JP4681736B2 - 遠心力および加熱による小体積混合物の均一化 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、反応混合物のテンペレーション（ｔｅｍｐｅｒａｔｉｏｎ、所定の温度にすること）および／またはインキュベーション（または温置）を必要とする化学反応、特に液体媒体中の化学反応の分野に関する。本発明は、効率的かつ均一な混合、ならびに反応混合物のテンペレーションおよび／またはインキュベーションのための新規な装置および方法を開示する。
【０００２】
（発明の背景）
各種の実験室で適用される方法と同様に、多くの重要な工業プロセスは、化学反応に依存している。一般的に、プロセスまたは方法を完了するのに要する時間は、ある特定の化学反応（単数または複数の反応）が平衡に達するのに要する時間によって決まる。これは、しばしば、化学反応の速度論的性質、または単に反応速度と呼ばれる。多くの可変要素、例えば、反応物質の濃度、温度、触媒物質の存在等は、それぞれの場合の反応速度に影響する。
【０００３】
一般的に、温度の増加は、分子または分子領域を相互に接触させる重要なメカニズムを昇速させ、よって、化学反応を速めるものである。それ故、反応容器を加熱すること、例えば、それを直火、高温ガス、高温液体、高温の砂または固体材料と接触させることが一般的である。この手順は、しばしば、インキュベーションと呼ばれている。
【０００４】
一部の反応混合物は、反応容器の壁と密接しており、より中心部の反応混合物に先立って加熱されるので、流体反応混合物のインキュベーションに関する1つの典型的な問題が、熱の不均一性である。多くの場合、他の部分の反応混合物が所望の温度に達する前であっても、一部の反応混合物が過熱される危険がある。これにより、反応混合物中に温度勾配が生じることになる。通常、反応混合物の高温な部分は、低温な部分より低密度であり、温度勾配、またはサーモクラインと呼ばれる液体のある程度等温の別々の層を生じる傾向がある。従って、反応混合物の温かく、より低密度の部分は、冷たく、より高密度な部分の上方に位置する傾向がある。反応混合物中の分子の運動および流れは、温度に関して結果的に反応混合物を均一化し、この過程を反応混合物のテンペレーションと呼ぶ。反応混合物をテンペレートする（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ、所定の温度にする）時間は、すべての反応に要する時間に実質的に影響することもある。
【０００５】
しかしながら、時間の消費それ自身が、化学反応混合物のテンペレーションに関する唯一の問題ではない。いわゆる熱サイクルプロセス（サイクル的に所定の温度に加熱／冷却するプロセス、thermocycling process）、例えば、PCR反応としても知られるポリメラーゼ連鎖反応を実施するプロセスに含まれる反復的テンペレーションのような、あるインキュベーション過程においては、長いテンペレーション期間もまた、不必要な副反応を生じ、得られるPCR生成物の精度および特異性に関して著しい品質問題を時には引き起こすことがある。
【０００６】
例えば、高処理能力スクリーニング（high throughput screening）の分野では明らかなことであるが、化学反応体積を減少させるために行われている試みにおいては、他のいくつかの問題に遭遇する。マイクロタイタープレートのウェルのような小さい反応容器においては、試料と試薬との混合およびテンペレーションの両方は著しく制限され得る。二つまたはそれ以上の混和性流体（または液体）を混合する時、通常、それらが、まず均一的な混合物を形成し、そして、反応すると推定されている。しかしながら、それは稀なケースである。
【０００７】
常套のマイクロタイターのプレートおよびキュベットは、しばしば、ポリスチレン、親水性ポリマーから製造される。容器の境界部での正確な液体挙動を考慮しなければ、マイクロタイタープレートのウェルような小さい反応容器においては、よどみ領域が形成され、そして、不充分な混合が容易に生じると結論付けることができる。反応物質および試料流体の性質もまた、互いとのおよび容器境界との相互作用に影響する。部分的な偏在、層の形成、凝集等は、反応容器内で遭遇し得る不規則性の幾つかの例に過ぎない。
【０００８】
反応混合物中の不均一な温度分布の問題を引き起こす二つの異なる過程を、区別する考え方がある。反応容器の壁近傍の低流動性により引き起こされる過程は、反応スケールが小さくなると、大きくなる問題である。それに対して、反応容器を加熱した際の壁近傍の液体よりも冷たい中心部の液体に関する問題は、反応スケールが大きくなると大きくなる。このことが、適切なテンペレーションが必要とされるプロセス（例えば、ＰＣＲのようなプロセス）に用いる熱サイクル装置（サイクル的に所定の温度に加熱／冷却する装置、thermocycling device）が、反応スケールに関して非常に狭いダイナミックレンジ(または動作範囲、ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ)を有する理由である。一般的に、ＰＣＲ反応においては、これらの問題は、反応体積が５μＬより小さい時および５０μＬよりも大きい時に、最も顕著となる。
