CN101135664A

CN101135664A - 用于区分ⅰ、ⅱ期和ⅲ、ⅳ期结直肠癌的蛋白标志物及其应用

Info

Publication number: CN101135664A
Application number: CNA2007100467076A
Authority: CN
Inventors: 郑民华; 陈国强; 乐飞; 王立顺; 冯波
Original assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2007-09-29
Filing date: 2007-09-29
Publication date: 2008-03-05

Abstract

本发明提供了一组用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的蛋白标志物，包括SerpinB1、PCNA和PPIase B三种蛋白，还提供了一种利用上述蛋白标志物区分I、II期和III、IV期结直肠癌的方法，包括步骤：用二维电泳技术对样品全蛋白进行定量蛋白质组学分析，获得蛋白凝胶图像，从而获得上述蛋白的灰度值，代入下列判别方程：F1＝0.032×Serpin B1+0.012×PCNA+0.001×PPIase B－12.186，F2＝0.008×Serpin B1+0.004×PCNA+0.003×PPIase B－6.033，如果F1＞F2，则可以判断样品属于I期或II期结直肠癌；如果F1＜F2，则可以判断样品属于III期或IV期结直肠癌，本发明的该组蛋白标志物可以准确区分I、II期和III、IV期结直肠癌，由此将降低I、II期结直肠癌患者的术前机体负担和经济负担，提高III、IV期结直肠癌患者的手术根治效果和生存率。

Description

用于区分Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ、Ⅳ期结直肠癌的蛋白标志物及其应用

技术领域

本发明涉及蛋白质技术领域，更具体地，涉及区分结直肠癌的蛋白标志物，特别是指一组用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的蛋白标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌是国内发病率排名居第三位的常见恶性肿瘤，死亡率也居于第五位，在上海等发达城市情况更为严重，是威胁到广大人民健康和生命的重大危险因素之一。

临床上将结直肠癌分为无淋巴结转移组(I期、II期)和有淋巴结转移组(III期、IV期)，四期患者的5年率分别为93.2％、82.5％、59.5％和8.1％。目前临床上提倡对III期和IV期患者应用新辅助治疗，即术前放、化疗，以提高手术根治效果和生存率。

遗憾的是，目前临床上对结直肠癌患者的术前分期和决定是否应用新辅助治疗尚缺乏有效的客观指标。影像学诊断将所有肿大的淋巴结均判断为阳性转移，对于术前分期有一定的指导作用，但存在较高的假阳性率，同时对于没有显著增大的癌侵犯淋巴结也不能正确识别。淋巴结转移阴性的结直肠癌患者如被误诊为淋巴结诊断转移阳性后，术前进行放、化疗的新辅助治疗不但没有治疗效果，反而加重了患者的术前机体负担，并且带来较重的经济负担。

故而，寻找具有高灵敏度和特异度的方法对结直肠癌患者进行术前区分的客观指标是十分有必要并有良好应用前景的。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的蛋白标志物，还提供了使用该组蛋白标志物区分I、II期和III、IV期结直肠癌的方法及其用途，使用该组蛋白标志物可以准确区分I、II期和III、IV期结直肠癌，由此将降低I、II期结直肠癌患者的术前机体负担和经济负担，提高III、IV期结直肠癌患者的手术根治效果和生存率。

为了实现上述目的，本发明的一组用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的蛋白标志物采用的技术方案如下：

该组用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的蛋白标志物，其特点是，包括SerpinB1、PCNA和PPIaseB三种蛋白。

本发明还提供了一种利用上述蛋白标志物区分I、II期和III、IV期结直肠癌的方法，其特点是，包括步骤：

a.提取样品全蛋白，应用二维电泳技术进行定量蛋白质组学分析，获得蛋白凝胶图像；

b.将所述蛋白凝胶图像进行归一化处理，对其中的Serpin B1蛋白点、PCNA蛋白点和PPIase B蛋白点进行定量测量，获得所述Serpin B1蛋白点、所述PCNA蛋白点和所述PPIaseB蛋白点的灰度值；

c.将所述Serpin B1蛋白点、所述PCNA蛋白点和所述PPIase B蛋白点的灰度值代入下列判别方程进行计算：

{\begin{matrix} F 1 = 0.032 \times Serpin B 1 + 0.012 \times PCNA + 0.001 \times PPIase B - 12.186; \\ F 2 = 0.008 \times Serpin B 1 + 0.004 \times PCNA + 0.003 \times PPIase B - 6.033; \end{matrix}

