expandida mostrada na figura 29B, o freio térmico 130 é mostrado simetricamente disposto sobre o canal 70 com a parede 133 que entra em contato com o canal 70. Em uma vista expandida mostrada na figura 29D, o primeiro freio térmico 130 é mostrado inclinado (inclinado) com relação ao eixo de canal 80 com a parede 133 que entra em contato com o canal 70. A figura 30 é um desenho esquemático mostrando uma vista su- perior de uma modalidade do aparelho 10 mostrando primeiro elemento de fixação 200, segundo elemento de fixação 210, elementos de aquecimento / resfriamento (160a-b), e sensores de temperatura (170a-b). Vários planos seccionados são indicados (A-A, B-B, e C-C). As figuras 31A-B são desenhos esquemáticos de vistas trans- versais seccionadas da modalidade do aparelho mostrado na figura 30 to- madas ao longo dos planos A-A (Figura 31A) e B-B (Figura 31B). A figura 32 é um desenho esquemático da vista em seção trans- versal do primeiro elemento de fixação 200 tomadas ao longo do plano C-C.

A figura 33 é um desenho esquemático de uma vista superior de uma modalidade do aparelho mostrando vários elementos de fixação, estru- turas de fonte de calor, elementos de aquecimento / resfriamento, e senso- res de temperatura.

As figuras 34A-B são desenhos esquemáticos de uma vista su- perior (Figura 34A) e a vista em seção transversal (Figura 34B) de uma mo- dalidade do aparelho mostrando um primeiro elemento de alojamento 300 definindo o segundo 310 e o terceiro 320 elementos isolantes. 5 As figuras 35A-B são desenhos esquemáticos de uma vista su- perior (Figura 35A) e a vista em seção transversal (Figura 35B) de uma mo- dalidade do aparelho compreendendo um segundo elemento de alojamento 400 e a quarto 410 e quinto 420 elementos isolantes.

As figuras 36A-B são desenhos esquemáticos de uma modalida- de da centrífuga de PCR.

A figura 36A mostra uma vista superior e a figura 36B mostra uma vista em seção transversal tomada ao longo do plano A-A.

A figura 37 é um desenho esquemático mostrando a vista em seção transversal de uma modalidade do aparelho de centrífuga de PCR tomada ao longo do plano A-A.

As figuras 38A-B são desenhos esquemáticos mostrando uma modalidade de uma centrífuga de PCR compreendendo uma primeira câma- ra.

Na figura 38A, o plano de seção ao longo de A-A é através do canal 70. Na figura 38B, o plano de seção ao longo de B-B é através dos primeiro 200 e segundo 210 meios de fixação.

As figuras 39A-B são desenhos esquemáticos mostrando moda- lidades de uma primeira (Figura 39A) e segunda (Figura 39B) fonte de calor para uso na centrífuga de PCR mostrada nas figuras 38A-B.

Planos seccio- nados através do aparelho (A-A e B-B) são indicados.

As figuras 40A-D são desenhos esquemáticos mostrando a vista em seção transversal de várias modalidades de recipiente de reação.

As figuras 41A-J são desenhos esquemáticos mostrando vistas transversais seccionadas de várias modalidades de recipiente de reação obtidas perpendicular ao eixo de recipiente de reação 95. As figuras 42A-C são resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 5A mostrando a amplificação da sequência de 349 bp a partir da amostra de plasmídeo de 1 ng de com três diferentes po- limerases de DNA da Takara Bio, Finnzymes, e Kapa Biosystems, respecti-

vamente.

A figura 43 mostra os resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 5A mostrando a amplificação da 936 bp se- quência a partir da amostra de plasmídeo de 1 ng. 5 As figuras 44A-D são resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 5A mostrando a aceleração da amplificação de PCR em temperaturas de desnaturação elevadas (98°C, 100°C, 102°C, e 104°C, respectivamente). As figuras 45A-B são resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 5A mostrando a amplificação de sequências de 479 bp GAPDH (Figura 45A) e de 363 bp β-globina (Figura 45B) a partir de amostras de genoma humano de 10 ng.

A figura 46 mostra os resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 5A mostrando a amplificação da sequência de 241 bp β-actina a partir de amostras de genoma humano de muito baixa có- pia.

A figura 47 mostra variações de temperatura das primeira e se- gunda fontes de calor do aparelho da figura 5A como uma função do tempo quando temperaturas-alvo foram ajustadas para 98°C e 64°C, respectiva- mente.

A figura 48 mostra o consumo de energia do aparelho da figura 5A tendo 12 canais como uma função do tempo.

As figuras 49A-E são resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A mostrando a aceleração da amplificação de PCR para um plasmídeo-alvo de 349 bp como uma função do ângulo de in- clinação de gravidade.

O ângulo de inclinação de gravidade foi 0°, 10°, 20°, 30°, e 45° para as figuras 49A-E, respectivamente.

As figuras 50A-E são resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A mostrando a aceleração da amplificação de PCR para um plasmídeo-alvo de 936 bp como uma função do ângulo de in- clinação de gravidade.

O ângulo de inclinação de gravidade foi 0°, 10°, 20°, 30°, e 45° para as figuras 50A-E, respectivamente.

A figura 51 mostra os resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A mostrando a amplificação de várias se- quências-alvo (com tamanho entre cerca de 150 bp a cerca de 2 kbp) a partir da amostras de plasmídeo de 1 ng.

O ângulo de inclinação de gravidade foi 5 10°. As figuras 52A-E são resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A mostrando a aceleração da amplificação de PCR para um genoma humano de 521 bp como uma função do ângulo de inclinação de gravidade.

O ângulo de inclinação de gravidade foi 0°, 10°, 20°, 30°, e 45° para as figuras 52A-E, respectivame nte.

As figuras 53A-B são resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A mostrando a amplificação das sequências de 200 bp β-globina (Figura 53A) e de 514 bp β-actina (Figura 53B) a partir de amostras de genoma humano de 10 ng.

O ângulo de inclinação de gravi- dade foi 10°. A figura 54 mostra os resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A mostrando a amplificação de várias se- quências-alvo (com tamanho entre cerca de 100 bp a cerca de 500 bp) a partir de genoma humano de 10 ng e amostras de cDNA.

O ângulo de incli- nação de gravidade foi 10°. A figura 55 mostra os resultados de PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A mostrando a amplificação sequência de 241 bp β-actina a partir de amostras de genoma humano de muito baixa cópia quando o ângulo de inclinação de gravidade de 10° f oi introduzido.

As figuras 56A-B são resultados de PCR por convecção térmica usando os aparelhos das figuras 5A e 20A, respectivamente, para amplifica- ção de 349 bp de plasmídeo-alvo.

O aparelho da figura 5A tem uma estrutu- ra de aquecimento simétrica e o da figura 20A tem uma estrutura de aqueci- mento simétrica compreendendo uma primeira câmara descentralizada.

As figuras 57A-B são resultados de PCR por convecção térmica usando os aparelhos da figura 5A e 20A, respectivamente, para amplificação da 241 bp de genoma humano-alvo.

O aparelho da figura 5A tem uma estru-

tura de aquecimento simétrica e o da figura 20A tem uma estrutura de aque- cimento simétrica compreendendo uma primeira câmara descentralizada.

As figuras 58A-B são resultados de PCR por convecção térmica usando os aparelhos da figura 5A e 20A, respectivamente, para amplificação 5 da 216 bp de genoma humano-alvo.

O aparelho da figura 5A tem uma estru- tura de aquecimento simétrica e o da figura 20A tem uma estrutura de aque- cimento simétrica compreendendo uma primeira câmara descentralizada.

A figura 59A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho tendo uma ou mais unidades de detecção ótica 600-603 espaçadas a partir da primeira fonte de calor 20 ao longo do eixo de canal 80 e suficiente para detectar um sinal de fluorescên- cia a partir das amostras nos recipientes de reação 90. O aparelho inclui uma única unidade de detecção ótica 600 para detectar o sinal de fluores- cência a partir de múltiplos recipientes de reação (Figura 59A) ou múltiplas unidades de detecção ótica 601-603 (Figura 59B) para detectar o sinal de fluorescência a partir de cada recipiente de reação.

Nas modalidades mos- tradas nas figuras 59A-B, a unidade de detecção ótica detecta o sinal de flu- orescência a partir da extremidade de fundo 92 do recipiente de reação 90. A primeira fonte de calor 20 compreende uma porta ótica 610 posicionada sobre o eixo de canal 80 entre a extremidade de fundo 72 do canal 70 e a protuberância da primeira fonte de calor 24 que proporciona um trajeto para a excitação e a emissão de luz paralela ao eixo de canal 80 (mostrada como setas para cima e para baixo, respectivamente). As figuras 60A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de modalidades do aparelho tendo uma unidade de detecção ótica 600 (Figura 60A) ou mais do que uma unidade de detecção ótica 601- 603 (Figura 60B). Cada uma das unidades de detecção ótica 600-603 é es- paçada a partir da segunda fonte de calor 30 ao longo do eixo de canal 80 o suficiente para detectar um sinal de fluorescência a partir das amostras loca- lizadas nos recipientes de reação 90. Nas referidas modalidades, uma parte central de um tampa do recipiente de reação (não mostrada) que tipicamente se encaixa na abertura de topo do recipiente de reação 90 funciona como uma porta ótica para uma luz de excitação e de emissão paralela ao eixo de canal 80 (mostrada nas figuras 60A-B como setas para baixo e para cima, respectivamente). A figura 61 é um desenho esquemático mostrando uma vista 5 seccionada de uma modalidade do aparelho tendo uma unidade de detecção ótica 600 espaçada a partir da segunda fonte de calor 30. Na referida moda- lidade, a porta ótica 610 é posicionada na segunda fonte de calor 30 (mos- trada como caixas retangulares cinzas) e o primeiro elemento isolante 50 (mostrado como linhas pontilhadas) ao longo do trajeto perpendicular ao eixo de canal 80 em direção da unidade de detecção ótica 600 o suficiente para detectar um sinal de fluorescência a partir do lado das amostras nos recipi- entes de reação 90. A porta ótica 610 proporciona um trajeto para uma luz de excitação e de emissão entre o recipiente de reação 90 e a unidade de detecção ótica 600 (mostrada como setas apontando para a esquerda e a direita ou vice versa). A parte lateral do recipiente de reação 90 e uma por- ção da primeira câmara 100 ao longo do trajeto de luz também funcionam como porta ótica na referida modalidade.

A figura 62 é um desenho esquemático mostrando uma vista seccionada de uma unidade de detecção ótica 600 posicionada para detec- tar um sinal de fluorescência a partir da extremidade de fundo 92 do recipi- ente de reação 90. Na referida modalidade, a fonte de luz 620, uma lente de excitação 630, e um filtro de excitação 640 que são configurados para gerar uma luz de excitação são localizados ao longo da direção em um ângulo reto com relação ao eixo de canal 80, e um detector 650, uma abertura ou fenda 655, uma lente de emissão 660, e um filtro de emissão 670 que são operá- veis para detectar uma luz de emissão são localizados ao longo do eixo de canal 80. Um divisor de feixe dicroico 680 que transmite a emissão de fluo- rescência e reflete a luz de excitação é também mostrada.

A figura 63 é um desenho esquemático mostrando uma vista seccionada de uma unidade de detecção ótica 600 posicionada para detec- tar um sinal de fluorescência a partir da extremidade de fundo 92 do recipi- ente de reação 90. Na referida modalidade, a fonte de luz 620, uma lente de excitação 630, e um filtro de excitação 640 são posicionados para gerar uma luz de excitação ao longo do eixo de canal 80. Um detector 650, uma abertu- ra ou fenda 655, uma lente de emissão 660, e um filtro de emissão 670 são posicionados para detectar uma luz de emissão como localizada ao longo da 5 direção em um ângulo reto com relação ao eixo de canal 80. Um divisor de feixe dicroico 680 que transmite a luz de excitação e reflete a emissão de fluorescência é mostrada.

As figuras 64A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de uma unidade de detecção ótica 600 posicionada para detec- tar um sinal de fluorescência a partir da extremidade de fundo 92 do recipi- ente de reação 90. Nas referidas modalidades, uma única lente 635 é usada para formar a luz de excitação e também para detectar a emissão de fluo- rescência.

Na modalidade mostrada na figura 64A, a fonte de luz 620 e um filtro de excitação 640 são localizados ao longo da direção em um ângulo reto com relação ao eixo de canal 80. Na modalidade mostrada na figura 64B, os elementos óticos para detectar a emissão de fluorescência (650, 655, e 670) são localizados ao longo da direção em um ângulo reto com re- lação ao eixo de canal 80. A figura 65 é um desenho esquemático mostrando uma vista seccionada de uma unidade de detecção ótica 600 posicionada para detec- tar um sinal de fluorescência a partir da extremidade de topo 91 do recipien- te de reação 90. Como na figura 62, a fonte de luz 620, a lente de excitação 630, e um filtro de excitação 640 são localizados ao longo da direção em um ângulo reto com relação ao eixo de canal 80, e o detector 650, a abertura ou fenda 655, a lente de emissão 660, e o filtro de emissão 670 são localizados ao longo do eixo de canal 80. Também mostrada na referida modalidade é um tampa do recipiente de reação 690 fixada em modo de vedação para a extremidade de topo 91 do recipiente de reação 90 e incluindo uma porta ótica 695 disposta em torno do ponto central da extremidade de topo 91 do recipiente de reação 90 e para transmissão de uma luz de excitação e de emissão.

A porta ótica 695 é adicionalmente definida pela parte superior da tampa do recipiente de reação 690 e a parte superior do recipiente de rea-

ção 90 na referida modalidade. As figuras 66A-B são desenhos esquemáticos mostrando vistas seccionadas de recipientes de reação 90 com tampa do recipientes de rea- ção 690 e portas óticas 695. A tampa do recipiente de reação 690 é fixada 5 de modo vedável à parte superior do recipiente de reação 90 e a porta ótica

695. Nas referidas modalidades, a extremidade de fundo 696 da porta ótica 695 é produzida para entrar em contato com a amostra quando o recipiente de reação 90 é vedado com a tampa do recipiente de reação 690. Um espa- ço aberto 698 é proporcionado no lado da extremidade de fundo 696 da por- ta ótica 695 e a tampa do recipiente de reação 690 de modo que a amostra pode preencher o espaço aberto quando o recipiente de reação 90 é vedado com a tampa do recipiente de reação 690. O menisco de amostra é localiza- do mais alto do que a extremidade de fundo 696 da porta ótica 695. Nas fi- guras 66A-B, a porta ótica 695 é disposta em torno do ponto central da parte mais baixa da tampa do recipiente de reação 690 e é adicionalmente defini- do pela parte mais baixa da tampa do recipiente de reação 690 e a parte superior do recipiente de reação 90. A figura 67 é um desenho esquemático mostrando uma vista seccionada de um recipiente de reação 90 com uma unidade de detecção ótica 600 disposta acima do recipiente de reação 90. O recipiente de reação 90 é vedado com a tampa do recipiente de reação 690 tendo uma porta ótica 695 disposta em torno do ponto central da parte superior do recipiente de reação 90 o suficiente para fazer contato com amostra. Na referida modali- dade, a luz de excitação e de emissão de fluorescência passam através da porta ótica 695 e alcançam a amostra ou vice versa sem passar ar contido dentro do recipiente de reação 90. Descrição Detalhada A figura chave a seguir pode ajudar ao leitor a melhor apreciar a presente invenção incluindo os Desenhos e as reivindicações: 10: modalidade do aparelho 20: primeira fonte de calor (estágio de fundo) 21: superfície de topo da primeira fonte de calor

22: superfície de fundo da primeira fonte de calor 23: protuberância da primeira fonte de calor (apontando em dire- ção da segunda fonte de calor) 24: protuberância da primeira fonte de calor (apontando em dire- 5 ção de tabela) 30: segunda fonte de calor (estágio intermediário) 31: superfície de topo da segunda fonte de calor 32: superfície de fundo da segunda fonte de calor 33: segunda protuberância de fonte de calor (apontando em di- reção da primeira fonte de calor) 34: segunda protuberância de fonte de calor (apontando em afastamento a partir do topo da segunda fonte de calor) 50: Primeiro elemento isolante (ou primeiro espaço isolante) 51: Primeira câmara isolante 70: canal 71: extremidade de topo do canal/orifício perfurado 72: extremidade de fundo do canal 73: orifício receptor 74: espaço de orifício receptor 80: (Centro) eixo do canal 90: recipiente de reação 91: extremidade de topo do recipiente de reação 92: extremidade de fundo do recipiente de reação 93: parede externa do recipiente de reação 94: parede interna do recipiente de reação 95: (Centro) eixo do recipiente de reação 100: Primeira Câmara 101: extremidade de topo da primeira câmara, definindo um limi- te superior da câmara 102: extremidade de fundo da primeira câmara, definindo um li- mite mais baixo da câmara 103: Primeira parede da primeira câmara, definindo um limite ho-

rizontal da câmara 105: Espaço da primeira câmara 106: (Centro) eixo da primeira câmara 110: segunda Câmara 5 111: extremidade de topo da segunda câmara 112: extremidade de fundo da segunda câmara 113: Primeira parede da segunda câmara 115: Espaço da segunda câmara 120: Terceira Câmara 121: extremidade de topo da terceira câmara 122: extremidade de fundo da terceira câmara 123: Primeira parede da terceira câmara 125: Espaço da terceira câmara 130: Primeiro freio térmico 131: extremidade de topo do primeiro freio térmico 132: extremidade de fundo do primeiro freio térmico 133: Primeira parede do primeiro freio térmico, que entra em contato essencialmente com pelo menos parte do canal 140: segundo freio térmico 141: extremidade de topo do segundo freio térmico 142: extremidade de fundo do segundo freio térmico 143: Primeira parede do segundo freio térmico, que entra em contato essencialmente com pelo menos parte do canal 160: elementos de aquecimento / resfriamento 160a: elemento de aquecimento (e/ou resfriamento) da primeira fonte de calor 160b: elemento de aquecimento (e/ou resfriamento) da segunda fonte de calor 170: Sensores de temperatura 170a: Sensor de temperatura da primeira fonte de calor 170b: Sensor de temperatura da segunda fonte de calor 200: Primeiro elemento de fixação compreendendo pelo menos um dos elementos a seguir 201: Parafuso ou prendedor (tipicamente produzido de um ele- mento térmico isolante) 202a: Arruela ou separador de posicionamento (tipicamente pro- 5 duzido de um elemento térmico isolante) 202b: Espaçador ou separador de posicionamento (tipicamente produzido de um elemento térmico isolante) 203a: Elemento de fixação da primeira fonte de calor 203b: Elemento de fixação da segunda fonte de calor 210: segundo elemento de fixação (tipicamente produzido como uma estrutura de aleta) - Usado para montar o conjunto de fonte de calor a um primeiro elemento de alojamento 300 300: Primeiro elemento de alojamento 310: segundo elemento isolante (ou segundo espaço isolante) - Localizado entre os lados das fontes de calor e as paredes late- rais do primeiro elemento de alojamento; e - Preenchido com um elemento térmico isolante tal como ar, um gás, ou um elemento isolante sólido 320: Terceiro elemento isolante (ou terceiro espaço isolante) - Localizado entre o fundo da primeira fonte de calor e a parede de fundo do primeiro elemento de alojamento; e - Preenchido com um elemento térmico isolante tal como ar, um gás, ou um elemento isolante sólido 330: Suporte 400: segundo elemento de alojamento 410: Quarto elemento isolante (ou quarto espaço isolante) - Localizado entre as paredes laterais do primeiro elemento de alojamento e as do segundo elemento de alojamento; e - Preenchido com um elemento térmico isolante tal como ar, um gás, ou um elemento isolante sólido 420: Quinto elemento isolante (ou quinto espaço isolante)

- Localizado entre a parede de fundo do primeiro elemento de alojamento e aquela do segundo elemento de alojamento; e - Preenchido com um elemento térmico isolante tal como ar, um gás, ou um elemento isolante sólido. 5 500: Unidade centrífuga 501: Motor 510: eixo de rotação da centrífuga 520: Braço de rotação 530: Eixo de inclinação 600-603: Unidades de detecção ótica 610: Porta ótica 620: Fonte de luz 630: lente de excitação 635: Lente 640: Filtro de excitação 650: Detector 655: Abertura ou fenda 660: lente de emissão 670: filtro de emissão 680: Divisor de feixe dicroico 690: tampa do recipiente de reação 695: Porta ótica 696: extremidade de fundo de porta ótica 697: extremidade de topo de porta ótica 698: espaço aberto entre a parede interna do recipiente de rea- ção e parede lateral de porta ótica 699: parede lateral de porta ótica Como discutido, e em uma modalidade, a presente invenção ca- racteriza um aparelho de convecção térmica de dois estágios adaptado para realizar amplificação de PCR por convecção térmica.

Em uma modalidade, o aparelho inclui como componentes ope- racionalmente ligados os elementos a seguir:

(a) uma primeira fonte de calor para aquecer ou resfriar um ca- nal e compreendendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo, o canal sendo adaptado para receber um recipiente de reação para realizar PCR, 5 (b) uma segunda fonte de calor para aquecer ou resfriar o canal e compreendendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo, a su- perfície de fundo voltada para a superfície de topo da primeira fonte de calor, em que o canal é definido por uma extremidade de fundo que entra em con- tato com a primeira fonte de calor e um orifício perfurado contíguo com a superfície de topo da segunda fonte de calor, e adicionalmente em que os pontos centrais entre a extremidade de fundo e o orifício perfurado formam um eixo de canal sobre o qual o canal é disposto, (c) pelo menos um elemento de formação de temperatura tal como pelo menos um espaço ou lugar (por exemplo, a câmara) disposto em torno do canal e dentro de pelo menos parte da segunda ou primeira fonte de calor, o espaço de câmara sendo suficiente para reduzir a transferência de calor entre a segunda ou primeira fonte de calor e o canal; e (e) um orifício receptor adaptado para receber o canal dentro da primeira fonte de calor.

Em operação, o aparelho usa múltiplas fontes de calor tal como duas, três, quatro ou mais fontes de calor, preferivelmente duas fontes de calor posicionadas dentro do aparelho de modo que cada uma é essencial- mente paralela à outra fonte de calor em modalidades típicas.

Na referida modalidade, o aparelho irá gerar uma distribuição de temperatura adequada para um processo de PCR com base em convecção que é rápida e eficiente.

Um aparelho típico inclui uma pluralidade de canais dispostos dentro das primeira e segunda fontes de calor de modo que um usuário pode realizar múltiplas reações de PCR ao mesmo tempo.

Por exemplo, o aparelho pode incluir pelo menos um ou dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ca- nais até cerca de dez, onze, ou doze canais, vinte, trinta, quarenta, cinquen- ta, ou até diversas centenas de canais que se estendem através das primei- ra e segunda fontes de calor, com entre cerca de oito a cerca de uma cente-

na de canais sendo em geral preferido para muitas aplicações da invenção.

A função de canal preferida é para receber um recipiente de reação conten- do a reação de PCR do usuário e proporcionar comunicação térmica direta ou indireta entre o recipiente de reação e pelo menos um de e preferivelmen- 5 te todos de a) as fontes de calor, b) o elemento de formação de temperatu- ra(s), e c) o orifício receptor.

A posição relativa de cada uma das duas fontes de calor para a outra é uma característica importante da presente invenção.

A primeira fonte de calor do aparelho é tipicamente localizada no fundo e mantida a uma temperatura adequada para desnaturação de ácido nucleico, e a segunda fonte de calor é tipicamente localizada em cima e mantida a uma temperatu- ra adequada para recozer a matriz desnaturada de ácido nucleico com um ou mais iniciadores de oligonucleotídeo.

Em algumas modalidades, a segun- da fonte de calor é mantida a uma temperatura adequada não só para reco- zimento mas também para polimerização.

Assim em uma modalidade, a par- te de fundo do canal na primeira fonte de calor e a parte de topo do canal na segunda fonte de calor são submetidas a uma distribuição de temperatura adequada para as etapas de desnaturação e recozimento de uma reação de PCR, respectivamente.

Entre as partes de topo e de fundo do canal está a região de transição na qual a mudança de temperatura a partir da temperatu- ra de desnaturação da primeira fonte de calor (a alta temperatura) para a temperatura de recozimento da segunda fonte de calor (a baixa temperatura) ocorre.

Assim, em modalidades típicas, pelo menos parte da região de tran- sição é submetida a uma distribuição de temperatura adequada para polime- rização do iniciador ao longo da matriz desnaturada.

Quando a segunda fon- te de calor é mantida a uma temperatura adequada não só para recozimento mas também para polimerização, a parte de topo do canal na segunda fonte de calor também proporciona uma distribuição de temperatura adequada para a etapa de polimerização além de uma parte superior da região de transição.

Portanto, a distribuição de temperatura na região de transição é importante para alcançar a eficiente amplificação de PCR, particularmente com relação à extensão do iniciador.

A convecção térmica dentro do recipi-

ente de reação tipicamente depende da magnitude e direção do gradiente de temperatura gerada na região de transição, e assim a distribuição de tempe- ratura na região de transição é também importante para gerar adequada convecção térmica dentro do recipiente de reação que é condutiva para am- 5 plificação de PCR.

Vários elementos de formação de temperatura podem ser usados com o aparelho para gerar a adequada distribuição de temperatura na região de transição para suportar uma amplificação de PCR rápida e efi- ciente.

Tipicamente, cada fonte individual de calor é mantida a uma temperatura adequada para induzir cada etapa de PCR por convecção tér- mica.

Adicionalmente, e em modalidades nas quais o aparelho caracteriza duas fontes de calor, as temperaturas das duas fontes de calor são adequa- damente arranjadas para induzir convecção térmica através da amostra den- tro de um recipiente de reação.

Uma condição geral para induzir a adequada convecção térmica de acordo com a presente invenção é, a fonte de calor mantida a uma temperatura mais elevada é localizada a uma posição mais baixa dentro do aparelho do que a fonte de calor mantida na temperatura mais baixa.

Assim na preferida modalidade compreendendo duas fontes de calor, a primeira fonte de calor é posicionada mais baixa no aparelho do que a segunda fonte de calor.

Como discutido, é um objetivo da presente invenção proporcio- nar um aparelho com pelo menos um elemento de formação de temperatura.

Na maioria das modalidades, cada canal do aparelho incluirá menos do que cerca de dez dos referidos elementos, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez dos elementos de formação de tempera- tura para cada canal.

Uma função do elemento de formação de temperatura é proporcionar PCR mediada a convecção térmica eficiente por proporcionar uma característica estrutural ou de posição que suporta PCR.

Como será mais aparente a partir dos exemplos e discussão que se segue, as referidas características incluem, mas não são limitadas a, pelo menos um espaço ou lugar tal como a câmara; pelo menos um elemento isolante ou espaço iso- lante localizado entre as fontes de calor; pelo menos um freio térmico; pelo menos uma estrutura de protuberância em pelo menos uma das primeira e segunda fontes de calor; pelo menos um estrutura assimetricamente dispos- ta dentro do aparelho, particularmente em pelo menos um de canais, primei- ra fonte de calor, segunda fonte de calor, espaço tal como a câmara, freio 5 térmico, protuberância, primeiro elemento isolante, ou o orifício receptor; ou pelo menos uma assimetria estrutural ou de posição.

Assimetria estrutural é tipicamente definida em referência ao canal e/ou eixo de canal.

Um exemplo de assimetria de posição é a inclinação ou de outro modo o deslocamento do aparelho com relação à direção de gravidade.

As palavras "espaço" e "área" será com frequência usado aqui intercambiavelmente.

O espaço é um pequeno espaço encerrado ou semi encerrado dentro do aparelho que é pretendido para ajudar PCR por con- vecção térmica.

Um grande espaço ou amplo espaço com a estrutura defini- da será referido aqui como a "câmara". Em muitas modalidades, a câmara incluirá o espaço e ser referido aqui como um "espaço de câmara". O espa- ço pode ser vazio, preenchido ou parcialmente preenchido com um material isolante como descrito aqui.

Para muitas aplicações, o espaço ou câmara preenchido com ar será em geral útil.

Um ou uma combinação de elementos de formação de tempera- tura (os mesmos ou diferentes) pode ser usado com um aparelho da presen- te invenção.

Elementos de formação de temperatura ilustrativos serão agora discutidos em mais detalhes.

Elementos de formação de temperatura ilustrativos A.

Espaço ou Câmara Em uma modalidade do presente aparelho, cada canal incluirá pelo menos um espaço ou câmara como o elemento de formação de tempe- ratura.

Em uma modalidade típica, o aparelho incluirá um, dois ou mesmo três câmaras dispostas em torno de cada canal e dentro de pelo menos a segunda fonte de calor.

Alternativamente, ou em adição, o aparelho pode caracterizar pelo menos uma câmara que é disposta em torno do canal den- tro da primeira fonte de calor.

Entretanto para muitas modalidades, é preferi- do se ter pelo menos uma câmara disposta em torno do canal dentro da se-

gunda fonte de calor, mas na estrutura de câmara disposta dentro da primei- ra fonte de calor.

No referido exemplo da presente invenção, a câmara cria o espaço entre o canal e a segunda (ou algumas vezes primeira) fonte de ca- lor que permite com que o usuário controle com precisão a distribuição de 5 temperatura dentro do aparelho.

Ou seja, a câmara ajuda a formar uma dis- tribuição de temperatura do canal na região de transição.

Por "região de transição" se quer dizer a região do canal basicamente entre uma parte su- perior do canal que entra em contato com a segunda fonte de calor e a parte mais baixa do canal que entra em contato com a primeira fonte de calor.

A câmara pode ser posicionada quase em qualquer lugar em torno do canal desde que os resultados pretendidos sejam alcançados.

Por exemplo, posi- cionar a câmara (ou mais do que uma câmara) dentro de ou próximo da se- gunda fonte de calor será útil em muitas aplicações da presente invenção.

Embora menos preferida, a câmara pode também residir na primeira fonte de calor ou ambas as primeira e segunda fontes de calor.

Em modalidades nas quais um canal no aparelho tem múltiplas câmaras, cada câmara pode ser separada uma a partir da outra e pode em alguns casos entrar em conta- to com uma ou mais outras câmaras dentro do aparelho.

Uma ou uma combinação de diferentes espaços ou estruturas de câmara é compatível com a presente invenção.

Como requisitos gerais, a câmara deve gerar uma distribuição de temperatura na região de transição que preenche pelo menos uma e preferivelmente todas as condições a se- guir: (1) um gradiente de temperatura gerada (particularmente através do perfil vertical do canal) deve ser suficientemente grande de modo a gerar a convecção térmica através da amostra dentro do recipiente de reação; e (2) a convecção térmica assim gerada por um gradiente de temperatura deve ser suficientemente lento (ou apropriadamente rápido) de modo que perío- dos de tempo suficiente podem ser proporcionados para cada etapa de um processo de PCR.

Em particular, é especialmente importante se fazer o pe- ríodo de tempo da etapa de polimerização suficientemente longo uma vez que a etapa de polimerização tipicamente leva mais tempo do que as etapas de desnaturação e de recozimento.

Exemplos de configurações particulares de espaço ou câmara são descritos abaixo.

Se desejado, o canal dentro de um aparelho da presente inven- ção pode ser dotado de pelo menos uma câmara disposta essencialmente simetricamente ou assimetricamente sobre o eixo de canal.

Em muitas mo- 5 dalidades, um aparelho com uma, duas ou três câmaras será preferido.

As câmaras podem ser dispostas em uma ou uma combinação das fontes de calor, por exemplo, a segunda fonte de calor, a primeira fonte de calor, ou ambas a segunda e primeira fontes de calor.

Para muitos aparelhos, tendo uma, duas ou três câmaras dentro da segunda fonte de calor será especial- mente útil.

Exemplos das referidas modalidades de câmara são proporcio- nados abaixo.

Em uma modalidade, a câmara será adicionalmente definida pe- lo que é referido aqui como a "protuberância" a partir de pelo menos um da primeira fonte de calor e a segunda fonte de calor.

Na modalidade particular, a protuberância se estenderá a partir da segunda fonte de calor em direção da primeira fonte de calor na direção em geral paralela ao eixo de canal.

Ou- tras modalidades são possíveis tais como incluir a segunda protuberância que se estende em afastamento a partir da superfície de topo da segunda fonte de calor em geral paralela ao eixo de canal.

Modalidades adicionais incluem um aparelho com a protuberância que se estende a partir da primei- ra fonte de calor em direção da segunda fonte de calor em geral paralela ao eixo de canal.

Ainda modalidades adicionais incluem um aparelho com a segunda protuberância que se estende em afastamento a partir da superfície de fundo da primeira fonte de calor também em geral paralela ao eixo de canal.

Em algumas modalidades, o aparelho pode compreender pelo menos uma protuberância que é inclinada com relação ao eixo de canal.

Nos referi- dos exemplos da presente invenção, é possível se reduzir substancialmente o volume da primeira e/ou segunda fontes de calor assim como a transferên- cia de calor entre as duas fontes de calor enquanto se alonga as dimensões da câmara ao longo do eixo de canal.

As referidas características foram ob- servadas aumentar a eficiência da PCR por convecção térmica ao mesmo tempo em que se reduz o consumo de energia.

As figuras 2A, 3A, 4A, 5A, 11A, 11B, 12A, 14A, 18A, e 20A pro- porcionam alguns exemplos de câmaras aceitáveis para uso com a presente invenção.

Outras estruturas adequadas de câmara são descritas abaixo.

B.

Freio térmico 5 Cada canal dentro de um aparelho da presente invenção pode incluir um, dois, três ou mais freio térmicos, tipicamente um ou dois freios térmicos para controlar uma distribuição de temperatura dentro do aparelho.

Em muitas modalidades, o freio térmico será definido por uma extremidade de topo e de fundo e uma parede que estará em ótimo contato térmico com o canal.

O freio térmico é tipicamente disposto adjacente ou próximo a uma parede do espaço ou câmara (se presente). Uma intrusão indesejável do perfil de temperatura a partir de uma fonte de calor para outra (tipicamente a partir da primeira fonte de calor para a segunda fonte de calor) pode ser con- trolada e em geral reduzida ao incluir o freio térmico como um elemento de formação de temperatura.

Como será descrito em mais detalhes abaixo, foi observado que a eficiência da amplificação de PCR por convecção térmica é sensível à posição e espessura do freio térmico.

Um freio térmico aceitável pode ser disposto com relação ao canal seja simetricamente ou assimetri- camente.

Um ou mais freios térmicos como descritos aqui podem ser dis- postos aproximadamente em qualquer posição em torno de cada canal do aparelho desde que os resultados pretendidos sejam alcançados.

Assim em uma modalidade, um freio térmico pode ser posicionado adjacente ou próxi- mo a uma câmara dentro da segunda fonte de calor para bloquear ou reduzir fluxo de calor indesejável a partir da primeira fonte de calor e alcançar ade- quada amplificação de PCR.

As figuras 4B, 13B, 14B, 20C, 23B, 24B, 26B, e 27B proporcio- nam alguns exemplos de freios térmicos adequados para uso com a presen- te invenção.

Outros freios térmicos adequados são descritos abaixo.

C.

Assimetria estrutural ou de posição Foi observado que PCR por convecção térmica foi mais rápida e mais eficiente quando um aparelho da presente invenção incluiu pelo menos um elemento assimétrico estrutural ou de posição, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, ou seis dos referidos elementos para cada canal.

Os refe- ridos elementos podem ser dispostos em torno de um ou mais canais até todo o aparelho.

Sem intenção de se estar ligado a uma teoria, acredita-se 5 que a presença de um elemento assimétrico dentro do aparelho aumente a força de flutuação de modo a tornar o processo de amplificação mais rápido e mais eficiente.

Foi também observado que ao se introduzir pelo menos uma assimetria estrutural ou de posição dentro do aparelho que pode ocasi- onar "aquecimento ou resfriamento horizontalmente assimétrico" com rela- ção ao eixo de canal ou a direção de gravidade, é possível para ajudar PCR por convecção térmica.

Sem intenção de se estar ligado a uma teoria, acre- dita-se que um aparelho com pelo menos um elemento assimétrico no mes- mo rompa a simetria do aparelho com relação ao aquecimento ou resfria- mento do canal e ajuda ou aumenta a geração da força de flutuação de mo- do a tornar o processo de amplificação mais rápido e mais eficiente.

Por um "elemento assimétrico de posição" se quer dizer que um elemento estrutural que torna o eixo de canal ou o aparelho inclinado com relação à direção de gravidade.

Por um "elemento assimétrico estrutural" se quer dizer que um elemento estrutural que não é simetricamente disposto dentro do aparelho com relação ao canal e/ou eixo de canal.