【０００９】
見かけ上は混合およびテンペレーションの問題と関係しない、もう１つの問題は、蒸発の問題である。蒸発を避けるために、反応容器、特にマイクロタイタープレートのウェルを、より深く、また、より狭くする傾向がある。当然、これは前述した不十分な混合およびテンペレーションの問題を更に際立たせる。
【００１０】
これまでのところ、温度の不均一性は、単一の反応容器内における特性に関して論じられてきた。特に、アッセイのミニチュア化を論じる時には、更にもう１つのテンペレーション不均一性の特徴、即ち、反応容器間の変化の特徴を考慮する必要がある。比較目的のアッセイ(例えば、新規な薬候補物質のスクリーニング、核酸における突然変異作用、単一のヌクレオチド多形性定量分析を伴う、あるいは伴わない)において、一般に、ウェル・トゥ・ウェル(ｗｅｌｌ−ｔｏ−ｗｅｌｌ)均一性と呼ばれる再現性を考慮することは重要である。
【００１１】
不十分な熱的不均一性に至る過程は、定量的に予測することが困難であるので、その問題に対しての唯一の有効な解決法は、しばしば、均一化過程を高める手段に焦点を当てることである。それをするために、数々の方策が用いられている。
【００１２】
1つは、反応混合物の中心部と周囲部との間の距離を最小化にするために、特定な平坦または長円形状の形態を有する反応容器を用いることである。この例は、細いキャピラリーにおいてインキュベートすることであり、例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ,Ｃ．Ｔ．らに記載されている（Ｔｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）：迅速な温度制御を有する微小量多試料蛍光計（Ａ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ｍｕｌｔｉｓａｍｐｌｅ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ ｗｉｔｈ Ｒａｐｉｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）、バイオ・テクニクス（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）第２２号：１７６−１８１頁、１９９７年１月）。この手法の１つの不利な点は、ガラスキャピラリーが、プラスチックの保持部にゆるく取り付けられており、多くの手作業を必要とすることである。ガラスキャピラリーの選択は、反応混合物の迅速なテンペレーションと増幅後の蛍光の検知との両方を可能とするものである。しかしながら、ガラスキャピラリーは、表面と流体の接触を最大化させる傾向あり、その結果、このことは混合およびテンペレーションにおいて影響を与える。更に、ガラスキャピラリーの使用は、試料の後PCR（post-PCR processing）処理を阻害する追加的な欠点を有する。後PCR処理の例としては、ＤＮＡ配列決定方法（DNA sequencing procedure）等が含まれる。
【００１３】
混合および温度の不均一性の問題を解決する他の方法は、撹拌、または反応容器の振盪によって、摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）を導入することである。その目的のために設計された特定の装置は、例えば種々のフラスコシェーカーおよびいわゆるボルテックス・マシン（Ｖｏｒｔｅｘ ｍａｃｈｉｎｅ、渦流機械）である。しばしば、この手法が遭遇する問題としては、摂動周期性が、流れまたは定常波を生じ、よって、不完全な均一化を引き起こすことがあり得ることである。
【００１４】
均一化に対するもう一つの手法は、超音波処理と呼ばれる、標準的な方法で超音波を使用することである。残念ながら、この方法は、多くの標準的なインキュベーション法と組み合わせることがしばしば困難である。
【００１５】
更に、もう一つの手法は、フロー−スルー−システム（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｙｓｔｅｍ）の使用であり、ここでは、絶えず移動する液体が加熱される。
【００１６】
ＰＣＲの分野においては、伝熱およびより速いランピング（または変化、ｒａｍｐｉｎｇ）の問題、即ち、加熱段階および冷却段階の両方において温度調節を迅速にする方法に多くの注意が払われてきた。
【００１７】
（最も近い先行技術）