其中，所述Serpin B1表示所述Serpin B1蛋白点的灰度值，所述PCNA表示所述PCNA蛋白点的灰度值，所述PPIaseB表示所述PPIaseB蛋白点的灰度值，如果F1>F2，则可以判断所述样品属于I期或II期结直肠癌；如果F1<F2，则可以判断所述样品属于III期或IV期结直肠癌。

本发明还提供了上述的蛋白标志物用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的用途。

本发明的有益效果如下：

1.本发明以SerpinB1、PCNA和PPIase B三种蛋白在样本中的表达水平为联合指标，用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌，回代检验的分类正确率达100％，交叉验证的分类正确率达93.3％，分类正确率十分理想。

2.本发明可以准确区分I、II期和III、IV期结直肠癌，从而为结直肠癌患者是否需要进行新辅助治疗提供准确参考，由此将降低I、II期结直肠癌患者的术前机体负担和经济负担，提高III、IV期结直肠癌患者的手术根治效果和生存率。

附图说明

图1为一个结直肠癌组织样本的全蛋白在经过双向电泳分离后的凝胶图谱。

具体实施方式

本发明针对现有技术中的缺点，应用定量蛋白质组学技术，寻找出了一组蛋白标志物，可以区分I、II期和III、IV期结直肠癌，总体准确率达93.3％。

本发明采用了15个结直肠癌组织样本，应用二维电泳技术对它们进行定量蛋白质组学分析，将肿瘤组织的全蛋白根据等电点和分子量大小的不同，经过第一向pH3-10的17cm胶条等电聚焦和第二向十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)的分离。

本发明将SerpinB1、PCNA和PPIase B三种蛋白的表达水平作为联合指标，可以将I、II期和III、IV期结直肠癌患者进行良好区分。其中Serpin B1和PCNA在III、IV期肿瘤中表达下调，I、II期肿瘤的这两种蛋白表达水平分别是III、IV期肿瘤的2.68倍和2.28倍；而III、IV期肿瘤的PPIase B的表达则是I、II期肿瘤的1.69倍。

将结直肠癌组织样本经二维电泳分析后，使用PDQuest 7.20(美国Bio-Rad公司)二维电泳图像分析软件对扫描仪获取的蛋白凝胶图像里的三个蛋白点进行定量测量。进行归一化处理后，读取图像中蛋白点的灰度值(单位：ppm)，再结合术后病理诊断的临床分期结果运用SPSS13.0统计分析软件进行判别分析，建立了二分类的判别方程，判别方程如下所示：

{\begin{matrix} F 1 = 0.032 \times Serpin B 1 + 0.012 \times PCNA + 0.001 \times PPIase B - 12.186; \\ F 2 = 0.008 \times Serpin B 1 + 0.004 \times PCNA + 0.003 \times PPIase B - 6.033 . \end{matrix}

对15个样本的回代检验的分类正确率达100％，交叉验证的分类正确率达93.3％，分类正确率十分理想。

利用这组判别方程即可对结直肠癌样品进行正确分期，仅需将该样品的全蛋白采用二维电泳技术进行定量蛋白质组学分析，将图像进行归一化处理，获得Serpin B1、PCNA和PPIase B三种蛋白的灰度值，代入上述判别方程。如果F1>F2，则可以判断样本属于淋巴结转移阴性(I期、II期)，提示预后较好，术前不需给予新辅助治疗；如果F1<F2，则可以判断样本属于淋巴结转移阳性(III期、IV期)，提示预后较差，需要予以新辅助治疗。