Como discutido, é necessário se gerar um gradiente de tempera- tura vertical dentro do fluido de amostra de modo a gerar convecção térmica (e também preencher as exigências de temperatura para um processo de PCR). Entretanto, mesmo na presença da gradiente de temperatura vertical, a força de flutuação que induz a convecção térmica pode não ser gerada se contornos isotérmicos de uma distribuição de temperatura são planos (isto é, horizontal) com relação à direção de gravidade (isto é, a direção vertical). Dentro da referida distribuição plana de temperatura, o fluido não experimen- ta qualquer força de flutuação uma vez que cada parte do fluido tem a mes- ma temperatura (e assim a mesma densidade) que as outras partes do fluido na mesma altura.

Em modalidades simétricas, todos os elementos estrutu- rais são simétricos com relação ao canal ou eixo de canal e a direção de gravidade é alinhada essencialmente paralela ao canal ou eixo de canal.

Nas referidas modalidades simétricas, contornos isotérmicos de uma distri- buição de temperatura dentro do canal ou o recipiente de reação com fre- quência se torna quase ou perfeitamente plana com relação ao campo gravi- 5 tacional, e assim é com frequência difícil se gerar a convecção térmica que é suficientemente rápida.

Sem intenção de se estar ligado a uma teoria, acre- dita-se que a presença de determinadas perturbações que possam induzir uma flutuação ou instabilidade em uma distribuição de temperatura com fre- quência ajuda ou aumenta a geração da força de flutuação e torna a amplifi- cação de PCR mais rápida e mais eficiente.

Por exemplo, uma pequena vi- bração que tipicamente existe em um ambiente comum pode perturbar a distribuição de temperatura próxima ou perfeitamente plana, ou um pequeno defeito estrutural no aparelho pode romper a simetria do canal/estrutura de câmara ou a estrutura do recipiente de reação de modo a perturbar a distri- buição de temperatura próxima ou perfeitamente plana.

Na referida distribui- ção de temperatura perturbada, o fluido pode ser dotado de diferente tempe- ratura para pelo menos parte do fluido em comparação a outra parte do flui- do na mesma altura, e assim a força de flutuação pode ser prontamente ge- rada em virtude da referida flutuação ou instabilidade de temperatura.

As referidas perturbações naturais ou incidentais são em geral importantes para gerar a convecção térmica nas modalidades simétricas.

Quando a assimetria estrutural ou de posição está presente dentro do aparelho, uma distribuição de temperatura dentro do canal ou o recipiente de reação pode ser produzi- do de modo controlável não uniforme na mesma altura (isto é, horizontal- mente não uniforme ou assimétrico). Na presença da referida distribuição de temperatura horizontalmente assimétrica, a força de flutuação pode ser pron- tamente e em geral mais fortemente gerada de modo a tornar a PCR por convecção térmica mais rápida e mais eficiente.

Elementos assimétricos es- truturais ou de posição úteis causam "aquecimento ou resfriamento horizon- talmente assimétrico" do canal com relação ao eixo de canal ou a direção de gravidade.

Assimetria pode ser introduzida em um aparelho da presente in-

venção por uma ou uma combinação de estratégias.

Em uma modalidade, é possível se fazer um aparelho da presente invenção com a assimetria de posição imposta no aparelho, por exemplo, por inclinação o aparelho ou o canal com relação à direção de gravidade.

Quase qualquer uma das modali- 5 dades do aparelho descrito aqui pode ser inclinada ao se incorporar uma estrutura capaz de deslocar o eixo de canal com relação à direção de gravi- dade.

Um exemplo de uma estrutura aceitável é uma cunha ou formato incli- nado relacionado, ou um canal inclinado ou em declive.

Vide figuras 11A-B para exemplos desta modalidade da presente invenção.

Em outras modalidades, pelo menos um dos elementos a seguir pode ser assimetricamente disposto dentro do aparelho com relação ao eixo de canal: a) o canal, b) o espaço tal como a câmara, c) o orifício receptor d) a primeira fonte de calor, e) a segunda fonte de calor, f) o freio térmico; e g) o elemento isolante.

Assim em uma modalidade da presente invenção, o aparelho caracteriza uma câmara como o elemento assimétrico estrutural.

Neste exemplo da presente invenção, o aparelho pode incluir um ou mais outros elementos assimétricos estruturais tais como o canal, orifício receptor, freio térmico, elemento isolante, ou uma ou mais das fontes de calor.

Em outra modalidade, o elemento assimétrico estrutural é o orifício receptor.

Em ainda outra modalidade, o elemento assimétrico estrutural é o freio térmico ou mais do que um freio térmico.

O aparelho pode incluir um ou mais outros elementos estruturais assimétricos ou simétricos tal como a primeira fonte de calor, a segunda fonte de calor, a câmara, o canal, o elemento isolante etc.

Em modalidades nas quais a primeira fonte de calor e/ou a se- gunda fonte de calor caracterizam um elemento estrutural assimétrico, a as- simetria pode residir particularmente na protuberância (ou mais do que um protuberância) que se estende em geral paralela ao eixo de canal.

Adicionalmente exemplos são proporcionados abaixo.

Em parti- cular, vide figuras 17A-B, 18A-D, 19A-B, 21, e 22. Como discutido, um ou ambos de canal e câmara pode ser sime- tricamente ou assimetricamente disposto no aparelho com relação ao eixo de canal.

Vide também as figuras 8A-J, 9A-I, e 10A-P para exemplos nos quais o canal e/ou câmara são o elemento estrutural simétrico ou assimétri- co.

Será com frequência desejável se ter um aparelho no qual o ori- fício receptor é o elemento assimétrico estrutural.

Sem intenção de estar li- 5 gado a qualquer teoria, acredita-se que a região entre o orifício receptor e a extremidade de fundo da câmara ou a segunda fonte de calor é um local no aparelho onde uma força de acionamento principal para fluxo de convecção térmica é gerada.

Como será prontamente aparente, a referida região é onde o aquecimento inicial a uma temperatura mais alta (isto é, a temperatura de desnaturação) e transição em direção da temperatura mais baixa (isto é, a temperatura de polimerização) ocorre, e assim a força de direcionamento maior deve se originar a partir da referida região.

Vide, por exemplo, as figuras 15 e 17A-B mostrando estruturas do orifício receptor assimétrico.

D.

Elemento isolante e Espaço isolante Será com frequência útil se isolar cada uma das fontes de calor uma a partir da outra para alcançar os objetivos da presente invenção.

Como será aparente a partir da discussão a seguir, o aparelho pode ser usado com uma grande variedade de elementos isolantes dispostos no espaço isolante entre as fontes de calor.

Assim em uma modalidade, um primeiro elemento isolante é disposto no primeiro espaço isolante entre as primeira e segunda fontes de calor.

Um ou uma combinação de elementos isolantes de gás ou sólido tendo baixa condutividade térmica pode ser usado.

Um elemento iso- lante em geral útil para muitos fins da presente invenção é ar (tendo baixa condutividade térmica de cerca de 0,024 W·m-1·K-1 a temperatura ambiente para ar estático, com um aumento gradual com temperatura crescente). Em- bora os materiais que tenham uma condutividade térmica maior do que aquela do ar estático possam ser usados sem reduzir de modo significativo o desempenho do aparelho além do consumo de energia, é em geral preferido se usar elementos isolantes de gás ou sólido que tenham uma condutividade térmica similar a ou menor do que a do ar.

Exemplos de bons elementos térmicos isolantes incluem, mas não são limitados a, madeira, cortiça, teci-

dos, plásticos, cerâmicas, borracha, silicone, sílica, carbono, etc.

Espumas rígidas produzidas dos referidos materiais são particularmente úteis uma vez que as mesmas representam condutividade térmica muito baixa.

Exemplos de espumas rígidas incluem, mas não são limitados a, Styrofoam, espuma 5 de poliuretano, aerossol de sílica, aerossol de carbono, SEAgel, espuma de silicone ou borracha, madeira, cortiça, etc.

Além de ar, espuma de poliureta- no, aerossol de sílica e aerossol de carbono são elementos térmicos isolan- tes particularmente úteis para usar em temperaturas elevadas.

Em modalidades nas quais um aparelho da presente invenção tem o espaço isolante, vantagens será aparente.

Por exemplo, a usuário do aparelho terá a capacidade de 1) reduzir o consumo de energia ao substan- cialmente reduzir transferência de calor a partir de uma fonte de calor para a próxima fonte de calor ; e 2) controlar um gradiente de temperatura para ge- rar a força de direcionamento (e portanto controlar a convecção térmica) uma vez que uma grande mudança de temperatura a partir de uma fonte de calor para a próxima fonte de calor ocorre na região de espaço isolante.

Foi também observado que um maior espaço isolante com um elemento isolante de baixa condutividade térmica em geral ajuda a reduzir o consumo de ener- gia.

O uso de estruturas de protuberância é particularmente útil para subs- tancialmente reduzir o consumo de energia uma vez que um maior espaço médio pode ser proporcionado enquanto se controla independentemente as diferentes regiões do espaço isolante (isto é, regiões próximas e distantes a partir do canal, separadamente). Foi também observado que ao mudar o espaço isolante, particularmente na região próxima ao canal, é possível se controlar a velocidade da convecção térmica e assim a velocidade da ampli- ficação de PCR.

Outras vantagens de ter o espaço isolante serão aparentes a partir da discussão e exemplos a seguir.

Será aparente a partir da discussão e dos exemplos a seguir que um aparelho da presente invenção pode incluir um ou uma combinação dos elementos de formação de temperatura a seguir.

Assim em uma modalidade, o aparelho caracteriza pelo menos uma câmara (por exemplo, uma, duas ou três câmaras) disposta simetricamente sobre o canal e tipicamente paralela ao eixo de canal ao longo do primeiro elemento isolante separando as pri- meira e segunda fontes de calor uma a partir da outra.

Na referida modalida- de, o aparelho pode adicionalmente incluir um ou dois freios térmicos para adicionalmente ajudar PCR por convecção térmica.

Em uma modalidade na 5 qual o aparelho inclui duas câmaras, por exemplo, dentro da segunda fonte de calor, cada câmara pode ser dotada da mesma ou diferente posição hori- zontal com relação ao eixo de canal.

Em outra modalidade, a segunda fonte de calor caracteriza uma primeira protuberância que se estende em direção da primeira fonte de calor; e opcionalmente a segunda protuberância que se estende em afastamento a partir da superfície de topo da segunda fonte de calor em geral paralela ao eixo de canal, no qual a primeira protuberância tipicamente define a câmara.

Na referida modalidade, o aparelho pode adici- onalmente incluir uma primeira protuberância que se estende a partir da pri- meira fonte de calor para a segunda fonte de calor; e opcionalmente a se- gunda protuberância que se estende em afastamento a partir da superfície de fundo da primeira fonte de calor em geral paralela ao eixo de canal.

Nas referidas modalidades, a segunda fonte de calor tipicamente inclui pelo me- nos uma câmara (por exemplo, uma, duas ou três câmaras) disposta sime- tricamente com relação ao eixo de canal, e a primeira fonte de calor tipica- mente não inclui uma câmara, mas algumas vezes pode incluir uma câmara ou duas câmaras dispostas simetricamente com relação ao eixo de canal.

Como discutido, será com frequência útil incluir elemento estru- tural assimétrico dentro do aparelho.

Assim é um objetivo da presente inven- ção incluir dentro do aparelho um orifício receptor que é disposto assimetri- camente com relação ao eixo de canal.

Na referida modalidade, o aparelho pode incluir uma ou mais câmaras dispostas simetricamente ou assimetri- camente com relação ao eixo de canal.

Alternativamente, ou em adição, o aparelho pode caracterizar pelo menos um freio térmico que é disposto as- simetricamente com relação ao eixo de canal.

Na referida modalidade, o aparelho pode incluir uma ou mais câmaras dispostas simetricamente ou assimetricamente com relação ao eixo de canal.

Alternativamente, ou em adição, o aparelho pode caracterizar pelo menos uma das protuberâncias dispostas assimetricamente com relação ao eixo de canal.

Em uma modali- dade, a protuberância que se estende a partir da primeira fonte de calor é disposta assimetricamente sobre o eixo de canal enquanto uma ou ambas as protuberâncias (e câmara) que se estende a partir da segunda fonte de 5 calor é disposta simetricamente ou assimetricamente sobre o eixo de canal.

Alternativamente, ou em adição, as uma ou mais protuberâncias (e câmara) da segunda fonte de calor podem ser dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal enquanto uma ou ambas as protuberâncias que se estendem a partir da primeira fonte de calor é disposta simetricamente ou assimetrica- mente sobre o eixo de canal.

Entretanto, em outra modalidade, um ou mais dos canais até to- dos os canais dentro do aparelho não precisam incluir qualquer estrutura de câmara ou espaço.

No referido exemplo, o aparelho preferivelmente irá in- cluir um ou mais outros elementos de formação de temperatura tal como in- clinação o ângulo do canal com relação à gravidade (um exemplo de assi- metria de posição). Alternativamente, ou em adição, o canal pode incluir a assimetria estrutural ou ser submetido à aceleração centrífuga como propor- cionado aqui.

Como será observado, é possível ter um aparelho da presente invenção no qual outro ou elementos adicionais assimétricos são presentes.

Por exemplo, o aparelho pode incluir duas ou três câmaras no qual uma ou mais das câmaras são dispostas assimetricamente com relação ao eixo de canal.

Em modalidades nas quais o aparelho inclui uma única câmara, aque- la câmara pode ser disposta assimetricamente com relação ao eixo de canal.

Modalidades incluem um aparelho no qual as protuberâncias que se esten- dem a partir da segunda fonte de calor em direção da primeira fonte de calor são dispostas assimetricamente com relação ao eixo de canal.

Se desejado, qualquer uma das modalidades anteriores da pre- sente invenção pode incluir a assimetria de posição ao inclinar o dispositivo ou o canal com relação à direção de gravidade ou dispor a mesma em uma cunha ou outro formato inclinado.

Como será observado, quase qualquer elemento de formação de temperatura de uma modalidade do aparelho (seja simetricamente ou assi- metricamente disposto dentro do aparelho com relação ao eixo de canal) pode ser combinado com um ou mais outros elementos de formação de temperatura incluindo outra característica estrutural ou de posição do apare- 5 lho desde que os resultados pretendidos sejam alcançados.

Como será também observado, a presente invenção é flexível e inclui um aparelho no qual cada canal inclui os mesmos ou diferentes ele- mentos de formação de temperatura.

Por exemplo, um canal do aparelho pode ser dotado de nenhuma estrutura de câmara ou espaços enquanto ou- tro canal do aparelho inclui um, dois, ou três da referida estrutura de câmara ou espaços.

A presente invenção não é limitada a qualquer configuração de canal (ou grupo de configurações de canal) desde que os resultados preten- didos sejam alcançados.

Entretanto, será com frequência preferido ter todos os canais de um aparelho da presente invenção com o mesmo número e tipo de elemento de formação de temperatura para simplificar uso e considera- ções de fabricação.

Referência às figuras a seguir e exemplos pretende proporcionar maior entendimento de um aparelho de PCR por convecção térmica.

Não é pretendido e não devem ser lidos como limitantes do âmbito da presente invenção.

Voltando agora às figuras 1 e 2A-C, o aparelho 10 caracteriza os elementos a seguir como componentes operacionalmente ligados: (a) uma primeira fonte de calor 20 para aquecer ou resfriar um canal 70 e compreendendo uma superfície de topo 21 e uma superfície de fundo 22 no qual o canal 70 é adaptado para receber um recipiente de rea- ção 90 para realizar PCR; (b) uma segunda fonte de calor 30 para aquecer ou resfriar o canal 70 e compreendendo uma superfície de topo 31 e uma superfície de fundo 32 na qual a superfície de fundo 32 está voltada para a superfície de topo da primeira fonte de calor 21, em que o canal 70 é definido por uma extremidade de fundo 72 que entra em contato com a primeira fonte de calor 20 e um orifício perfurado 71 contíguo com a superfície de topo da segunda fonte de calor 41. Na referida modalidade, pontos centrais entre a extremi- dade de fundo 72 e o orifício perfurado 71 formam um eixo de canal 80 so- bre o qual o canal 70 é disposto; (c) pelo menos uma câmara disposta em torno do canal 70 e 5 dentro de pelo menos parte da segunda fonte de calor 30. Na referida moda- lidade, a primeira câmara 100 inclui um espaço de câmara 105 entre a se- gunda fonte de calor 30 e o canal 70 suficiente para reduzir a transferência de calor entre a segunda fonte de calor 30 e o canal 70; e (d) um orifício receptor 73 adaptado para receber o canal 70 dentro da primeira fonte de calor 20. Pela frase "ligado de modo operacional", "associado de modo operacional" ou frase similar se quer dizer um ou mais elementos do apare- lho que são ligados de modo operacional a um ou mais outros elementos.

Mais especificamente, a referida associação pode ser direta ou indireta (por exemplo, térmica), física e/ou funcional.

Um aparelho no qual alguns ele- mentos são diretamente ligados e outros indiretamente (por exemplo, termi- camente) ligados está dentro do âmbito da presente invenção.

Na modalidade mostrada na figura 2A, o aparelho adicionalmen- te inclui um primeiro elemento isolante 50 posicionado entre a superfície de topo 21 da primeira fonte de calor 20 e a superfície de fundo 32 da segunda fonte de calor 30. Como será observado, a prática da presente invenção não é limitada a ter apenas um elemento isolante presente desde que o número de elementos isolantes seja suficiente para que os resultados pretendidos sejam alcançados.

Ou seja, a presente invenção pode incluir múltiplos ele- mentos isolantes (por exemplo, 2, 3 ou 4 elementos isolantes). Na maioria das modalidades, é preferido se ter o comprimento da segunda fonte de ca- lor 30 que é maior do que o comprimento da primeira fonte de calor 20 ao longo do eixo de canal 80. Embora em outras modalidades o comprimento da segunda fonte de calor 30 pode ser menor ou essencialmente o mesmo que aquele da primeira fonte de calor 20, é vantajoso se ter um maior com- primento para a segunda fonte de calor 30 para alcançar um comprimento de trajeto mais longo para a etapa de polimerização.

Em uma modalidade mostrada na figura 2A, o primeiro elemento isolante 50 é preenchido com um elemento térmico isolante tendo a baixa condutividade térmica.

Elementos térmicos isolantes preferidos têm uma condutividade térmica entre cerca da poucos décimos de W·m-1·K-1 a cerca 5 de 0,01 W·m-1·K-1 ou menor.

Na referida modalidade, o comprimento do primeiro elemento isolante 50 ao longo do eixo de canal 80 é produzida para ser pequena, por exemplo, entre cerca de 0,1 mm a cerca de 5 mm, preferi- velmente entre cerca de 0,2 mm a cerca de 4 mm.

No referido exemplo da presente invenção, perda de calor a partir de uma fonte de calor a uma fonte de calor adjacente pode ser substancialmente grande, resultando em grande consumo de energia para operar o aparelho.

Para muitas aplicações, será com frequência preferido se ter as duas fontes de calor (por exemplo, 20 e 30) isolada uma a partir da outra e também preferivelmente isolada a partir de outros elementos do aparelho se existir.

Uso de um ou mais elementos térmicos isolantes será com frequência útil.

Por exemplo, uso de um elemen- to térmico isolante no primeiro espaço isolante 50 pode com frequência re- duzir o consumo de energia.

Assim na modalidade da presente invenção mostrada nas figu- ras 2A-C, o primeiro elemento isolante 50 compreende ou consiste em um sólido ou um gás como um elemento térmico isolante.

Voltando mais uma vez para o aparelho mostrado nas figuras 2A-C, o espaço de câmara 105 entre a parede de câmara 103 e o canal 70 dentro da segunda fonte de calor pode ser parcialmente ou totalmente pre- enchido com um elemento térmico isolante tal como um gás, solido, ou com- binação de gás-sólido.

Tipicamente elementos isolantes úteis incluem ar, e elementos isolantes de gás ou sólido que tenham uma condutividade térmica similar a ou menor do que ar.

Uma vez que uma importante função do espa- ço de câmara 105 é para controlar (tipicamente reduzir) a transferência de calor a partir da segunda fonte de calor para o canal dentro da segunda fon- te de calor, materiais que têm uma condutividade térmica maior do que aquela do ar tais como plásticos ou cerâmicas podem também ser usados.

Entretanto, quando os referidos materiais de mais alta condutividade térmica são usados, o espaço de câmara 105 deve ser ajustado para ser maior em comparação à modalidade de usar ar como um elemento isolante.

De modo similar, se um material tendo uma condutividade térmica mais baixa do que a do ar for usado, o espaço de câmara 105 deve ser ajustado para ser menor 5 do que aquele da modalidade de elemento isolante de ar.

Em particular, as figuras 2A-C mostram uma modalidade do apa- relho na qual ar ou um gás é usado como um elemento isolante no primeiro elemento isolante 50 e o espaço de câmara 105. As estruturas de canal den- tro dos referidos espaços são ilustrados com linhas pontilhadas para repre- sentar invisibilidade das referidas estruturas quando ar (ou um gás) é usado como um elemento isolante.

Se desejado para alcançar um objetivo particu- lar da invenção, o aparelho pode ser adaptado de modo que um elemento isolante sólido seja usado no espaço de câmara 105. Alternativamente, ou em adição, o aparelho pode incluir um elemento isolante sólido no primeiro elemento isolante 50. As figuras 2B e 2C mostram vistas em perspectiva de seção A-A e B-B do aparelho como marcado na figura 1. Uma modalidade na qual ar ou um gás é usado como um elemento isolante é mostrada.

Como mostrado na modalidade das figuras 1 e 2A-C, o aparelho caracteriza doze canais (algumas vezes referido aqui como canais recipien- tes de reação). Entretanto, mais ou menos canais são possíveis Dependen- do do uso pretendido, por exemplo, a partir de cerca de um ou dois a cerca de doze canais, ou entre cerca de doze a diversas centenas canais, preferi- velmente cerca de oito a cerca de uma centena canais.

Preferivelmente, ca- da canal é independentemente adaptado para receber um recipiente de rea- ção 90 que é tipicamente definido por uma extremidade de fundo 92 dentro da primeira fonte de calor 20 e uma extremidade de topo 91 em cima da se- gunda fonte de calor 31. O canal 70 nas primeira 20 e segunda 30 fontes de calor tipicamente passa através do primeiro elemento isolante 50. Pontos centrais entre as extremidades de topo 71 e de fundo 72 do canal 70 formam um eixo do canal 80 (algumas vezes referido aqui como eixo de canal) sobre o qual as fontes de calor e os elementos isolantes são dispostos.

Com referência mais uma vez à modalidade mostrada nas figu- ras 1 e 2A-C, o canal 70 é adaptado de modo que o recipiente de reação 90 pode se encaixar apertadamente no mesmo isto é, o mesmo tem um perfil dimensional que é essencialmente o mesmo que aquele da parte mais baixa 5 do recipiente de reação como ilustrado na figura 2A.

Em operação, o canal funciona como um receptor para receber um recipiente de reação.

Entretanto como será explicado em mais detalhes abaixo, a estrutura do canal 70 pode ser ajustada e/ou movida em relação ao eixo de canal 80 proporcionando diferentes possibilidades de contato térmico entre o recipiente de reação 90 e uma ou mais das fontes de calor 20 e 30. Como um exemplo, o orifício perfurado 71 formado na segunda fonte de calor 30 pode funcionar como uma parte de topo do canal 70. Na referida modalidade, o canal 70 dentro da segunda fonte de calor 30 está em contato físico com a segunda fonte de calor 30. Ou seja, uma parede do ori- fício perfurado 71 que se estende para dentro da segunda fonte de calor 30 está em contato físico com o recipiente de reação 90. Na referida modalida- de, o aparelho pode proporcionar eficiente transferência de calor a partir da segunda fonte de calor 30 para o canal 70 e recipiente de reação 90. Para muitas aplicações da invenção, será em geral preferido se ter o tamanho do orifício perfurado na segunda fonte de calor essencialmen- te o mesmo que aquele do canal ou recipiente de reação.

Entretanto, outras modalidades de orifício perfurado estão dentro do âmbito da presente inven- ção e são descritas aqui.

Por exemplo, e com referência de novo às figuras 2A-C, o orifício perfurado 71 na segunda fonte de calor 30 pode ser produzi- do maior do que o tamanho do recipiente de reação 90. Entretanto, em tal caso, a transferência de calor a partir da segunda fonte de calor 30 para o recipiente de reação 90 pode se tornar menos eficiente.

Na referida modali- dade, pode ser útil se reduzir a temperatura da segunda fonte de calor 30 para a prática ótima da presente invenção.

Para a maior parte das aplica- ções da presente invenção, será em geral útil se ter o tamanho do orifício perfurado 71 na segunda fonte de calor 30 essencialmente de mesmo tama- nho que aquele do recipiente de reação 90.

Em modalidades da presente invenção nas quais o orifício re- ceptor 73 tem uma extremidade de fundo fechada 72 formada na primeira fonte de calor 20, a mesma com frequência funcionará como uma porção de fundo do canal 70. Vide a figura 2A, por exemplo.

Na referida modalidade, o 5 orifício receptor 73 da primeira fonte de calor 20 tem um tamanho essenci- almente o mesmo que aquele da parte de fundo do recipiente de reação 92 o qual na maioria das modalidades proporcionará contato físico e eficiente transferência de calor para o recipiente de reação 90. Em algumas modali- dades da presente invenção, o orifício receptor 73 na primeira fonte de calor 20 pode ser dotado de uma estrutura de câmara parcial ou um tamanho rela- tivamente maior do que aquele da parte de fundo do recipiente de reação como será discutido.

Estrutura de câmara e Função Voltando mais uma vez para o aparelho mostrado nas figuras 2A-C, a primeira câmara 100 é simetricamente disposta sobre o canal 70 e dentro da segunda fonte de calor 30. Presença do referido espaço fisicamen- te não em contato (mas termicamente em contato com) dentro do aparelho 10 proporciona muitos benefícios e vantagens.

Por exemplo, e sem intenção de estar ligado a qualquer teoria, a presença da primeira câmara 100 pro- porciona transferência de calor a partir da segunda fonte de calor 30 para o canal 70 ou o recipiente de reação 90 que é desejavelmente menos eficien- te.

Ou seja, a câmara 100 reduz a transferência de calor substancialmente entre a segunda fonte de calor 30 e o canal 70 ou o recipiente de reação 90. Como se tornará mais aparente a partir da discussão a seguir, a característi- ca da presente invenção suporta PCR por convecção térmica robusta e mais rápida dentro do aparelho 10. Embora seja com frequência útil incluir um espaço fisicamente não em contato dentro da segunda fonte de calor 30, está dentro do âmbito da presente invenção incluir o referido espaço dentro da primeira fonte de calor 20. Por exemplo, a primeira fonte de calor 20 pode incluir uma ou mais câmaras pretendidas para reduzir a transferência de calor entre a primeira fonte de calor 20 e o canal 70 ou o recipiente de reação 90.

A modalidade da presente invenção mostrada nas figuras 2A-C inclui uma primeira câmara 100 na segunda fonte de calor 20 como um ele- mento estrutural chave. No referido exemplo da presente invenção, a primei- ra câmara 100 é independentemente adaptada para receber o canal 70 a 5 partir do topo da segunda fonte de calor 31 em direção do fundo da segunda fonte de calor 32 e o topo da primeira fonte de calor 21. A primeira câmara 100 é definida por uma extremidade de topo 101 dentro da segunda fonte de calor 30, uma extremidade de fundo 102 no fundo da segunda fonte de calor 30, e a primeira parede de câmara 103 que é disposta em torno do eixo de canal 80 e espaçada a partir do canal 70 dentro da segunda fonte de calor

30. A parede de câmara 103 circunda o canal 70 dentro da segunda fonte de calor 20 a uma distância, formando um espaço de câmara 105. O espaço de câmara 105 entre a parede de câmara 103 e o canal 70 é preferivelmente na faixa entre a partir de cerca de 0,1 mm a cerca de 6 mm, mais preferivelmen- te a partir de cerca de 0,2 mm a cerca de 4 mm. O comprimento da primeira câmara 100 é entre cerca de 1 mm a cerca de 25 mm, preferivelmente entre cerca de 2 mm a cerca de 15 mm. A presente invenção é compatível com uma grande variedade de configurações de fonte de calor e elemento isolante. Por exemplo, a primeira fonte de calor 20 pode ser dotada de um comprimento maior do que cerca de 1 mm ao longo do eixo de canal 80, preferivelmente a partir de cerca de 2 mm a cerca de 10 mm; e a segunda fonte de calor 30 pode ser dotada de um comprimento entre a partir de cerca de 2 mm a cerca de 25 mm ao longo do eixo de canal 80, preferivelmente a partir de cerca de 3 mm a cerca de 15 mm. Como discutido, será em geral útil se ter um aparelho com um primeiro elemento isolante 50. Por exemplo, em modalidades sem as protuberâncias, o primeiro elemento isolante 50 pode ser dotado de um comprimento ao lon- go do eixo de canal 80 entre cerca de 0,2 mm a cerca de 8 mm ao longo do eixo de canal 80, preferivelmente entre cerca de 0,5 mm a 5 mm. Em outras modalidades nas quais a estrutura de protuberância está presente, o primei- ro elemento isolante 50 pode ser dotado de diferentes comprimentos ao lon- go do eixo de canal 80 dependendo da posição com relação ao canal 70.

Por exemplo, na região próxima ou em torno do canal (isto é, dentro das pro- tuberâncias), o primeiro elemento isolante 50 pode ser dotado de um com- primento ao longo do eixo de canal entre cerca de 0,2 mm a cerca de 8 mm, preferivelmente entre cerca de 0,5 mm a 5 mm. Na região distante a partir do 5 canal (isto é, fora das estruturas de protuberância), o primeiro elemento iso- lante 50 pode ser dotado de um comprimento ao longo do eixo de canal en- tre cerca de 0,5 mm a cerca de 20 mm, preferivelmente entre cerca de 1 mm a 10 mm. Como discutido, um aparelho da presente invenção pode incluir múltiplas câmaras (por exemplo, duas, três, quatro ou mais câmaras) dentro de pelo menos uma das fontes de calor tal como a segunda fonte de calor. Na modalidade mostrada nas figuras 3A-B, o aparelho inclui uma primeira câmara 100 posicionada inteiramente dentro da segunda fonte de calor 30. Na referida modalidade, a primeira câmara 100 inclui a extremidade de topo de câmara 101 voltada para uma primeira extremidade de fundo de câmara 102 ao longo do eixo de canal 80. O aparelho adicionalmente inclui a segunda câmara 110 posicionada inteiramente dentro da segunda fonte de calor 30 e em contato com a extremidade de topo 101 da primeira câmara

100. A parede 103 da primeira câmara 100 é alinhada essencialmente para- lela ao eixo de canal 80. A segunda câmara 110 é adicionalmente definida pela parede 113 posicionada essencialmente paralela ao eixo de canal 80. A segunda câmara 110 é adicionalmente definida por uma extremidade de to- po 111 dentro da segunda fonte de calor 30 e uma extremidade de fundo 112 em contato com a extremidade de topo 101 da primeira câmara 100. Como mostrado, a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 incluem espaços 105 e 115, respectivamente. Na modalidade mostrada, cada uma das extremidade de topo 111 e extremidade de fundo 112 da segunda câma- ra 110 são perpendiculares ao eixo de canal 80. Como mostrado na figura 3A, a largura ou raio da primeira câmara 100 a partir do eixo de canal 80 é menor (cerca de 0,9 a 0,3 vezes menor) do que a largura ou raio da segunda câmara 110 a partir do eixo de canal 80. Entretanto como mostrado na mo- dalidade da figura 3B, a largura ou raio da primeira câmara 100 a partir do eixo de canal 80 é maior (cerca de 1,1 a cerca de 3 vezes maior) do que a largura da segunda câmara 110 a partir do eixo de canal 80. Voltando mais uma vez às figuras 3A-B, a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 proporcionam um controle útil de temperatura ou 5 efeito de formação.

Nas referidas modalidades, a primeira câmara 100 (figu- ra 3A) ou a segunda câmara 110 (figura 3B) tem um menor diâmetro ou lar- gura comparado com a outra câmara.

A porção mais estreita da segunda câmara 110 (figura 3B) ou primeira câmara 100 (figura 3A) proporciona uma transferência de calor mais eficiente a partir da segunda fonte de calor 30 comparado com a outra câmara.

Em adição, a configuração de câmara mos- trada nas referidas modalidades bloqueia ou reduz a transferência de calor a partir da primeira fonte de calor.

A não ser que de outro modo mencionado, as modalidades com múltiplas câmaras serão descritas ao numerar as câmaras a partir da primei- ra fonte de calor (tipicamente localizadas mais próximas do fundo do apare- lho). Assim a câmara mais próxima da primeira fonte de calor será designa- da "primeira câmara", a próxima mais próxima de câmara para a primeira fonte de calor será designada "segunda câmara", etc.

Estrutura de Freio Término e Função A figura 4A mostra uma modalidade da invenção com duas câ- maras posicionadas na segunda fonte de calor.

Em particular, o aparelho 10 tem a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 posicionadas na se- gunda fonte de calor 30. A figura 4B é uma vista expandida do círculo pontilhado mostra- do na figura 4A.

Em particular, a região entre a primeira câmara 100 e a se- gunda câmara 110 define um primeiro freio térmico 130. Como mencionado acima, o primeiro freio térmico 130 é pretendido para controlar uma distribui- ção de temperatura dentro do aparelho 10. Na modalidade mostrada, o pri- meiro freio térmico 130 é definido por uma extremidade de topo 131 e uma extremidade de fundo 132 e uma parede 133 que essencialmente entra em contato com o canal 70. Na referida modalidade, uma função do primeiro freio térmico 130 é para reduzir ou bloquear uma intrusão indesejável do per-

fil de temperatura a partir da primeira fonte de calor 20 para a segunda fonte de calor 30. Outra função do primeiro freio térmico 130 é proporcionar uma eficiente transferência de calor entre a segunda fonte de calor 30 e o canal 70 de modo a fazer com que o canal naquela região rapidamente alcance a 5 temperatura da segunda fonte de calor 30. O primeiro freio térmico 130 é disposto simetricamente sobre o canal 70. Se desejado, pelo menos um da primeira câmara 100 e da se- gunda câmara 110 (ou uma porção da mesma) pode incluir um elemento isolante de sólido ou gás adequado.

Alternativamente, ou em adição, o pri- meiro elemento isolante 50 mostrado pode incluir ou consistir de um gás ou sólido adequado.

Um exemplo de gás isolante adequado é ar.

Estrutura de protuberância e Função Em muitas modalidades da presente invenção, o aparelho 10 ca- racteriza pelo menos uma protuberância que se estende a partir do topo ou superfície de fundo da primeira ou segunda fonte de calor.

Em uma modali- dade, a segunda fonte de calor 30 caracteriza uma primeira protuberância 33 que se estende a partir da superfície de fundo 32 da segunda fonte de calor 30 em direção da primeira fonte de calor 20 na direção em geral paralela ao eixo de canal; e opcionalmente a segunda protuberância 34 que se estende em afastamento a partir da superfície de topo 31 da segunda fonte de calor 30 em geral paralela ao eixo de canal.

Alternativamente, ou em adição, a primeira fonte de calor 20 pode incluir uma primeira protuberância 23 que se estende a partir da superfície de topo 21 da primeira fonte de calor 20 em direção da segunda fonte de calor 30 em geral paralela ao eixo de canal; e opcionalmente a segunda protuberância 24 que se estende em afastamento a partir da superfície de fundo 22 da primeira fonte de calor 20 em geral pa- ralela ao eixo de canal.

Em algumas modalidades, o aparelho pode compre- ender pelo menos uma protuberância que é inclinada com relação ao eixo de canal.

As figuras 5A-C mostram uma modalidade da invenção compre- endendo uma primeira protuberância 33 da segunda fonte de calor 30 que se estende em direção da primeira fonte de calor 20 e uma primeira protube-

rância 23 da primeira fonte de calor 20 que se estende em direção da se- gunda fonte de calor 30. No referido exemplo da presente invenção, cada uma das protuberâncias (23, 33) é disposta simetricamente sobre a primeira câmara 100 e/ou o eixo de canal 80. Na referida modalidade, a primeira pro- 5 tuberância 33 da segunda fonte de calor 30 ajuda a definir a primeira câmara 100 ou o canal 70, o primeiro elemento isolante 50, e a segunda fonte de calor 30, e separa o primeiro elemento isolante 50 a partir da primeira câma- ra 100 ou o canal 70. A primeira protuberância 23 da primeira fonte de calor 20 ajuda a definir o canal 80 e a primeira fonte de calor 20, e separa o pri- meiro elemento isolante 50 a partir do canal 70. As protuberâncias 23, 33 também definem uma porção 51 do primeiro elemento isolante 50 (chamada uma primeira câmara isolante). Na referida modalidade, a primeira câmara isolante 51 é definida por pelo menos a primeira fonte de calor 20, a primeira protuberância da primeira fonte de calor 23, a segunda fonte de calor 30, e a primeira protuberância da segunda fonte de calor 33. Na modalidade mostrada nas figuras 5A-C, as extremidades de topo 101 e de fundo 102s da primeira câmara 100 são essencialmente per- pendiculares ao eixo de canal 80. O comprimento da primeira câmara 100 é entre cerca de 1 mm a cerca de 25 mm, preferivelmente entre cerca de 2 mm a cerca de 15 mm.