ＷＯ ９８／４９３４０（ＰＣＴ／ＡＵ９８／００２７７）は、温度サイクル装置および方法を開示しており、反応混合物および試料がディスポーサブル・ローター上の充填用のウェルに仕込まれ、その後、ローターが遠心力を用いる熱サイクル装置に配置され、そして回転させられる。その結果、反応混合物と試料がローター周囲の反応ウェルへの遠心力により移動することになる。この装置は、加熱手段、例えば、赤外線光、対流加熱要素またはマイクロ波源を含んで成る。興味深いことに、明細書中には、ローターを冷却する設備も含まれている。1つの態様では、ローター速度が増加すると、空気が装置内に入り込み、ローター周辺の反応チャンバーの内容物が急速に冷却されることになる。周囲の空気の他に、冷媒ガスを用いてもよい。冷却空気は、冷媒ガスの例として挙げられる。重要なことは、ＷＯ ９８／４９３４０の開示が、種々の回転速度の使用を示唆していることである。更に、ＷＯ ９８／４９３４０は混合および均一的なテンペレーションの問題に対処していない。例えば、加熱方向を明確にしていないし、同時に加熱および冷却することについて考慮されてない。
【００１８】
ＤＥ１９５０１１０５Ａ１は、温度制御システムを有する遠心機を開示しており、循環流体が上からローターに流れ込み、試験管、または試料容器の周囲で、半径方向に対して外向きおよび下向きに流れ出ている。ＤＥ１９５０１１０５に記載の遠心機の発明者は、熱放射源を使用するそれまで既知の装置を批評し、それらを満足のいくものでないとしている。
【００１９】
本発明の目的は、小体積の化学反応混合物のインキュベーションが関連する手順における、時間を要する、また、不十分な混合およびテンペレーションの工程に関する問題を、効率的な混合および均一化の手段を見出すことによって解決することである。重要なことは、その手段は、邪魔されない反応分析手段と両立するものであり、好ましくは、化学ならびに生物工学分野の反応、スクリーニング、および分析（例えば高処理能力スクリーニング、増幅反応等）の分野における現在ならびに将来の技術にも応用できるものである必要があるということである。
【００２０】
特に、迅速で精度の良い熱サイクル装置およびそのような方法に対するニーズは、先行の技術の装置および方法では、まだ満たされていない。
【００２１】
（発明の概要）
この問題は、添付の特許請求の範囲の請求項の特徴部分に記載されている本発明によって解決されるものであり、請求項の内容は発明の詳細な説明に含まれる。本発明は、装置と方法の両方を含んで成り、発明の詳細な説明で開示され、添付の請求項で規定されている。更に、本発明により解決される問題および得られる利点は、明細書および図面から理解することができる。
【００２２】
（発明の説明）
本発明を、添付図面を参照して、以下に説明する。
【００２３】
本発明の以下の説明において、ある種の定義を用いる。それらは、以下に説明するように解釈すべきものである。
【００２４】
重力場の方向：ベクトルで表される。重力場の方向は、遠心力を表わすベクトル、即ち、遠心機のローター軸に対して直角の、ローター中心からのベクトルが、地球の重力を表わすベクトルに加えられた時に得られるベクトルと同じである。従って、下方向は、本明細書で、重力場と同じ方向として定義され、遠心力および重力を表している合成ベクトルによって定義される。
【００２５】
反応混合物：いずれかの流体の反応混合物、好ましくは、液体の反応混合物であり、反応速度が温度により影響され、より速い、より効率的な、また、均一的なテンペレーションが望まれるものである。本発明の装置および方法に適した反応例は、反復的テンペレーション（例えばサイクル的な温度変化）を含む生化学反応および高処理処理スクリーニングの分野の化学／生化学反応であり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、「間隙ＬＣＲ反応」（ｇａｐｐｅｄ−ＬＣＲ−ｒｅａｃｔｉｏｎ）、核酸配列に基礎を置いた増幅法（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、自己複製（３ＳＲ：ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、転写増幅法（ＴＭＡ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換増幅法（ＳＤＡ：ｓｔａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、超的増幅法（ｔａｒｇｅｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、シグナル増幅法（ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または、これらのいずれかの組合せが含まれる。
【００２６】
一般的な、ポリメラーゼ連鎖反応は、次の工程を含む：
１）反応混合物の調製、例えば試験すべき試料の準備
２）増幅、例えばＤＮＡ分子の指数関数的な複製、および
３）例えば電気泳動またはハイブリダイゼーションによる、特定のシーケンスの検知。
工程２）は、繰り返す温度変化を含み、ヌクレオチドストランドのアニール、および伸張の工程に反応混合物を付す。不十分なテンペレーション、即ち、反応混合物における温度の放散は、不特定な増幅生成物を生じる。反応混合物の迅速かつ均一なテンペレーションの必要性は、品質および反応の信頼性および質のために中心的な事項である。
【００２７】