本发明建立判别方程的具体过程如下：

应用美国Bio-Rad公司的17cm的pH3-10预制IPG胶条对这15个结直肠癌组织样本在Bio-Rad公司的二维电泳系统中按Bio-Rad公司的官方实验方案进行了蛋白二维电泳和银染显影，每个结直肠癌组织样本取0.1g，液氮条件下研磨成粉末，于10％三氯乙酸/丙酮中沉淀过夜，15000g离心，弃上清。-20度丙酮洗涤后15000g，离心，弃上清，重复两次。加入0.5ml裂解液，裂解液含7M(摩尔)尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)，50mM(毫摩尔)DTT(二硫苏糖醇)。30mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)，0.2％两性电解质。室温条件裂解1小时，35000g离心1小时，取上清，RC-DC定量试剂盒(美国Bio-Rad公司)定量样品蛋白浓度。取200微克样品蛋白进行电泳分析。第一向等电聚焦设备PROTEAN IEF Cell(美国Bio-Rad公司)，50V水化12h，200V×30min，500V×30min，1000V×1h，10000V×2h(线性升压)，10000V完成60000V*h。胶条为IPG ReadyStrip pH3-10 17cm(美国Bio-Rad公司)。完成聚焦后分别用含130mM的DTT和135mM的IAA(碘乙酰胺)的平衡液平衡15分钟。平衡液母液含6M尿素，2％十二烷基磺酸钠，50mM三羟甲基氨基甲烷一盐酸，20％甘油。第二向聚丙烯酰胺电泳设备为PROTEAN II Multi-cell(美国Bio-Rad公司)。16mA/胶×30分钟，24mA/胶×4小时30分钟。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺的浓度为12％。完成第二向电泳后，用40％乙醇/10％乙酸固定凝胶过夜。敏化液(0.314％五水硫代硫酸钠，6.8％醋酸钠，30％乙醇)孵育30min，去离子水洗5min×3次。0.25％硝酸银染色20分钟，去离子水快速洗2分钟后，显色液(2.5％碳酸钠，0.04％甲醛)显色，1.54％二钠·二水·乙二胺四乙酸终止显色。图1为其中一个结直肠癌组织样本的全蛋白在经过双向电泳分离后的凝胶图谱，本发明所选用的三个蛋白点，在凝胶中的位置如图1中标示。

然后用PDQuest7.20软件分析GS-800 Calibrated Densitometer(美国Bio-Rad公司)扫描仪获得的凝胶图像，读取的灰度值导入SPSS 13.0统计软件进行判别分析，建立判别方程，根据相应的计算概率结果进行分类。样本属于计算所得结果概率大的组。最后的区分结果中，9例早期结直肠癌样本正确分类，晚期的6例结直肠癌样本正确分类，总正确率100％。交叉验证，9例早期结直肠癌样本正确分类，晚期的6例结直肠癌样本有5个正确分类，总正确率93.3％。验证结果见下表1：

表1 利用判别方程进行分类及验证结果

对于待分类的新样品，在其二维电泳所得图像进行归一化处理后，定量测量出所述三个蛋白的灰度值，把三个蛋白的灰度值应用判别方程进行计算分类，从而预测新样品的结直肠癌是否已经发生淋巴结转移，本发明可以用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌样品，为后续研究提供依据，还可以用于结直肠癌患者的术前分期，以便帮助确定是否需要进行新辅助治疗。

综上所述，本发明的用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的蛋白标志物可以准确区分I、II期和III、IV期结直肠癌，由此将降低I、II期结直肠癌患者的术前机体负担和经济负担，提高III、IV期结直肠癌患者的手术根治效果和生存率。

需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。

Claims

1.一组用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的蛋白标志物，其特征在于，包括SerpinB1、PCNA和PPIase B三种蛋白。

2.一种利用如权利要求1所述的蛋白标志物区分I、II期和III、IV期结直肠癌的方法，其特征在于，包括步骤：

b.对所述蛋白凝胶图像进行归一化处理，其中的Serpin B1蛋白点、PCNA蛋白点和PPIase B蛋白点进行定量测量，获得所述Serpin B1蛋白点、所述PCNA蛋白点和所述PPIase B蛋白点的灰度值；

\{\begin{matrix} F 1 = 0.032 \times SerpinB 1 + 0.012 \times PCNA + 0.001 \times PPIaseB - 12.186; \\ F 2 = 0.008 \times SerpinB 1 + 0.004 \times PCNA + 0.003 \times PPIaseB - 6.033; \end{matrix}

其中，所述Serpin B1表示所述Serpin B1蛋白点的灰度值，所述PCNA表示所述PCNA蛋白点的灰度值，所述PPIase B表示所述PPIase B蛋白点的灰度值，如果F1＞F2，则可以判断所述样品属于I期或II期结直肠癌；如果F1＜F2，则可以判断所述样品属于III期或IV期结直肠癌。

3.如权利要求1所述的蛋白标志物用于区分I、II期和III、IV期结直肠癌的用途。