Adicionalmente, o orifício receptor 73 é simetrica- mente disposto sobre o canal 70 e eixo de canal 80. Na referida modalidade, a função da protuberâncias 23 e 33 é para reduzir a transferência de calor entre as primeira 20 e segunda 30 fon- tes de calor assim como o volume das primeira 20 e segunda 30 fontes de calor enquanto se alonga a dimensão da câmara ao longo do eixo de canal para ajudar a PCR por convecção térmica.

Pelo uso de estruturas de protu- berância, um primeiro espaço isolante pode ser produzido pequeno próximo à região de canal (isto é, dentro das estruturas de protuberância) de modo que um comprimento de câmara mais longo ao longo do eixo de canal pode ser proporcionado para aumentar a eficiência da PCR por convecção térmi- ca, enquanto se proporciona um maior espaço fora das estruturas de protu- berância para ajudar a reduzir a transferência de calor entre as duas fontes de calor de modo a reduzir o consumo de energia do aparelho.

O volume das duas fontes de calor pode também ser reduzido substancialmente pelo uso das estruturas de protuberância 23, 33 de modo que a capacidade de calor das duas fontes de calor é reduzida para adicionalmente ajudar a redu- 5 ção do consumo de energia.

Com referência à modalidade mostrada nas figuras 6A-C, a pri- meira fonte de calor 20 adicionalmente inclui a segunda protuberância 24 que se estende em afastamento a partir da superfície de fundo 22 da primei- ra fonte de calor 20 em adição à primeira protuberância 23. A segunda fonte de calor 30 também adicionalmente inclui a segunda protuberância 34 que se estende em afastamento a partir da superfície de topo 31 da segunda fonte de calor em adição à primeira protuberância 33. Outra característica da presente modalidade é a mesma da modalidade mostrada nas figuras 5A-C.

Na referida modalidade, a função das segundas protuberâncias 24 e 34 é de adicionalmente reduzir o volume das primeira e segunda fontes de calor de modo a adicionalmente reduzir o consumo de energia do aparelho.

As se- gundas protuberâncias 24, 34 das primeira e segunda fontes de calor são também úteis na referida modalidade para ajudar o rápido resfriamento das duas fontes de calor após a conclusão da PCR por convecção térmica usan- do um elemento de resfriamento tal como uma ventoinha.

Estrutura de canal A.

Perfis verticais A presente invenção é completamente compatível com diversas configurações de canal.

Por exemplo, as figuras 7A-D mostram seções verti- cais de configurações adequadas de canal.

Como mostrado, o perfil vertical do canal pode ser formado como um canal linear (figuras 7C-D) ou afunilado (Figura 7A-B). Na modalidade afunilada, o canal pode ser afunilado seja a partir do topo para o fundo ou a partir do fundo para o topo.

Embora várias modificações sejam possíveis com relação ao perfil vertical do canal (por exemplo, um canal tendo a parede lateral que é curvada, ou afunilada com dois ou mais ângulos diferentes, etc.), é em geral preferido se usar um canal que seja (linearmente) afunilado a partir do topo para o fundo pelo fato de que a referida estrutura facilita não apenas o processo da fabricação mas também a introdução do recipiente de reação para o canal.

Um ângulo de inclinação em geral útil (θ) está na faixa entre a partir de cerca de 0° a cer ca de 15°, preferivelmente a partir de cerca de 2o a c erca de 10°. 5 Nas modalidades mostradas nas figuras 7A-B, o canal 70 é adi- cionalmente definido por um topo aberto 71 e uma extremidade de fundo fechada 72 cujas extremidades podem ser perpendiculares ao eixo de canal 80 (figura 7A) ou curvada (figura 7B). A extremidade de fundo 72 pode ser curvada com um formato côncavo ou convexo tendo um raio de curvatura igual a ou maior do que o raio ou metade da largura do perfil horizontal da extremidade de fundo.

A extremidade de fundo plana ou quase plana com o seu raio de curvatura pelo menos duas vezes maior do que o raio ou metade da largura do perfil horizontal da extremidade de fundo é mais preferida em relação a outros formatos uma vez que pode proporcionar uma maior trans- ferência de calor para o processo de desnaturação.

O canal 70 é adicional- mente definido pela altura (h) ao longo do eixo de canal 80 e a largura (w1) perpendicular ao eixo de canal 80. Para muitas aplicações da invenção, será útil se ter um canal 70 que é essencialmente retilíneo (isto é, não dobrado ou afunilado). Nas moda- lidades mostradas nas figuras 7C-D, o canal 70 tem a extremidade de topo aberta 71 e a extremidade de fundo fechada 72 que pode ser perpendicular ao eixo de canal 80 (figura 7C) ou curvada (figura 7D). Como nas modalida- des de canal afunilado, a extremidade de fundo 72 pode ser curvada com um formato côncavo ou convexo e a extremidade de fundo plana ou quase plana tendo uma grande curvatura é tipicamente mais preferida.

O canal 70 é adicionalmente definido nas referidas modalidades pela altura (h) ao longo do eixo de canal 80 e a largura (w1) perpendicular ao eixo de canal 80. Nas modalidades de canal mostradas nas figuras 7A-D, a altura (h) é pelo menos de cerca de 5 mm a cerca de 25 mm, preferivelmente 8 mm a cerca de 16 mm para um volume de amostra de cerca de 20 microli- tros.

Cada modalidade de canal é adicionalmente definida por a média da largura (w1) ao longo do eixo de canal 80 que é tipicamente pelo menos de cerca de 1 mm a cerca de 5 mm.

Cada uma das modalidades de canal mos- tradas nas figuras 7A-D pode ser adicionalmente definida por uma proporção de aspecto vertical que é a proporção da altura (h) para a largura (w1), e uma proporção de aspecto horizontal que é a proporção da primeira largura 5 (w1) para a segunda largura (w2) ao longo das primeira e segunda direções, respectivamente, que são mutuamente perpendiculares uma a outra e ali- nhadas perpendiculares ao eixo de canal.

Uma proporção de aspecto verti- cal em geral adequada é entre cerca de 4 a cerca de 15, preferivelmente a partir de cerca de 5 a cerca de 10. A proporção de aspecto horizontal é tipi- camente entre cerca de 1 a cerca de 4. Em modalidades nas quais o canal 70 é afunilado (figuras 7A-B), a largura ou diâmetro do canal muda através do perfil vertical do canal.

Por meio de orientação geral, para volumes de amostra maiores ou menores do que 20 microlitros, a altura e a largura (ou diâmetro) podem ser graduadas por um fator de raiz cúbica ou algumas ve- zes raiz quadrada da proporção de volume.

Como discutido, a extremidade de fundo 72 do canal pode ser plana, arredondada, ou curvada como ilustrado na figura 7A-D. quando a extremidade de fundo é arredondada ou curvada, a mesma tipicamente tem um formato convexo ou côncavo.

Como discutido, a extremidade de fundo plana ou quase plana é mais preferida em relação a outros formatos para muitas modalidades da presente invenção.

Embora não se deseje estar liga- do a uma teoria, acredita-se que a referida configuração de fundo possa au- mentar a transferência de calor a partir da primeira fonte de calor 20 para a extremidade de fundo 71 do canal 70 de modo a facilitar o processo de des- naturação.

Nenhum dos perfis de canal vertical anteriores é mutuamente exclusivo.

Ou seja, um canal que tem uma primeira porção que é retilínea e segunda porção que é afunilada (com relação ao eixo de canal 80) está den- tro do âmbito da presente invenção.

B.

Perfis horizontais A presente invenção é também compatível com uma variedade de perfis de canal horizontal.

Um formato de canal essencialmente simétrico é em geral preferido onde a facilidade de fabricação é uma preocupação.

As figuras 8A-J mostram alguns exemplos de perfis de canal horizontal aceitá- veis, cada um com uma simetria designada.

Por exemplo, o canal 70 pode ser dotado de seu formato horizontal que é circular (Figura 8A), quadrado 5 (Figura 8D), quadrado arredondado (Figura 8G) ou hexagonal (Figura 8J) com relação ao eixo de canal 80. Em outras modalidades, o canal 70 pode ser dotado de um formato horizontal que tem sua largura maior do que seu comprimento (ou vice versa). Por exemplo, e como ilustrado na coluna do meio da figura 8B, E e H, o perfil horizontal do canal 70 pode ser formado como uma elipsoide (Figura 8B), retangular (Figura 8E), ou arredondada re- tangular (Figura 8H). O referido tipo de formato horizontal é útil quando in- corporando um padrão de fluxo de convecção com sentido ascendente em um lado (por exemplo, no lado esquerdo) e com sentido descendente no la- do oposto (por exemplo, no lado direito). Em virtude do perfil de largura rela- tivamente maior incorporado em comparação ao comprimento, a interferên- cia entre os fluxos de convecção ascendente e descendente pode ser redu- zida, conduzindo a fluxo de circulação mais suave.

O canal pode ser dotado de um formato horizontal que tem um de seus lados mais estreito do que o lado oposto.

Alguns exemplos são mostrados na coluna da direita das figu- ras 8C, F e I.

O lado esquerdo do canal é ilustrado para ser mais estreito do que o lado direito por exemplo.

O referido tipo de formato horizontal é tam- bém útil quando incorporando um padrão de fluxo de convecção com sentido ascendente em um lado (por exemplo, no lado esquerdo) e com sentido descendente no lado oposto (por exemplo, no lado direito). Adicionalmente, quando o referido tipo de formato é incorporado, velocidade do fluxo des- cendente (por exemplo, no lado direito) pode ser controlada (tipicamente reduzida) com relação ao fluxo ascendente.

Uma vez que o fluxo de convec- ção deve ser contínuo dentro do meio contínuo da amostra, a velocidade do fluxo deve ser reduzida quando a área de seção transversal se torna maior (ou vice versa). Esta característica é particularmente importante com relação a aumentar a eficiência da polimerização.

A etapa de polimerização tipica- mente ocorre durante o fluxo descendente (isto é, após a etapa de recozi-

mento), e portanto, o período de tempo para a etapa de polimerização pode ser alongado ao fazer o fluxo descendente mais baixo em comparação àque- le do fluxo ascendente, conduzindo a amplificação de PCR mais eficiente.

Assim em uma modalidade da presente invenção, pelo menos 5 parte do canal 70 (incluindo todo o canal) tem um formato horizontal ao lon- go de um plano essencialmente perpendicular ao eixo de canal 80. Em um exemplo da invenção, o formato horizontal tem pelo menos uma reflexão (σ) ou de elemento de simetria de rotação (Cx) no qual X é 1, 2, 3, 4, até ∞ (infi- nito). Quase qualquer formato horizontal é aceitável desde que satisfaça os objetivos pretendidos da invenção.

Formatos horizontais adicionalmente aceitáveis incluem circular, losango, quadrado, quadrado arredondado, elip- soide, romboide, retangular, arredondada retangular, oval, semicircular, tra- pezoide, ou trapezoide arredondado ao longo do plano.

Se desejado, o plano perpendicular ao eixo de canal 80 pode estar dentro da primeira 20 ou se- gunda 30 fonte de calor.

Nenhum dos perfis de canal horizontal anteriores é mutuamente exclusivo.

Ou seja, um canal que tem uma primeira porção que é circular, por exemplo, e a segunda porção que é semicircular (com relação ao eixo de canal 80) está dentro do âmbito da presente invenção.

Formato e Posição de Câmara Horizontal Como discutido, um aparelho da presente invenção pode incluir pelo menos uma câmara, preferivelmente uma, duas ou três câmaras para ajudar a controlar uma distribuição de temperatura dentro do aparelho, por exemplo, dentro da região de transição do canal.

O canal pode ser dotado de um ou uma combinação de formatos adequados desde que os resultados pretendidos da presente invenção sejam alcançados.

Por exemplo, as figuras 9A-I mostram perfis horizontais adequa- dos de uma câmara (a primeira câmara 100 é usada como uma ilustração apenas). Em uma modalidade da presente invenção, o perfil horizontal da câmara 100 pode ser produzido em vários formatos diferentes embora for- matos que sejam essencialmente simétricos sejam com frequência úteis pa- ra facilitar o processo da fabricação.

Por exemplo, a primeira câmara 100 pode ser dotada de um formato horizontal que é circular, quadrado, ou qua- drado arredondado como ilustrado na coluna da esquerda.

Vide figuras 9A, D, e G.

A primeira câmara 100 pode ser dotada de um formato horizontal que tem sua largura maior do que seu comprimento (ou vice versa), por 5 exemplo, um formato elipsoide, retangular, ou arredondado retangular como ilustrado na coluna do meio.

A primeira câmara 100 pode ser dotada de um formato horizontal que tem um de seus lados mais estreito do que o lado oposto como ilustrado na coluna da direita.

Vide figuras 9C, F, e I.

Como discutido, estrutura de câmara é útil em controlar (tipica- mente reduzir) a transferência de calor a partir da fonte de calor (tipicamente a segunda fonte de calor) para o canal ou o recipiente de reação.

Portanto, é importante mudar a posição da primeira câmara 100 com relação àquela do canal 70 dependendo da modalidade de interesse da presente invenção.

Em uma modalidade, a primeira câmara 100 é disposta simetricamente com re- lação à posição do canal 70, isto é, um eixo da câmara (um eixo formado pelos pontos centrais das extremidades de fundo e de topo da câmara, 106) coincide com o eixo de canal 80. Na referida modalidade, a transferência de calor a partir da fonte de calor 20 ou 30 para o canal é pretendida ser cons- tante em todas as direções através do perfil horizontal do canal (em determi- nado local vertical). Portanto, é preferido se usar um formato horizontal da primeira câmara 100 que é o mesmo que aquele do canal nas referidas mo- dalidades.

Vide figuras 9A-I.

Entretanto outras modalidades da estrutura de câmara estão dentro do âmbito da presente invenção.

Por exemplo, uma ou mais das câ- maras dentro do aparelho pode ser disposto assimetricamente com relação à posição do canal 70. Ou seja, um eixo da câmara 106 formado entre a ex- tremidade de topo e extremidade de fundo da câmara particular pode ser descentralizado, inclinado ou não só descentralizado mas também inclinado com relação ao eixo de canal 80. Na referida modalidade, um ou mais dos espaços de câmara entre o canal 70 e uma parede da câmara será maior em um lado e menor no lado oposto daquela câmara.

Transferência de calor nas referidas modalidades será mais alta em um lado do canal 70 e mais baixa no lado oposto (embora seja a mesma ou similar nos dois lados opos- tos localizados ao longo da direção perpendicular às posições de acima de dois lados). Na modalidade particular, é preferido se usar um formato hori- zontal da primeira câmara 100 que é circular ou arredondada retangular.

Um 5 formato circular é em geral mais preferido.

Assim em uma modalidade do aparelho, pelo menos parte da primeira câmara 100 (incluindo toda a câmara) tem um formato horizontal ao longo de um plano essencialmente perpendicular ao eixo de canal 80. Vide a figura 9A e a figura 2A-C, por exemplo.

Tipicamente, o formato horizontal tem pelo menos um elemento de simetria de reflexão ou rotação.

Formatos horizontais preferidos para uso com a presente invenção incluem os que são de formato circular, losango, quadrado, quadrado arredondado, elipsoide, romboide, retangular, arredondada retangular, oval, semicircular, trapezoide, ou trapezoide arredondado ao longo de um plano perpendicular ao eixo de canal 80. Em uma modalidade, o plano perpendicular ao eixo de canal 80 está dentro da segunda 30 ou primeira 20 fonte de calor.

Será observado que a discussão anterior sobre a estrutura de câmara e posição será aplicável a mais modalidades de câmara do que a primeira câmara 100. Ou seja, em uma modalidade da invenção com múlti- plas câmaras (por exemplo, um com a segunda câmara 110 e/ou terceira câmara 120), as referidas considerações podem também se aplicar.

Configurações de Canal/Câmara Assimétrico e Simétrico Como mencionado, a presente invenção é compatível com uma grande variedade de configurações de canal e de câmara.

Em uma modali- dade, um canal adequado é disposto assimetricamente com relação à câma- ra.

As figuras 10A-P mostram alguns exemplos do referido conceito.

Em particular, as figuras 10A-P mostram seções horizontais de estruturas adequadas de canal e câmara com referência ao local do canal 70 dentro da câmara 100 (a primeira câmara 100 é usada apenas para fins ilus- trativos). Formatos horizontais da primeira câmara 100 e canal 70 são mos- trados para ser circular ou arredondada retangular por exemplo.

A primeira coluna (figuras 10A, E, I e M) mostra exemplos de estruturas simetricamente posicionadas.

Nas referidas modalidades, um eixo da câmara coincide com o eixo de canal 70. Portanto, o espaço entre a primeira parede de câmara (103, linha sólida) e o canal 70 (linha pontilhada) é o mesmo para os lados esquerdo e direito, e também para os lados superior e mais baixo, proporci- 5 onando a transferência de calor a partir da fonte de calor para o canal que é simétrico em ambas as direções.

A segunda coluna (figuras 10B, F, J e N) mostra exemplos das estruturas simetricamente posicionadas.

O eixo de canal 80 é posicionado descentralizado (para o lado esquerdo) a partir do eixo da câmara e o espaço entre a primeira parede de câmara 103 e o canal 70 é menor no lado esquerdo (embora seja o mesmo nos lados superior e mais baixo), proporcionando mais alta transferência de calor a partir do lado esquerdo.

A terceira (figuras 10C, G, K e O) e quarta (figuras 8D, H, L, e P) colunas mostram outros exemplos das estruturas simetricamente posiciona- das que proporcionam transferência de calor mais assimétrica.

A terceira coluna (Figura 10C, G, K e O) mostra exemplos nos quais a parede de câ- mara está em contato com o canal em um lado (o lado esquerdo). A quarta coluna (Figura 10D, H, L, e P) mostra exemplos nos quais um lado (o lado direito) forma a primeira câmara 100 enquanto o lado oposto (o lado esquer- do) forma o canal 70. Em ambos os exemplos, transferência de calor a partir do lado esquerdo é muito mais alta do que a partir do lado direito.

O lado fisicamente em contato mostrado nas terceira e quarta colunas é pretendido funcionar como um freio térmico, particularmente como um freio térmico as- simétrico que proporciona frenagem térmica em um lado apenas.

É assim um objetivo da presente invenção proporcionar um apa- relho no qual pelo menos uma das câmaras no mesmo (por exemplo, uma ou mais de primeira câmara 100, segunda câmara 110, ou a terceira câmara 120) é disposta essencialmente simetricamente sobre o canal ao longo de um plano que é essencialmente perpendicular ao eixo de canal.

É também um objetivo proporcionar um aparelho no qual pelo menos uma das câmaras é disposta assimetricamente sobre o canal e ao longo do plano que é essen- cialmente perpendicular ao eixo de canal.

Todas ou parte da(s) câmara(s) particular(es) pode ser disposta sobre o eixo de canal seja simetricamente ou assimetricamente conforme necessário.

Em modalidades nas quais pelo menos uma câmara é disposta assimetricamente sobre o eixo de canal, um eixo da câmara e o eixo de canal podem ser descentralizados enquanto es- sencialmente paralelos entre si, inclinado ou não só descentralizado mas 5 também inclinado.

Em uma modalidade mais específica do dito acima, pelo menos parte de uma câmara incluindo toda a câmara é disposta assimetri- camente sobre o canal ao longo de um plano perpendicular ao eixo de canal.

Em outras modalidades, pelo menos parte do canal é localizada dentro da câmara ao longo do plano perpendicular ao eixo de canal.

Em um exemplo da presente modalidade, pelo menos parte do canal está em contato com a parede de câmara ao longo do plano perpendicular ao eixo de canal.

Em outra modalidade, pelo menos parte do canal é localizada fora da câmara ao longo do plano perpendicular ao eixo de canal e entra em contato com a se- gunda ou primeira fonte de calor.

Para algumas modalidades da presente invenção, o plano perpendicular ao eixo de canal entra em contato com a segunda ou primeira fonte de calor.

Formato da Câmara Vertical É também um objetivo da presente invenção proporcionar um aparelho no qual a segunda fonte de calor inclui pelo menos uma câmara, tipicamente uma, duas ou três da mesma para ajudar a controlar a distribui- ção de temperatura.

Preferivelmente, a câmara ajuda controlar um gradiente de temperatura da região de transição a partir de uma fonte de calor (por exemplo, a primeira fonte de calor 20) dentro do aparelho para outra fonte de calor (por exemplo, a segunda fonte de calor 30) no mesmo.

Várias adapta- ções da câmara estão dentro do âmbito da presente invenção desde que a mesma gere uma distribuição de temperatura adequada para processo de PCR com base em convecção da presente invenção.

É um objetivo da presente invenção proporcionar um aparelho no qual pelo menos parte de uma câmara (até e incluindo toda a câmara) é afunilada ao longo do eixo de canal.

Por exemplo, e em uma modalidade, uma ou mais das câmaras incluindo todas as câmaras no mesmo são afuni- ladas ao longo do eixo de canal.

Em uma modalidade, pelo menos parte de uma ou todas as câmaras são posicionadas dentro da segunda fonte de ca- lor e tem uma largura (w) perpendicular ao eixo de canal que é maior em direção da primeira fonte de calor do que o outro lado.

Em algumas modali- dades, pelo menos parte da câmara é posicionada dentro da segunda fonte 5 de calor e tem uma largura (w) perpendicular ao eixo de canal que é menor em direção da primeira fonte de calor do que o outro lado.

Em uma modali- dade, o aparelho inclui a primeira câmara e a segunda câmara posicionadas dentro da segunda fonte de calor, a primeira câmara tendo a largura (w) per- pendicular ao eixo de canal que é maior (ou menor) do que a largura (w) da segunda câmara.

Para algumas modalidades, a primeira câmara é voltada para a primeira fonte de calor.

Modalidades adicionais ilustrativas do aparelho Configurações adequadas de fonte de calor, elemento isolante, canal, espaço, câmara, do orifício receptor e condições de PCR são descri- tas através do presente pedido e podem ser usados conforme necessário com os exemplos a seguir da invenção.

A.

Uma câmara, Primeira e segunda fontes de calor, Protuberância Em algumas modalidades da presente invenção, será útil se manipular a estrutura de uma ou mais das câmaras ao mudar a estrutura de pelo menos uma das fontes de calor.

Por exemplo, pelo menos uma das primeira e segunda fontes de calor pode ser adaptada para incluir uma ou mais protuberâncias que definem o espaço ou câmara e em geral se esten- de essencialmente paralela ao canal ou eixo da câmara.

A protuberância pode ser disposta simetricamente ou assimetricamente sobre o canal ou eixo da câmara.

Protuberâncias significativas se estendem em afastamento a partir de uma fonte de calor para outra fonte de calor dentro do aparelho.

Por exemplo, a primeira protuberância da segunda fonte de calor estende em afastamento a partir da segunda fonte de calor em direção da primeira fonte de calor e a primeira protuberância da primeira fonte de calor estende em afastamento a partir da primeira fonte de calor em direção da segunda fonte de calor.

Nas referidas modalidades, a protuberância entra em contato com a câmara e define um espaço de câmara ou parede de câmara.

Na modali-

dade particular, a largura ou diâmetro da segunda protuberância de fonte de calor ao longo do eixo de canal é reduzido indo em afastamento a partir da segunda fonte de calor enquanto a largura do primeiro elemento isolante adjacente à protuberância ao longo do eixo de canal é aumentada. Cada 5 câmara pode ser dotada das mesmas ou diferentes protuberâncias (incluin- do nenhuma protuberância). Uma importante vantagem das protuberâncias é de ajudar a reduzir o tamanho das fontes de calor e aumentar as dimensões da câmara e as dimensões do elemento isolante ou espaço isolante ao longo do eixo de canal. Os referidos e outros benefícios foram observados ajudar PCR por convecção térmica no aparelho e ainda substancialmente reduzir o consumo de energia do aparelho. A modalidade particular de um aparelho da presente invenção com protuberâncias é mostrada na figura 5A. O aparelho inclui uma primeira protuberância 33 da segunda fonte de calor 30 disposto essencialmente si- metricamente sobre o eixo de canal 80 e que se estende em direção da pri- meira fonte de calor 20. A primeira câmara 100 é disposta dentro da segun- da fonte de calor 30 e compreende uma parede de câmara 103 que é es- sencialmente paralela ao eixo de canal 80. Importante, há o espaço entre o fundo da segunda fonte de calor 32 e o topo da primeira fonte de calor 21. Na referida modalidade, a primeira fonte de calor 20 também inclui uma pri- meira protuberância 23 que é disposta simetricamente sobre o canal 70 e que se estende em direção da segunda fonte de calor 30. Também na refe- rida modalidade, a largura ou diâmetro da protuberância das primeiras fontes de calor 23, 24 ao longo do eixo de canal 80 é reduzida indo em afastamento a partir da primeira fonte de calor 20. . Como é também mostrado na figura 5A, o orifício receptor 73 é disposto simetricamente sobre o eixo de canal 80. Na referida modalidade, o orifício receptor 73 tem uma largura ou diâmetro perpendicular ao eixo de canal 80 que é cerca da mesma largura que a largura ou diâmetro do canal

70. Alternativamente, o orifício receptor 73 pode ser dotado de a largura ou diâmetro perpendicular ao eixo de canal 80 que é relativamente maior (por exemplo, cerca de 0,01 mm a cerca de 0,2 mm maior) do que a largura ou diâmetro do canal 70. Como discutido, é um objetivo da presente invenção proporcio- nar um aparelho para realizar PCR por convecção térmica que inclui pelo menos um elemento de formação de temperatura o qual em uma modalida- 5 de pode ser a assimetria de posição imposta no aparelho.

A figura 11A mos- tra um importante exemplo da presente modalidade.

Como mostrado, o apa- relho é inclinado em um ângulo θg (ângulo de inclinação) com relação à di- reção de gravidade.

O referido tipo de modalidades é particularmente útil em controlar (tipicamente aumentar) velocidade da PCR por convecção térmica.

Alternativamente, o aparelho pode ser produzido para incluir um ou mais de canal e câmaras que são inclinadas com relação à direção de gravidade.

A figura 11B mostra um exemplo das referidas modalidades nas quais ambos o canal e a primeira câmara são inclinados com relação à direção de gravi- dade.

Como será discutido abaixo, o aumento do ângulo de inclinação tipi- camente leva a uma PCR por convecção térmica mais rápida e mais robus- ta.

Outras modalidades que incluem uma ou mais assimetrias de posição serão descritas em mais detalhes abaixo.

As modalidades mostradas nas figuras 5A e 11A serão particu- larmente adequadas para muitas aplicações da presente invenção incluindo amplificação de amostras "difíceis" tal como sequências-alvo genômicas ou cromossômicas ou matrizes de sequência-alvo longa (por exemplo, mais longa do que cerca de 1,5 ou 2 kbp). Em particular, a figura 5A mostra fontes de calor com a câmara simétrica e configuração de canal.

A primeira câmara 100 e a primeira protuberância 33 da segunda fonte de calor 30 efetivamente bloqueiam a protuberância da alta temperatura da primeira fonte de calor 20 em direção de dentro de primeira câmara 100 pelo fato de que as mesmas são localizadas no fundo da segunda fonte de calor 32. Em uso, a tempera- tura cai rapidamente na primeira região de elemento isolante 50 a partir da alta temperatura de desnaturação (cerca de 92°C a c erca de 106°C) da pri- meira fonte de calor 20 a uma temperatura de polimerização (cerca de 80°C a cerca de 60°C) na parte de fundo da primeira câma ra 100. Assim, a tempe- ratura dentro de primeira câmara 100 se torna mais estreitamente distribuída em torno da temperatura de polimerização (em virtude do corte precoce da alta temperatura de desnaturação pelo primeiro freio térmico) de modo que um grande volume (e time) dentro da segunda fonte de calor 30 se torna disponível para a etapa de polimerização. 5 Uma grande diferença entre as modalidades mostradas nas figu- ras 5A e 11A é que o aparelho da figura 11A tem um ângulo de inclinação θg.

O aparelho sem o ângulo de inclinação (figura 5A) funciona bem e leva cerca de 15 a 25 minutos para amplificar a partir da amostra de plasmídeo de 1 ng de e cerca de 25 a 30 minutos para amplificar a partir da amostra de genoma humano de 10 ng (3,000 cópias) quando a estrutura do aparelho é otimiza- da.

A eficiência da amplificação de PCR do aparelho pode ser adicionalmen- te aumentada se um ângulo de inclinação de cerca de 2o a cerca de 60° (mais preferivelmente cerca de 5° a cerca de 30°) é introduzido como ilus- trado na figura 11A.

Com o ângulo de inclinação de gravidade introduzido com a referida estrutura (figura 11A), a amplificação de PCR a partir da amostra de genoma humano de 10 ng pode ser concluída em cerca de 20 a 25 minutos.

Vide exemplos 1 e 2 abaixo.

B.

Câmara Afunilada Com referência agora às figuras 12A-B, a modalidade do apare- lho caracteriza uma primeira câmara 100 que é concêntrica com o canal.

No referido exemplo da presente invenção, um eixo da câmara (isto é, um eixo formado pelos centros das extremidades de fundo e de topo da câmara) coincide com o eixo de canal 80. A parede de câmara 103 da primeira câma- ra 100 tem um ângulo com relação ao eixo de canal 80. Ou seja, a parede de câmara 103 é afunilada a partir da extremidade de topo 101 para a ex- tremidade de fundo 102 da primeira câmara 100 (Figura 12A). Na figura 12B, a parede de câmara 103 é afunilada a partir da extremidade de fundo 102 para a extremidade de topo 101 da primeira câmara 100. A referida estrutura proporciona um orifício estreito no fundo e um orifício amplo no topo, ou vice versa.

Por exemplo, se a parte de fundo é produzida mais estreita, como na figura 12A, a transferência de calor a partir da parte de fundo 32 da segunda fonte de calor 30 para o canal 70 se torna maior do que aquela a partir de a parte de topo 31 da segunda fonte de calor 30. Adicionalmente, a alta tem- peratura de desnaturação típica da primeira fonte de calor 20 é mais preferi- velmente bloqueada Na referida modalidade em comparação à modalidade com a parte de topo da segunda fonte de calor 31 que é produzida mais es- 5 treito, como na figura 12B.

Nos exemplos mostrados nas figuras 12A-B, uma distribuição de temperatura do canal 70 dentro da segunda fonte de calor 30 pode ser con- trolada com a estrutura de câmara afunilada.

Dependendo da propriedade de temperatura de polimerase de DNA usado, as condições de temperatura dentro da segunda fonte de calor 30 podem precisar ser ajustadas usando a referida estrutura pelo fato de que a eficiência da polimerização é sensível às condições de temperatura dentro da segunda fonte de calor 30. Para a mais amplamente usada Taq polimerase de DNA ou seus derivados, uma primeira parede de câmara 103 que é afunilada a partir do topo para o fundo é mais preferida uma vez que ótima temperatura de Taq polimerase de DNA (em torno de 70°C) é mais próxima da temperatura de recozimento compa- rada a uma temperatura de desnaturação em condições típicas de operação.

C.

Uma ou Duas câmaras, um Freio térmico Com referência agora à figura 4A, o aparelho 10 caracteriza a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 dispostas na segunda fonte de calor 30 essencialmente simetricamente sobre o eixo de canal 80. Na referida modalidade, a primeira câmara 100 é localizada na parte de fundo da segunda fonte de calor 30 e a segunda câmara 110 é localizada na parte superior da segunda fonte de calor 30. O aparelho 10 inclui o primeiro freio térmico 130 para ajudar a proporcionar o controle mais ativo da distribuição da temperatura.

Na referida modalidade, a largura da primeira câmara 100 e da segunda câmara 110 é aproximadamente a mesma.

Entretanto, as altu- ras da primeira câmara 100 e da segunda câmara 110 podem ser variadas entre cerca de 0,2 mm a cerca de 80% ou 90% do comprimento da segunda fonte de calor 30 ao longo do eixo de canal 80, dependendo da propriedade de temperatura de polimerase de DNA usado como discutido abaixo.

A figu- ra 4B proporciona uma vista expandida do primeiro freio térmico 130 definido pela extremidade de topo 131, extremidade de fundo 132, e parede 133 que entra em contato com o canal 70. Na referida modalidade, o local e espessu- ra do primeiro freio térmico 130 ao longo do eixo de canal 80 será definido pelas alturas das primeira 100 e segunda 110 câmaras ao longo do eixo de 5 canal 80. A espessura do freio térmico 130 ao longo do eixo de canal 80 é entre cerca de 0,1 mm a cerca de 60% da altura da segunda fonte de calor 30 ao longo do eixo de canal 80, preferivelmente entre cerca de 0,5 mm a cerca de 40% da altura da segunda fonte de calor 30. O primeiro freio térmi- co 130 pode ser localizado quase em qualquer lugar dentro da segunda fon- te de calor entre as primeira 100 e segunda 110 câmaras, dependendo de propriedade de temperatura de polimerase de DNA usado.

É preferido se localizar o primeiro freio térmico 130 mais próxima da superfície de fundo 32 da segunda fonte de calor 30 se ótima temperatura de polimerase de DNA usado é mais próxima da temperatura de recozimento da segunda fonte de calor 30 do que a temperatura de desnaturação da primeira fonte de calor 20, ou vice versa.

A figura 13A é um exemplo no qual a primeira câmara 100 tem menor largura do que a segunda câmara 110, por exemplo, cerca de 0,9 a cerca de 0,3 vezes menor, preferivelmente cerca de 0,8 a cerca de 0,4 vezes menor.

Um arranjo oposto com a primeira câmara 100 tendo a maior largura do que a segunda câmara 110 pode também ser usado dependendo da pro- priedade de temperatura de polimerase de DNA usado.

Uma vista expandida do primeiro freio térmico 130 é mostrada na figura 13B.

Nas modalidades mostradas nas figuras 4A-B e 13A-B, o apare- lho caracteriza a primeira câmara e a segunda câmara que não são afunila- das.

Nas referidas modalidades, a primeira câmara é espaçada a partir da segunda câmara por um comprimento (l) ao longo do eixo de canal 80. Em uma modalidade, a primeira câmara, a segunda câmara, e a segunda fonte de calor definem um primeiro freio térmico que entra em contato com o canal entre as primeira e segunda câmaras com uma área e uma espessura (ou um volume) suficiente para reduzir a transferência de calor a partir da primei- ra fonte de calor.

Com referência às figuras 14A-B, o aparelho caracteriza a pri- meira câmara 100 disposta simetricamente sobre o eixo de canal 80. O pri- meiro freio térmico 130 é posicionado no fundo da segunda fonte de calor 30 entre a primeira câmara 100 e o primeiro elemento isolante 50. 5 A espessura do primeiro freio térmico 130 ao longo do eixo de canal 80 mostrada nas figuras 14A-B é definida pela distância a partir da extremidade de topo 131 para a extremidade de fundo 132 do primeiro freio térmico 130. Preferivelmente a referida distância é entre a partir de cerca de 0,1 mm a cerca de 60% da altura da segunda fonte de calor 30 ao longo do eixo de canal 80, mais preferivelmente cerca de 0,5 mm a cerca de 40% da altura da segunda fonte de calor 30. Na referida modalidade, o aparelho caracteriza a primeira câma- ra posicionada na parte de fundo da segunda fonte de calor e a primeira câ- mara e o primeiro elemento isolante define o primeiro freio térmico.

O primei- ro freio térmico entra em contato com o canal entre a primeira câmara e o primeiro elemento isolante com uma área e uma espessura (ou um volume) suficiente para reduzir a transferência de calor a partir da primeira fonte de calor.

Na referida modalidade, o primeiro freio térmico compreende uma su- perfície de topo e uma superfície de fundo no qual a superfície de fundo do primeiro freio térmico é localizado em cerca da mesma altura que a superfí- cie de fundo da segunda fonte de calor.