反応容器：反応を実施するのに必要な温度範囲の反応混合物を含むことができる、いずれかの容器。本発明に基づく使用に適した反応容器の例には、次のものが含まれるが、それらに限定されるものではない。試験管、いわゆるマイクロチューブ、エッペンドルフ管（Eppendorf-tube）、マイクロタイタープレートのような単一のウェルまたは多数のウェル等。マイクロタイターは例えば９６穴式のもの、およびウェルのアレイの種々の高密度のもの（例えば１９２穴式、３８４穴式、より高密度なもの等）がある。本発明に基づいて使用する反応容器は、常套なもので、市販の上記に列挙した反応容器であってもよく、または本発明の装置の装置において使用するのに特に適した反応容器であってよく、後者は、例えば、遠位端部で光学的要素を含むもの、遠位端部で熱を吸収する特殊な色や表面を含むもの、あるいは側壁において不伝導性、絶縁性あるいは反射性の表面を含むものであってもよい。
【００２８】
反応混合物は、反応容器、例えば、少なくとも1つの開口端部と、それの実質的に反対方向にある、1つの閉鎖端部を有する容器内に配置される。その容器には、試料と少なくとも１つの反応物質が入れられており、それらが、定義によって、反応混合物を構成し、均一的にインキュベートされる。反応物質は、開口端部からディスペンスされ、その後に、例えば、蓋を用いて密封され得る。反応物質のディスペンスは、手動あるいは自動化ピペット装置を用いて実施してもよく、あるいは、より好ましい発明の態様では、予めディスペンスされた試薬キャピラリー（ＰＣＴ／ＳＥ９１／００３４３）または試薬カートリッジ（ＰＣＴ／ＳＥ９７／０１５６２）を用いて実施され得る。
【００２９】
閉口端部は、現在の重力場と同じ方向を示す遠位端部として定義される。開口端部、あるいは、蓋または試薬カートリッジでふさがれている端部は近位端部と呼ぶ。従って、遠心作用が生じない時は、反応容器の遠位端部は、しばしば、地球の重力場に従って下方向である。この説明と対応して、本明細書における上方向は、特定の状況において内容物を含む反応容器に影響を与える重力場に対して反対の方向として定義される。従って、近位端部は上方向に向いているか、または遠心力に対して反対の方向を向いている。
【００３０】
本発明の装置を図１に示すが、この装置は内容物を含む少なくとも1つの反応容器２を保持する手段、例えばローター１、該少なくとも1つの反応容器およびその内容物を遠心力下に付す手段、例えばモーター３、遠心力に対して外方向に向いた反応容器の一部を加熱する手段５および６、ならびに反応容器の近位端部を冷却する手段（図示せず）を含んで成る。温度センサー７は、回転している反応容器２の試料含有端部から読み取りを行うが、それを概略的に示す線によって示している。温度センサー７は、好ましくは赤外線センサーである。
【００３１】
赤外線センサー、または他の迅速なセンサーを用いて、温度のオンライン測定を実施する。速くかつ正確な温度測定法により、説明する非常に高い温度の使用が可能になる。
【００３２】
図１において、プロセッサー４が示されている。このプロセッサーはコンピューターコードの形式の操作指令をロードした常套のいかなる論理的回路であってもよく、あるいは、本発明の装置に特に適用させた回路であってもよい。プロセッサーの機能は、少なくとも次のことを含む：温度センサー７からの温度信号を処理し、オペレーターによって選ばれる１つまたそれ以上のプログラムに基づいて、モーター３および加熱／冷却源５の運転を制御すること。
【００３３】
好ましくは、少なくとも1つの反応容器を保持する該手段１は、ローターであり、例えばドラムローター、スイングバケットローター、および固定角ローターの中から選ばれるものである。更に、選択されたローターは、好ましくは、反応容器の遠位または「下方」端部と加熱源との間で熱的な接触が阻害されないように修正してされている。同様に、ローターは、近位端部の効率的な冷却ができるように適切に修正してもよい。
【００３４】
加熱源５および６は、反応容器の遠位端部を加熱することができる、いかなる加熱源でもあってもよく、例えば、電気抵抗性ワイヤーを有する加熱要素、赤外線源、マイクロ波源等の放熱源であってもよい。本発明の１つの態様では、加熱と冷却は、マントル６に接続された少なくとも1つの外部の加熱および冷却源（図面を通じて５として示されている）の使用により実施される。マントルは、図１、２、３、および４の断面図にて示すように、反応容器２の回転軌道（または経路）の中少なくとも一部の間で、回転軌道を囲む。
【００３５】
好ましくは、マントル６は、本発明の二つの態様を示している図５および図６で概略的に示すように、ローター形状に適合するものである。図７においては、マントルまたはその一部が、反応容器の回転軌道に対して可動である態様を示している。この場合、マントルの可動部は、好ましくは加熱源１７を含む環状または部分的に環状の反射体１６であり、反応容器の回転軌道に近づくように、あるいはそれらが離れるように移動できるように配置されている。
【００３６】
加熱源もまた、反応容器の遠位端部または下方端部（図示せず）のレベルにてローターの中にも配置してもよい。本発明の一つの態様では、テレセントリックレンズが、加熱源と１または複数の反応容器あるいは複数の反応容器との間に置かれる。
