CN106405104A - 一种新的肝硬化或肝纤维化标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肝硬化、肝纤维化的诊断和治疗领域，本发明具体涉及高尔基体蛋白73(GP73)和用于检测高尔基体蛋白73(GP73)浓度的物质在制备筛查或辅助诊断肝硬化或肝纤维化相关疾病的产品或辅助判断疾病的预后的产品中的应用。本发明证明高尔基体蛋白73(GP73)可以作为一种新的肝硬化标志物，特别对非乙型肝炎病毒感染所致的肝硬化也具有诊断价值，而对原发性肝癌无诊断价值。

Description

一种新的肝硬化或肝纤维化标志物
技术领域
本发明属于生物医学领域，涉及检测高尔基体蛋白73(GP73)浓度的物质的新用途以及高尔基体蛋白73(GP73)在制备筛查诊断肝硬化或肝纤维化疾病的产品中的应用。
背景技术
2000年Kladney等在研究成人巨细胞肝炎时发现了高尔基体蛋白73(GP73)，至今已有16年(Kladney RD,Bulla GA,Guo L,et al.Gene.2000.249(1-2):53-65)。GP73是一个有402个氨基酸、相对分子量为73kDa的跨膜糖蛋白，又称为II型高尔基体膜蛋白(Golgiphosphoprotein 2，Golph2)和高尔基体膜蛋白I(Golgi membraneprotein 1，Golm1)。它通常位于反式高尔基复合体中，编码GP73蛋白的基因位于第9号染色体，全长共3080个核苷酸，编码区位于199-1404nt。GP73在多种组织中均有表达，但强弱不等，在小肠、结肠以及胃中呈高表达，而在心脏中表达最少，在肝、肾、脾、肺、子宫及睾丸表达很弱，在正常的人体肝组织中GP73主要表达于正常肝脏组织的胆管上皮细胞，而在正常肝细胞中几乎不表达。Kladney等在随后的研究中发现，在病毒(HBV及HCV)感染和非病毒原因(酒精性肝病及自身免疫性肝炎)引起的肝病患者(慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、酒精性肝硬化及自身免疫性肝炎导致的肝硬化)组织中GP73水平均显著上调，高于正常肝组织70倍，然而肝病组之间的差异无统计学意义。Kladney等的进一步研究表明，GP73在正常肝组织中呈低表达，在多种原因(病毒相关性、酒精性或自身免疫性)导致的肝脏疾病中GP73表达水平均显著升高的同时，胆管上皮细胞中GP73的表达变化并不明显，而受损肝细胞较患病前显著表达GP73，表明肝病中GP73的高表达是肝细胞中GP73表达上调的结果，这是GP73应用于肝脏疾病领域的病理基础(Kladney RD,Cui X,Bulla GA,Brunt EM,FimmelCJ.Hepatology.2002.35(6):1431-40.)。Iftikhar等研究发现GP73在急性肝炎(病毒性和自身免疫性)和进行性肝硬化(酒精性肝病和慢性丙型肝炎)中表达升高，自身免疫性肝炎在经过免疫抑制剂治疗后，GP73的表达降至正常水平，表明该疾病起初的GP73高水平表达可以逆转，Iftikhar认为GP73的表达可能存在两种调节机制：一种是急性的肝损伤，另一种存在于慢性肝病的进展过程中(Iftikhar R,Kladney RD,Havlioglu N,et al.Am JGastroenterol.2004.99(6):1087-95.)。2005年Block等的研究是将GP73应用于肝癌临床领域的重要一步，他们在研究血清GP73在土拨鼠中的表达关系时发现，GP73浓度在患肝癌土拨鼠中显著高于非肝癌土拨鼠，进而研究GP73在人肝癌中的表达也得出了相同的结论。其中发现GP73诊断肝癌的敏感性为69％，特异性为75％，提示了肝癌患者血清中GP73水平明显增高，并且对于诊断早期肝癌，GP73可能优于AFP(Block TM,Comunale MA,Lowman M,et al.Proc Natl Acad Sci U S A.2005.102(3):779-84.)。Cassandra因此提出GP73可能成为更好的诊断肝癌尤其是早期肝癌的血清标志物。