A referida modalidade é particular- mente útil quando usando polimerase de DNA que tem ótima temperatura mais próxima da temperatura de recozimento da segunda fonte de calor do que a temperatura de desnaturação da primeira fonte de calor (por exemplo, Taq polimerase de DNA). A figura 14C é um exemplo no qual a parede de câmara 103 da primeira câmara 100 é afunilada a partir da extremidade de topo 101 para a extremidade de fundo 102 da primeira câmara 100. Um arranjo oposto com a parede de câmara afunilada a partir da extremidade de fundo 102 para a extremidade de topo 101 da primeira câmara 100 pode também ser usado dependendo da propriedade de temperatura de polimerase de DNA usada.

O primeiro freio térmico 130 é posicionado no fundo da segunda fonte de calor 30 entre a primeira câmara 100 e o primeiro elemento isolante 50. Uma vista expandida do primeiro freio térmico 130 é mostrado na figura 14D.

D.

Orifício Receptor Assimétrico Como mencionado, é um objetivo da presente invenção propor- 5 cionar um aparelho com pelo menos um elemento de formação de tempera- tura que tem assimetria horizontal.

Por "assimetria horizontal" se quer dizer assimetria ao longo da direção ou plano perpendicular ao canal e/ou eixo de canal.

Será aparente que muitos dos exemplos de aparelho proporcionados aqui podem ser adaptados para ter a assimetria horizontal.

Em uma modali- dade, o orifício receptor é disposto assimetricamente na primeira fonte de calor com relação ao eixo de canal suficiente para gerar uma distribuição de temperatura horizontalmente assimétrica adequada para induzir um fluxo de convecção direcionado e estável.

Sem intenção de se estar ligado à teoria, acredita-se que a região entre o orifício receptor e a extremidade de fundo da câmara é um local onde uma força de acionamento principal para fluxo de convecção térmica pode ser gerada.

Como será prontamente aparente, a referida região é onde o aquecimento inicial a uma temperatura mais alta (isto é, a temperatura de desnaturação) e transição em direção da tempera- tura mais baixa (isto é, a temperatura de polimerização) ocorre, e assim a força de direcionamento maior pode se originar a partir da referida região.

É assim um objetivo da presente invenção proporcionar um apa- relho com pelo menos uma assimetria horizontal no qual pelo menos um dos orifícios receptores (por exemplo, todos eles) na primeira fonte de calor tem uma largura ou diâmetro maior do que o canal na primeira fonte de calor.

Preferivelmente, a disparidade de largura permite que o orifício receptor para seja descentralizado a partir do eixo de canal.

No referido exemplo da pre- sente invenção, a assimetria do orifício receptor produz o espaço no qual um lado do orifício receptor é localizado mais próxima para o canal em compa- ração ao lado oposto.

Acredita-se que na referida modalidade, o aparelho irá exibir aquecimento horizontalmente assimétrico a partir da primeira fonte de calor para o canal.

Um exemplo do referido aparelho da presente invenção é mos-

trado na figura 15. Como mostrado, o orifício receptor 73 é disposto assime- tricamente com relação ao eixo de canal 80 para formar um espaço de orifí- cio receptor 74. Ou seja, o orifício receptor 73 é relativamente descentraliza- do com relação ao eixo de canal 80, por exemplo, por cerca de 0,02 mm a 5 cerca de 0,5 mm.

No referido exemplo, o orifício receptor 73 tem uma largura ou diâmetro perpendicular ao eixo de canal 80 que é maior do que a largura ou diâmetro do canal 70. Por exemplo, a largura ou diâmetro do orifício re- ceptor 73 pode ser cerca de 0,04 mm a cerca de 1 mm maior do que a largu- ra ou diâmetro do canal 70. Voltando mais uma vez à modalidade mostrada na figura 15, um lado (o lado esquerdo) do canal 70 está em contato com a primeira fonte de calor 20 e o lado oposto (o lado direito) não está em contato com a primeira fonte de calor 20 para formar um espaço de orifício receptor 74. Embora a presente invenção seja compatível com diversos tamanhos de espaço, um típico espaço de orifício receptor pode ser tão pequeno quanto cerca de 0,04 mm, particularmente se o outro lado está em contato com o canal . Em ou- tras palavras, um lado é formado como um canal e o lado oposto como um pequeno espaço.

Na referida modalidade, acredita-se que um lado (o lado esquerdo) seja aquecido preferivelmente sobre o lado oposto (o lado direito), proporcionando um aquecimento horizontalmente assimétrico direcionando o fluxo ascendente para o lado preferivelmente aquecido (o lado esquerdo). Um efeito similar pode ser obtido com um orifício receptor tendo o espaço a partir da parede do orifício receptor que é menor em um lado do que o lado oposto.

Para aumentar assimetria, é possível se fazer um lado do orifício receptor mais profundo do que o outro com relação à primeira fonte de calor (e também mais próxima da câmara e da segunda fonte de calor). Com refe- rência agora ao aparelho mostrado nas figuras 16A-B, o orifício receptor 73 tem uma maior profundidade em um lado do orifício (lado esquerdo) em comparação ao lado oposto ao canal 70 (lado direito). Na referida modalida- de, ambos os lados do orifício receptor 73 permanecem em contato com o canal 70. Como mostrado na figura 16A, a porção de topo da parede lateral do orifício receptor 73 é removida para formar um espaço de orifício receptor 74 definido basicamente pelo canal 70 e pela primeira fonte de calor 20. O fundo do espaço de orifício receptor 74 pode ser perpendicular ao eixo de canal 80 (Figura 16A) ou pode ser disposto em um ângulo com relação ao 5 mesmo (Figura 16B). A parede lateral do espaço de orifício receptor 74 pode ser paralela ao eixo de canal 80 (Figura 16A) ou pode estar em um ângulo com relação ao mesmo (Figura 16B). Em ambas as modalidades mostradas nas figuras 16A-B, um lado do canal 70 tem uma maior profundidade com relação à primeira fonte de calor 20 do que o outro lado com o espaço de orifício receptor 74. Sem intenção de se estar ligado à teoria, acredita-se que o lado do canal com a maior profundidade nas modalidades mostradas nas figuras 16A-B seja aquecido preferivelmente em virtude de mais transferên- cia de calor a partir da primeira fonte de calor, gerando uma maior força de flutuação naquele lado.

Acredita-se adicionalmente que por adicionar o refe- rido orifício receptor assimétrico 73 e espaço de orifício receptor 74 ao apa- relho, há um aumento do gradiente de temperatura em um lado do canal 70 em comparação ao lado oposto (um gradiente de temperatura é tipicamente inversamente proporcional à distância). Acredita-se também que as referidas características criam a maior força de direcionamento em um lado (por exemplo, o lado esquerdo nas figuras 16A e B) e suporte fluxo de convecção térmica ascendente ao longo daquele lado.

Será observado que uma ou uma combinação de diferentes adaptações do orifício receptor 73 e do espaço de orifício receptor 74 são possíveis para alcançar este objetivo.

Entretanto, para muitas modalidades da presente invenção, será em geral útil se fazer diferença na profundidade do orifício receptor nos dois lados opostos na fai- xa de entre a partir de cerca de 0,1 mm até cerca de 40 a 50% da profundi- dade do orifício receptor.

As figuras 17A-B mostram adicionalmente exemplos de modali- dades adequadas do aparelho no qual o orifício receptor 73 é disposto sobre o canal assimetricamente.

Porções do orifício receptor são mais profundas na primeira fonte de calor e mais próximas da câmara ou da segunda fonte de calor do que outras porções, deste modo proporcionando fluxo térmico não uniforme em direção da segunda fonte de calor.

No aparelho mostrado na figura 17A, o orifício receptor 73 tem duas superfícies coincidentes com o topo 21 da primeira fonte de calor 20. Cada superfície está voltada para a segunda fonte de calor 30 e uma das 5 superfícies (aquela no lado direito na figura 17A) tem um maior espaço em um lado do canal 70 em comparação à superfície oposta o canal 70 (aquela no lado esquerdo) com relação à superfície de fundo 32 da segunda fonte de calor 30. Ou seja, uma das superfícies é mais próxima para o fundo 102 da primeira câmara 100 ou a superfície de fundo 32 da segunda fonte de calor 30 do que a outra.

Na referida modalidade, ambos os lados do orifício recep- tor 73 permanecem em contato com o canal 70. A diferença da profundidade do orifício receptor entre as duas superfícies é preferivelmente na faixa de entre a partir de cerca de 0,1 mm até cerca de 40 a 50% da profundidade do orifício receptor.

A segunda fonte de calor 30 caracteriza a primeira protube- rância 33 que é disposto simetricamente sobre o eixo de canal 80. Também na referida modalidade, a primeira fonte de calor 20 inclui a primeira protube- rância 23 disposta assimetricamente sobre o eixo de canal 80. Voltando à figura 17B, o orifício receptor 73 tem uma única su- perfície inclinada coincidente com o topo 21 da primeira fonte de calor 20. O ângulo de inclinação é entre cerca de 2o a cerca de 45° com relação a um eixo perpendicular ao eixo de canal 80. Na referida modalidade, o ápice da superfície inclinada é relativamente próximo ao fundo 102 da primeira câma- ra 100. A segunda fonte de calor 30 caracteriza a primeira protuberância 33 que é disposto simetricamente sobre o eixo de canal 80. Também na referi- da modalidade, a primeira fonte de calor 20 inclui a primeira protuberância 23 disposta assimetricamente sobre o eixo de canal 80. E.

Uma Câmara assimétrica, Orifício Receptor Assimétrico ou Simétrico Na modalidade mostrada na figura 18A-B, a primeira câmara 100 é disposta assimetricamente sobre o eixo de canal 80 o suficiente para ocasionar a transferência de calor horizontalmente não uniforme a partir da segunda fonte de calor 20 para o canal 70. O orifício receptor 73 pode tam- bém ser disposto assimetricamente sobre o canal 70 como nas figuras 18A-

B.

Na modalidade mostrada na figura 18A, a primeira câmara 100 é posicio- nada dentro da segunda fonte de calor 30 e tem maior altura em um lado da câmara do que o outro lado oposto ao eixo de canal 80. Ou seja, o compri- mento entre uma superfície da extremidade de topo da primeira câmara 101 5 e uma superfície da extremidade de fundo da primeira câmara 102 é maior (lado esquerdo da figura 18A) ao longo do eixo de canal 80 do que o com- primento entre a outra superfície da extremidade de topo da primeira câmara 101 e outra superfície da extremidade de fundo da primeira câmara 102 (la- do direito da figura 18A). A diferença da altura da câmara entre os dois lados opostos é preferivelmente na faixa de entre a partir de cerca de 0,1 mm até cerca de 5 mm.

Há espaço entre o fundo 101 da primeira câmara 100 (ou a superfície de fundo da segunda fonte de calor) e a extremidade de topo do orifício receptor 73 que é menor no lado esquerdo do canal 70 do que no outro lado.

Voltando à figura 18B, a extremidade de fundo 102 da primeira câmara 100 é inclinada com relação a um eixo perpendicular ao eixo de ca- nal 80 por a partir de cerca de 2o a cerca de 45°. No exemplo, o ápice da inclinação é adicionalmente mais próximo do orifício receptor 73. O topo do orifício receptor 73 coincidente com a superfície de topo 21 da primeira fonte de calor 20 é inclinada com relação ao eixo de canal 80. Na referida modali- dade, o ápice da inclinação do orifício receptor é mais próxima para a extre- midade de fundo da primeira câmara 102. Ou seja, há espaço entre o fundo da primeira câmara 100 (ou a superfície de fundo da segunda fonte de calor) e a extremidade de topo do orifício receptor 73 que é menor no lado esquer- do do canal 70 do que no outro lado.

As configurações mostradas nas figuras 18A-B proporcionam aquecimento preferencial em um lado do canal 70 (isto é, o lado esquerdo) no orifício receptor 73, e assim o fluxo de convecção ascendente inicial pode iniciar preferivelmente naquele lado.

Entretanto, a segunda fonte de calor 30 proporciona resfriamento preferencial no mesmo lado em virtude do compri- mento mais longo da câmara naquele lado.

Portanto, o fluxo ascendente po- de mudar o seu trajeto para o outro lado dependendo da extensão da assi-

metria da primeira câmara.

Voltando às figuras 18C-D, o comprimento entre a extremidade de topo 101 e a extremidade de fundo 102 é maior em um lado da primeira câmara 100 (o lado direito) do que o outro lado com relação ao eixo de canal 5 80. Aqui, resfriamento preferencial a partir da segunda fonte de calor será no lado direito da câmara mostrada nas figuras 18C-D.

Adicionalmente, a assi- metria é proporcionada pela maior a profundidade do orifício receptor 73 em um lado do canal 70 (isto é, o lado esquerdo das figuras 18C-D) do que o outro lado.

No orifício receptor 73, o aquecimento preferencial será no lado esquerdo do canal 70. Na referida modalidade, o espaço entre o fundo 102 da câmara 100 e o topo do orifício receptor 73 é essencialmente constante em torno do canal 70. As configurações mostradas nas figuras 18C-D suportam o aquecimento preferencial em um lado do canal 70 (isto é, o lado esquerdo) no orifício receptor 73 e o resfriamento preferencial no lado oposto na primei- ra câmara 100, e assim fluxo de convecção ascendente permanecerá prefe- rivelmente no lado esquerdo.

Nas modalidades mostradas nas figuras 18A-D, a assimetria in- troduzida pelas configurações da câmara é o suficiente para ocasionar a transferência de calor horizontalmente não uniforme a partir da segunda fon- te de calor para o canal.

Também nas referidas modalidades, as protuberân- cias 23, 33 são dispostas assimetricamente sobre o eixo de canal 80. Outras modalidades do aparelho com pelo menos uma assime- tria estrutural estão dentro do âmbito da presente invenção.

Por exemplo, e como mostrado nas figuras 19A-B, a extremida- de de fundo da primeira câmara 102, é assimetricamente disposta com rela- ção ao eixo de canal 80. O comprimento entre a extremidade de topo 101 e a extremidade de fundo 102 é maior em um lado da primeira câmara 100 (o lado esquerdo das figuras 19A-B) do que o outro lado com relação ao eixo de canal 80. o espaço entre o fundo da primeira câmara 102 e o topo do ori- fício receptor 73 é menor em um lado do canal 70 (o lado esquerdo das figu- ras 19A-B) do que o outro lado.

Nas referidas modalidades, a primeira protu-

berância 23 da primeira fonte de calor 20 é disposto simetricamente sobre o eixo de canal 80. Também nas referidas modalidades, há aquecimento pre- ferencial no lado direito do orifício receptor 73 (com relação ao eixo de canal 80) em virtude do maior espaço naquele lado (uma vez que o resfriamento 5 pela segunda fonte de calor é menos significativa naquele lado em virtude do maior espaço) e assim a maior força de direcionamento é gerada no lado direito do canal 70 e um fluxo ascendente mais pronunciado naquele lado.

Em adição, a segunda fonte de calor 30 caracteriza uma primeira protube- rância 33 disposta assimetricamente sobre o eixo de canal 80. F.

Uma Câmara assimétrica com ou sem Freio térmico Com referência à figura 20A, a primeira câmara 100 é descentra- lizada com relação ao eixo de canal 80. Na referida modalidade, o orifício receptor 73 é disposto simetricamente sobre o eixo de canal 80 e é de pro- fundidade constante.

A primeira câmara 100 é descentralizada a partir do canal 70 de modo que o espaço de câmara 105 é menor em um lado em comparação ao lado oposto.

Como mostrado na figura 20B, a câmara 100 pode ser adicionalmente descentralizada a partir do canal 70 de modo que um lado ou parede do canal 70 torna entrar em contato com a parede de câmara.

Na referida modalidade, o lado de formação de canal (por exemplo, o lado esquerdo na figura 29B) funciona como um primeiro freio térmico 130 tendo suas extremidades de topo 131 e de fundo 132 coincidindo com as extremidades de topo 101 e de fundo 102 da primeira câmara 100. Na refe- rida modalidade, a transferência de calor entre a segunda fonte de calor 30 e o canal 70 é maior no lado onde o espaço de câmara 105 é menor ou não existe (isto é, o lado esquerdo nas figuras 20A e B), assim produzindo a dis- tribuição de temperatura horizontalmente assimétrica.

A figura 20C proporci- ona uma vista expandida do primeiro freio térmico 130. Uma diferença acei- tável entre o espaços de câmara nos dois lados opostos é preferivelmente na faixa entre a partir de cerca de 0,2 mm a cerca de 4 a 6 mm, e assim um eixo da câmara é descentralizado a partir do eixo de canal por pelo menos de cerca de 0,1 mm até cerca de 2 a 3 mm.

Será observado que toda ou parte de uma câmara pode ser pro-

duzida assimétrica com relação ao eixo de canal 80, por exemplo, toda ou parte da câmara pode ser descentralizada.

Para a maior parte das aplica- ções da presente invenção, será útil se descentralizar toda a câmara.

G.

Câmaras assimétricas 5 Como discutido, é um objetivo da presente invenção proporcio- nar um aparelho dentro de uma, duas ou três câmaras na segunda fonte de calor, por exemplo.

Em uma modalidade, pelo menos uma das câmaras tem assimetria horizontal.

A assimetria ajuda a criar a força de direcionamento horizontalmente assimétrica dentro do aparelho.

Por exemplo, e na modali- dade mostrada na figura 21, a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 são cada uma das quais descentralizadas a partir do eixo de canal 80 ao longo de direções opostas.

Em particular, a extremidade de topo da primeira câmara 101 é posicionada essencialmente na mesma altura que a extremi- dade de fundo da segunda câmara 112. As primeira e segunda câmaras po- dem ser dotadas de diferente largura ou diâmetro.

Diferença do espaço de câmara 105, 115 nos dois lados opostos pode ser pelo menos de cerca de 0,2 mm até cerca de 4 a 6 mm.

Além das estruturas descentralizadas de câmara exemplificadas na figura 21, uma ou mais das câmaras pode ser produzida horizontalmente assimétrica ao incluir estruturas que são inclinadas (enviesadas) com rela- ção ao eixo de canal 80. Por exemplo, e como mostrado na figura 22, a pri- meira câmara 100 pode ser inclinada com relação ao eixo de canal 80. Na referida modalidade, a primeira parede da primeira câmara 103 é inclinada com relação ao eixo de canal 80 (por exemplo, em um ângulo menor do que cerca de 30° com relação ao eixo de canal 80). O ân gulo de inclinação como definido por um ângulo entre o eixo central da câmara (ou a parede de câ- mara 103) e o eixo de canal pode ser entre a partir de cerca de 2o a cerca de 30°, mais preferivelmente entre a partir de cerc a de 5° a cerca de 20°. Nas modalidades do aparelho mostrado nas figuras 21 e 22, o fluxo de convecção ascendente a partir do fundo do canal 70 é favorecido ao longo do lado direito do canal 70 como um resultado do aquecimento prefe- rencial a partir do orifício receptor 73 naquele lado (em virtude de resfria-

mento menos significativo pela segunda fonte de calor como um resultado do maior espaço de câmara naquele lado). H.

Uma câmara na segunda fonte de calor, Inclinada Como mencionado, é um objetivo da presente invenção propor- 5 cionar um aparelho no qual vários elementos de formação de temperatura tal como um ou mais do canal, orifício receptor, protuberância (se presente), espaço tal como a câmara, elementos isolantes ou espaços isolantes, e freio térmico são cada um dos quais dispostos simetricamente sobre o eixo de canal.

Em uso, o aparelho será com frequência dispostos em uma superfície horizontal plana de modo que o eixo de canal será substancialmente alinha- do com a direção de gravidade.

Na referida orientação, acredita-se que a força de flutuação é gerada por um gradiente de temperatura dentro do canal e que a força de flutuação também se torna alinhada paralela ao eixo de ca- nal.

Acredita-se também que a força de flutuação terá sua direção oposta à direção de gravidade com uma magnitude proporcional a um gradiente de temperatura (ao longo de a direção vertical). Uma vez que o canal e as uma ou mais câmaras são simetricamente dispostas cerca do eixo de canal Na referida modalidade, acredita-se que uma distribuição de temperatura (isto é, distribuição do gradiente de temperatura) gerada dentro do canal deve tam- bém ser simétrico com relação ao eixo de canal.

Portanto, distribuição da força de flutuação deve também ser simétrica com relação ao eixo de canal com sua direção paralela ao eixo de canal.

É possível se introduzir a assimetria horizontal no aparelho ao mover o eixo de canal em afastamento a partir de a direção de gravidade.

Nas referidas modalidades, é possível se adicionalmente aumentar a efici- ência e velocidade de PCR com base em convecção dentro do aparelho.

Assim é um objetivo da presente invenção proporcionar um aparelho carac- terizando uma ou mais assimetrias horizontais.

Exemplos de um aparelho da presente invenção com assimetria horizontal de posição são proporcionados pelas figuras 11A-B.

Na figura 11A, o eixo de canal 80 é deslocado com relação à di- reção de gravidade para proporcionar a assimetria horizontal de posição do aparelho.

Em particular, o canal e câmara são formados simetricamente com relação ao eixo de canal.

Entretanto o aparelho como um todo é girado (ou inclinado) por um ângulo θg com relação à direção de gravidade.

Na referida estrutura inclinada, o eixo de canal 80 é não está mais paralelo à direção de 5 gravidade, e assim a força de flutuação gerada por um gradiente de tempe- ratura no fundo do canal se torna inclinado com relação ao eixo de canal 80 uma vez que se supõe ter a direção oposta à direção de gravidade.

Sem intenção de se estar ligado à teoria, a direção da força de flutuação torna um ângulo θg com o eixo de canal 80 mesmo se o canal/estrutura de câmara é simétrico com relação ao eixo de canal 80. No referido arranjo estrutural, o fluxo de convecção ascendente se encaminhará em um lado do canal ou o recipiente de reação (o lado esquerdo no caso da figura 11A) e o fluxo des- cendente se encaminhará no lado oposto (isto é, o lado direito no caso da figura 11A). Assim, acredita-se que a via ou padrão do fluxo de convecção se torne substancialmente travada em um dos referidos arranjos estruturais determinados, portanto o fluxo de convecção se torna mais estável e não sensível a pequena perturbações a partir do ambiente ou pequena defeitos estruturais, conduzindo a um fluxo de convecção mais estável e aumentada amplificação de PCR.

Foi também observado que introdução do ângulo de inclinação de gravidade ajuda aumentar a velocidade da convecção térmica, deste modo suportar mais rápida e mais robusta amplificação de PCR por convecção.

Um ângulo de inclinação θg pode ser variado entre a partir de cerca de 2o a cerca de 60°, preferivelmente entre c erca de 5° a cerca de 30°. A referida estrutura inclinada pode ser usada em combinação com todo o canal/estruturas de câmara simétricas ou assimétricas proporcionados na presente invenção.

O ângulo de inclinação θg mostrado na figura 11A pode ser in- troduzido por um ou uma combinação de diferentes elementos.

Em uma mo- dalidade, a inclinação é introduzida manualmente.

Entretanto será com fre- quência mais conveniente se introduzir um ângulo de inclinação θg ao dispor o aparelho 10 em uma inclinação, por exemplo, ao dispor aparelho 10 em uma cunha ou base formada similar.

Entretanto para algumas modalidades da presente invenção, não será útil se inclinar o aparelho 10. A figura 11B mostra outra abordagem para introduzir a assimetria horizontal.

Como mostrado, um ou mais de canal e câmaras é inclinado com relação à direção de gravidade.

Ou seja, o eixo 5 de canal 80 (e um eixo da câmara) são deslocados (em θg) com relação a um eixo perpendicular à superfície horizontal das fontes de calor.

Em uma modalidade da presente invenção, o eixo de canal 80 faz um ângulo θg com relação à direção de gravidade quando o aparelho é disposto em uma super- fície horizontal plana para ter o seu fundo oposto a partir de e paralelo àque- la superfície (como seria típico). De acordo com a referida modalidade, e sem intenção de se estar ligado à teoria, a força de flutuação gerada por um gradiente de temperatura no fundo do canal (que é suposto ter a direção oposta à direção de gravidade) fará um ângulo θg com relação ao eixo de canal como no caso das modalidades descritas acima.

O referido arranjo estrutural fará o fluxo de convecção com sentido ascendente em um lado (isto é, o lado esquerdo no caso da figura 11B) e com sentido descendente no lado oposto (isto é, o lado direito no caso da figura 11B). Um ângulo de inclinação θg pode ser variado preferivelmente entre a partir de cerca de 2o a cerca de 60°, mais preferivelmente entre cerca de 5° a cerca de 30°. A re- ferida estrutura inclinada pode também ser usada em combinação com todas as características estruturais do canal e a da câmara proporcionadas na pre- sente invenção.

Quase qualquer uma das modalidades do aparelho descrito aqui pode ser inclinada por dispor a mesma em uma estrutura capaz de deslocar o eixo de canal 80 entre a partir de cerca de 2° a cerca de 60° com relação à direção de gravidade.

Como mencionado, um exemplo de uma estrutura aceitável é a superfície capaz de produzir uma inclinação tal como uma cu- nha ou formato relacionado.

L.

Duas câmaras e Freio térmico(s) com Assimetria estrutural É um objetivo da presente invenção proporcionar um aparelho com um ou mais freio térmico, por exemplo, um, dois ou três freios térmicos no qual um ou mais dos mesmos têm assimetria horizontal.

Com referência ao aparelho mostrado nas figuras 23A-B, o primeiro freio térmico 130 tem assimetria horizontal.

Na referida modalidade, o orifício perfurado formado no primeiro freio térmico 130 (que tipicamente é produzido para se encaixar com o canal) é maior do que o canal 70 e descentralizado a partir do eixo de 5 canal 80 proporcionando um menor (ou nenhum) espaço em um lado e um maior espaço no lado oposto.

A distribuição de temperatura é observada ser mais sensível à assimetria no freio térmico em comparação à assimetria na câmara (isto é, assimetria na primeira parede de câmara 103). Preferivel- mente, o orifício perfurado no freio térmico pode ser produzido pelo menos de cerca de 0,1 mm até cerca de 2 mm maior, e descentralizado a partir do eixo de canal por pelo menos de cerca de 0,05 mm até cerca de 1 mm.

Em modalidades nas quais a assimetria estrutural reside no pri- meiro freio térmico 130 ou no segundo freio térmico 140 (ou ambos o primei- ro 130 e segundo 140 freios térmicos), o aparelho pode incluir pelo menos uma câmara que é disposta simetricamente ou assimetricamente sobre o eixo de canal 80. Na modalidade mostrada na figura 23A, a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 são posicionadas dentro da segunda fonte de calor 30 e dispostas simetricamente sobre o eixo de canal 80. Na referida modalidade, a primeira câmara 100 é espaçada a partir da segunda câmara 110 por um comprimento l ao longo do eixo de canal 80. Uma porção da se- gunda fonte de calor 30 entra em contato com o canal 70 para formar o pri- meiro freio térmico 130 o suficiente para reduzir a transferência de calor a partir da primeira fonte de calor 20. O primeiro freio térmico 130 é disposto assimetricamente sobre o canal 70. O primeiro freio térmico 130 entra em contato com um lado do canal 70 entre as primeira 100 e segunda 110 câ- maras, o outro lado do canal 70 sendo espaçado a partir da segunda fonte de calor 30. A figura 23B mostra uma vista expandida do primeiro freio tér- mico 130 mostrando a parede 133 que entra em contato com o canal 70 no lado esquerdo.

Quando a assimetria estrutural está associada com um ou mais dos freios térmicos, o fluxo de convecção ascendente e descendente pode ser favorecido em um lado do canal ou o lado oposto com relação ao eixo de canal dependendo da posição e da espessura dos freios térmicos ao longo do eixo de canal. Será algumas vezes útil se ter um aparelho da presente inven- ção com uma, duas ou três câmaras dispostas na segunda fonte de calor seja simetricamente ou assimetricamente sobre o eixo de canal 80. Em uma 5 modalidade, o aparelho tem uma primeira, segunda, e terceira câmara na qual uma ou duas das câmaras é disposta assimetricamente sobre o eixo de canal 80 e o outra câmara é disposta simetricamente sobre o mesmo eixo. Em uma modalidade na qual o aparelho inclui uma primeira câmara e se- gunda câmara que são cada uma das quais dispostas assimetricamente so- bre o eixo de canal 80, as referidas câmaras podem residir completamente ou parcialmente dentro da segunda fonte de calor. Exemplos particulares desta modalidade da presente invenção são mostrados nas figuras 24A-D. Na figura 24A, o primeiro freio térmico 130 entra em contato com parte da altura do canal 70 dentro da segunda fonte de calor 30. A primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 são cada uma das quais posicionadas na segunda fonte de calor 30 e a primeira câmara 100 é espaçada a partir da segunda câmara 110 por um comprimento (l) ao longo do eixo de canal

80. Na referida modalidade, o freio térmico 130 entra em contato com toda a circunferência do canal 70 no comprimento (l) entre as primeira 100 e se- gunda 110 câmaras. A primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 são cada uma das quais descentralizadas a partir do eixo de canal 80 na mesma direção horizontal. A figura 24B proporciona uma vista expandida do primeiro freio térmico 130 na qual parede 133 entra em contato com o canal 70. Voltando à figura 24C, a primeira câmara 100 e a segunda câ- mara 110 são cada uma das quais descentralizadas a partir do eixo de canal na mesma direção horizontal. As primeira 100 e segunda 110 câmaras po- dem ser dotadas dos mesmos ou diferentes largura ou diâmetro. Na referida modalidade, o primeiro freio térmico 130 entra em contato com um lado do canal 70 (isto é, o lado esquerdo) dentro da primeira câmara 100 em um comprimento a partir da extremidade de fundo 132 para a extremidade de topo 131 do primeiro freio térmico 130 que é a mesma que o comprimento da primeira câmara 100 ao longo do eixo de canal 80 na modalidade mos- trada na figura 24C. A figura 24D proporciona uma vista expandida do pri- meiro freio térmico 130 mostrando a parede 133 que entra em contato com o canal 70. 5 Em cada uma das modalidades mostradas nas figuras 24A-D, o orifício receptor 73 é disposto simetricamente sobre o canal 70. A figura 25A mostra uma modalidade da invenção na qual a pri- meira câmara 100 e a segunda câmara 110 são cada uma das quais des- centralizadas em direções opostas com relação ao eixo de canal 80 por cer- ca de 0,1 mm até cerca de 2 a 3 mm. O primeiro freio térmico 130 é simetri- camente disposto com relação ao eixo de canal 80. Na referida modalidade, uma porção da segunda fonte de calor 30 entra em contato com o canal 70 para formar um primeiro freio térmico 130 o suficiente para reduzir a transfe- rência de calor a partir da primeira fonte de calor 20. No referido exemplo da presente invenção, o primeiro freio térmico 130 entra em contato com toda a circunferência do canal 70 em um comprimento (l) entre as primeira 100 e segunda 110 câmaras. Em outras modalidades, o primeiro freio térmico 130 pode entrar em contato com o canal 70 em um lado, o outro lado sendo es- paçado a partir da segunda fonte de calor 30. A figura 25B proporciona uma vista expandida do primeiro freio térmico 130 mostrando a parede 133 que entra em contato com o canal 70. Com referência à modalidade mostrada nas figuras 26A, a pri- meira câmara 100 e a segunda câmara 110 são cada uma das quais des- centralizadas com relação ao eixo de canal 80 na mesma direção horizontal (por exemplo, por cerca de 0,1 mm até cerca de 2 a 3 mm). Na referida mo- dalidade, o primeiro freio térmico 130 é assimetricamente disposto com rela- ção ao eixo de canal 80. O primeiro freio térmico 130 e a parede de câmara 103 são descentralizados na mesma direção. Na referida modalidade, o pri- meiro freio térmico 130 entra em contato com o canal 70 em um lado (isto é, o lado esquerdo), o outro lado sendo espaçado a partir da segunda fonte de calor 30. A figura 26B mostra uma vista expandida do primeiro freio térmico

130.

Na figura 26C, a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 são cada uma das quais descentralizadas com relação ao eixo de canal 80 na mesma direção horizontal e o primeiro freio térmico 130 é descentralizado para a direção oposta.

Na referida modalidade, o primeiro freio térmico 130 5 entra em contato com o canal 70 em um lado (isto é, o lado direito), o outro lado sendo espaçado a partir da segunda fonte de calor 30. A figura 26D mostra uma vista expandida do primeiro freio térmico 130. Em outra modalidade da invenção, o aparelho tem duas câma- ras na segunda fonte de calor 30 no qual cada câmara é deslocada uma a partir da outra em diferentes direções horizontais.

A figura 27A mostra um exemplo.

Aqui, a primeira câmara 100 e segunda câmara 110 dentro da se- gunda fonte de calor 30 são cada uma das quais deslocadas com relação ao eixo de canal 80 em direções horizontais opostas (por exemplo, por cerca de 0,5 mm a cerca de 2 a 2,5 mm). A parede da primeira câmara 103 é disposta mais baixa ao longo do eixo de canal 80 do que a parede da segunda câma- ra 113. A parede do primeiro freio térmico 133 entra em contato com um lado do canal 70 (isto é, o lado esquerdo) na parte mais baixa do canal 70 dentro da primeira câmara 100, e a parede do segundo freio térmico 143 entra em contato com o outro lado do canal (isto é, o lado direito) na parte superior do canal 70 dentro da segunda câmara 110. A extremidade de topo do primeiro freio térmico 131 é posicionada essencialmente na mesma altura que a ex- tremidade de fundo do segundo freio térmico 142. O referido arranjo é em geral o suficiente para ocasionar a transferência de calor horizontalmente não uniforme entre a segunda fonte de calor 30 e o canal 70. A figura 27B mostra uma vista expandida do primeiro freio térmico 130 e um segundo freio térmico 140. A figura 27C mostra uma modalidade da invenção na qual a ex- tremidade de topo do primeiro freio térmico 131 é posicionada mais alta do que a extremidade de fundo do segundo freio térmico 142. A parede do pri- meiro freio térmico 133 e a parede do segundo freio térmico 143 cada uma entrando em contato com o canal 70 em um lado.

A figura 27D mostra uma vista expandida do primeiro freio térmico 130 e um segundo freio térmico

140. A figura 27E mostra uma modalidade na qual a extremidade de topo do primeiro freio térmico 131 é posicionada mais baixa do que a extre- midade de fundo do segundo freio térmico 142. A parede do primeiro freio 5 térmico 133 e a parede do segundo freio térmico 143 cada uma entrando em contato com o canal 70 em um lado.

A figura 27F mostra uma vista expandi- da do primeiro freio térmico 130 e um segundo freio térmico 140. A presente invenção proporciona outras modalidades nas quais uma assimetria é introduzida no aparelho por inclinação (enviesado) um ou mais dos freios térmicos ou a câmara com relação ao eixo de canal.

Com referência agora à figura 28A, a extremidade de topo da primeira câmara 101 e a extremidade de fundo da segunda câmara 112 são cada uma das quais inclinadas entre cerca de 2o a cerca de 45° c om relação a um eixo perpendicular ao eixo de canal 80. Na referida modalidade, a distância entre a extremidade de topo da primeira fonte de calor 21 e a extremidade de fun- do do primeiro freio térmico 132 é menor em um lado (isto é, o lado esquer- do) com relação ao eixo de canal 80, resultando na gradiente de temperatura que é orientado para ser maior naquele lado da primeira câmara 100. O freio térmico 130 entra em contato com toda a circunferência do canal 70 entre a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 e em um local mais elevado em um lado do que no outro lado.

A figura 28B mostra uma vista expandida da primeira câmara 100, do primeiro freio térmico 130 e da segunda câmara 110 na qual a parede 133 entra em contato com o canal 70. Em algumas modalidades da presente invenção, será útil se in- clinar pelo menos uma das câmaras com relação ao eixo de canal (por exemplo, uma, duas, ou três das câmaras). De fato, diferentes combinações de estruturas inclinadas ou enviesadas podem ser adaptadas para alcançar a pretendida distribuição de temperatura horizontalmente assimétrica.

Al- guns exemplos são mostrados nas figuras 29A-D.

Em particular, a figura 29A mostra um caso no qual a primeira câmara 100 e a segunda câmara 110 são cada uma das quais inclinadas ou enviesadas com relação ao eixo de canal 80 entre cerca de 2o a cerca de

30°. Na referida modalidade, o primeiro freio térmi co 130 não é inclinado.

A figura 29B mostra uma vista expandida da primeira câmara 100, o primeiro freio térmico 130 e a segunda câmara 110 na qual a parede 133 entra em contato com o canal 70. 5 A figura 29C mostra um exemplo no qual ambas a primeira câ- mara 100, a segunda câmara 110, e o primeiro freio térmico 130 são cada um dos quais inclinados com relação ao eixo de canal 80. Cada uma da pri- meira câmara 100 e da segunda câmara 110 pode ser inclinada ou enviesa- da com relação ao eixo de canal 80 por entre cerca de 2o a cerca de 30°. A extremidade de topo 131 e extremidade de fundo 132 do primeiro freio tér- mico 130 pode ser cada uma das quais inclinadas ou enviesadas por entre cerca de 2o a cerca de 45° com relação a um eixo pe rpendicular ao eixo de canal 80. Na referida modalidade, o primeiro freio térmico 130 entra em con- tato com toda a circunferência do canal entre a primeira câmara e a segunda câmara e em um local mais elevado em um lado do que no outro lado.