【００３７】
冷却源または冷却手段は、対流冷却および循環冷却媒体、例えば空気および好ましくは窒素のような冷却ガスから選ばれるものであってもよい。添付図面に示しているような態様では、冷却媒体はマントルの中へ入れられ、よって、回転している反応容器と接触することになる。もう一つの態様（図示せず）では、ローター環境（または、周囲）は、マントル部を除いて冷却させられている。ローター対して、マントルを移動することによって、例えば、回転している反応容器の極近傍まで近づくように、上げること、また、下げることによって、該容器を加熱する。マントルを下げる、上げる、または取り除くことにより、周囲の冷却環境が、回転している反応容器と再度接触することができる。マントルを移動する代わりに、マントルを定位置に維持し、ローターを移動させることもできる。
【００３８】
反応容器２は、一組の個々の管、例えばＥｐｐｅｎdｏｒｆ管、マイクロタイタープレートの個々のウェルまたは個々の試験管の内のいずれであってもよい。
【００３９】
図２は、照射源８が、反応容器の回転軌道と交差する放射線、例え、レーザービームを発する態様を概略的に示している。この放射線の反射は、センサー９で検知される。例えば赤外線センサーのような温度センサー７は、例えば温度測定を回転速度に対して調節する目的で、プロセッサー１０を介して反射センサー９と通信し得るものである。放射源８と反射センサー９は、試料中の化学反応を検知する、例えば反応の終点または正もしくは負の試験応答を示す光反射または発光を検知することにも用いてもよい。
【００４０】
更に、図２において、ユーザーインターフェース１１が示されている。そのユーザーインターフェースは、操作パラメーターの選択、あるいは予めプログラム化された操作スキームの選択を入力できるキーボードまたは類似物、ならびに運転、プロセスパラメーター等の経過状況を映すディスプレイ等を含んで成る。
【００４１】
より好ましい態様では、本発明に記載の装置は、試料の確認、操作指令等に関する情報を読み込む手段を含む。そのような情報の例としては、時間、温度、サイクル数、後ＰＣＲの温度等の操作パラメーター；日付、ソース、疾患者の身元、品質等の試料情報；およびバッチ数、日付、試薬量、タイプ等の試薬情報が含まれる。
【００４２】
1つの態様では、試料または反応容器は、上記の情報またはそれと類似の情報を含んで成り、それらは、例えば、バーコード、光学的に読み取れるディスク等のような光学的に読み取れる信号の形式、または磁気担体、集積回路もしくはチップに含まれている情報のような電子的に読み取れる情報の形式である。この態様を用いれば、高度な安全性および制御を達成できる。オペレーターのミスは最小限となる。試料が確認され、そして、各々の試料のキャリアー、例えば各々のマイクロタイタープレートに含まれる情報に応じて操作が実施される。オペレータは、例えば、バーコードリーダーを用いて、または、試料が装置に仕込まれると自動的に情報を検出する装置によって、情報を読取ることができる。
【００４３】
図３においては、温度の読み込みおよび制御が、反応容器の1つに配置されたセンサー１２を介して実施され、センサー１２が送信器１３と受信器１４を介してプロセッサー４と通信する態様を示している。センサーは、例えば熱電対であり、送信器／受信機システムは赤外線信号を用いるシステムであってもよい。
【００４４】
図４は、本発明の装置の概略的な断面を示しており、マントル６を示している。反応容器２、ローター１およびモーター３は、先に説明したようなものである。
【００４５】
図５は、例えば図２の態様の上側からの概略図である。マントル６は、入口および出口を有しており、これらは矢印により示すように、マントルに入り、また、マントルから出るようになっている。マントルは、反応容器２の回転軌道の一部のみを覆っており、妨害されない測定のための弧部分が残っていることがわかる。ここでは、測定器は、赤外線センサー７、レーザー源８および反射率センサー９を含んで成ることを示している。
【００４６】
図６においては、マントル６が反応容器２の全回転軌道を覆っている態様を示している。ここでは、センサー７によって検出された信号に対して透過性を有するか、またはそれを伝達することができるマントルを通して、好ましくはマントルのセクション１５を通して、センサー７により示されるように測定値が得られる。
【００４７】
図７は、加熱源１７、例えば管状赤外線ランプが、可動性の反射体１６に配置されている態様の概略的な断面を示している。赤外線ランプを起動させ、そして、回転している反応容器に近づくように反射体を上げることによって、効果的に試料を加熱する。ランプを停止させ、そして、反射体を下げると、熱は、すぐに、その試料から消散する。冷却は、装置の全内部または回転している反応容器の近傍の部分を冷却することによっても、助成され得る。反射体１６は、反応容器の回転軌道より下に配置する必要はなく、その軌道より上、あるいはその軌道の周りに配置され得る。その場合、回転している反応容器の近傍に近づくように、反射体を下方向または内方向へ移動させる。