Nas modalidades mostradas nas figuras 25A-B, 26A-D, 27A-F, 28A-B, e 29A-D, o orifício receptor 73 é disposto simetricamente sobre o ei- xo de canal 80. Fabricação, Uso e Seleção de Elemento de formação de temperatura A. fontes de calor Para a maior parte das modalidades da presente invenção, uma ou mais das fontes de calor podem ser produzidas com materiais tendo uma condutividade térmica relativamente baixa em comparação aos materiais usados para outros aparelhos do tipo de ciclagem térmica.

Processos de rápida mudança de temperatura podem ser em geral evitados na presente invenção.

Portanto, uma alta uniformidade de temperatura através de cada uma das fontes de calor (por exemplo, com uma variação de temperatura menor do que cerca de 0,1°C) pode ser prontamente a lcançada usando um material tendo uma condutividade térmica relativamente baixa.

As fontes de calor podem ser produzidas de qualquer material sólido que tem uma condu- tividade térmica suficientemente maior do que aquela da amostra ou o reci- piente de reação, por exemplo, preferivelmente pelo menos de cerca de 10 vezes maior, mais preferivelmente pelo menos de cerca de 100 vezes maior.

A amostra para ser aquecida é em sua maioria água que tem uma condutivi- dade térmica de 0,58 W·m-1·K-1 a temperatura ambiente, e o recipiente de reação é tipicamente produzido de um plástico que tem uma condutividade 5 térmica tipicamente cerca da poucos décimos de W·m-1·K-1. Portanto, a condutividade térmica do material adequado é pelo menos de cerca de 5 W·m-1·K-1 ou maior, mais preferivelmente pelo menos de cerca de 50 W·m- 1·K-1 ou maior.

Se o recipiente de reação é produzido da vidro ou cerâmica que tem uma condutividade térmica maior do que aquela do plástico, é pre- ferido se usar um material tendo relativamente maior condutividade térmica, por exemplo, um tendo uma condutividade térmica maior do que cerca de 80 ou cerca de 100 W·m-1·K-1. A maioria dos metais e ligais de metal assim como algumas cerâmicas térmicas de alta condutividade preenchem a refe- rida necessidade.

Embora materiais tendo a mais alta condutividade térmica em geral irão proporcionar melhor uniformidade de temperatura através de cada uma das fontes de calor, ligas de alumínio e ligas de cobre são tipica- mente materiais úteis uma vez que os mesmos são relativamente econômi- cos e fáceis de fabricar e ainda possuem alta condutividade térmica.

As especificações a seguir serão em geral úteis para produzir e usar as modalidades do aparelho descrito aqui.

As dimensões de largura e comprimento das primeira e segunda fontes de calor ao longo de um eixo perpendicular ao eixo de canal podem ser selecionadas como quaisquer va- lores dependendo do uso pretendido, por exemplo, dependendo do espaça- mento entre o canal adjacente/estruturas de câmara.

O espaçamento entre o canal adjacente/estruturas de câmara pode ser pelo menos de cerca de 2 a 3 mm, preferivelmente entre cerca de 4 mm a cerca de 15 mm.

Será em ge- ral preferido se usar os padrões industriais, isto é, 4,5 mm ou 9 mm de espa- çamento.

Em modalidades típicas, o canal/estruturas de câmara são arran- jados em fileiras e/ou colunas igualmente espaçadas.

Nas referidas modali- dades, é preferido se fazer a largura ou comprimento (ao longo de um eixo perpendicular ao eixo de canal) de cada uma das fontes de calor sendo pelo menos de cerca do valor correspondendo ao espaçamento versus o número de fileiras ou colunas até cerca de um a cerca de três espaçamentos maior do que o referido valor.

Em outras modalidades, o canal/estruturas de câma- ra podem ser arranjados em um padrão circular e preferivelmente igualmen- te espaçados.

O espaçamento nas referidas modalidades é também pelo 5 menos de cerca de 2 a 3 mm, preferivelmente cerca de 4 mm a cerca de 15 mm com os padrões industriais de 4,5 mm ou 9 mm de espaçamento mais preferida.

Nas referidas modalidades, é preferido se ter o formato das fontes de calor como um formato similar a uma rosca tipicamente tendo um orifício no centro.

O canal/estruturas de câmara pode ser posicionado em um, dois, três, até cerca de dez círculos concêntricos.

Diâmetro de cada círculo con- cêntrico pode ser determinado pela necessidade geométrica para o uso pre- tendido, por exemplo, dependendo de número do canal/estruturas de câma- ra, espaçamento entre canal adjacente/estruturas de câmara naquele círcu- lo, etc.

O diâmetro externo das fontes de calor é preferivelmente pelo menos de cerca de um espaçamento maior do que diâmetro do maior círculo con- cêntrico, e o diâmetro interno das fontes de calor é preferivelmente pelo me- nos de cerca de um espaçamento menor do que diâmetro do menor círculo concêntrico.

O comprimento ou espessura das primeira e segunda fontes de calor ao longo do eixo de canal já foi discutido.

Nas modalidades compreen- dendo pelo menos uma câmara na segunda fonte de calor, a espessura da primeira fonte de calor é maior do que cerca de 1 mm ao longo do eixo de canal, preferivelmente a partir de cerca de 2 mm a cerca de 10 mm.

A es- pessura da segunda fonte de calor ao longo do eixo de canal é entre cerca de 2 mm a cerca de 25 mm, preferivelmente entre 3 mm a cerca de 15 mm.

Na medida em que as dimensões do canal podem ser definidas por poucos parâmetros como denotados nas figuras 7A-D e 8A-J.

A altura (h) do canal ao longo do eixo de canal é pelo menos de cerca de 5 mm a cerca de 25 mm, preferivelmente 8 mm a cerca de 16 mm para um volume de amostra de cerca de 20 microlitros.

O ângulo de inclinação (θ) é entre a partir de cerca de 0° a cerca de 15°, preferivelmen te a partir de cerca de 2o a cerca de 10°. A largura ( w1) ou diâmetro do canal (ou sua média) ao longo de um eixo perpendicular ao eixo de canal é pelo menos de cerca de 1 mm a cerca de 5 mm.

A proporção de aspecto vertical como definido pela propor- ção da altura (h) para a largura (w1) é entre cerca de 4 a cerca de 15, prefe- rivelmente a partir de cerca de 5 a cerca de 10. A proporção de aspecto ho- 5 rizontal como definido pela proporção da primeira largura (w1) para a segun- da largura (w2) ao longo das primeira e segunda direções, respectivamente, que são mutuamente perpendiculares uma a outra e alinhadas perpendicula- res ao eixo de canal, é tipicamente entre cerca de 1 a cerca de 4. O orifício receptor tem uma largura ou diâmetro que está na mesma faixa que o canal, isto é, pelo menos de cerca de 1 mm a cerca de 5 mm.

Quando o canal é afunilado, a largura ou diâmetro do orifício receptor é menor ou maior do que aquela do canal dependendo da direção de inclina- ção.

A profundidade do orifício receptor é tipicamente pelo menos de cerca de 0,5 mm até cerca de 8 mm, preferivelmente entre cerca de 1 mm a cerca de 5 mm.

A câmara tipicamente tem uma largura ou diâmetro ao longo de um eixo perpendicular ao eixo de canal que é pelo menos de cerca de 1 mm a cerca de 10 ou 12 mm, preferivelmente entre cerca de 2 mm a cerca de 8 mm.

A presença da estrutura de câmara proporciona o espaço de câmara entre o canal e a parede de câmara que é tipicamente entre cerca de 0,1 mm a cerca de 6 mm, mais preferivelmente cerca de 0,2 mm a cerca de 4 mm. comprimento ou altura da câmara ao longo do eixo de canal pode variar dependendo das diferentes modalidades.

Por exemplo, se o aparelho com- preende uma câmara na segunda fonte de calor, aquela câmara pode ser dotada de uma altura ao longo do eixo de canal entre cerca de 1 mm a cerca de 25 mm, preferivelmente entre cerca de 2 mm a cerca de 15 mm.

Nas mo- dalidades tendo duas ou mais câmaras na segunda fonte de calor, a altura de cada câmara é entre cerca de 0,2 mm a cerca de 80% ou 90% da espes- sura da segunda fonte de calor ao longo do eixo de canal.

As dimensões do freio térmico e dos elementos isolantes (ou es- paços isolantes) são também muito importantes.

Favor se referir às especifi- cações gerais como já proporcionado acima.

Embora em geral não necessário para o uso ótimo da presente invenção, está dentro do âmbito da presente invenção proporcionar um apa- relho com protuberâncias 24, 34, ou ambas.

Vide a figura 6A, por exemplo.

Será observado que existem em geral determinadas tolerâncias 5 na usinagem e fabricação estruturas mecânicas.

Portanto, na prática atual, os orifícios de contato físico (por exemplo, o orifício perfurado na segunda fonte de calor ou o orifício receptor na primeira fonte de calor em modalida- des particulares) devem ser projetados para terem tolerâncias positivas com relação ao tamanho do recipiente de reação.

De outro modo, o orifício perfu- rado ou o canal pode ser produzido menor ou igual ao tamanho do recipiente de reação, não permitindo a instalação adequada do recipiente de reação para o canal.

Tolerâncias praticamente confiáveis para o orifício de contato físico é de cerca de +0,05 mm em processo da fabricação padrão.

Portanto, se for dito que dois objetos devem estar "em contato físico", isto deve ser interpretado como tendo um espaço entre os dois objetos de contato que é menor do que ou igual a cerca de 0,05 mm.

Se for dito que dois objetos de- vem estar "não em contato físico", ou "espaçados", isto deve ser interpretado como tendo o espaço entre os dois objetos que é maior do que cerca de 0,05 ou 0,1 mm.

B.

Uso Quase qualquer aparelho de PCR por convecção térmica des- crito aqui pode ser usado para realizar uma ou uma combinação de diferen- tes técnicas de amplificação de PCR.

Um método adequado inclui pelo me- nos uma de e preferivelmente todas as etapas a seguir: (a) manter uma primeira fonte de calor compreendendo um orifí- cio receptor em uma faixa de temperatura adequada para desnaturar uma molécula de ácido nucleico de dupla fita e formar uma matriz de uma fita, (b) manter uma segunda fonte de calor em uma faixa de tempe- ratura adequada para recozer pelo menos um iniciador de oligonucleotídeo para a matriz de uma fita; e (c) produzir convecção térmica entre o orifício receptor e segun- da fonte de calor sob condições suficientes para produzir o produto de ex-

tensão de iniciador.

Em uma modalidade, o método adicionalmente inclui a etapa de proporcionar um recipiente de reação compreendendo o ácido nucleico de dupla fita e o iniciador de oligonucleotídeo(s) em uma solução de tampão 5 aquoso.

Tipicamente, o recipiente de reação adicionalmente inclui um ou mais polimerases de DNA.

Se desejado, a enzima pode ser imobilizada.

Em uma modalidade mais particular do método de reação, o método inclui a eta- pa de contato com (seja diretamente ou indiretamente) o recipiente de rea- ção para o orifício receptor, o orifício perfurado, e pelo menos um elemento de formação de temperatura (tipicamente pelo menos uma câmara) disposto dentro de pelo menos uma das segunda ou primeira fontes de calor.

Na refe- rida modalidade, o contato é suficiente para suportar a convecção térmica dentro do recipiente de reação.

Preferivelmente, o método adicionalmente inclui a etapa de contato com o recipiente de reação a um primeiro elemento isolante entre as primeira e segunda fontes de calor.

Em uma modalidade, as primeira e segunda fontes de calor têm uma condutividade térmica pelo menos de cerca de dez vezes, preferivelmente cerca de uma centena vezes maior do que o recipiente de reação ou solução aquosa no mesmo.

O pri- meiro elemento isolante pode ser dotado de uma condutividade térmica pelo menos de cerca de cinco vezes menor do que o recipiente de reação ou so- lução aquosa no mesmo no qual a condutividade térmica do primeiro ele- mento isolante é suficiente para reduzir a transferência de calor entre as primeira e segunda fontes de calor.

Na etapa (c) do dito acima método, o fluxo de fluido de convec- ção térmica é produzido essencialmente simetricamente ou assimetricamen- te sobre o eixo de canal dentro do recipiente de reação.

Preferivelmente, as etapas (a)-(c) do método descrito acima consome menos do que cerca de 1 W, preferivelmente menos do que cerca de 0,5 W de energia por recipiente de reação para produzir o produto de extensão de iniciador.

Se desejado, a energia para realizar o método é fornecida por uma bateria.

Em modalidades típicas, o produto de extensão de PCR é produzido em cerca de 15 a cerca de 30 minutos ou menos e o recipiente de reação pode ser dotado de um volume de menos do que cerca de 50 ou 100 microlitros, por exemplo, me- nos do que ou igual a cerca de 20 microlitros.

Em modalidades nas quais o método é usado com a centrífuga de PCR de convecção térmica da presente invenção, o método adicional- 5 mente inclui a etapa de aplicar ou imprimir uma força centrífuga para o reci- piente de reação condutiva para realizar a PCR.

Em uma modalidade mais específica do método para realizar PCR por convecção térmica, o método inclui as etapas de adicionar um ini- ciador de oligonucleotídeo, matriz de ácido nucleico, e tampão a um recipi- ente de reação recebido por qualquer dos aparelhos descritos aqui sob con- dições suficientes para produzir um produto de extensão de iniciador.

Em uma modalidade, o método adicionalmente compreende a etapa de adicio- nar a polimerase de DNA para o recipiente de reação.

Em outra modalidade do método para realizar PCR por convec- ção térmica, o método compreendendo as etapas de adicionar um iniciador de oligonucleotídeo, matriz de ácido nucleico, e tampão a um recipiente de reação recebido por qualquer centrífuga de PCR descrita aqui e aplicar uma força centrífuga para o recipiente de reação sob condições suficientes para produzir um produto de extensão de iniciador.

Em uma modalidade, o méto- do inclui a etapa de adicionar a polimerase de DNA para o recipiente de rea- ção.

A prática da presente invenção é compatível com uma ou uma combinação de técnicas de PCR incluindo PCR quantitativa (qPCR), PCR multiplex, PCR mediada a ligação, PCR de início quente, PCR específica de alelo dentre outras variações da técnica de amplificação.

O uso particular a seguir da presente invenção é com referência à modalidade mostrada nas figuras 1 e 2A.

Como será observado, entretanto, a metodologia é em geral aplicável a outras modalidades referidas aqui.

Com referência às figuras 1 e 2A, a primeira fonte de calor 20 gera uma distribuição de temperatura adequada para o processo de desna- turação no fundo ou mais baixa porção do canal (algumas vezes referido aqui como a região de desnaturação). A primeira fonte de calor 20 é tipica-

mente mantida a uma temperatura útil para fundir a matriz de ácido nucleico de interesse (por exemplo, cerca de 1 fg a cerca de 100 ng da matriz com base em DNA). Na referida modalidade, a primeira fonte de calor 20 deve ser mantida entre cerca de 92°C a cerca de 106°C, p referivelmente entre 5 cerca de 94°C a cerca de 104°C, e mais preferivelme nte entre cerca de 96°C a cerca de 102°C.

Como será observado, outro perfil de temperaturas pode ser melhor adequado para prática ótima da presente invenção dependendo dos parâmetros reconhecidos tal como o ácido nucleico de interesse, a sen- sibilidade desejada, e a velocidade na qual um processo de PCR deve ser conduzido.

A segunda fonte de calor 30 gera uma distribuição de temperatu- ra adequada para o processo de recozimento na porção de topo ou de cima do canal (algumas vezes referido aqui como uma região de recozimento). A segunda fonte de calor é tipicamente mantida a uma temperatura entre cerca de 45°C a cerca de 65°C, dependendo, por exemplo, d as temperaturas de fusão dos iniciadores de oligonucleotídeo usados e de outros parâmetros conhecidos daqueles com experiência em reações de PCR.

A distribuição de temperatura adequada para o processo de po- limerização é gerada na região intermediária (isto é, região de transição) do canal 70 (algumas vezes referido aqui como a região de polimerização) entre a região de desnaturação no fundo do canal e a região de recozimento em cima ou parte superior do canal.

Para alguns casos (no qual a temperatura da segunda fonte de calor é mantida a uma temperatura igual a ou mais alta do que cerca de 60°C), a região de recozimento na p arte de cima do canal pode também funcionar como parte da região de polimerização.

Para muitas aplicações da invenção, a região de polimerização é tipicamente mantida a uma temperatura entre cerca de 60°C a cerca de 80°C , mais preferivelmente entre cerca de 65°C a cerca de 75°C, em casos nos q uais Taq polimerase de DNA ou um derivado da mesma relativamente estável a calor é usado. se a polimerase de DNA que tem um perfil de temperatura diferente de sua ati- vidade é usado, a faixa de temperatura da região de polimerização pode ser mudada (ao mudar a temperatura de recozimento da segunda fonte de calor ou a estrutura dos elementos de formação de temperatura) para correspon- der com um perfil de temperatura de polimerase usado.

Vide Patente US No. 7,238,505 e referências descritas na mesma com relação a uso de polimera- ses sensíveis a calor e estáveis a calor em um processo de PCR. 5 Vide a seção de exemplos for informação sobre o uso de moda- lidades adicionais do aparelho.

C.

Seleção de Elementos de formação de temperatura A seção a seguir pretende proporcionar orientação adicional na seleção e no uso de elementos de formação de temperatura.

Não é preten- dido se limitar a presente invenção à configuração particular do aparelho ou seu uso.

A escolha de um ou uma combinação de elementos de formação de temperatura para uso com um aparelho da presente invenção será guia- da pela aplicação de PCR particular de interesse.

Por exemplo, as proprie- dades da matriz-alvo são importantes para selecionar elemento de formação de temperatura(s) que é/são melhor adequados para uma aplicação de PCR particular.

Por exemplo, a sequência-alvo pode ser relativamente curta ou longa; e/ou a sequência-alvo pode ser dotada de uma estrutura relativamen- te simples (tal como em plasmídeo ou DNA bacteriano, DNA viral, DNA de fago, ou cDNA) ou uma estrutura complexa (tal como em DNA genômico ou cromossomial). Em geral, sequências-alvo tendo sequências mais longas e/ou estruturas complexas são mais difíceis para amplificar e tipicamente necessitam de um tempo mais longo de polimerização.

Adicionalmente, tempos mais longos para recozimento e desnaturação são com frequência necessários.

Adicionalmente, a sequência-alvo pode estar disponível em grande ou pequena quantidade.

Sequências-alvo em menores quantidades são mais difíceis para amplificar e em geral necessitam de mais tempo de reação de PCR (isto é, mais ciclos de PCR). Outras considerações podem também ser importantes dependendo de particular uses.

Por exemplo, um aparelho de PCR pode ser usado para produzir uma determinada quantida- de da sequência-alvo para subsequentes aplicações, experimentos, ou aná- lises, ou qualquer outra coisa para detectar ou identificar a sequência-alvo a partir da amostra.

Em considerações adicionais, um aparelho de PCR pode ser usado no laboratório ou no campo, ou em determinados ambientes ex- traordinários, por exemplo, dentro do carro, um navio, um submarino, ou uma nave espacial; sob severas condições de tempo, etc. 5 Como discutido, um aparelho de PCR por convecção térmica da presente invenção em geral proporciona amplificação de PCR mais rápida e mais eficiente do que os aparelhos de PCR anteriores.

Adicionalmente, um aparelho da presente invenção tem uma necessidade de energia substanci- almente mais baixa e um tamanho muito menor do que os aparelhos de PCR anteriores.

Por exemplo, um aparelho de PCR por convecção térmica é tipi- camente pelo menos de cerca de 1,5 a 2 vezes mais rápido (preferivelmente cerca de 3 a 4 vezes mais rápido) e requer pelo menos de cerca de 5 vezes (preferivelmente cerca de dez vezes a diversas dezenas de vezes) menos energia para operação com o seu tamanho ou peso pelo menos de cerca de 5 a 10 vezes menor.

Assim, se um desenho adequado pode ser selecionado, usuários podem ter um aparelho que pode custar muito menos tempo, ener- gia, e espaço.

De modo a selecionar uma configuração adequada de aparelho, é importante se observar as funções chave de um elemento de formação de temperatura pretendido.

Como resumido na Tabela 1 abaixo, cada elemento de formação de temperatura tem funções específicas com relação ao de- sempenho de um aparelho de PCR por convecção térmica.

Por exemplo, a estrutura de câmara em geral aumenta a velocidade da convecção térmica dentro da fonte de calor na qual uma câmara reside em comparação às es- truturas na câmara, e o freio térmico em geral diminui a velocidade da con- vecção térmica em comparação às estruturas tendo a estrutura de câmara sem o freio térmico.

Importante, entretanto, incorporação da estrutura de freio térmico além da estrutura de câmara dentro da segunda fonte de calor torna a extensão de tempo ou volume da amostra disponível para a etapa de polimerização maior de modo que eficiência da amplificação de PCR pode ser aumentada para as sequências-alvo que necessitam de um tempo mais longo de polimerização.

Assim, a estrutura de câmara pode ser usada com ou sem o freio térmico dependendo das aplicações particulares como discu- tido abaixo.

Como também resumido na Tabela 1, qualquer um ou uma combinação dos elementos de aceleração de convecção (por exemplo, a assimetria de posição, a assimetria estrutural, e a centrífuga de aceleração) 5 pode ser usado para aumentar a velocidade da convecção térmica indepen- dente de outras estruturas de fonte de calor incluindo a estrutura isolada de canal (isto é, uma estrutura na câmara). Assim, pelo menos um ou uma combinação dos referidos elementos de aceleração de convecção podem ser combinados com quase todas as estruturas de fonte de calor de modo a aumentar a velocidade de convecção térmica conforme necessário.

Como discutido, um aparelho da presente invenção requer muito menos energia do que os aparelhos de PCR anteriores, principalmente como um resultado de eliminar necessidade de um processo de ciclagem térmica (isto é, o proces- so que muda a temperatura da fonte de calor). Como também discutido, uma escolha adequada do primeiro elemento isolante (isto é, a espessura do es- paço isolante assim como uso do adequado elemento térmico isolante) pode tornar o consumo de energia do aparelho da presente invenção adicional- mente reduzida.

Adicionalmente, uso da estrutura de protuberância(s) pode ainda adicionalmente reduzir o consumo de energia do aparelho da presente invenção substancialmente (vide exemplo 1, por exemplo) e também para aumentar o comprimento da câmara e assim para aumentar o tempo de po- limerização.

Outros parâmetros tais como A profundidade do orifício receptor e as temperaturas das primeira e segunda fontes de calor podem também ser usados para modular a velocidade de convecção térmica e também o período de tempo disponível para cada uma das etapas de polimerização, recozimento e desnaturação.

Como discutido abaixo, cada um dos referidos elementos de formação de temperatura pode ser usado isoladamente ou em combinação com um ou mais outros elementos para construir um aparelho particular de PCR por convecção térmica que seja adequado para uma apli- cação particular.

Tabela 1. Funções chave de Elementos de formação de temperatura

Elemento de formação Funções chave de temperatura Aumenta a velocidade de convecção térmica dentro da fonte de calor na qual a câmara reside em comparação Câmara com a estrutura de canal isoladamente.

Quanto menor o diâmetro de câmara ou o espaço de câmara, mais baixa é a velocidade de convecção térmica.

Diminui a velocidade de convecção térmica quando combinado com a estrutura de câmara.

Tipicamente posicionado dentro da segunda fonte de calor em com- binação com pelo menos uma câmara e faz a extensão de tempo e volume da amostra disponível para a etapa Freio térmico de polimerização aumentar em comparação apenas com a estrutura da câmara.

Quanto maior o comprimen- to do freio térmico ao longo do eixo de canal, mais bai- xa é a velocidade de convecção térmica e o maior tem- po e volume de amostra se torna disponível para a eta- pa de polimerização.

Em geral necessário para o aparelho de convecção térmica de múltiplos estágios.

Útil para controlar a velo- cidade de convecção térmica e para reduzir o consumo Isolante/Espaço isolan- de energia.

Quanto menor o comprimento do elemento te isolante ao longo do eixo de canal, maior é o consumo de energia e a força de direcionamento para a convec- ção térmica.

Útil para reduzir o consumo de energia substancialmen- te e também para aumentar o comprimento da câmara Protuberância ao longo do eixo de canal (e assim para aumentar o tempo e volume de amostra disponível para a etapa de polimerização). Assimetria de posição Aumenta a velocidade de convecção térmica e pode ser incorporada em um aparelho da presente invenção co- mo um elemento estrutural ajustável de modo a propor- cionar liberdade para controlar a velocidade de convec- ção térmica dentro de uma determinada configuração.

Quando usado com a assimetria estrutural, uma assi- metria ajustável do elemento de posição pode ser usa- da não só como um elemento de aceleração mas tam- bém como um elemento de desaceleração.

Assimetria estrutural Aumenta a velocidade de convecção térmica.

Aumenta a velocidade de convecção térmica enquanto proporciona liberdade para controlar a velocidade de Aceleração centrífuga convecção térmica dentro de uma determinada configu- ração.

Tipicamente usado com a assimetria de posição.

Embora muitas modalidades úteis do aparelho sejam proporcio- nados pela presente invenção, as combinações a seguir são particularmente úteis e fáceis de prever o desempenho do aparelho da presente invenção.

Um aparelho aceitável de PCR por convecção térmica para mui- 5 tas aplicações tipicamente inclui o canal e o primeiro elemento isolante (ou um primeiro espaço isolante) como elementos básicos.

Um ou mais outros elementos de formação de temperatura pode ser combinado para usar com os referidos elementos básicos.

Um aparelho que usa o canal e o elemento isolante apenas pode não ser ótimo para algumas aplicações de PCR.

Com a estrutura de canal isoladamente, um gradiente de temperatura dentro da amostra dentro de cada fonte de calor pode ser muito pequena em virtude de eficiente transferência de calor a partir das fontes de calor, e assim con- vecção térmica se torna ou muito lenta ou não ocorrendo adequadamente.

Uso da estrutura de câmara pode remediar a referida deficiência.

Como dis- cutido, a velocidade da convecção térmica dentro de cada fonte de calor po- de ser aumentada ao se incorporar uma estrutura de câmara na referida fon- te de calor.

Aparelhos de PCR por convecção térmica que usam a câmara como um elemento adicional de formação de temperatura são em geral ade- quado para a maioria das aplicações incluindo rápida amplificação de se-

quências-alvo relativamente curtas (por exemplo, mais curta do que cerca de 1 kbp) tendo estruturas simples assim como sequências-alvo mais longas (por exemplo, mais longa do que cerca de 1 kbp até cerca de 2 ou 3 kbp) ou sequências-alvo tendo estruturas complexas (por exemplo, DNA genômico 5 ou cromossomials). Por exemplo, uma configuração de aparelho tendo uma câmara retilínea na segunda fonte de calor com sua largura ou diâmetro maior do que cerca de 3 ou 4 mm pode enviar amplificação de PCR de rela- tivamente curta sequências dentro de menos do que cerca de 20 ou 25 min, preferivelmente dentro de menos do que cerca de 10 a 15 minutos depen- dendo da quantidade e tamanho da sequência-alvo (vide exemplo 1, por exemplo). Amplificação de sequências-alvo tendo estruturas complexas (por exemplo, vide exemplo 1 para amplificação de genoma humano-alvos) tipi- camente leva cerca de 25 ou 30 minutos.

Sequências-alvo mais longas tipi- camente levam mais tempo, por exemplo, cerca de 30 minutos a até cerca de 1 hora dependendo do tamanho e estrutura da sequência-alvo.

O aumen- to adicional da velocidade de uma PCR por convecção térmica pode ser al- cançado ao se incorporar pelo menos um dos elementos de aceleração de convecção (por exemplo, vide exemplos 2 e 3). O aumento adicional da faixa dinâmica de um aparelho de PCR por convecção térmica pode ser alcançada ao se incorporar um freio térmico e/ou a câmara mais estreita (por exemplo, menor do que cerca de 3 mm da largura ou diâmetro da câmara) dentro da segunda fonte de calor.

O uso de um freio térmico ou uma câmara tendo a largura ou o diâmetro reduzido (se- ja parcialmente ou completamente) dentro da segunda fonte de calor leva a maior transferência de calor a partir da segunda fonte de calor para o canal, e assim a convecção térmica se torna desacelerada.

Nas referidas estrutu- ras desaceleradas de fonte de calor, o período de tempo de polimerização pode ser adicionalmente aumentado de modo a amplificar sequências mais longas, por exemplo, até cerca de 5 ou 6 kbp.

Entretanto, o tempo de reação de PCR total pode ser inevitavelmente aumentado em virtude de uma baixa velocidade de convecção térmica, por exemplo, cerca de 35 minutos a até cerca de 1 hora ou mais dependendo do tamanho e estrutura da sequência-

alvo.

Qualquer um ou mais dos elementos de aceleração de convecção pode ser combinado com o referido tipo de configuração dos aparelhos para au- mentar a velocidade da PCR por convecção térmica como desejado.

No re- ferido tipo de modalidades, it é tipicamente recomendado para usar iniciado- 5 res tendo pontos de fusão relativamente altos (por exemplo, mais alta do que cerca de 60°C) de modo a se fazer a temperatura da amostra dentro da se- gunda fonte de calor em ou próxima da ótima temperatura de típicas polime- rases de DNA.

Os elementos de aceleração de convecção mencionados acima (isto é, a assimetria de posição, a assimetria estrutural, e a centrífuga de aceleração) podem afetar a velocidade da convecção térmica em diferentes graus.

A assimetria de posição ou estrutural pode tipicamente aumentar a velocidade de convecção térmica a partir de cerca de 10% ou 20% até cerca de 3 a 4 vezes.

No caso da centrífuga de aceleração, o aumento pode ser produzido tão grande quanto possível, por exemplo, cerca de 11,200 vezes a 10,000 rpm quando R = 10 cm como discutido.

Uma faixa praticamente útil seria até cerca de 10 a cerca de 20 vezes de aumento.

Quando qualquer um dos referidos elementos de aceleração de convecção é usado, a velocidade da convecção térmica pode ser aumentada.

Assim, sempre que um aumento adicional da velocidade de convecção térmica for necessário para as aplica- ções do usuário, a referida característica pode ser convenientemente incor- porada.

Uma configuração particular que inclui pelo menos um dos elemen- tos de aceleração de convecção é uma estrutura de fonte de calor que não inclui a câmara (isto é, o canal apenas). O uso do elemento de aceleração de convecção pode tornar a configuração do canal isolado operável.

Na refe- rida modalidade de canal isoladamente, o uso de iniciadores tendo pontos de fusão relativamente altos (por exemplo, mais alta do que cerca de 60°C) é tipicamente recomendado de modo a se fazer a temperatura da amostra dentro da segunda fonte de calor próximo ou próxima da temperatura ótima de típicas polimerases de DNA.

A referida configuração do canal isolado quando usada com iniciadores de alto ponto de fusão é vantajosa uma vez que pode proporcionar o período de tempo e volume da amostra disponível para a etapa de polimerização que é a maior possível.

Entretanto, como dis- cutido, a referida configuração envia a velocidade de convecção térmica que é tipicamente muito lenta.

Uso de qualquer um ou mais dos elementos de aceleração de convecção pode remediar a referida deficiência por aumentar 5 a velocidade de convecção térmica de acordo com a demanda do usuário.

Todos os exemplos de aparelho discutidos acima requerem mui- to menos energia do que os aparelhos de PCR anteriores e podem ser pro- duzidos como dispositivos portáteis, isto é, operáveis com uma bateria, mesmo sem a estrutura de protuberância.

Como discutido, o uso da estrutu- ra de protuberância pode reduzir o consumo de energia substancialmente e assim mais recomendado se um aparelho de PCR portátil for essencial para as aplicações do usuário.

Também, a configuração dos aparelhos discutidos acima pode amplificar a partir de amostras de um número muito baixo de cópias (quando otimizada). Por exemplo, como demonstrado nos exemplos 1 e 2, sequên- cias-alvo com muito menos do que cerca de 100 cópias podem ser amplifi- cadas em cerca de 25 minutos ou cerca de 30 minutos.

Adicionalmente, a configuração dos aparelhos discutidos acima pode ser usada no laboratório ou no campo, ou em determinadas condições extraordinárias, não como muito dos aparelhos de PCR anteriores que po- dem ser usados apenas sob condições controladas tal como dentro de um laboratório.

Por exemplo, testamos alguns poucos aparelhos da presente invenção dentro do carro enquanto se dirigia e foi confirmado que uma am- plificação de PCR rápida e eficiente pode ser alcançada como dentro de um laboratório.

Adicionalmente, também foram testados alguns aparelhos da presente invenção sob condições extraordinárias de temperatura (a partir de abaixo de cerca de -20°C a acima de cerca de 40°C) e confirmou uma ampli- ficação de PCR rápida e eficiente independente das temperaturas externas.

Finalmente, como exemplificado através dos exemplos, os apa- relhos de PCR por convecção térmica da presente invenção podem enviar amplificação de PCR que não é apenas rápida, mas também muito eficiente.

Assim, é demonstrado que os aparelhos da presente invenção são em geral adequados para quase todas as diversas aplicações diferentes de um apare- lho de PCR enquanto proporciona maior desempenho com uma nova carac- terística de um dispositivo de PCR de tamanho portátil.

Aparelho com Alojamento e os elementos de controle de temperatura 5 O aparelho da presente invenção referido acima pode ser usa- do isoladamente ou em combinação com alojamento adequado, sensor de temperatura, e elementos de aquecimento e/ou resfriamento.

Em uma moda- lidade mostrada na figura 30, a primeira fonte de calor 20 e a segunda fonte de calor 30 caracterizam pelo menos um primeiro elemento de fixação 200 (tipicamente um orifício de parafuso) e um segundo elemento de fixação 210 no qual cada um dos elementos é adaptado para fixar as fontes de calor e o primeiro elemento isolante 50 juntos como uma única unidade operacional.

Um segundo elemento de fixação 210 é preferivelmente "em forma de asa" para ajudar a proporcionar um limite para espaços de isolamento adicionais (vide abaixo). Os elementos de aquecimento e/ou resfriamento 160a e 160b são cada um dos quais posicionados nas primeira 20 e segunda 30 fontes de calor, respectivamente.

Cada uma das fontes de calor é tipicamente equi- pada com pelo menos um elemento de aquecimento.

Tipicamente elementos de aquecimento úteis são dos tipos de aquecimento resistivo e aquecimento indutivo.

Dependendo do uso pretendido, uma ou mais das fontes de calor pode ser adicionalmente equipada com um ou mais dos elementos de resfri- amento e/ou um ou mais dos elementos de aquecimento.

Tipicamente ele- mentos de resfriamento preferidos são um ventilador ou um cooler de Peltier.

Como é bem conhecido, o cooler de Peltier pode funcionar não só como um elemento de aquecimento mas também como um elemento de resfriamento.

É particularmente preferido se usar mais do que um elemento de aqueci- mento ou ambos elemento de aquecimento e de resfriamento em diferente locais de uma ou mais das fontes de calor quando uma operação de gradi- ente de temperatura é necessária para proporcionar diferentes temperaturas através daquela fonte de calor.

As primeira 20 e segunda 30 fontes de calor adicionalmente incluem sensores de temperatura 170a e 170b disposto em cada uma das fontes de calor, respectivamente.

Para a maioria das modali-

dades, cada uma das fontes de calor é tipicamente equipada com um sensor de temperatura.

Entretanto, em algumas modalidades tal como aquelas com uma capacidade de operação de gradiente de temperatura em uma ou mais das fontes de calor, dois ou mais sensores de temperatura podem ser locali- 5 zados em diferentes posições daquela fonte de calor.

As figuras 31A-B proporcionam vistas transversais seccionadas da modalidade mostrada na figura 30. Além das vistas transversais seccio- nadas das estruturas de canal e câmara, locais dos elementos de aqueci- mento e/ou resfriamento são mostrados como um exemplo.

Como mostrado no referido exemplo, é preferido se posicionar os elementos de aquecimento e/ou resfriamento uniformemente a cada uma das fontes de calor proporcio- nando um aquecimento e/ou resfriamento uniforme através de cada uma das fontes de calor.

Por exemplo, como ilustrado na figura 31B, os elementos de aquecimento e/ou resfriamento são posicionados entre cada uma das estru- turas de canal e câmara e igualmente espaçados um a partir do outro (vide também a figura 33, por exemplo). A vista em seção transversal ilustrada nas figuras 31A, por exemplo, mostra conexões (isto é, os círculos) entre os elementos de aquecimento e/ou resfriamento a partir de uma posição entre cada uma das estruturas de canal e câmara para a outra.

Em outros tipos de modalidades tal como aquelas com uma opção de operação de gradiente de temperatura, dois ou mais dos elementos de aquecimento ou de resfriamen- to podem ser usados em uma ou mais das fontes de calor e posicionados em diferentes locais daquela fonte de calor proporcionando um aquecimento e/ou resfriamento orientado através daquela fonte de calor.

Na figura 32, o plano de seção é através de um de segundos elementos de fixação 210 e um primeiro elemento de fixação 200. Como mostrado, um primeiro elemento de fixação 200 inclui um parafuso 201, ar- ruela 202a, elemento de fixação da primeira fonte de calor 203a, espaçador 202b, e elemento de fixação da segunda fonte de calor 203b.

Preferivelmen- te, pelo menos um de e mais preferivelmente todos de parafuso 201, a ar- ruela 202a e o espaçador 202b são produzidos a partir de um material de elemento térmico isolante.

Exemplos incluem plásticos, cerâmicas, e compó-

sitos de plástico (tal como aqueles com carbono ou fibra de vidro). Materiais tendo uma alta resistência mecânica, alta temperatura de fusão e/ou defle- xão (por exemplo, cerca de 100°C ou mais alta, mais preferivelmente cerca de 120°C ou mais alta), e baixa condutividade térmi ca (por exemplo, plásti- 5 cos com condutividade térmica menor do que cerca da poucos décimos de W·m-1·1-1 ou cerâmicas com condutividade térmica menor do que cerca da pouco W·m-1·K-1) são mais preferidas. Exemplos mais específicos incluem plásticos tais como PPS (sulfeto de polifenileno), PEEK (poliéteretercetona), Vesper (poliimida), RENY (poliamida), etc. ou seus compósitos de carbono ou vidro, e cerâmicas de baixa condutividade térmica tal como Macor, sílica fundida, óxido de zircônio, Mullite, Accuflect, etc. A figura 33 proporciona uma vista expandida de uma modalidade do aparelho com vários elementos de fixação e os elementos de controle de temperatura. Será aparente que além das estruturas de fixação particulares mostradas na figura 33, outras são possíveis. Assim em uma modalidade, pelo menos um de primeiro e/ou segundos elementos de fixação (200, 210) é localizado em outra(s) região(s) de pelo menos um, e preferivelmente to- dos de primeira fonte de calor 20 e segunda fonte de calor 30, e primeiro elemento isolante 50. Ou seja, embora a segunda fonte de calor 30 seja mostrada incluindo o segundo elemento de fixação 210, qualquer outra ou todas das fontes de calor e/ou o primeiro elemento isolante podem incluir o segundo elemento de fixação 210. Em outra modalidade, pelo menos um de primeiro e/ou segundos elementos de fixação (200, 210) é localizado em uma região interna de pelo menos um, e preferivelmente todos de primeira fonte de calor 20, segunda fonte de calor 30, e primeiro elemento isolante

50. Embora as modalidades anteriores da presente invenção sejam em geral úteis para muitas aplicações de PCR, será com frequência desejá- vel se adicionar alojamento de proteção. Uma modalidade é mostrada nas figuras 34A-B. Como mostrado, o aparelho 10 caracteriza um primeiro ele- mento de alojamento 300 que circunda a primeira fonte de calor 20, a se- gunda fonte de calor 30, e o primeiro elemento isolante 50. Na referida mo-

dalidade, cada um dos segundos elementos de fixação 210 tem uma estrutu- ra em forma de asa que coopera com outros elementos estruturais do apare- lho 10 para formar pelo menos um espaço isolante, por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito dos referidos espaços. Cada um dos 5 espaços pode ser preenchido com um material isolante adequado tal como aqueles descritos aqui tal como um gás ou elemento isolante sólido. Ar será o material isolante preferido para muitas aplicações. Presença do(s) espa- ço(s) isolante(s) proporciona vantagens tal como reduzir perda de calor a partir do aparelho 10, deste modo reduzindo o consumo de energia. Assim na modalidade mostrada na figura 34A-B, a segunda fon- te de calor 30 compreende quatro segundos elementos de fixação 210 no qual cada par dos segundos elementos de fixação define um segundo espa- ço isolante 310. Em particular, a figura 34A mostra quatro partes do segundo espaços isolantes 310 cada definido por um primeiro elemento de alojamen- to 300 e um par de segundo elemento de fixação 210. A figura 34A também mostra um terceiro espaço isolante 320 localizado entre o fundo da primeira fonte de calor 20 e um primeiro elemento de alojamento 300. Também mos- trado é um suporte 330 para suspender as fontes fixadas de calor dentro do primeiro elemento de alojamento 300, deste modo ajudando a formar o se- gundo espaço isolante 310 e o terceiro espaço isolante 320. Será com frequência desejável se adicionalmente alojar um apa- relho da presente invenção, por exemplo, proporcionar adicionalmente pro- teção e espaços isolantes. Com referência agora à figura 35A-B, o aparelho adicionalmente inclui um segundo elemento de alojamento 400 que circunda um primeiro elemento de alojamento 300. Na referida modalidade, o apare- lho 10 adicionalmente inclui a quarto espaço isolante 410 definido por um primeiro elemento de alojamento 300 e um segundo elemento de alojamento

400. O aparelho 10 pode também incluir um quinto espaço isolante 420 loca- lizado entre o fundo do primeiro elemento de alojamento 300 e o fundo do segundo elemento de alojamento 400. Se desejado, um aparelho da presente invenção pode adicio- nalmente incluir pelo menos uma unidade de ventoinha para remover calor a partir do aparelho.

Em uma modalidade, o aparelho compreende uma primei- ra unidade de ventoinha posicionada acima da segunda fonte de calor 30 para remover calor a partir da segunda fonte de calor 30. Se desejado, o aparelho pode adicionalmente incluir a segunda unidade de ventoinha posi- 5 cionada abaixo da primeira fonte de calor 20 para remover calor a partir da primeira fonte de calor 20. Aparelho de PCR por Convecção Incorporando Aceleração Centrífuga É um objetivo da presente invenção proporcionar "aceleração centrífuga" como uma característica adicional das modalidades do aparelho descrito aqui.

Como discutido acima, acredita-se que convecção térmica possa ser produzida ótima quando um gradiente de temperatura vertical (e opcionalmente ou em adição, uma distribuição de temperatura horizontal- mente assimétrica quando a assimetria de posição ou estrutural é usada) é gerada dentro de um fluido.

Proporcional à magnitude de gradiente de tem- peratura vertical, uma força de flutuação é gerada a qual orienta um fluxo de convecção dentro do fluido.

Convecção térmica gerada por um aparelho da presente invenção deve tipicamente preencher várias condições para induzir uma reação de PCR.

Por exemplo, a convecção térmica deve fluir através de uma pluralidade de regiões espaciais em sequência e repetidamente, en- quanto mantém cada uma das regiões espaciais em uma faixa de tempera- tura adequada para cada etapa da reação de PCR (isto é, as etapas de des- naturação, recozimento e de polimerização). Adicionalmente, a convecção térmica deve ser controlada para ter uma velocidade adequada de modo a permitir período de tempo adequado para cada uma das três etapas de rea- ção de PCR.

Sem se ater a qualquer teoria, acredita-se que convecção térmi- ca possa ser controlada por controlar um gradiente de temperatura, mais precisamente distribuição do gradiente de temperatura dentro do fluido.

Um gradiente de temperatura (dT/dS) depende da diferença de temperatura (dT) e distância (dS) entre duas posições de referência.

Portanto, a diferença de temperatura ou distância pode ser mudada para controlar um gradiente de temperatura.

Entretanto, em um aparelho de PCR de convecção, na tempe-

ratura (ou sua diferença) na distância pode ser mudada facilmente.

A tempe- ratura de diferentes regiões espaciais dentro de um fluido de amostra é submetida a uma faixa específica como definido pela temperatura adequada para cada uma das três etapas de reação de PCR.

Não há muitas oportuni- 5 dades de mudar a temperatura de diferente (tipicamente pelo menos verti- calmente diferente) regiões espaciais dentro da amostra.

Adicionalmente, posições verticais das diferentes regiões espaciais (de modo a gerar um gradiente de temperatura vertical para induzir uma força de direcionamento flutuante) são em geral restritas em virtude de um pequeno volume de um fluido de amostra.

Por exemplo, um típico volume da amostra de PCR é apenas cerca de 20 a 50 microlitros e algumas vezes menor.

Os referidos pequenos volumes e limitações de espaço não permitem muita liberdade para mudar as posições verticais das diferentes regiões espaciais para uma reação de PCR.

Como discutido, a força de flutuação é proporcional ao gradiente de temperatura vertical o que por sua vez depende da diferença de tempera- tura e distância entre dois pontos de referência.

Além da referida dependên- cia, entretanto, a força de flutuação é também proporcional à aceleração gravitacional (g = 9.8 m/sec2 na Terra). O referido parâmetro de campo de força é uma constante, a variável que não pode ser controlada ou mudada, mas pode ser apenas definido pela lei de gravitação universal.

Portanto, quase todos os aparelhos de PCR com base em convecção térmica se ba- seiam em estruturas especiais altamente restritas, inevitavelmente adapta- das às forças gravitacionais.

O uso de aceleração centrífuga de acordo com a presente in- venção proporciona uma solução para este problema.

Ao fazer um aparelho de PCR com base em convecção submetido a um campo de força de acele- ração centrífuga, se pode controlar a magnitude da força de direcionamento de flutuação independente da estrutura que define a magnitude do gradiente de temperatura, deste modo controlando a velocidade de convecção sem muita limitação.

As figuras 36A-B mostram uma modalidade de uma centrífuga de PCR 500 de acordo com a presente invenção.

No referido exemplo, o aparelho 10 é fixado para um braço de rotação 520 fixado de modo rotacio- nal ao motor 501. Na referida modalidade, o braço de rotação 520 inclui um eixo inclinado 530 para proporcionar liberdade de mudar o ângulo entre o 5 eixo de rotação 510 e o eixo de canal 80. A centrífuga de PCR pode incluir qualquer número do aparelho 10 desde que os resultados pretendidos sejam alcançados, por exemplo, 2, 4, 6, 8, 10 ou mesmo 12. O aparelho 10 pode ou não incluir alojamento de proteção como discutido acima, embora ter al- guns alojamento de proteção seja em geral útil.

Um eixo de inclinação 530 é preferivelmente configurado para ser um elemento de indução de ângulo capaz de inclinar o ângulo da fonte de calor (mais particularmente o ângulo do eixo de canal 80) com relação ao eixo de rotação.

O ângulo de inclinação pode ser ajustado dependendo da velocidade de rotação (isto é, dependendo da magnitude da centrífuga de aceleração) de modo que um ângulo de inclinação entre o eixo de canal 80 e o vetor de aceleração líquida ilustrado na figura 37 pode ser ajustado na fai- xa entre a partir de cerca de 0° a cerca de 60°. Em uma modalidade, o ele- mento de indução de ângulo na figura 36A é um eixo de rotação (ilustrados como um círculo) no centro da região de junta entre o braço horizontal e um braço no qual o conjunto de fonte de calor é localizado.

Na modalidade mostrada nas figuras 36A-B, um fluido de amos- tra dentro do recipiente de reação disposto dentro do aparelho 10 é submeti- do a uma força de aceleração centrífuga além da força de aceleração gravi- tacional.

Vide a figura 37. Como será observado, a direção da aceleração centrífuga gc é perpendicular ao (e para fora a partir de) eixo de rotação da centrífuga, e a sua magnitude é dada por uma equação gc = R ω2, onde R é a distância a partir do eixo da rotação centrífuga a um fluido de amostra e ω é velocidade angular em radianos/segundo.

Por exemplo, quando R = 10 cm e velocidade da rotação centrífuga é 100 rpm (correspondendo a ω = cerca de 10,5 radianos/segundo), magnitude da aceleração centrífuga é de cerca de 11 m/sec2, similar à aceleração gravitacional na Terra.

Uma vez que a aceleração centrífuga é proporcional ao quadrado da velocidade de rotação

(ou quadrado da velocidade angular), a aceleração centrífuga aumenta qua- draticamente com o aumento da velocidade de rotação, por exemplo, cerca de 4,5 vezes a aceleração gravitacional a 200 rpm, cerca de 112 vezes a 1,000 rpm, e cerca de 11,200 vezes a 10,000 rpm quando R = 10 cm.

A 5 magnitude do campo de força líquida que atua em um fluido de amostra po- de ser controlada livremente ao adotar a referida aceleração centrífuga.

Por- tanto, a força de flutuação pode ser controlada (tipicamente aumentada) con- forme necessário de modo a tornar a velocidade de convecção tão rápida conforme necessário.

Praticamente, há poucas limitações para induzir a convecção térmica a um fluxo de velocidade muito alto suficiente para uma reação de PCR em velocidade muito alta, desde que um pequeno gradiente de temperatura vertical possa ser gerado em um fluido de amostra.

Portanto, limitações anteriores com relação a conjunto de fonte de calor e uso podem ser minimizadas ou evitadas quando combinado com aceleração centrífuga de acordo com a presente invenção.

Como ilustrado na figura 37, um fluido de amostra é submetido a um campo de força líquida gerado pela adição da aceleração centrífuga e a aceleração gravitacional.

Em uma modalidade típica, o eixo de canal 80 é alinhado paralelo ao campo de força líquida ou produzido para ter a o ângulo de inclinação θc com relação ao campo de força líquida.

Como discutido, a presença de um ângulo de inclinação é em geral preferida de modo a se fa- zer o fluxo de convecção permanecer em uma via estável.

Um ângulo de inclinação θc varia a partir de cerca de 2o a cerca de 60°, mai s preferivel- mente cerca de 5° a cerca de 30°. Será observado que a modalidade do aparelho usado para exemplificar a centrífuga de PCR 500 é mostrada nas figuras 1 e 2A-C.

En- tretanto, a centrífuga de PCR 500 é compatível com uso de um ou uma combinação de diferentes aparelhos da presente invenção como descrito aqui.

Em particular, a centrífuga de PCR 500 pode também ser usada com quase qualquer tipo de estrutura de fonte de calor e recipiente de reação des- crito aqui desde que um pequeno gradiente de temperatura vertical possa ser gerado dentro da amostra.

Por exemplo, quase qualquer uma das estruturas de fonte de calor descritas em algum ponto acima (por exemplo, WO02/072267 para Benett et al. e Patente US No. 6,783,993 a Malmquist et al.) pode ser combinada com o elemento centrífugo da presente invenção de modo a au- mentar a velocidade de amplificação e o desempenho do aparelho.

Adicio- 5 nalmente, outras estruturas de fonte de calor que não podem ser produzidas operáveis (ou que não podem ser produzidas para proporcionar uma alta velocidade de amplificação de PCR) em modo típico gravitacionalmente orien- tado podem ser produzidas operáveis quando combinadas com a estrutura de centrífuga de aceleração.

Por exemplo, uma estrutura de fonte de calor que não inclui uma câmara como descrito aqui mas apenas compreende a estrutura de canal pode também ser produzida operável.

Vide PCT/KR02/01900, PCT/KR02/01728 e Patente US No. 7,238,505, por exemplo.

Na referida modalidade, as estruturas anteriores de fonte de calor na câmara proporcio- nam uma distribuição de temperatura dentro da segunda fonte de calor que muda lentamente, presumivelmente em virtude da alta transferência de calor a partir da segunda fonte de calor.

Um resultado é um pequeno gradiente de temperatura dentro da segunda fonte de calor.

Com apenas gravidade, con- vecção térmica será insatisfatória ou muito lenta para muitas aplicações de PCR.

Entretanto, a introdução de aceleração centrífuga de acordo com a presente invenção pode tornar a convecção térmica suficientemente rápida e estável de modo a induzir a reação de PCR com sucesso e eficientemente.

Em uma típica operação da centrífuga de PCR de convecção térmica 500, o eixo de rotação 510 é essencialmente paralelo à direção de gravidade.

Vide a figura 37. Na referida modalidade, o eixo de canal 80 é essencialmente paralelo a, ou inclinado com relação à direção de força líqui- da gerada pela força gravitacional e pela força centrífuga.

Ou seja, o eixo de canal 80 pode ser inclinado com relação à direção de força líquida gerada pela força gravitacional e pela força centrífuga.

Para a maioria das modali- dades, um ângulo de inclinação θc entre o eixo de canal 80 e a direção da força líquida é entre cerca de 2o a cerca de 60°. U m eixo de inclinação 530 é adaptado para controlar o ângulo entre o eixo de canal 80 e a força líquida.

Em operação, o eixo de rotação 510 é em geral localizado fora das primeira

20 e segunda 30 fontes de calor.

Alternativamente, o eixo de rotação 510 é localizado essencialmente em ou próximo ao centro das primeira 20 e se- gunda 30 fontes de calor.

Nas referidas modalidades, o aparelho 10 inclui uma pluralidade de canais 70 que são localizados concentricamente com 5 relação ao eixo de rotação 510. Fontes de calor de formato circular Em outra modalidade da centrífuga de PCR por convecção tér- mica, uma ou mais das fontes de calor tem um formato circular ou semicircu- lar.

As figuras 38A-B e 39A-B mostram modalidades particulares da referida estrutura de fonte de calor.

As figuras 38A-B mostram seções verticais da modalidade parti- cular do aparelho de PCR por convecção acelerada por centrífuga.

Em parti- cular, as figuras 38A e 38B mostram seções transversais ao longo do canal e regiões de elemento de fixação, respectivamente.

As duas seções são de- finidas nas figuras 39A-B que ilustram vistas planas de topo das primeira 20 e segunda 30 fontes de calor, respectivamente. como ilustrado nas figuras 38A-B, as duas fontes de calor de formato circular são montadas para formar uma modalidade do aparelho fixado de modo rotacional ao eixo de rotação 510 de uma centrífuga de PCR 500 através de um braço de rotação 520. O centro do conjunto de fonte de calor é posicionado concêntrico com relação ao eixo de rotação 510 de modo que o raio de rotação da centrífuga é defini- do pelo comprimento horizontal do braço de rotação a partir do eixo de rota- ção para o centro do canal 70. As duas fontes de calor 20 e 30 são monta- das essencialmente paralelas uma a outra com o topo de uma fonte de calor voltado para o fundo de outra fonte de calor.

Como também ilustrado, o con- junto de fonte de calor é orientado com relação ao eixo de rotação de modo que o eixo de canal 80 é alinhado ou paralelo a, ou inclinado a partir do vetor de aceleração líquida ilustrado na figura 37. As duas fontes de calor ilustradas nas figuras 39A-B são monta- das usando um conjunto de primeiro elemento de fixação compreendendo um parafuso 201, espaçadores ou arruelas 202a-b, e aberturas de fixação 203a-b formadas nas fontes de calor como ilustrado nas figuras 38B.

Um segundo elemento de fixação 210 formado na segunda fonte de calor 30 mostrada nas figuras 38B e 39B é usado para instalar o aparelho dentro do primeiro elemento de alojamento 300. Quase qualquer uma das modalidades do aparelho descrito no 5 presente pedido (incluindo várias estruturas de canal e câmara) pode ser usado com o aparelho de PCR por convecção térmica acelerado por centrí- fuga descrito aqui. Entretanto, um aparelho sem qualquer estrutura de câma- ra pode também ser usado. Em uma modalidade da centrífuga de PCR por convecção térmi- ca anterior, o dispositivo é produzido portátil e preferivelmente operado com uma bateria. A modalidade mostrada nas figuras 36A-B pode ser usada para amplificação de PCR com produtividade em grande escala, por exemplo. Na referida modalidade, o aparelho pode ser usado como um módulo separável e assim pode ser facilmente abastecido e desabastecido na unidade centrí- fuga.

FRASCOS DE REAÇÃO Um canal adequado do aparelho é adaptado para manter um re- cipiente de reação dentro do aparelho de modo que os resultados pretendi- dos podem ser alcançados. Na maioria dos casos, o canal terá a configura- ção que é essencialmente a mesma daquela da parte mais baixa do recipi- ente de reação. Na referida modalidade, o perfil externo do recipiente de re- ação, particularmente a parte mais baixa, será essencialmente idêntica aos perfis vertical e horizontal do canal. A parte superior do recipiente de reação (isto é, em direção da extremidade de topo) pode ser dotada de quase qual- quer formato dependendo do uso pretendido. Por exemplo, o recipiente de reação pode ser dotado de uma maior largura ou diâmetro na parte superior para facilitar introdução da amostra e pode incluir uma tampa para vedar o recipiente de reação após introdução da amostra para ser submetida a PCR por convecção térmica. Em uma modalidade do recipiente de reação adequado, e com referência de novo à figura 7A-D, o perfil externo do recipiente de reação pode ser idêntico aos perfis do canal 70 até a extremidade de topo 71 do canal 70. O formato ou perfil de dentro do recipiente de reação pode ser do- tado de um formato diferente a partir daquele de fora do recipiente de reação (se a espessura da parede do recipiente de reação for produzida para vari- ar). Por exemplo, o perfil externo da seção horizontal pode ser circular en- 5 quanto o perfil interno é elipsoide, ou vice versa.

Diferentes combinações de perfis externo e interno são possíveis desde que o perfil externo seja ade- quadamente selecionado proporcionar contato térmico adequado com as fontes de calor, e o perfil interno seja adequadamente selecionado para um padrão de convecção térmica pretendido.

Em modalidades típicas, entretan- to, o recipiente de reação tem uma espessura de parede que é relativamente constante ou não varia muito, isto é, o perfil interno é tipicamente idêntico ou similar a o perfil externo do recipiente de reação.

Espessuras de paredes típicas variam entre a partir de cerca de 0,1 mm a cerca de 0,5 mm, mais preferivelmente entre a partir de cerca de 0,2 mm a cerca de 0,4 mm, embo- ra a mesma possa variar dependendo do material usado.

Se desejado, o perfil vertical do recipiente de reação pode tam- bém ser formado para formar um tubo linear ou afunilado para se encaixar com o canal como mostrado nas figuras 7A-D.

Quando afunilado, o recipien- te de reação pode ser afunilado seja a partir do topo para o fundo ou a partir do fundo para o topo, embora um recipiente de reação que seja (linearmen- te) afunilado a partir do topo para o fundo seja em geral preferido como no caso do canal.

O ângulo de inclinação típico θ do recipiente de reação está na faixa entre a partir de cerca de 0° a cerca de 1 5°, mais preferivelmente a partir de cerca de 2o a cerca de 10°. A extremidade de fundo do recipiente de reação pode também ser produzida plana, arredondada, ou curvada como para a extremidade de fundo do canal ilustrado nas figuras 7A-D.

Quando a extremidade de fundo é arredondada ou curvada, a mesma pode ser dotada de um formato côncavo ou convexo com o seu raio de curvatura igual a ou maior do que o raio ou metade da largura do perfil horizontal da extremidade de fundo.

Uma extre- midade de fundo plana ou quase plana é mais preferida em relação a outros formatos uma vez que pode proporcionar uma maior transferência de calor de modo a facilitar o processo de desnaturação.

Nas referidas modalidades preferidas, a extremidade de fundo plana ou quase plana tem um raio de curvatura que é pelo menos duas vezes maior do que o raio ou metade da largura do perfil horizontal da extremidade de fundo. 5 Também se desejado, o perfil horizontal do recipiente de reação pode também ser produzido em vários formatos diferentes embora um for- mato tendo determinadas simetrias seja em geral preferido.

As figuras 8A-J mostram alguns exemplos do perfil horizontal do canal tendo determinadas simetrias.

Um recipiente de reação aceitável pode ser produzido para se adaptar aos referidos formatos.

Por exemplo, o recipiente de reação pode ser dotado de seu formato horizontal que é circular (topo, esquerdo), qua- drado (meio, esquerdo), ou quadrado arredondado (fundo, esquerdo) em geral o mesmo que aquele mostrado para o canal 70 nas figuras 8A, D, G, e J.

Assim, o recipiente de reação pode ser dotado de um formato horizontal que tem sua largura maior do que seu comprimento (ou vice versa), por exemplo, um formato elipsoide (topo, meio), retangular (meio, meio), ou ar- redondada retangular (fundo, meio) que é em geral o mesmo que aquele ilustrado na coluna do meio das figuras 8B, E, e H para o canal 70. O referi- do tipo de formato horizontal para o recipiente de reação é útil quando incor- pora um padrão de fluxo de convecção com sentido ascendente em um lado (por exemplo, no lado esquerdo) e com sentido descendente no lado oposto (por exemplo, no lado direito). Em virtude do perfil de largura relativamente maior incorporado em comparação ao comprimento, a interferência entre os fluxos de convecção ascendente e descendente pode ser reduzida, condu- zindo a fluxo de circulação mais suave.

O recipiente de reação pode ser do- tado de um formato horizontal que tem um de seus lados mais estreito do que o lado oposto.

Alguns exemplos são mostrados na coluna da direita das figuras 8A-J para o formato do canal.

Em particular, o recipiente de reação pode ser produzido de modo que o lado esquerdo do recipiente de reação é mais estreito do que o lado direito, por exemplo, como mostrado nas figuras 8C, F e I para o canal 70. O referido tipo de formato horizontal é também útil quando incorpora um padrão de fluxo de convecção com sentido ascendente em um lado (por exemplo, no lado esquerdo) e com sentido descendente no lado oposto (por exemplo, no lado direito). Adicionalmente, quando o referido tipo de formato é incorporado, a velocidade do fluxo descendente (por exemplo, no lado direito) pode ser controlada (tipicamente reduzida) com 5 relação ao fluxo ascendente.

Uma vez que o fluxo de convecção deve ser contínuo dentro do meio contínuo da amostra, a velocidade do fluxo deve ser reduzida quando a área de seção transversal se torna maior (ou vice versa). Esta característica é particularmente importante com relação a aumentar a eficiência da polimerização.

A etapa de polimerização tipicamente ocorre durante o fluxo descendente (isto é, após a etapa de recozimento), e portan- to, o período de tempo para a etapa de polimerização pode ser alongado ao fazer o fluxo descendente mais baixo em comparação àquele do fluxo as- cendente, conduzindo a amplificação de PCR mais eficiente.

Adicionalmente exemplos de recipientes de reação adequados são proporcionados nas figuras 40A-D.

Como mostrado, o recipiente de rea- ção 90 inclui uma extremidade de topo 91 e uma extremidade de fundo 92 cujas extremidades incluem pontos centrais que definem um eixo central de recipiente de reação 95. O recipiente de reação 90 é adicionalmente definido por uma parede externa 93 e uma parede interna 94 que circundam a região para conter a mistura de reação de PCR.

Nas figuras 40A-B, o recipiente de reação 90 é afunilado a partir da extremidade de topo 91 para a extremidade de fundo 92. Um ângulo de inclinação em geral útil (θ ) está na faixa entre a partir de cerca de 0° a cerca de 15°, preferivelmen te a partir de cerca de 2 o a cerca de 10°. Na modalidade mostrada na figura 40 A, o recipiente de rea- ção 90 tem extremidade de fundo plana ou quase plana 92 enquanto no exemplo mostrado na figura 40B, a extremidade de fundo é curvada ou arre- dondada.

As extremidades de topo 71 e de fundo 72 do canal são marcadas nas figuras 40A-D.

As figuras 40C-D proporcionam exemplos de recipientes de rea- ção adequados com paredes retilíneas a partir da extremidade de topo 91 para a extremidade de fundo 92. O recipiente de reação 90 mostrado na fi- gura 40C tem extremidade de fundo plana ou quase plana 92 enquanto no exemplo mostrado na figura 40D, a extremidade de fundo é curvada ou arre- dondada.

Preferivelmente, a proporção de aspecto vertical da parede ex- terna 93 do recipiente de reação 90 mostrado nas figuras 40A-D é pelo me- 5 nos de cerca de 4 a cerca de 15, preferivelmente a partir de cerca de 5 a cerca de 10. A proporção de aspecto horizontal do recipiente de reação é definida pela proporção da altura (h) para a largura (w1) até a posição cor- respondendo para a extremidade de topo 71 do canal 70 como no caso do canal.

A proporção de aspecto horizontal da parede externa 93 é tipicamente cerca de 1 a cerca de 4. A proporção de aspecto horizontal é definida pela proporção da primeira largura (w1) para a segunda largura (w2) do recipiente de reação ao longo das primeira e segunda direções, respectivamente, que são mutuamente perpendiculares uma a outra e alinhadas perpendiculares ao eixo de canal.

Preferivelmente, a altura do recipiente de reação 90 ao longo do eixo de recipiente de reação 95 é pelo menos entre cerca de 6 mm a cerca de 35 mm.

Na referida modalidade, a média da largura da parede externa é entre cerca de 1 mm a cerca de 5 mm, e aquela da parede interna do recipiente de reação é entre cerca de 0,5 mm a cerca de 4,5 mm.

As figuras 41A-J mostram vistas horizontais transversais seccio- nadas de recipientes de reação adequados para uso com a presente inven- ção.

A presente invenção é compatível com outras configurações do recipi- ente de reação desde que os resultados pretendidos sejam alcançados.

As- sim sendo, o formato horizontal de um recipiente de reação aceitável pode ser um ou uma combinação de formato de círculo, semi-círculo, losango, quadrado, quadrado arredondado, elipsoide, romboide, retangular, arredon- dada retangular, oval, triangular, arredondada triangular, trapezoide, trape- zoide arredondado ou oblongado.

Em muitas modalidades, a parede interna é disposta essencialmente simetricamente com relação ao eixo de recipiente de reação.

Por exemplo, a espessura da parede do recipiente de reação po- de ser entre cerca de 0,1 mm a cerca de 0,5 mm.

Preferivelmente, a espes- sura da parede do recipiente de reação é essencialmente inalterada ao lon- go do eixo de recipiente de reação 95.

Em uma modalidade do recipiente de reação 90, a parede inter- na 94 é disposta descentralizada com relação ao eixo de recipiente de rea- ção 95. Por exemplo, a espessura da parede do recipiente de reação é entre cerca de 0,1 mm a cerca de 1 mm.

Preferivelmente, a espessura da parede 5 do recipiente de reação é mais delgada em um lado do que o outro lado por pelo menos de cerca de 0,05 ou 0,1 mm.

Como discutido, a extremidade de fundo do recipiente de reação adequado pode ser plana, curvada ou arredondada.

Em uma modalidade, a extremidade de fundo é disposta essencialmente simetricamente com rela- ção ao eixo de recipiente de reação.

Em outra modalidade, a extremidade de fundo é disposta assimetricamente com relação ao eixo de recipiente de re- ação.

A extremidade de fundo pode ser fechada e pode incluir ou consistir de um plástico, cerâmica ou um vidro.

Para algumas reações, o recipiente de reação pode adicionalmente incluir uma polimerase de DNA imobilizada.

Quase qualquer recipiente de reação descrito aqui pode incluir uma tampa em contato de vedação com o recipiente de reação.

Em modalidades onde um recipiente de reação é usado com a centrífuga de PCR de convecção térmica da presente invenção, forças rela- tivamente grandes serão geradas por rotação da centrífuga.

Preferivelmente, o canal e o recipiente de reação terão um menor diâmetro ou largura assim tendo um grande perfil vertical que pode ser usado.

O diâmetro ou a largura do canal e a parede externa do recipiente de reação é pelo menos de cerca de 0,4 mm a até cerca de 4 a 5 mm, e aquela da parede interna do recipien- te de reação é pelo menos de cerca de 0,1 mm a até cerca de 3,5 a 4,5 mm.

Aparelho de PCR por convecção Compreendendo Uma unidade de detecção ótica É um objetivo da presente invenção proporcionar "detecção óti- ca" como uma característica adicional das modalidades do aparelho descrito aqui.

É importante se detectar o progresso ou os resultados da reação de cadeia de polimerase (PCR) durante ou após a reação de PCR com veloci- dade e precisão.

A característica de detecção ótica pode ser útil para as re- feridas necessidades por proporcionar aparelhos e métodos para amplifica-

ção e detecção simultânea de uma reação de PCR.

Em modalidades típicas, uma sonda detectável que pode gerar um sinal ótico como uma função da quantidade do produto de PCR amplifi- cado é introduzida na amostra, e o sinal ótico a partir da sonda detectável é 5 monitorado ou detectado durante ou após a reação de PCR sem abrir o reci- piente de reação.

A sonda detectável é tipicamente um agente de ligação de DNA detectável que muda sua propriedade ótica dependendo de sua ligação ou não ligação a moléculas de DNA ou interação com a reação de PCR e/ou um produto de PCR.

Exemplos úteis da sonda detectável incluem, mas não são limitados a, corantes intercalados tendo uma propriedade de ligação a DNA de dupla fita e várias sondas de oligonucleotídeo tendo marcação(ões) detectável(veis). A sonda detectável que pode ser usada com a presente inven- ção tipicamente muda sua propriedade de fluorescência tal como sua inten- sidade de fluorescência , comprimento de onda ou polarização, dependendo da amplificação de PCR.

Por exemplo, corantes intercalados tal como SYBR verde 1, YO-PRO 1, brometo de etidínio, e corantes similares geram sinal de fluorescência que é aumentado ou ativado quando o corante se liga a um DNA de dupla fita.

Assim, o sinal de fluorescência a partir dos referidos co- rantes intercalados pode ser detectado para monitorar a quantidade do pro- duto de PCR amplificado.

A detecção usando o corante intercalado não é específico com relação à sequência do DNA de dupla fita.

Várias sondas de oligonucleotídeo que podem ser usadas com a presente invenção são co- nhecidas no campo.

As referidas sondas de oligonucleotídeo tipicamente têm pelo menos uma marcação detectável e a sequência de ácido nucleico que pode especificamente hibridizar ao produto de PCR amplificado ou a matriz.

Assim, detecção específica de sequência do produto de PCR amplifi- cado, incluindo discriminação alélica, é possível.

As sondas de oligonucleo- tídeo são tipicamente marcadas com um par de marcação interativa tal como um par de dois fluoróforos ou um par da fluoróforo e um arrefecedor cuja interação (tal como "transferência de energia ressonante fluorescente" ou "transferência de energia não fluorescente") é aumentada na medida em que a distância entre as duas marcações se torna mais curta.

A maioria das son- das de oligonucleotídeo é projetada de modo que a distância entre as duas marcações interativas é modulada dependendo de sua ligação (tipicamente a mais longa distância) ou não ligação (tipicamente a mais curta distância) 5 para a sequência de DNA-alvo.

A referida modulação de distância depen- dente de hibridização resulta em mudança da intensidade de fluorescência ou mudança (aumento ou redução) do comprimento de onda de fluorescên- cia dependendo da quantidade do produto de PCR amplificado.

Em outros tipos de sondas de oligonucleotídeo, as sondas são projetadas para sofre- rem determinadas reações químicas durante a etapa de extensão de uma reação de PCR, tal como hidrólise da marcação de fluoróforo em virtude da atividade de 5’-3’ nuclease da polimerase de DNA ou extensão da sequência de sonda.

As referidas mudanças dependentes de reação de PCR das son- das levam a ativação ou aumento do sinal de fluorescência a partir do fluoró- foro de modo a sinalizar a mudança da quantidade do produto de PCR.

Uma variedade de sondas e dispositivos detectáveis adequados para detectar as referidas sondas são descrito nas patentes US a seguir Nos. 5,210,015; 5,487,972; 5,538,838; 5,716,784; 5,804,375; 5,925,517; 5,994,056; 5,475,610; 5,602,756; 6,028,190; 6,030,787; 6,103,476; 6,150,097; 6,171,785; 6,174,670; 6,258,569; 6,326,145; 6,365,729; 6,703,236; 6,814,934; 7,238,517, 7,504,241; 7,537,377; assim como nos pedidos de contrapartes não US e patentes.

Como usado aqui, a frase "unidade de detecção ótica" incluindo a forma plural significa dispositivo(s) para detectar amplificação de PCR que é compatível com um ou mais dos aparelhos de PCR convecção térmica e métodos de PCR descritos aqui.

A unidade de detecção ótica preferida é configurada para detectar um sinal de fluorescência ótica tal como quando a amplificação de reação de PCR está em progresso.

Tipicamente, o dispositi- vo proporcionará a detecção do sinal e preferivelmente a quantificação do mesmo sem abrir pelo menos um recipiente de reação do aparelho ao qual o mesmo está fixado de modo operacional.