【００４８】
本発明の１つの態様では、該装置は、１つまたはそれ以上の反応容器の内容物を相当な遠心力下に付することができ、その遠心力は、好ましくは約５００×Ｇ〜約２００００×Ｇの範囲あるいはそれ以上、好ましくは約１５００×Ｇ〜２００００×Ｇの範囲、および最も好ましくは約５０００×Ｇ〜約１５０００×Ｇの範囲内にある。本発明装置または方法により達成されるテンペレーションは、当然ながら、反応体積、その構成、温度および遠心力の関数である。
【００４９】
更に、本発明の１つの態様の装置は、遠心力に対して内側に向いている反応容器の一部を冷却する手段を含んで成る。この場合、ローターは、反応容器の近位端部または「上方」と冷却媒体との間で熱的な接触が阻害されないように修正させられる。
【００５０】
加熱手段は、少なくとも１つの熱源、例えば、熱を生じる波長範囲内の放射線を発する放射源、例えば赤外線源、電気的要素、高温ガスまたは高温液体を含んで成り、遠心機に接続されるか、または遠心機内に設置されるものであり、遠心機のローターに、適切に設置された反応容器が遠心力下に付された時、発する熱が、１または複数の反応容器の１またはそれ以上の遠位端部に達するようになっている。本発明が、サイクル的加熱および冷却用を意図する際、この熱源は、遠心機を停止させることなく、スイッチがオンおよびオフされ得る。熱源の影響は、１または複数の反応容器内に含まれる反応混合物の全量を所望の化学反応に対して適切な温度にするほどに十分高いものである必要がある、。加熱手段は、好ましくは、１もしくは複数の温度センサーまたはサーモスタットを含んで成り、加熱をモニタリングおよび制御する。
【００５１】
本発明の１つの態様では、高温空気を、回転している反応容器または該容器の少なくとも頂端部の周囲の空間に強制的に入れる。この空間を「加熱マントル（ｈｅａｔｉｎｇ ｍａｎｔｌｅ）」と呼ぶ。
【００５２】
ここで引用する高温空気は、空気または適当な気体混合物であり、反応容器の材料、例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管またはマイクロタイターウェルの熱可塑性材料の融点より高い温度まで加熱される。この温度は、使用する設備に起因する制限の下、好ましくはできる限り高く、好ましくは２００〜８００℃の幅、最も好ましくは約６００℃である。
【００５３】
冷却効果は、不変の回転速度において達成される。本発明の１つの態様では、ローターに対して加熱マントルを移動させること、例えば、加熱マントルを上げること、またはローター下げることのいずれかによって、加熱マントルを反応容器の極近傍から取り除く。この場合、速く回転している反応容器は、周囲の空気または気体混合物、例えば遠心機の中の空気または周囲の空間から吸引された空気と接触することになる。好ましい態様では、遠心機内の空気または気体混合物が周囲温度以下に冷却される。ローターは、冷却された、より大きい空間内に格納されてよい。加熱マントルを、反応容器との極近接状態から離すと、冷却空気により容器が急速に冷却される。
【００５４】
冷却手段は、冷却媒体、例えば気体、液体または周囲の空気を反応容器の近位端部あるいは「上方端部」の極近傍に導く手段を含んで成ってよい。適した冷却媒体は、液体窒素または冷却窒素ガスである。
【００５５】
本発明を使用する時、全ての反応混合物またはその一部分を含む反応容器は、問題としている反応容器を遠心作用下に付す標準的な実施手順に基づいて、閉鎖端部を下または他の向きにして遠心機のローターに配置する。それから、遠心機を始動、即ち、ローターを回転させる機関のスイッチを入れる。ローターを選択した重力までに加速すると、その回転を一定速度に保持する。この時、加熱源のスイッチを入れると、反応容器の頂端部において優先的に温度が上昇する。この熱は、反応容器の壁の材料を介して、反応混合物の本体（バルク）の最も遠位の部分まで伝達される。代わりに、温度の上昇により増加した分子運動が広がること、即ち、反応混合物のこの加熱した部分の密度が減少することになる。反応混合物のより高密度な部分に作用している重力場から生じる圧力によって、より低密度の部分は、強制的に上方向へ移動し、より高密度の反応混合物と迅速に入れ替わることになる。その後、この高密度部分は加熱源からの熱伝達の同じプロセスによって加熱されることになる。反応混合物のこの部分の密度は減少し、上方向に移動し、より温度の低い反応混合物と入れ替わることになる。本発明の１つの態様では、冷却手段は、反応容器の上方部あるいは近位端部に対して同時に作用し、完全な混合と均一化を確保するように協動する。この一連の事象は継続して起こり、従って、完全に混合された均一な反応混合物および反応混合物のバルクの均一な温度分布をもたらすことになる。
【００５６】