Se desejado, a unidade de detec- ção ótica e um ou mais dos aparelhos de PCR convecção térmica da pre-

sente invenção podem ser configurados para relacionar a quantidade de áci- do nucleico amplificado no recipiente de reação (isto é, amplificação de PCR em tempo real ou quantitativa). Uma típica unidade de detecção ótica para uso com a presente invenção inclui um ou mais dos componentes a seguir 5 em uma combinação operável: uma fonte de luz apropriada(s), lentes, filtros, espelhos, e divisor(es) de feixe(s) para detectar fluorescência tipicamente na região do visível entre a partir de cerca de 400 a cerca de 750 nm.

A unidade de detecção ótica preferida é posicionada abaixo de, acima de e/ou para o lado de um recipiente de reação suficiente para receber e a luz emitida para detectar amplificação de PCR dentro do recipiente de reação.

Uma unidade de detecção ótica é compatível com um aparelho de PCR por convecção térmica da presente invenção se a mesma suporta detecção da amplificação de PCR robusta, sensível e rápida para a qual aparelho é pretendido.

Em uma modalidade, um aparelho de PCR por con- vecção térmica inclui uma unidade de detecção ótica que permite a detecção de uma propriedade ótica da amostra no recipiente de reação.

A propriedade ótica a ser detectada é preferivelmente fluorescência em um ou mais com- primentos de onda dependendo da sonda detectável usada, embora absor- ção da amostra seja algumas vezes útil se detectar.

Quando fluorescência a partir da amostra é detectada, a unidade de detecção ótica irradia a amostra (ou uma porção de, ou toda a amostra) com uma luz de excitação e detecta um sinal de fluorescência a partir da amostra.

O comprimento de onda da luz de excitação é tipicamente mais curto do que a luz de fluorescência.

No caso de detectar absorção, a unidade de detecção ótica irradia a amostra com a luz (tipicamente em um comprimento de onda selecionado ou com leitura do comprimento de onda) e a intensidade da luz antes e após passar através da amostra é medida.

A detecção da fluorescência é em geral preferida pelo fato de ser mais sensível e específica para a molécula-alvo a ser detectada.

Referência às figuras a seguir e descrições pretende proporcio- nar maior entendimento de um aparelho de PCR por convecção térmica compreendendo uma unidade de detecção ótica para detecção de fluores- cência.

Com referência às figuras 59A-B, as modalidades do aparelho caracterizam uma ou mais unidades de detecção ótica 600-603 operáveis para detectar um sinal de fluorescência a partir da amostra no recipiente de 5 reação 90 a partir da extremidade de fundo 92 do recipiente de reação 90 ou da extremidade de fundo 72 do canal 70. Mostrada na figura 59A é uma mo- dalidade na qual uma única unidade de detecção ótica 600 é usada para detectar fluorescência a partir de múltiplos recipientes de reação 90. Na refe- rida modalidade, um feixe de excitação ampla (mostrado como setas ascen- dentes) é gerado para irradiar múltiplos recipientes de reação e um sinal de fluorescência (mostrado como setas descendentes) a partir de múltiplos re- cipientes de reação 90 é detectado.

Na referida modalidade, um detector 650 (vide a figura 62, por exemplo) para ser usado para a detecção da fluo- rescência é preferivelmente um que tem uma capacidade de imageamento de modo que o sinal de fluorescência a partir de diferentes recipientes de reação pode ser distinguido a partir da imagem de fluorescência.

Alternati- vamente, múltiplos detectores 650 cada um dos quais detecta o sinal de fluo- rescência a partir de cada recipiente de reação podem ser incorporados.

Na modalidade mostrada na figura 59B, múltiplas unidades de detecção ótica 601-603 são incorporadas.

Na referida modalidade, cada uni- dade de detecção ótica irradia a amostra em cada recipiente de reação 90 com uma luz de excitação e detecta um sinal de fluorescência a partir de cada amostra.

A referida modalidade é vantajosa em controlar o perfil de um feixe de excitação para cada recipiente de reação mais precisamente e tam- bém medir um sinal de fluorescência diferente a partir de diferentes recipien- tes de reação independentemente e simultaneamente.

O referido tipo de modalidade é também vantajoso na construção de aparelhos miniaturizados uma vez que elementos óticos maiores e trajetos óticos maiores necessários para gerar um feixe de excitação ampla na modalidade de detecção ótica de uma única unidade podem ser evitados.

Mais uma vez com referência às figuras 59A-B, quando a unida- de de detecção ótica 600-603 é localizada na extremidade de fundo 92 do recipiente de reação 90, a primeira fonte de calor 20 compreende uma porta ótica 610 para cada canal 70 proporcionando um trajeto para uma luz de excitação e de emissão para o recipiente de reação 70. A porta ótica 610 pode ser um orifício perfurado ou um elemento ótico produzido (parcialmente 5 ou inteiramente) de um material oticamente transparente ou semitransparen- te tal como vidro, quartzo ou materiais poliméricos tendo a referida proprie- dade ótica.

Se a porta ótica 610 é produzida como um orifício perfurado, o diâmetro ou a largura da porta ótica é tipicamente menor do que aquele da extremidade de fundo 72 do canal 70 ou da extremidade de fundo 92 do re- cipiente de reação 90. Nas modalidades mostradas nas figuras 59A-B, a ex- tremidade de fundo 92 do recipiente de reação 90 também funciona como uma porta ótica.

Portanto, é em geral desejável se ter todas ou pelo menos a extremidade de fundo 92 do recipiente de reação 90 produzida de um mate- rial oticamente transparente ou semitransparente.

Voltando agora às figuras 60A-B, as modalidades do aparelho caracterizam uma única unidade de detecção ótica 600 (Figura 60A) ou múl- tiplas unidades de detecção ótica 601-603 (Figura 60B) que são localizados acima da extremidade de topo 91 do recipiente de reação 90. Mais uma vez, quando uma única unidade de detecção ótica 600 é incorporada (Figura 60A), um feixe de excitação ampla (mostrado como setas descendentes) é gerado para irradiar os múltiplos recipientes de reação e um sinal de fluores- cência (mostrado como setas ascendentes) a partir dos múltiplos recipientes de reação 90 é detectado.

Quando múltiplas unidades de detecção ótica 601-603 (Figura 60B) são incorporadas, cada unidade de detecção ótica ir- radia a amostra em cada recipiente de reação 90 com uma luz de excitação e detecta um sinal de fluorescência a partir de cada amostra.

Nas modalidades mostradas nas figuras 60A-B, uma parte cen- tral de um tampa do recipiente de reação (não mostrada) que tipicamente se encaixa na extremidade de topo (abertura) 91 do recipiente de reação 90 funciona como uma porta ótica para uma luz de excitação e de emissão.

Por- tanto, toda ou pelo menos a parte central da tampa do recipiente de reação é produzida de um material oticamente transparente ou semitransparente.

A figura 61 mostra uma modalidade do aparelho que caracteriza unidades de detecção ótica 600 que são localizadas no lado do recipiente de reação 90. Na referida modalidade particular, a porta ótica 610 é formada no lado da segunda fonte de calor 30 (mostrada caixas retangulares cinza) e o 5 lado do primeiro elemento isolante 50 (mostrado como linhas pontilhadas). Alternativamente, a porta ótica 610 pode ser formada qualquer um ou mais das primeira 20 e segunda 30 fontes de calor, e o primeiro elemento isolante 50 dependendo da posição da detecção da fluorescência como necessária para os fins de aplicação particulares.

Na referida modalidade, a parte lateral do recipiente de reação 90 e uma porção da primeira câmara 100 ao longo do trajeto de luz também funcionam como porta ótica, e assim todas ou pelo menos as partes do recipiente de reação 90 e a primeira câmara 100 são produzidos de um material oticamente transparente ou semitransparente.

Quando a unidade de detecção ótica 600 é localizada na lateral do recipiente de reação 90, os canais 90 são tipicamente formados em uma ou duas es- truturas que são arranjadas de modo linear ou circular.

O referido arranjo dos canais 70 permite detectar um sinal de fluorescência a partir de cada canal 70 ou recipiente de reação 90 sem interferência por outros canais.

Nas modalidades descritas acima, ambas a excitação e a detec- ção da fluorescência são realizadas a partir do mesmo lado com relação ao recipiente de reação 90, e assim não só uma parte de excitação mas tam- bém uma parte detecção da fluorescência são localizadas no mesmo lado, tipicamente dentro do mesmo compartimento de uma unidade de detecção ótica 600-603. Por exemplo, nas modalidades mostradas nas figuras 59A-B, a unidade de detecção ótica 600-603 que contém ambas as partes é locali- zada na extremidade de fundo 92 do recipiente de reação 90. De modo simi- lar, toda a unidade de detecção ótica é localizada acima da extremidade de topo 91 do recipiente de reação 90 nas modalidades mostradas nas figuras 60A-B, e na parte lateral do recipiente de reação 90 na modalidade mostrada na figura 61. Alternativamente, a unidade de detecção ótica 600-603 pode ser modificada de modo que a parte de excitação e a parte de detecção da fluorescência são localizadas separadamente.

Por exemplo, a parte de exci-

tação é localizada no fundo (ou topo) do recipiente de reação 90 e a parte de detecção da fluorescência é localizada em cima (fundo) ou parte lateral do recipiente de reação 90. Em outras modalidades, a parte de excitação pode ser localizada em um lado (por exemplo, lado esquerdo) do recipiente de 5 reação 90 e a parte de detecção da fluorescência pode ser localizada no outro lado (por exemplo, lado de topo, fundo, direito, dianteiro ou traseiro; ou a parte lateral diferente do lado de excitação). A unidade de detecção ótica 600-603 tipicamente compreende uma parte de excitação que gera uma luz de excitação com um comprimento de onda selecionado e uma parte de detecção da fluorescência que detecta um sinal de fluorescência a partir da amostra no recipiente de reação 90. A parte de excitação tipicamente compreende uma combinação de fontes de luz, elementos de seleção de comprimento de onda, e/ou elementos de for- mação de feixe.

Exemplos da fonte de luz incluem, mas não são limitados a, lâmpadas de arco tal como lâmpadas de arco de mercúrio, lâmpadas de ar- co de xenônio, e lâmpadas de arco de haleto de metal, lasers, e diodos emissores de luz (LED). As lâmpadas de arco tipicamente geram múltiplos faixas ou faixas amplas de luz, e os lasers e LEDs tipicamente geram uma luz monocromática ou uma luz de faixa estreita.

O elemento de seleção de comprimento de onda é usado para selecionar um comprimento de onda de excitação a partir da luz gerada pela fonte de luz.

Exemplos do elemento de seleção de comprimento de onda inclui uma grade ou um prisma (para dis- persar a luz) combinado com uma fenda ou uma abertura (para selecionar um comprimento de onda), e um filtro ótico (para transmitir um comprimento de onda selecionado). O filtro ótico é em geral preferido pelo fato de que o mesmo pode efetivamente selecionar o comprimento de onda com tamanho compacto e o mesmo é relativamente econômico.

Um filtro ótico preferido é um filtro de interferência tendo um revestimento de filtro delgado que pode transmitir determinadas bandas de luz (filtro de passagem de banda) ou luz tendo comprimento de onda mais longo (filtro de passagem longa) ou mais curto (filtro de passagem curta) do que determinadas válvulas de corte.

Fil- tros óticos acústicos e filtros sintonizáveis de cristal líquido podem ser um excelente elemento de seleção de comprimento de onda uma vez que os referidos tipos de filtros podem ser eletronicamente controlados para mudar a transmissão do comprimento de onda com velocidade e precisão em ta- manho compacto embora relativamente oneroso.

Um filtro de vidro colorido 5 pode também ser usado como um elemento de seleção de comprimento de onda como uma substituição econômica de, ou em combinação com outros tipos do elemento de seleção de comprimento de onda para aumentar rejei- ção de luz indesejada (por exemplo, IR, UV, ou outra luz desgarrada). A es- colha de o filtro ótico depende das características da luz gerada pela fonte de luz e o comprimento de onda da luz de excitação assim como de outra necessidade geométrica do aparelho tal como o tamanho.

O elemento de formação de feixe é usado para formar e guiar um feixe de excitação.

O elemento de formação de feixe pode ser qualquer um ou combinação de len- tes (convexa ou côncava), espelhos (convexa, côncava, ou elíptico), e pris- mas.

A parte de detecção da fluorescência tipicamente compreende a combinação de detectores, elementos de seleção de comprimento de onda, e/ou elementos de formação de feixe.

Exemplos do detector incluem, mas não são limitados a, tubos fotomultiplicadores (PMT), fotodiodos, dispositivos acoplados a carga (CCD), e câmera de vídeo.

Os tubos fotomultiplicadores são tipicamente em sua maioria sensíveis.

Portanto, quando a sensibilidade é o item chave em virtude de um sinal de fluorescência muito fraco, o tubo fotomultiplicador pode ser uma escolha adequada.

Entretanto, os tubos fo- tomultiplicadores não são adequados se um tamanho compacto ou uma ca- pacidade de imageamento for necessário (em virtude de seu tamanho gran- de). CCDs, fotodiodos de silicone, ou câmeras de vídeo intensificadas com, por exemplo, uma placa de microcanal podem ser dotadas de sensibilidade similar aos tubos fotomultiplicadores.

Se o imageamento do sinal de fluores- cência não é necessário e miniaturização é importante como nas modalida- des tendo uma unidade de detecção ótica para cada recipiente de reação, fotodiodos ou CCDs com ou sem um intensificador podem ser uma boa es- colha uma vez que os referidos elementos são compactos e relativamente econômicos. Se imageamento for necessário como nas modalidades tendo uma única unidade de detecção ótica para múltiplos recipientes de reação, estruturas CCD, estruturas de fotodiodo, ou câmeras de vídeo (também com ou sem um intensificador) podem ser incorporados. Similar à parte de exci- 5 tação, o elemento de seleção de comprimento de onda é usado para seleci- onar uma emissão de comprimento de onda a partir da luz coletada a partir da amostra e o elemento de formação de feixe é usado para formar e guiar a luz de emissão para detecção eficiente. Exemplos do elemento de seleção de comprimento de onda e o elemento de formação de feixe são os mesmos que os descritos para a parte de excitação. Além dos elementos óticos descritos acima, a unidade de detec- ção ótica pode compreender um divisor de feixe. O divisor de feixe é particu- larmente útil se a parte de excitação e a parte de detecção da fluorescência forem localizadas no mesmo lado com relação ao recipiente de reação 90. Nas referidas modalidades, os trajetos dos feixes de excitação e de emissão (ao longo de direções opostas) coincidem um com o outro e assim se torna necessário se separar os trajetos dos feixes usando um divisor de feixe. Di- visores de feixe tipicamente úteis são divisores de feixe dicroicos ou espe- lhos dicroicos que têm um revestimento de interferência de película delgada aos filtros óticos de película delgada. Típicos divisores de feixe refletem a luz de excitação e transmitem a luz de fluorescência (um tipo de longa passa- gem), ou vice versa (um tipo de curta passagem). Com referência agora às figuras 62-63, 64A-B, e 65, poucos exemplos de configuração de estrutura de uma unidade de detecção ótica 600 são descritos. Na figura 62, uma modalidade de uma unidade de detecção óti- ca 600 é ilustrada. Na referida modalidade, elementos óticos de excitação (620, 630, e 640) são localizados ao longo da direção em um ângulo reto com relação ao eixo de canal 80, e os elementos óticos de detecção de fluo- rescência (650, 655, 660, e 670) são localizados ao longo do eixo de canal

80. Um divisor de feixe dicroico 680 que transmite a emissão de fluorescên- cia e reflete a luz de excitação (isto é, um tipo de longa passagem) é locali-

zado em torno do meio.

Como é típico, a luz gerada pela fonte de luz 620 é coletada por uma lente de excitação 630 e filtrada com um filtro de excitação 640 para selecionar uma luz de excitação com um desejado comprimento de onda.

A luz de excitação selecionada é então refletida por um divisor de fei- 5 xe dicroico e irradiada para a amostra.

A emissão de fluorescência a partir da amostra é coletada por uma lente de emissão 660 após passar através do divisor de feixe dicroico 680 e um filtro de emissão 670 para selecionar uma luz de emissão com um desejado comprimento de onda.

A luz de fluo- rescência assim coletada é então focalizada a uma abertura ou fenda 655 ou para um detector 650 para medir o sinal de fluorescência.

A função da aber- tura ou fenda 655 é "filtragem espacial" da emissão.

Tipicamente, a luz de fluorescência é focalizada em ou próximo da abertura ou fenda 655 e assim a imagem de fluorescência a partir de determinados locais (vertical) da amostra é formada na abertura ou fenda 655. O referido arranjo ótico permi- te coletar um sinal de fluorescência eficientemente a partir de determinados locais limitados dentro da amostra (por exemplo, a região de recozimento, de extensão ou de desnaturação) ao mesmo tempo em que se rejeita a luz a partir de outros locais.

Uso da abertura ou fenda 655 é ótimo dependendo do tipo da sonda detectável usada.

Se o sinal de fluorescência é sujeito a ser gerado a partir de uma região específica dentro da amostra, o uso de uma ou mais abertura ou fenda 655 é preferido.

Se o sinal de fluorescência é su- jeito a ser gerado independente do local dentro da amostra, o uso da abertu- ra ou fenda 655 pode não ser necessário ou um tendo uma maior abertura pode ser usado.

Como mostrado na modalidade ilustrada na figura 63, a unidade de detecção ótica 600 pode ser modificada para posicionar os elementos óticos de excitação (620, 630, 640) ao longo do eixo de canal 80 e os ele- mentos óticos de detecção de fluorescência (650, 655, 660, e 670) ao longo da direção em um ângulo reto com relação ao eixo de canal 80. Um divisor de feixe dicroico 680 útil para o referido tipo de modalidade é um tipo de cur- ta passagem que transmite a luz de excitação e reflete a luz de emissão.

A lente de excitação 630 usada nas modalidades mostradas nas figuras 62-63 pode ser substituída com uma combinação de mais do que uma lente ou uma combinação de lentes e espelhos.

Quando uma combina- ção dos referidos elementos óticos é usada, a primeira lente (tipicamente a lente convexa) é preferivelmente localizada próxima a e em frente da fonte 5 de luz de modo a coletar a luz de excitação eficientemente.

De modo a adi- cionalmente aumentar a eficiência da coleta da luz de excitação, um espelho (tipicamente côncavo ou elíptico) pode ser disposto no lado de trás da fonte de luz.

Quando é necessário se fazer um grande feixe de excitação como nas modalidades tendo uma única unidade de detecção ótica 600 para irra- diar múltiplos recipientes de reação 90, uma lente côncava ou um espelho convexo pode ser usado adicionalmente para expandir um feixe de excita- ção.

Em algumas modalidades, um ou mais dos elementos óticos (por exemplo, um ou mais de lentes ou espelhos) pode ser disposto em outros locais, por exemplo, entre o recipiente de reação 90 e o divisor de feixe di- croico 680 ou um filtro de excitação 640. Em outro aspecto, a luz de excita- ção é tipicamente formada a um feixe essencialmente colinear de modo a irradiar um maior volume da(s) amostra(s). Em algumas aplicações especiais tal como quando usando um esquema de excitação de múltiplos fótons, a luz de excitação pode ser estritamente focalizada para determinadas posições dentro da amostra.

A lente de emissão 660 usada nas modalidades mostradas nas figuras 62-63 pode também ser substituída com uma combinação de mais do que uma lente ou uma combinação de lentes e espelhos.

Quando uma com- binação dos referidos elementos óticos é usada, a primeira lente (tipicamen- te a lente convexa) é preferivelmente localizada próxima ao recipiente de reação 90 (por exemplo, entre o recipiente de reação 90 e o divisor de feixe dicroico 680 ou o filtro de emissão 670) de modo a coletar a luz de fluores- cência mais eficientemente.

Em algumas modalidades, um ou mais dos ele- mentos óticos (por exemplo, uma lente ou um espelho) pode ser disposto em outros locais, por exemplo, entre o recipiente de reação 90 e o divisor de feixe dicroico 680 ou o filtro de emissão 670. As figuras 64A-B mostram modalidades nas quais uma lente 635 é usada para formar não só um feixe de excitação, mas também um feixe de emissão.

Dois exemplos de arranjar os elementos óticos de excitação (620 e 640) e os elementos óticos de detecção de fluorescência (650, 655, e 670) são mostrados.

Os elementos óticos de excitação (620 e 640) são localiza- 5 dos ao longo da direção em um ângulo reto com relação ao eixo de canal 80 na figura 64A e ao longo do eixo de canal 80 na figura 64B.

O referido tipo de modalidades usando uma única lente é útil em miniaturizar a unidade de detecção ótica 600 tal como nas modalidades de incorporar múltiplas unida- des de detecção ótica mostradas nas figuras 59B, 60B e 61. A figura 65 mostra uma modalidade do aparelho na qual a uni- dade de detecção ótica 600 é localizada no lado de cima do recipiente de reação 90. O arranjo dos elementos óticos ilustrados é o mesmo da modali- dade mostrada na figura 62. Outros tipos de arranjos óticos (por exemplo, os mostrados nas figuras 63 e 64A-B) podem também ser incorporados.

Quan- do a unidade de detecção ótica 600 (ou a parte de excitação ou a parte de detecção de fluorescência) é localizada no lado de cima do recipiente de reação 90, a parte central da tampa do recipiente de reação 690 funciona como uma porta ótica 610. Portanto, como discutido, a tampa do recipiente de reação 690 ou pelo menos a parte central é preferivelmente produzida de um material oticamente transparente ou semitransparente no referido tipo de modalidades.

Mais uma vez com referência à figura 65, o recipiente de reação 90 e a tampa do recipiente de reação 690 tipicamente têm uma relação de vedação uma com a outra de modo a evitar uma perda de evaporação da amostra durante uma reação de PCR.

Na modalidade do recipiente de rea- ção mostrado na figura 65, a relação de vedação é produzida entre uma pa- rede interna do recipiente de reação 90 e uma parede externa da tampa do recipiente de reação 690. Alternativamente, a relação de vedação pode ser produzida entre uma parede externa do recipiente de reação 90 e uma pare- de interna da tampa do recipiente de reação 690 ou entre uma superfície de topo do recipiente de reação 90 e uma superfície de fundo da tampa do reci- piente de reação 690. Em algumas modalidades, a tampa do recipiente de reação 690 pode ser uma fita adesiva de filme delgado que é oticamente transparente ou semitransparente.

Nas referidas modalidades, a relação de vedação é produzida entre uma superfície de topo do recipiente de reação 90 e uma superfície de fundo da tampa do recipiente de reação 690. 5 As modalidades de recipiente de reação descritas acima de po- dem não ser ótimas para todos os usos da presente invenção.

Por exemplo, e como mostrado na figura 65, é típico que o menisco de amostra (isto é, uma interface de água-ar) é formado entre a amostra e a tampa do recipien- te de reação 690 (ou uma parte de porta ótica da tampa do recipiente de re- ação 690). Em operação, água na amostra evapora e condensa na superfí- cie interna da tampa do recipiente de reação 690 (ou uma parte de porta óti- ca da tampa do recipiente de reação 690) em virtude da reação de PCR que envolve um processo de alta temperatura.

A referida água condensada po- de, para algumas aplicações, interferir relativamente com um feixe de excita- ção e um feixe de fluorescência, particularmente quando a unidade de de- tecção ótica é posicionada no lado de cima do recipiente de reação 90. As modalidades de recipiente de reação exemplificadas nas figu- ras 66A-B proporcionam outra abordagem.

Como mostrado, um recipiente de reação 90 e um tampa do recipiente de reação 690 são projetados para ter uma porta ótica 695 para entrar em contato com a amostra.

O menisco de amostra é formado mais alto do que, ou em cerca da mesma altura que a superfície de fundo 696 da porta ótica 695. Diferente das modalidades típi- cas de recipiente de reação descritas acima, um feixe de excitação e um feixe de fluorescência são transmitidos diretamente a partir da porta ótica 695 para a amostra ou vice versa sem passar através do ar ou qualquer água condensada dentro do recipiente de reação 90. As necessidades estru- turais para as referidas modalidades são como a seguir: Primeiramente, como mostrado nas figuras 66A-B, a tampa do recipiente de reação 690 tem uma relação de vedação com a parte superior do recipiente de reação 90 e também com a porta ótica 695. Como discutido, a vedação entre o recipiente de reação 90 e a tampa do recipiente de reação 690 pode ser produzida em uma parede interna do recipiente de reação

(como nas figuras 66A-B) ou em uma parede externa ou uma extremidade de topo 91 do recipiente de reação 90. A vedação entre a tampa do recipien- te de reação 690 e a porta ótica 695 pode ser produzida a uma superfície de topo 697 (Figura 66A) ou a parede lateral 699 (Figura 66B) da porta ótica 5 695. Alternativamente a tampa do recipiente de reação 690 e a porta ótica 695 podem ser produzidas como um corpo, preferivelmente usando o mes- mo ou material similar oticamente transparente ou semitransparente. Adicionalmente, o diâmetro ou a largura da porta ótica 695 (e também aquele da parede da tampa do recipiente de reação 690 se a referi- da parede for localizada próxima ou em cerca da mesma altura que a super- fície de fundo 696 da porta ótica 695) é produzida menor do que o diâmetro ou a largura da porção da parede interna do recipiente de reação 90 que é localizado próximo ou em cerca da mesma altura que a superfície de fundo 696 da porta ótica 695. Adicionalmente, a superfície de fundo 696 da porta ótica 695 é localizada mais baixa do que, ou cerca da mesma altura que o fundo da parte interna da tampa do recipiente de reação 690. Quando as referidas necessidades estruturais são alcançadas, um espaço aberto 698 é proporcionado entre a parede interna do recipiente de reação 90 e a parte lateral da porta ótica 695. Portanto, a amostra pode preencher uma porção do espaço aberto para formar o menisco de amostra acima da parte de fun- do 696 da porta ótica 695 quando o recipiente de reação 90 é vedado com a tampa do recipiente de reação 690 ao se fazer o fundo da porta ótica entrar em contato com a amostra. Na figura 67, uso do recipiente de reação oticamente não interfe- rente discutido acima é exemplificado. Como discutido, o fundo 696 da porta ótica 695 entra em contato com a amostra e o menisco de amostra é forma- do acima do fundo 696 da porta ótica 695. Com uma unidade de detecção ótica 600 localizada na extremidade de topo 91 do recipiente de reação 90, um feixe de excitação e um feixe de fluorescência são transmitidos direta- mente a partir da porta ótica 695 para a amostra ou vice versa sem passar através do ar ou qualquer água condensada dentro do recipiente de reação

90. A referida estrutura ótica pode grandemente facilitar a característica de detecção ótica da presente invenção. Os exemplos a seguir são oferecidos apenas com o objetivo de ilustração de modo que a presente invenção possa ser mais completamente entendida. Os referidos exemplos não são pretendidos para limitar de modo 5 algum o âmbito da presente invenção a não ser que de outro modo especifi- camente indicado.

EXEMPLOS Materiais e Métodos Três diferentes polimerases de DNA adquiridas da Takara Bio (Japan), Finnzymes (Finland), e Kapa Biosystems (South Africa) foram usa- das para testar o desempenho da amplificação de PCR de vários aparelhos da presente invenção. DNAs de plasmídeo compreendendo várias sequên- cias de inserção, DNA de genoma humano, e cDNA foram usadas como DNAs matrizes. Os DNAs de plasmídeo foram preparados ao clonar se- quências de inserção com diferente tamanhos em vetor pcDNA3.1. O DNA de genoma humano foi preparado a partir de uma célula de rim de embrião humano (293, ATCC CRL-1573). O cDNA foi preparado por transcrição re- versa dos extratos de mRNA a partir de células HOS ou SV-OV-3. Composição da mistura de PCR foi como a seguir: a matriz DNA com diferente quantidade dependendo dos experimentos, cerca de 0,4 µM de cada um dos iniciadores direto e reverso, cerca de 0,2 mM de cada um de dNTPs, cerca de 0,5 a 1 unidades de polimerase de DNA dependendo de polimerase de DNA usado, cerca de 1,5 mm a 2 mM de MgCl2 misturado em um volume total de 20 µL usando uma solução tampão fornecida por cada fabricante. O recipiente de reação foi produzido de polipropileno e tinha ca- racterísticas estruturais como ilustrado na figura 40A. O recipiente de reação tinha um formato cilíndrico afunilado com sua extremidade de fundo fechada e compreendia uma tampa que se encaixava com o diâmetro interno da ex- tremidade de topo do recipiente de reação de modo a vedar o recipiente de reação após introdução da mistura de PCR. O recipiente de reação foi (line- armente) afunilado a partir do topo para a extremidade de fundo de modo que a parte superior tinha o maior diâmetro.

O ângulo de inclinação como definido na figura 40A foi cerca de 4o.

A extremidade de fundo do recipiente de reação foi produzida plana de modo a facilitar a transferência de calor a partir do orifício receptor na primeira fonte de calor.

O recipiente de reação 5 tinha um comprimento a partir da extremidade de topo para a extremidade de fundo de cerca de 22 mm a cerca de 24 mm, um diâmetro externo na ex- tremidade de fundo de cerca de 1,5 mm, um diâmetro interno na extremida- de de fundo de cerca de 1 mm, e uma espessura de parede de cerca de 0,25 mm a cerca de 0,3 mm.

Volume da mistura de PCR usado para cada reação foi 20 µL.

A mistura de PCR com 20 µL volume produzido a altura de cerca de 12 a 13 mm dentro do recipiente de reação.

Todos os aparelhos usados nos exemplos abaixo foram produzi- dos operáveis com uma energia DC.

Uma bateria de polímero de Li+ recar- regável (12.6 V) ou um fornecimento de energia DC foi usado para operar o aparelho.

Os aparelhos usados nos exemplos tinham 12 (3 x 4), 24 (4 x 6), ou 48 (6 x 8) canais que foram arranjados em um formato de armação com múltiplas fileiras e colunas como exemplificado na figura 30. O espaçamento entre canais adjacentes foi produzido com 9 mm.

Nos experimentos, o reci- piente de reação(s) contendo a amostra de mistura de PCR foi introduzido no canal(s) após as três fontes de calor do aparelho serem aquecidas às temperaturas desejadas.

A amostra de mistura de PCR foi removida a partir do aparelho após um tempo desejado de reação de PCR e analisada com eletroforese de gel de agarose usando brometo de etidínio (EtBr) como um corante fluorescente para visualizar as faixas de DNA amplificado.

Exemplo 1. PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 5A O aparelho usado no referido exemplo tinha a estrutura mostra- da na figura 5A compreendendo um canal 70, uma primeira câmara 100, um orifício receptor 73, um orifício perfurado 71, uma primeira protuberância 33 da segunda fonte de calor 30, e uma primeira protuberância 23 da primeira fonte de calor 20. O comprimento das primeira e segunda fontes de calor ao longo do eixo de canal 80 foram cerca de 4 mm e cerca de 9.5 mm, respecti-

vamente.

O primeiro elemento isolante (ou primeiro espaço isolante) tinha um comprimento ao longo do eixo de canal 80 próximo a região de canal (isto é, dentro da região de protuberância) de cerca de 1,5 mm.

O compri- mento do primeiro elemento isolante ao longo do eixo de canal 80 fora da 5 região de canal (isto é, fora da região de protuberância) foi cerca de 9,5 mm a cerca de 8 mm dependendo da posição.

A primeira câmara 100 foi locali- zada na parte mais baixa da segunda fonte de calor 30 e tinha um formato cilíndrico com um comprimento ao longo do eixo de canal 80 de cerca de 6,5 mm e um diâmetro de cerca de 4 mm.

A profundidade do orifício receptor 73 ao longo do eixo de canal 80 foi cerca de 2,5 mm para os dados apresenta- dos no referido exemplo embora a mesma tenha sido variada entre a partir de cerca de 1,5 mm a cerca de 3 mm.

No referido aparelho, o canal 70 foi definido pelo orifício perfurado 71 na segunda fonte de calor 30 e o orifício receptor 73 na primeira fonte de calor 20. O canal 70 tinha um formato cilín- drico afunilado.

O diâmetro médio do canal foi cerca de 2 mm com o diâme- tro na extremidade de fundo (no orifício receptor) sendo cerca de 1,5 mm.

No referido aparelho, todos os elementos de formação de temperatura inclu- indo a primeira câmara, o orifício receptor, o primeiro elemento isolante, e as protuberâncias foram dispostos simetricamente com relação ao eixo de ca- nal.

Como apresentado abaixo, o aparelho usado no referido exem- plo tendo a estrutura mostrada na figura 5A foi observado ser suficientemen- te eficiente para amplificar a partir da amostra de genoma humano de 10 ng (cerca de 3,000 cópias) em cerca de 25 minutos sem o ângulo de inclinação de gravidade.

Para a amostra de plasmídeo de 1 ng, amplificação de PCR resultou em uma amplificação detectável em tão pouco tempo quanto cerca de 6 ou 8 minutos.

Assim, este é um bom exemplo de demonstração da es- trutura de aquecimento simétrica que pode proporcionar uma eficiente ampli- ficação de PCR sem usar o ângulo de inclinação de gravidade.

Como apre- sentado no exemplo 2, a referida estrutura também funciona melhor (isto é, mais rápida e mais eficiente) quando o ângulo de inclinação de gravidade é introduzido.

Entretanto, um pequeno ângulo de inclinação (cerca de 10° a

20° ou menor) pode ser suficiente para a maioria da s aplicações. 1,1. Amplificação de PCR a partir de Amostras de Plasmídeo As figuras 42A-C mostram resultados de amplificação de PCR obtidos a partir da 1 ng de matriz de DNA de plasmídeo usando as três dife- 5 rentes polimerases de DNA (da Takara Bio, Finnzymes, e Kapa Biosystems, respectivamente) descritas acima.

O tamanho esperado do amplicon foi 349 bp.

Os iniciadores direto e reverso usados foram 5’-GGGAGACCCAAGCTGGCTAGC-3’ (SEQ ID NO: 1) e 5’- CACAGTCGAGGCTGATCAGCGG-3’ (SEQ ID NO: 2), respectivamente.

Nas figuras 42A-C, a linha mais a esquerda mostra o marcador de tamanho de DNA (2-Log DNA Ladder (0,1-10,0 kb) da New England BioLabs) e linhas 1 a 4 são os resultados obtidos com um aparelho de PCR por convecção térmica a um tempo de reação de PCR de 10, 15, 20, e 25 min, respectiva- mente, como denotado no fundo de cada figura.

As temperaturas das primei- ra e segunda fontes de calor do aparelho da presente invenção foram ajus- tadas para 98°C e 62°C, respectivamente.

A profundi dade do orifício recep- tor ao longo do eixo de canal foi cerca de 2,5 mm.

Como mostrado nas figu- ras 42A-C, a convecção térmica aparelho produziu um produto amplificado ao tamanho esperado em um tempo de reação muito mais curto.

A amplifi- cação de PCR alcançou um nível detectável em cerca de 10 minutos e se tornou saturado em cerca de 20 ou 25 minutos.

Como manifestadas, as três polimerases de DNA foram observadas ser quase equivalentes para usar com um aparelho de PCR por convecção térmica.

Um experimento de con- trole foi também realizado usando T1 Biometra Thermocycler da Biometra para a mesma mistura de PCR contendo a mesma quantidade da matriz de plasmídeo (dados não mostrados). O experimento de controle produziu uma faixa de produto no tamanho esperado com a sua intensidade similar às ob- servadas em cerca de 20 ou 25 minutos de tempo de reação de PCR com um aparelho da presente invenção; entretanto levou um tempo de cerca de 3 a 4 vezes mais longo para completar a reação de PCR (cerca de 1 hora 30 minutos incluindo 5 minutos pré-aquecimento e 10 minutos de extensão fi- nal).

A figura 43 mostra outro resultado de PCR por convecção térmi- ca obtido usando a plasmídeo matriz que pode produzir a 936 bp amplicon. A quantidade da matriz de plasmídeo usada foi 1 ng. Os iniciadores direto e reverso usados tinham as sequências como determinadas em SEQ ID NOs: 5 1 e 2, respectivamente. As temperaturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 62°C, respectivam ente. A profundidade do orifício receptor ao longo do eixo de canal foi cerca de 2,5 mm. Como mostrado, mesmo um amplicon maior (cerca de 1 kbp) foi amplificado com sucesso em um tempo de reação muito curto (cerca de 20 a 25 min), de- monstrando a ampla faixa dinâmica do aparelho da presente invenção.

1.2. Aceleração da amplificação de PCR em temperatura elevada de desna- turação Os resultados mostrados nas figuras 44A-D demonstram a ace- leração da PCR por convecção térmica em temperaturas de desnaturação elevadas. A matriz usada foi a 1 ng de plasmídeo que pode produzir a 349 bp amplicon. Exceto pela temperatura de desnaturação, todas as outras condições experimentais incluindo a matriz e os iniciadores usados foram os mesmos que os usados para os experimentos apresentados nas figuras 42A-C e 43. Enquanto a temperatura da segunda fonte de calor foi ajustado a 62°C, a temperatura da primeira fonte de calor fo i aumentada a partir de 98°C (figura 44A) a 100°C (figura 44B), 102°C (figu ra 44C), e 104°C (figura 44D). Como mostrado, o aumento da temperatura de desnaturação (isto é, a temperatura da primeira fonte de calor) resultou em aceleração da amplifica- ção de PCR. O produto de 349 bp foi escassamente observável a 10 minu- tos de tempo de reação quando a temperatura de desnaturação foi 98°C (fi- gura 44A). Entretanto, a faixa do produto se tornou mais forte mesmo em um tempo de reação de 8 minutos quando a temperatura de desnaturação foi aumentada para 100°C (figura 44B). Quando a tempera tura de desnaturação foi adicionalmente aumentada para 102°C (figura 44C ) e 104°C (figura 44D), a faixa do produto se tornou observável em um tempo de reação tão curto quanto 6 minutos.

1.3. Amplificação de PCR a partir de Amostra de genoma humano As figuras 45A-B mostram dois exemplos de PCR por convecção térmica para amplificação a partir da amostra de genoma humano. A profun- didade do orifício receptor ao longo do eixo de canal foi cerca de 2,5 mm. A 5 quantidade da matriz de genoma humano usada para cada reação foi 10 ng correspondendo a cerca de 3,000 cópias apenas. A figura 45A mostra os resultados para amplificação do segmento de 479 bp do gene GAPDH. Os iniciadores direto e reverso usados no referido experimento foram 5’-GGTGGGCTTGCCCTGTCCAGTTAA-3’ (SEQ ID NO: 3) e 5’-CCTGGTGACCAGGCGCC-3’ (SEQ ID NO: 4), respectivamente. No refe- rido experimento, as temperaturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 62°C, respectivamente. A figura 45B mostra os resultados para amplificação de um segmento de 363 bp do gene β-globina. Os iniciadores direto e reverso usados no referido experimento foram 5’-GCATCAGGAGTGGACAGAT-3’ (SEQ ID NO: 5) e 5’-AGGGCAGAGCCATCTATTG -3’ (SEQ ID NO: 6), respectivamente. No referido experimento, as temperaturas das primeira e segunda fontes de ca- lor foram mudada para 98°C e 54°C, respectivamente, para corresponder às mais baixas temperaturas de recozimento do iniciador usado. Como mostrado nas figuras 45A-B, a PCR por convecção térmi- ca a partir de cerca de 3,000 cópias de amostra de genomas humanos pro- duziu amplicons com tamanho correto em um tempo de reação muito curto. A amplificação de PCR foi concluído em cerca de 25 ou 30 minutos. Os refe- ridos resultados demonstram que a PCR por convecção térmica é rápida e muito eficiente para amplificar a partir de amostras de baixo número de có- pias.

1.4. Amplificação de PCR a partir de Cópias muito baixas de Amostra de genoma humano A figura 46 mostra a amplificação de PCR a partir de amostras de um número muito baixo de cópias usando um aparelho da presente in- venção. A amostra de matriz usada foi DNA de genoma humano extraído a partir de 293 células. Os iniciadores direto e reverso usados no referido ex-

perimento foram 5’-ACAGGAAGTCCCTTGCCATCCTAAAAGC-3’ (SEQ ID NO: 7) e 5’-CCAAAAGCCTTCATACATCTCAAGTTGGGGG-3’ (SEQ ID NO: 8), respectivamente.

As temperaturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 62°C, respectivamente.

A profundidade do ori- 5 fício receptor ao longo do eixo de canal foi cerca de 2,5 mm.

Sequência-alvo foi o segmento de 241 bp de β-actina.

O tempo de reação de PCR foi 25 mi- nutos.

Como denotado no fundo da figura 46, a quantidade da amostra de genoma humano usado para cada reação foi reduzida consecutivamente, iniciando a partir de 10 ng (cerca de 3,000 cópias) a 1 ng de (cerca de 300 cópias), 0,3 ng (cerca de 100 cópias), e 0,1 ng de (cerca de 30 cópias). Co- mo manifestadas, a PCR por convecção térmica produziu amplificação de PCR bem sucedida a partir de tão pouco quanto uma amostra de 30 cópias (uma faixa fraca foi observada como mostrado). 1,5. Estabilidade de temperatura e consumo de energia do aparelho da pre- sente invenção A estabilidade de temperatura e o consumo de energia do apare- lho da presente invenção tendo a estrutura mostrada na figura 5A foram tes- tados.

O aparelho usado no referido experimento tinha 12 canais (3 x 4) dis- postos a 9 mm em afastamento um a partir do outro como mostrado nas fi- guras 30 e 33. As primeira e segunda fontes de calor foram cada uma das quais equipada com um fio de aquecimento de NiCr (160a-b) que foi dispos- to entre os canais como mostrado na figura 33. O aparelho também compre- endia um ventilador acima da segunda fonte de calor proporcionar resfriar para a segunda fonte de calor quando necessário.

Energia DC a partir de uma bateria de polímero de Li+ recarregável (12.6 V) foi fornecida a cada fio de aquecimento e controlada por algoritmo de controle PID (derivado- integral-proporcional) de modo a manter a temperatura de cada uma das duas fontes de calor a um valor-alvo predeterminado.

A figura 47 mostra variações de temperatura das primeira e se- gunda fontes de calor quando temperaturas-alvo foram ajustadas para 98°C e 64°C, respectivamente.

A temperatura ambiente foi cerca de 25°C.

Como mostrado, as duas fontes de calor alcançou as temperaturas-alvo dentro de menos do que cerca de 2 minutos.

Durante cerca de lapso de tempo de 40 minutos após alcançar as temperaturas-alvo, as temperaturas das duas fon- tes de calor foram mantidas estavelmente e precisamente nas temperaturas- alvo.

A temperatura média de cada fonte de calor durante o lapso de tempo 5 de 40 minutos foi dentro de cerca de ±0,05°C com relação a cada temperatu- ra-alvo.

Flutuações de temperatura foram também muito pequenas, isto é, desvio padrão da temperatura de cada fonte de calor foi dentro de cerca de ±0,06°C.

A figura 48 mostra o consumo de energia do aparelho da pre- sente invenção tendo 12 canais.

Como mostrado, o consumo de energia foi alta no período de tempo inicial (isto é, até cerca de 2 min) no qual o rápido aquecimento para as temperaturas-alvo ocorreu.

Após as duas fontes de calor alcançarem as temperaturas-alvo (isto é, após cerca de 2 min), o con- sumo de energia foi reduzida a valores mais baixos.

As grandes flutuações observadas após cerca de 2 minutos são resultado do controle ativo de um fornecimento de energia a cada fonte de calor.

Em virtude do referido contro- le de energia ativa, as temperaturas das duas fontes de calor pode ser man- tida estavelmente e precisamente nas temperaturas-alvo como mostrado na figura 47. A média do consumo de energia na região de manutenção de temperatura (isto é, após cerca de 2 min) foi cerca de 4.6 W como denotado na figura 48. Portanto, o consumo de energia por cada canal ou cada reação foi menos do que cerca de 0,4 W. uma vez que cerca de 25 minutos a 30 minutos ou menos tempo é suficiente para amplificação de PCR em um apa- relho da presente invenção, os custos de energia para a conclusão de um reação de PCR é apenas cerca de 600 J a 700 J ou menos como é equiva- lente para a energia necessária para aquecer cerca de 2 mL água a partir de temperatura ambiente a cerca de 100°C uma vez.

Os aparelhos da presente invenção tendo 24 e 48 canais foram também testados (data não mostrada). O consumo médio de energia foi cer- ca de 6 a 8 W para o aparelho de 24 canais e cerca de 9 a 12 W para o apa- relho de 48 canais.

Assim, o consumo de energia por cada reação de PCR foi observado ser ainda menor para aparelhos maiores, isto é, cerca de 0,3

W para o aparelho de 24 canais e cerca de 0,2 W para o aparelho de 48 ca- nais. Exemplo 2. PCR por convecção térmica usando o aparelho da figura 11A No referido exemplo, o efeito do ângulo de inclinação de gravi- 5 dade θg para a PCR por convecção térmica foi examinado. O aparelho usa- do no referido exemplo tinha a mesma estrutura e as dimensões usadas no exemplo 1 exceto pela incorporação do ângulo de inclinação de gravidade θg como definido na figura 11A. O aparelho foi equipado com uma cunha inclinada no fundo de modo que o eixo de canal foi inclinado por θg com re- lação à direção de gravidade. Como apresentado abaixo, a introdução do ângulo de inclinação de gravidade proporcionou o fluxo de convecção mais rápido e assim acele- rou a PCR por convecção térmica. Foi portanto confirmado que um elemento estrutural tal como uma cunha ou perna, ou um canal inclinado ou em decli- ve que pode impor o ângulo de inclinação de gravidade para o aparelho ou o canal é um elemento estrutural útil em conduzir um aparelho de PCR por convecção térmica rápido e eficiente.

2.1. Amplificação de PCR a partir de Amostra de Plasmídeo As figuras 49A-E mostram resultados de PCR por convecção térmica como uma função do ângulo de inclinação de gravidade para ampli- ficação a partir da amostra de Plasmídeo. As temperaturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 64°C, respectivamen- te. A profundidade do orifício receptor ao longo do eixo de canal foi cerca de 2,5 mm. A quantidade da matriz de plasmídeo usada para cada reação foi 1 ng. Os iniciadores usados tinham as sequências como determinadas em SEQ ID NOs: 1 e 2. O tamanho esperado do amplicon foi 349 bp. A figura 49A mostra os resultados obtidos em um ângulo de inclinação de gravidade zero. As figuras 49B-E mostram resultados obtidos a θg igual a 10°, 20°, 30°, e 45°, respectivamente. Em um ângulo de inclinação de gravidade zero (figu- ra 49A), o produto amplificado foi escassamente observável a 15 minutos de tempo de reação e se tornou forte em 20 minutos. De modo diferente, o pro- duto amplificado foi observável com a significativa intensidade a 15 minutos de tempo de reação quando o ângulo de inclinação de gravidade de 10° foi introduzido (figura 49B). Adicionalmente um aumento da faixa de intensidade do produto a 15 minutos de tempo de reação e o aparecimento da faixa de produto fraco em um tempo mais curto (isto é, 10 min) foram evidentes na 5 medida em que o ângulo de inclinação de gravidade foi aumentado para 20° (figura 49C). Acima de 20° ângulo de inclinação (fi guras 49D-E), a amplifica- ção da velocidade foi observada ser similar àquela observada a 20° (isto é, apenas relativamente aumentada). As figuras 50A-E mostram outro exemplo para amplificação de cerca de 1 kbp amplicon a partir da amostra de Plasmídeo. Todas as condi- ções experimentais incluindo os iniciadores usados (exceto para a matriz plasmídeo) são as mesmas que as dos experimentos mostrados nas figuras 49A-E. O tamanho esperado do amplicon foi 936 bp. A figura 50A mostra os resultados obtidos em um ângulo de inclinação de gravidade zero. As figuras 50B-E mostram resultados obtidos a θg igual a 10°, 20°, 30°, e 45°, respecti- vamente. Em um ângulo de inclinação de gravidade zero (figura 50A), a faixa de produto fraco foi observada em 20 minutos de tempo de reação. De modo diferente, o produto amplificado foi observável a 15 minutos de tempo de reação quando o ângulo de inclinação de gravidade de 10° foi introduzido (figura 50B). Adicionalmente um aumento da faixa de intensidade do produto a 15 minutos de tempo de reação e o aparecimento de uma faixa de produto muito fraco em um tempo mais curto (isto é, 10 min) foram observadas na medida em que o ângulo de inclinação de gravidade foi aumentado para 20° (figura 50C). Acima de 20° ângulo de inclinação (fi guras 50D-E), apenas um ligeiro aumento da velocidade de amplificação foi observado em comparação ao 20° ângulo de inclinação. O efeito do ângulo de inclinação de gravidade observado para o amplicon mais longo no referido exemplo foi observado ser similar aos resultados obtidos para o amplicon mais curto mostrado nas figu- ras 49A-E.

2.2. Amplificação de PCR a partir de Várias Amostra de Plasmídeo A figura 51 mostra os resultados de amplificação de PCR por convecção térmica obtidos a partir de várias plasmídeo matrizes com tama-

nho de amplicon entre cerca de 150 bp a cerca de 2 kbp quando o ângulo de inclinação de gravidade de 10° foi introduzido. As temperaturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 64°C, respectiva- mente. A profundidade do orifício receptor ao longo do eixo de canal foi cer- 5 ca de 2,5 mm. A quantidade da matriz de plasmídeo usada para cada reação foi 1 ng. Os iniciadores direto e reverso usados tinham as sequências como determinadas em SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente. O tamanho espera- do do amplicon foi 153 bp para a linha 1; 349 bp para a linha 2; 577 bp para a linha 3; 709 bp para a linha 4; 936 bp para a linha 5; 1,584 bp para a linha 6; e 1,942 bp para a linha 7. O tempo de reação de PCR foi 25 minutos para as linhas 1-6 e 30 minutos para a linha 7. Como mostrado, faixas de produ- tos quase saturados foram observadas para todos os amplicons em um tem- po de reação curto. O referido resultado demonstra que PCR por convecção térmica não é apenas rápida e eficiente, mas também tem uma faixa ampla e dinâmica.

2.3. Amplificação de PCR a partir de Amostra de genoma humano As figuras 52A-E mostram um exemplo que demonstra o efeito do ângulo de inclinação de gravidade para amplificação a partir da amostra de genoma humano. No referido experimento, a amostra de genoma huma- no de 10 ng (cerca de 3,000 cópias) foi usado como a matriz DNA. Os inicia- dores direto e reverso usados no referido experimento foram 5’-GCTTCTAGGCGGACTATGACTTAGTTGCG-3’ (SEQ ID NO: 9) e 5’-CCAAAAGCCTTCATACATCTCAAGTTGGGGG- 3’ (SEQ ID NO: 8), res- pectivamente. Um segmento de 521 bp do gene β-actina foi o-alvo. Outras condições experimentais foram as mesmas que as usadas para o experi- mento apresentado nas figuras 49A-E e 50A-E acima de. As figuras 52A-E mostram os resultados obtidos quando θg foi ajustado a 0°, 10°, 20°, 30°, e 45°, respectivamente. Como mostrado na figura 52A, nenhuma faixa de pro- duto foi observada mesmo após 30 minutos de tempo de reação quando ne- nhum ângulo de inclinação de gravidade foi usado. De modo diferente, a fai- xa do produto foi observada em um tempo de reação tão curto quanto 20 minutos quando o ângulo de inclinação de gravidade foi introduzido (figuras

52B-E). O aumento da velocidade de amplificação de PCR em comparação ao ângulo de inclinação zero foi observado ser similar para as diferentes gravidades de ângulo de inclinação examinadas (isto é, entre cerca de 10° a 45°). Apenas um ligeiro aumento da velocidade de PC R foi observado acima 5 de 10°.

2.4. Amplificação de PCR a partir de Várias Genes-alvo de Genoma Humano As figuras 53A-B mostram adicionalmente exemplos de amplifi- cação de PCR por convecção térmica a partir da amostra de genoma huma- no quando o ângulo de inclinação de gravidade de 10° foi introduzido. Nos referidos exemplos, um genoma humano de 10 ng (cerca de 3,000 cópias) foi usado como a matriz DNA e iniciadores tendo temperaturas de fusão rela- tivamente baixas (cerca de 54°C) em comparação aos iniciadores usados em outros exemplos foram usados. As temperaturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 54°C, r espectivamente. A pro- fundidade do orifício receptor ao longo do eixo de canal foi cerca de 2,5 mm. A figura 53A mostra a amplificação resultados para um segmento de 200 bp do gene β-globina. Os iniciadores direto e reverso usados tinham sequên- cias 5’-CCCATCACTTTGGCAAAGAATTCA-3’ (SEQ ID NO: 10) e 5’-GAATCCAGATGCTCAAGGCC-3’ (SEQ ID NO: 11), respectivamente. A figura 53B mostra a amplificação resultados para um segmento de 514 bp do gene β-actina. Os iniciadores direto e reverso usados tinham sequências 5’-TTCTAGGCGGACTATGACTTAGTTGCG -3’ (SEQ ID NO: 12) e 5’-AGCCTTCATACATCTCAAGTTGGGGG-3’ (SEQ ID NO: 13), respectiva- mente. Como mostrado nas figuras 53A-B, a PCR por convecção térmica produziu muito rápida amplificação para ambos os genes, enviando uma fai- xa de intensidade significativa do produto um tempo tão curto quanto 20 mi- nutos. No caso da sequência de β-actina, uma faixa fraca foi observada mesmo em 15 minutos de tempo de reação. A figura 54 mostra adicionalmente exemplos de amplificação de PCR por convecção térmica a partir de genoma humano de 10 ng ou amos- tras de cDNA quando o ângulo de inclinação de gravidade foi 10°. As tempe- raturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e

64°C, respectivamente.

A profundidade do orifício r eceptor ao longo do eixo de canal foi cerca de 2,5 mm.

O tempo de reação de PCR foi 25 minutos para as linhas 10, 11, e 13 e 30 minutos for outro as linhas.

Como mostrado, todos os quatorze segmentos de gene com seu tamanho variando a partir de 5 cerca de 100 bp a cerca de 500 bp foram amplificados com sucesso em 25 ou 30 minutos de tempo de reação.

Genes-alvo e sequências de iniciador correspondentes são resumidos na Tabela 2 abaixo.

As matrizes usadas foram DNA de genoma humano (10 ng) para as linhas 2, 4-7, e 10-14; e cDNA (10 ng) para as linhas 1, 3, 8, e 9. A amostras de cDNA foram prepa- rados por transcrição reversa dos extratos de mRNA a partir de células HOS (as linhas 1 e 8) ou SK-OV-3 (as linhas 3 e 9).

Tabela 2. Sequências de Iniciador e Genes-alvo usados para os experimentos na figura 54

A linha No.

Gene-alvo Tamanho de amplicon SEQ ID NO Sequência de Iniciador 14 5’-TGCCCAACAACACCAGCTCCTCT-3’ 1 p53 123 bp 15 5'-CCAAGGCCTCATTCAGCTCTCGGAAC-3’ 16 5'-CCCCAGCCCTCTGACGTCC-3’ 2 HER2 144 bp 17 5'-TCCGTTTCCTGCAGCAGTCTCCG-3’ 18 5'-AGCACTGGGGAGTCTTTGTGGATTCTGAG-3’ 3 HER2 192 bp 19 5'-GGGACAGTCTCTGAATGGGTCGCTTTTGT-3’ 20 5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGG-3’

140/146 4 MTHFR 198 bp 21 5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’ 22 5'-GGGTCCCGCGATGTCAGCCTAG-3’ PIGR 216 bp 23 5'-TTCTCCGAGTGGGGAGCCTT-3’ 24 5'-ACAGGAAGTCCCTTGCCATCC-3’ 6 β-actin 236 bp 13 5'-AGCCTTCATACATCTCAAGTTGGGGG-3’ 25 5'-TGACCCACTTGCCACCCGTGC-3’ 7 GNB3 268 bp 26 5'-GCAGCAGCCAGGGCTGGC-3’ 27 5'- GGTGTTTGAGCATGTAGACCAGGACCTAAGGA-3’ 8 CDK4 284 bp 28 5'- GAACTTCGGGAGCTCGGTACCAGAGTG-3’

A linha No.

Gene-alvo Tamanho de amplicon SEQ ID NO Sequência de Iniciador 29 5'-TCCAAGCACCCAGCATCCTGCTAG-3’ 9 CD24 330 bp 30 5'-TGGGGAAATTTAGAAGACGTTTCTTGGCCTGA-3’ 31 5'-GGGAGGTTGGGGTCTTGCCTTTCTG-3’ CR2 405 bp 32 5'-CACCTGTGCTAGACGGTGTTAGCAGC-3’ 33 5'-GCCACCTACTACCCAGAGGCATTGTG-3’ 11 PIGR 433 bp 34 5'-TGATGGTCACCGTTCTGCCCAGG-3’ 3 5'-GGTGGGCTTGCCCTGTCCAGTTAA-3’ 12 GAPDH 479 bp

141/146 4 5'-CCTGGTGACCAGGCGCC-3’ 35 5'-CTAAGCCAGTGCCAGAAGAGCCAAGGAC-3’ 13 β-globin 500 bp 36 5'-GCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAAAGG-3’ 12 5'-TTCTAGGCGGACTATGACTTAGTTGCG-3’ 14 β-actin 514 bp 13 5'-AGCCTTCATACATCTCAAGTTGGGGG-3’

As abreviações usadas na Tabela 2 são como a seguir.

HER2: ERBB2, v-erb-b2 homólogo de oncogênio viral de leucemia eritoblástica 2; MTHFR: 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH); PIGR: receptor de imunoglobulina polimérica; GNB3: proteína de ligação de nucleotídeo 5 guanina, beta polipeptídeo 3; CDK4: quinase dependente de ciclina 4; CR2: receptor de complemento 2; GAPDH: gliceraldeídos 3-fosfato desidrogenase. 2,5. Amplificação de PCR a partir de Cópias muito baixas de Amostra de genoma humano A figura 55 mostra os resultados de amplificação de PCR por convecção térmica a partir de amostras de genoma humano de muito baixa cópia quando o ângulo de inclinação de gravidade foi usado.

Os iniciadores usados tinham as sequências como determinadas em SEQ ID NOs: 7 e 8. A amplificação-alvo foi um segmento de 241 bp do gene β-actina.

As tempera- turas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 64°C, respectivamente.

O ângulo de inclinação de gravidade foi ajus- tado a 10° e O tempo de reação de PCR foi ajustado a 25 minutos.

Como denotado no fundo da figura 55, a quantidade da amostra de genoma huma- no usado para cada reação foi reduzida consecutivamente, iniciando a partir de 10 ng (cerca de 3,000 cópias) a 1 ng de (cerca de 300 cópias), 0,3 ng (cerca de 100 cópias), e 0,1 ng de (cerca de 30 cópias). Como manifestadas, a PCR por convecção térmica produziu amplificação de PCR bem sucedida a partir de tão pouco quanto uma amostra de 30 cópias Os resultados apresentados no referido exemplo demonstram que o ângulo de inclinação de gravidade é um elemento estrutural importan- te que pode ser usado para aumentar a velocidade da PCR por convecção térmica.

Adicionalmente, os resultados sugerem que podem haver determi- nadas limitações (além do aparelho em si) em acelerar a PCR por convec- ção térmica.

Por exemplo, a velocidade da PCR por convecção térmica foi observada ser cerca do mesmo quando o ângulo de inclinação de gravidade foi maior do que cerca de 10° ou 20° (por exemplo, vide figuras 49B-E, 50B- E, e 52B-E). Os referidos resultados demonstram que a última velocidade da

PCR por convecção térmica pode ser limitada por outros fatores tais como a velocidade de polimerização da polimerase de DNA e a propriedade da ma- triz-alvo embora a velocidade de convecção do aparelho da presente inven- ção possa ser aumentada tão rápida quanto desejado. 5 Exemplo 3. PCR por convecção térmica usando aparelhos tendo assimetria estrutural Dois tipos de aparelhos foram usados no referido exemplo.

Um primeiro aparelho usado no referido exemplo tinha a mesma estrutura que a usada no exemplo 1 (isto é, a estrutura mostrada na figura 5A), mas com dimensões relativamente diferentes.

O primeiro elemento isolante tinha um menor comprimento ao longo do eixo de canal 80 próximo a região de canal como comparado ao aparelho usado no exemplo 1. O comprimento ao longo do eixo de canal 80 próximo a região de canal (isto é, dentro da região de protuberância) foi cerca de 0,5 mm que foi menor do que cerca de 1,5 mm do comprimento do aparelho usado no exemplo 1. O comprimento do primei- ro elemento isolante ao longo do eixo de canal 80 fora da região de canal (isto é, fora da região de protuberância) foi o mesmo (isto é, cerca de 9.5 mm a cerca de 8 mm dependendo da posição). O comprimento das primeira e segunda fontes de calor ao longo do eixo de canal 80 foram cerca de 4 mm e cerca de 11,5 mm, respectivamente.

A primeira câmara 100 foi locali- zada na parte mais baixa da segunda fonte de calor 30 como mostrado na figura 5A e tinha um formato cilíndrico com um comprimento ao longo do eixo de canal 80 de cerca de 7,5 mm e um diâmetro de cerca de 4 mm.

A profundidade do orifício receptor 73 ao longo do eixo de canal 80 foi cerca de 2,5 mm para os dados apresentados no referido exemplo embora a mesma tenha sido variada entre a partir de cerca de 1,5 mm a cerca de 3 mm.

O canal 70 tinha um formato cilíndrico afunilado com um diâmetro mé- dio de cerca de 2 mm e o diâmetro na extremidade de fundo (no orifício re- ceptor) de cerca de 1,5 mm.

No referido aparelho, todos os elementos de formação de temperatura incluindo a primeira câmara, o orifício receptor, o primeiro elemento isolante, e as protuberâncias das primeira e segunda fon- tes de calor foram dispostos simetricamente com relação ao eixo de canal.

O segundo aparelho usado tinha uma câmara assimétrica tendo uma estrutura mostrada na figura 20A. A primeira câmara 100 localizada na parte mais baixa da segunda fonte de calor foi descentralizada com relação ao eixo de canal por cerca de 0,8 mm como mostrado na figura 20A. Assim, 5 a primeira protuberância 33 da segunda fonte de calor foi também descen- tralizada com relação ao eixo de canal por 0,8 mm. Outras estruturas e di- mensões do segundo aparelho foram idênticas às do primeiro aparelho des- crito acima de. No segundo aparelho, a primeira câmara 100 e a primeira protuberância 33 da segunda fonte de calor foram dispostas assimetrica- mente (isto é, descentralizadas) com relação ao eixo de canal, enquanto o orifício receptor na primeira fonte de calor e o orifício perfurado na segunda fonte de calor foram dispostos simetricamente com relação ao eixo de canal. Como apresentado abaixo, a presença da assimetria estrutural foi observada aumentar a velocidade da PCR por convecção térmica subs- tancialmente. Assim, é demonstrado que os elementos estruturais assimétri- cos tais como câmara assimétrica, orifício receptor assimétrico, freio térmico assimétrico, elemento isolante assimétrico, protuberâncias assimétricas, etc. são elementos estruturais úteis. Os referidos elementos estruturais assimé- tricos podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros ele- mentos de formação de temperatura e/ou o ângulo de inclinação de gravida- de para modular (tipicamente para aumentar) a velocidade da PCR por con- vecção térmica como desejado.

3.1. Amplificação de PCR a partir de Amostra de Plasmídeo A matriz de DNA usada no referido exemplo foi a 1 ng de plas- mídeo DNA. Dois iniciadores tendo as sequências como determinadas em SEQ ID NOs: 1 e 2 foram usados. O tamanho esperado do amplicon foi 349 bp. As temperaturas das primeira e segunda fontes de calor foram ajustadas para 98°C e 64°C, respectivamente. Nenhum ângulo de inclinação de gravi- dade foi introduzido. A figura 56A mostra os resultados obtidos com um primeiro apa- relho tendo todos os elementos de formação de temperatura que são dispos- tos simetricamente com relação ao eixo de canal. Como mostrado, uma faixa de produto muito fraco foi observada a 15 minutos de tempo de reação e faixas fortes foram observadas após 20 minutos. As figuras 56B mostram os resultados obtidos com um segundo aparelho que tinha a estrutura assimétrica de câmara. Como descrito acima, 5 a primeira câmara foi descentralizada em cerca de 0,8 mm com relação ao eixo de canal. Como mostrado na figura 56B, a amplificação de PCR se tor- nou mais rápida e mais eficiente em comparação aos resultados obtidos com o aparelho simétrico (figura 56A). A faixa de produto fraco foi observada mesmo a 10 minutos de tempo de reação, demonstrando de redução do tempo de reação de PCR por cerca de 5 a 10 minutos. Como manifestadas, a pequena assimetria horizontal na primeira câmara foi suficiente para acele- rar a PCR por convecção térmica dramaticamente.

3.2. amplificação de PCR a partir de Amostra de genoma humano As figuras 57A-B e 58A-B mostram os resultados obtidos for dois genoma humano-alvos, um segmento de 241 bp de β-actina e um segmento de 216 bp de PIGR, respectivamente. Iniciadores usados para os resultados mostrados nas figuras 57A-B tinham as sequências como determinadas em SEQ ID NOs: 7 e 8. Iniciadores usados para os resultados mostrados nas figuras 58A-B tinham as sequências como determinadas em SEQ ID NOs: 22 e 23. A quantidade da amostra de genoma humano usado para cada rea- ção foi 10 ng correspondendo a cerca de 3,000 cópias. Como mostrado nas figuras 57A-B para amplificação da sequên- cia de β-actina, um segundo aparelho compreendendo a estrutura de aque- cimento simétrica (isto é, tendo a primeira câmara descentralizada) forneceu uma amplificação de PCR mais rápida e mais eficiente (figura 57B) em com- paração com um primeiro aparelho tendo a estrutura de aquecimento simé- trica (figura 57A). A faixa de produto fraco foi observada a 25 minutos de tempo de reação quando a estrutura de aquecimento simétrica foi usada (fi- gura 57A). Entretanto, quando a estrutura de câmara assimétrica foi usada (figura 57B), a faixa do produto se tornou muito mais forte no mesmo tempo de reação de 25 minutos e a mesma se tornou observável em 20 minutos. Como mostrado nas figuras 58A-B, resultados similares foram obtidos quando o-alvo foi mudado para a sequência de PIGR.

Com a estru- tura de aquecimento simétrica (figura 58A), o produto foi observado como uma faixa fraca a 25 minutos.

Entretanto, com a estrutura de câmara assi- métrica (figura 58B), a faixa do produto se tornou saturado nos mesmos 25 5 minutos de tempo de reação e se tornou observável como uma faixa fraca em 20 minutos.

As descrições de todas as referências mencionadas aqui (inclu- indo todas as patentes e documentos específicos) estão aqui incorporadas por referência.

A presente invenção foi descrita em detalhes com referência às modalidades particulares da mesma.

Entretanto, será observado que aqueles versados na técnica, considerando a presente descrição, podem fazer modificações e aprimoramentos inseridos no espírito e âmbito da pre- sente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Aparelho adaptado para realizar convecção térmica PCR compreendendo: (a) uma primeira fonte de calor para aquecer ou resfriar um ca- 5 nal e compreendendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo, o canal sendo adaptado para receber um recipiente de reação para realizar PCR, (b) uma segunda fonte de calor para aquecer ou resfriar o canal e compreendendo uma superfície de topo e uma superfície de fundo, a su- perfície de fundo voltada para a superfície de topo da primeira fonte de calor, em que o canal é definido por uma extremidade de fundo que entra em con- tato com a primeira fonte de calor e um orifício perfurado contíguo com a superfície de topo da segunda fonte de calor, e adicionalmente em que pon- tos centrais entre a extremidade de fundo e o orifício perfurado formam um eixo de canal sobre o qual o canal é disposto, (c) pelo menos um elemento de formação de temperatura tal como uma câmara disposta em torno do canal e dentro de pelo menos parte da segunda ou primeira fonte de calor, a câmara compreendendo um espaço de câmara entre a segunda ou primeira fonte de calor e o canal suficiente para reduzir a transferência de calor entre a segunda ou primeira fonte de calor e o canal; e (d) um orifício receptor adaptado para receber o canal dentro da primeira fonte de calor.

2. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, em que o apare- lho compreende um primeiro elemento isolante posicionado entre a superfí- cie de topo da primeira fonte de calor e a superfície de fundo da segunda fonte de calor.

3. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, em que o apare- lho compreende uma primeira câmara posicionada inteiramente dentro da segunda fonte de calor e a primeira câmara compreende uma primeira ex- tremidade de topo de câmara voltada para uma primeira extremidade de fundo de câmara ao longo do eixo de canal e em que pelo menos uma pare-

de da câmara está disposta ao redor do eixo do canal.

4. Aparelho, de acordo com a reivindicação 2, em que o primeiro elemento isolante compreende um sólido ou um gás.

5. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3, em que a primeira 5 câmara compreende um sólido ou um gás.

6. Aparelho, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o gás é ar.

7. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3, em que a primeira câmara é disposta essencialmente simetricamente sobre o canal ao longo de um plano perpendicular ao eixo de canal.

8. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3, em que pelo me- nos parte da primeira câmara é disposta assimetricamente sobre o canal ao longo de um plano perpendicular ao eixo de canal.

9. Aparelho, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o aparelho compreende ainda uma segunda câmara posicionada dentro da segunda fonte de calor, e a primeira câmara tem uma largura (w) perpendi- cular ao eixo de canal que é diferente a partir da largura (w) da segunda câ- mara.

10. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que a segunda fonte de calor compreende pelo menos uma protube- rância que se estende na direção da primeira fonte de calor ou para longe da superfície superior da segunda fonte de calor.

11. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a primeira fonte de calor compreende pelo menos uma protu- berância que se estende na direção da segunda fonte de calor ou para longe da superfície inferior da primeira fonte de calor.

12. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o aparelho é adaptado de modo que o eixo de canal é inclina- do com relação à direção de gravidade.

13. Aparelho, de acordo com a reivindicação 12, em que o eixo de canal é perpendicular à superfície de topo ou de fundo de qualquer uma das primeira e segunda fontes de calor, e o aparelho é inclinado.

14. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, que ainda compreende pelo menos uma unidade de detecção ótica.

15. Aparelho, de acordo com qualquer uma das revindicações 1 a 13, em que a extremidade de fundo da primeira câmara é localizada apro- 5 ximadamente na mesma altura que a superfície de fundo da segunda fonte de calor.

16. Aparelho, de acordo com a reivindicação 15, compreenden- do ainda pelo menos uma unidade de detecção ótica.

17. Método para realizar uma reação de cadeia de polimerase (PCR) por convecção térmica, o método compreendendo pelo menos um e preferivelmente todas as etapas a seguir: (a) manter uma primeira fonte de calor compreendendo um orifí- cio receptor em uma faixa de temperatura adequada para desnaturar uma molécula de ácido nucleico de dupla fita e formar uma matriz de uma fita, (b) manter uma segunda fonte de calor em uma faixa de tempe- ratura adequada para recozer pelo menos um iniciador de oligonucleotídeo para a matriz de uma fita; e (c) produzir convecção térmica entre o orifício receptor e a se- gunda fonte de calor sob condições suficientes para produzir um produto de extensão de iniciador.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o método adicionalmente compreende a etapa de proporcionar um recipiente de rea- ção compreendendo o ácido nucleico de dupla fita e o iniciador de oligonu- cleotídeo em solução aquosa, e uma polimerase de DNA em solução aquo- sa, ou uma polimerase de DNA imobilizada.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o método ainda compreende a etapa de entrar em contato com o recipiente de reação para o orifício receptor e uma câmara disposta dentro de pelo menos um da segunda ou primeira fonte de calor, o contato sendo suficiente para suportar a convecção térmica dentro do recipiente de reação.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o método adicionalmente compreende a etapa de entrar em contato com o recipiente de reação a um primeiro elemento isolante entre as primeira e segunda fon- tes de calor.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o método adicionalmente compreende a etapa de produzir um fluxo de fluido dentro do 5 recipiente de reação que é essencialmente simétrico sobre o eixo de canal.

22. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que o método adicionalmente compreende a etapa de produzir um fluxo de fluido dentro do recipiente de reação que é assimétrico sobre o eixo de canal.

23. Método, de acordo com a reivindicação 18, em que pelo me- nos as etapas (a) - (b) consomem menos do que cerca de 1 W de energia por recipiente de reação para produzir o produto de extensão de iniciador.

24. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o produto de extensão iniciador é produzido em cerca de 15 a cerca de 30 minutos ou menos.

25. Método para realizar uma reação de cadeia de polimerase (PCR) por convecção térmica, o método compreendendo as etapas de adici- onar um iniciador de oligonucleotídeo, matriz de ácido nucleico, polimerase de DNA, e tampão a um recipiente de reação recebido pelo aparelho como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 sob condições suficien- tes para produzir um produto de extensão de iniciador.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, compreendendo ainda a etapa de detectar o produto de extensão de iniciador em tempo real ao usar pelo menos uma unidade de detecção ótica.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, compreendendo ainda a etapa de detectar o produto de extensão de iniciador em tempo real ao usar pelo menos uma unidade de detecção ótica.

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