好ましい態様では、本発明の装置は、赤外線センサー、および好ましくは回転している容器の内容物の温度をモニタリングするフォーカシング赤外線センサー（focussed IR-sensor）を備えている。温度を制御する先行技術は、しばしは熱電対を用いており、１つの反応容器に熱電対が設置され、熱サイクル過程に用いられている。しかしながら、これは必ずしも正確なものではない。反応容器に使用する多くのプラスチック材料は、赤外線放射を吸収しないので、本発明に基づく測定は、試料自身内の温度を正確に提供するものである。この測定は、アルゴリズムにより管理でき、回転している容器の平均温度のみならず、平均値からのあり得る偏差を提供しうるものである。
【００５７】
上述の赤外線センサーは、好ましくは、反応容器を照射する集光光線を発するレーザーを備えている。容器上に生じるそのレーザー「ポイント」は、オプションとしてのセンサーを用いて測定され得るものであり、赤外線センサーの焦点および回転速度の調整、試料温度の測定の開始、反射定量的（ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｒｉｃ）および／または蛍光定量的測定に用いることができる。温度測定を開始するためにレーザーの反射を用いる時は、より高い精度を達成される。
【００５８】
更に、赤外線センサーとおそらく反応容器を加熱するのに用いられ得る赤外線源との間の干渉を避けるため、赤外線源は、赤外線センサーの読取波長と明らかに異なる波長の赤外線を発するように選択される。
【００５９】
本発明の態様における、重力場と反対方向からの同時冷却は、密度の均一化の程度を効果的に増加させ、従って、反応混合物のテンペレーションおよび反応混合物の均一化に要する時間を短くする。
【００６０】
本発明の方法は、次の工程を含んで成る：
ｉ）少なくとも１つの反応物質を、反応容器に秤取すること；
ｉｉ）内容物を含む該反応容器を、それを遠心力下および加熱下に同時にさらすことができる装置に配置すること；
ｉｉｉ）該反応容器を遠心力下にさらすこと；
ｉｖ）反応容器の遠位端部を加熱下にさらすこと。
本発明の好ましい態様では、遠心力下にある時に内容物を放出するだけのキャピラリーまたは同様のデバイスを用いて、少なくとも１つの反応物質を添加する。
【００６１】
本発明の１つの態様に基づく方法は、次の工程を含んで成る：
ｉ）少なくとも１つの反応物を、意図する処置あるいは処理工程に関する情報を有する反応容器に秤取する工程；
ｉｉ）遠心作用およびと加熱に同時に付すことができる装置に接続されているあるいはその一部であるデバイスによって情報を読み取る工程；
ｉｉｉ）内容物を含む該反応容器を、遠心作用および加熱用の上述の装置に配置する工程；
ｉｖ）該容器を遠心作用に付す工程；
ｖ）反応容器の遠位端部を加熱に付す工程；
ｖｉ）工程ｉｖ）および工程ｖ）を、反応容器に含まれる情報に応じて実施する工程。
【００６２】
上記の工程ｉ）〜工程ｖｉ）に基づく方法を実施する時は、オペレーターがミスを犯す危険性が、完全に無くならないとしても、最小限となる。また、この方法は、プロセスの自動化を相当可能にし、更に、品質制御スキームとの適合性を容易にする。
【００６３】
一般的に、本発明は、反応容器内に含まれる流体媒体中で化学反応を実施する場合の方法をも開示し、この方法は、添付の装置に関する請求項のいずれか１つに記載された装置を用いることを特徴とする。
【００６４】
特に、本発明は、高度な均一化が要求され、また、繰り返されるテンペレーションを含む反応、例えば、熱サイクルを含む分析または合成を実施するための、新規かつ効率的な方法を開示する。そのような分析の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術である。もう一つの重要な用途は、高処理能力スクリーニングの分野にある。これおよび他の方法は、本明細書において先に説明している。
【００６５】
本発明の装置は、「ホット・スタートＰＣＲ（ｈｏｔ ｓｔａｒｔ ＰＣＲ）」として一般に知られるＰＣＲ分析のバリエーションに特に適している。本発明の装置を使用して、温度を、まず、プライマーのアニール温度以上の温度にセットする。この初期テンペレーションの間、ローターは、テンペレーションを助成するのに十分なより低い速度で回転させる。所望の温度に達した時、試薬キャピラリーまたは試薬カートリッジ（例えば、同一出願人によるＰＣＴ／ＳＥ９１／００３４３およびＰＣＴ／ＳＥ９７／０１５６２で開示されているようなキャピラリーまたはカートリッジ)により試薬が添加される。試薬キャピラリーまたはカートリッジは、回転速度の増加により添加を始める。より速い回転速度においては、試薬用キャピラリーまたはカートリッジは、遠心力により空になり、明細書において上述したようにＰＣＲ分析を進めることができる。
【００６６】
本発明のデバイスまたは装置を使用してＰＣＲ分析を実施する時には、増幅工程に要する時間がかなり短縮される。ＰＣＲ増幅は、完了するまでに通常約２時間要するが、発明者によって実施した実際の実験では、影響ない、または向上した結果を伴って２０分以下の時間で実施することができる。この結果は、高特異性および高分解能を示すＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルで確認した。
【００６７】
本発明を好ましい態様に関して説明しているが、これは、発明者が現在知りうるベストモードを構成すると知っているものであるが、当業者とって自明である数々の変更および修正は、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく、為され得るものであると理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、概略的に、本発明の第１の態様を示しており、プロセッサー（４）と接続した温度測定装置（７）を含む態様である。
【図２】 図２は、本発明の第２の態様を示しており、温度測定装置（７）がレーザー源（８）とセンサー（９）とを具備している。
【図３】 図３は、本発明の第３の態様を示しており、温度は、プローブ（１２）によって測定され、プローブは送信器（１３）と受信器（１４）を介してプロセッサー（４）と通信している。
【図４】 図４は、本発明の装置の概略的な断面を示しており、加熱用マントル（６）のような基本的な構成要素を示している。
【図５】 図５は、図２の態様の上側からの概略図である。
【図６】 図６は、態様、例えば図１の態様における上側からの概略図である。
【図７】 図７は、垂直に移動可能な下方のマントルハーフ（１６）に設置された加熱源（１７）を有する装置の概略的な断面を示している。

Claims (18)

1. 反復的なテンペレーションおよび均一化を伴う化学反応または生化学反応を行うための方法であって、
   ａ）均一的にインキュベーションに付す反応混合物を反応容器に仕込む工程、
   ｂ）前記反応容器およびその内容物を遠心力に付す工程、ならびに
   ｃ）前記遠心力下における選択された反応に相当する温度となるように前記反応容器内の反応混合物の温度を調整する工程
   を含んで成り、工程ｃ）では、反応混合物のより高密度な部分に作用している重力場により、均一な反応混合物および反応混合物のバルクの均一な温度分布がもたらされる、方法。
2. 工程ｂ）における遠心力が５００×Ｇ〜２００００×Ｇの範囲である、請求項１に記載の方法。
3. 遠心力が１５００×Ｇ〜２００００×Ｇの範囲である、請求項２に記載の方法。
4. 反応容器の加熱を、前記反応容器内の反応混合物に熱を生じる波長範囲内の放射線を発する放射源を用いて行う、請求項１に記載の方法。
5. 反応容器の冷却を、周囲の空気、冷却空気、空気以外の冷却ガスを含んだ環境で反応容器を回転させることによって行う、請求項１に記載の方法。
6. 温度測定は、回転する容器の内容物の温度をモニタリングする赤外線（ＩＲ）センサーを用いて行う、請求項１に記載の方法。
7. 反復的なテンペレーションがサイクル的な温度変化を伴う、請求項１に記載の方法。
8. 工程ｃ）の調整を、同時に加熱および冷却することによって行う、請求項１に記載の方法。
9. 生化学反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 反復的なテンペレーションおよび均一化を伴う化学反応または生化学反応を実施するためのデバイスであって、
    ａ）均一的にインキュベーションに付される反応混合物を含む反応容器（２）を保持する手段（１）、
    ｂ）反応容器およびその内容物を遠心力に付す手段（３）、ならびに
    ｃ）前記遠心力下における選択された反応に相当する温度となるように前記反応容器内の反応混合物の温度を調整する手段（５,６）であって、それによって、反応混合物のより高密度な部分に作用している重力場により、均一な反応混合物および反応混合物のバルクの均一な温度分布がもたらされることになる温度調整手段（５,６）
    を有して成る、デバイス。
11. 前記ｂ）の手段（３）によって作り出される遠心力が５００×Ｇ〜２００００×Ｇの範囲である、請求項１０に記載のデバイス。
12. 遠心力が１５００×Ｇ〜２００００×Ｇの範囲である、請求項１１に記載のデバイス。
13. 反応容器（２）の内容物を加熱する手段を有して成る温度調整手段（５,６）は、前記反応容器内の反応混合物に熱を生じる波長範囲内の放射線を発する手段を有して成る、請求項１０に記載のデバイス。
14. 反応容器（２）の内容物を冷却する手段を有して成る温度調整手段（５,６）は、回転する反応容器を、周囲の空気、冷却空気、空気以外の冷却ガスを含んだ環境に曝す手段を有して成る、請求項１０に記載のデバイス。
15. 反応混合物の温度を測定するための温度測定手段を有して成り、該温度測定手段が、反応混合物によって発せられる赤外線放射をモニタリングする手段（７）を有して成る、請求項１０に記載のデバイス。
16. 反復的なテンペレーションがサイクル的な温度変化を伴う、請求項１０に記載のデバイス。
17. 前記ｃ）の調整を、同時に行う加熱および冷却によって行う、請求項１０に記載のデバイス。
18. 生化学反応がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１０〜１７のいずれかに記載のデバイス。

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