Marrero(Marrero JA,Romano PR,Nikolaeva O,et al.J Hepatol.2005.43(6):1007-12.)与Hu(Hu JS,Wu DW,Liang S,Miao XY.Med Oncol.2010.27(2):339-45.)等对GP73在人肝癌中的研究较早，他们认为GP73在肝癌中的含量显著高于肝炎及肝硬化患者，与AFP诊断肝癌相比效果较好。毛一雷等(Mao Y,Yang H,Xu H,et al.Gut.2010.59(12):1687-93.)对GP73的临床研究较为深入，其报道的4217例大样本临床试验显示：当取GP73相对单位8.5为诊断肝癌临界值时，其诊断灵敏度与特异度分别为74.6％和97.4％，均高于AFP检测，GP73联合AFP检测效果更好，同时该研究表明，尽管GP73在肝脏良性疾病(如肝炎、肝硬化)以及肝外其它恶性肿瘤中均有不同程度升高，但其在肝癌中升高尤为显著，毛等的研究成果极大的推动了GP73在肝癌诊断领域中的应用。GP73相较于AFP的优势在于其提高了部分AFP阴性肝癌患者的检出。
GP73在预测肝癌预后中的作用同样值得探讨，Sun等(Sun Y,Yang H,Mao Y,etal.J Gastroenterol Hepatol.2011.26(7):1207-12.)研究结果表明，血清中GP73浓度与患者年龄、性别、肿瘤数目、肝功能、肿瘤大小、门静脉侵犯无关，而肿瘤组织中GP73浓度与肿瘤直径、门静脉侵犯、肿瘤分化程度密切相关，提示组织中GP73浓度与肿瘤恶性程度有关，但未能揭示GP73与患者生存期的关系。
GP73在评价肿瘤治疗效果中的作用也需要我们关注。Harm等(Hann HW,Wang M,Hafner J,et al.Cancer Biomark.2010.7(6):269-73.)认为接受首次疗后GP73浓度下降患者可获得近6年的无瘤生存期，而在首次治疗后GP73浓度上升患者在5年内出现复发可能性大。毛等研究者也探讨了肝癌术后血清中GP73表达水平与肿瘤复发的关系，结果显示患者术后GP73浓度进行性下降，在术后第14天出现低峰，而当疾病复发时GP73浓度再次显著升高。以上研究提示GP73可能在肝癌患者术后随访、监测疾病复发中有一定作用。
目前，大量文献已显示GP73可作为肝癌诊断的血清标志物，联合AFP检测可以提高诊断灵敏度与特异度，已有研究结果显示其可能在肝癌术后监测中有一定意义。但事实上，国内外学者对GP73在肝癌临床中的作用意见也并不统一。Morota(Morota K,Nakagawa M,Sekiya R,et al.Clin Chem Lab Med.2011.49(4):711-8.)与Gu等(Gu Y,Chen W,Zhao Y,Chen L,Peng T.Ann Clin Biochem.2009.46(Pt 1):38-43.)认为GP73可以作为肝脏疾病的诊断标记物，其在肝硬化及肝癌患者中浓度显著高于肝炎患者及健康受试者，但不推荐其单独作为肝癌诊断标记物。Yamamoto等(Yamamoto K,Imamura H,Matsuyama Y,et al.JGastroenterol.2010.45(12):1272-82.)的研究显示患者手术前后GP73浓度变化不大，不建议其作为术后检测的临床指标。同时，前发表的成果多来源于回顾性临床研究，因此，GP73是否对肝癌真正具有诊断价值，仍亟需大规模、前瞻性、多中心合作以获取更高级别的证据支持。另外，尽管GP73在某些肝脏疾病例如急性肝炎(病毒性和自身免疫性)和进行性肝硬化(酒精性肝病和慢性丙型肝炎)中表达升高，然而肝病组之间的差异无统计学意义，是否GP73可以作为未发生肝癌之前的病情的诊断标志物，也亟待揭示。
发明内容
本发明的目的是提供了一种用于检测高尔基体蛋白73含量的物质的新用途。
本发明所提供的用于检测高尔基体蛋白73含量的物质新用途具体为用于检测高尔基体蛋白73含量的物质制备筛查、辅助诊断肝脏疾病或辅助判定肝脏疾病预后的产品中的应用。
在本发明中，高尔基体蛋白73(GP73)可用作从健康人以及肝纤维化、肝硬化患者中筛查判别诊断肝纤维化、肝硬化(非乙型肝炎病毒感染的)的标志物，且依靠检测筛查对象样本中的GP73蛋白浓度进行筛查诊断不同程度肝纤维化或肝硬化(主要为非乙型肝炎病毒感染的)的方法结果准确、操作简便。同时，根据对现有技术的理解，标志物通常可用于疾病的诊断、治疗及预后；GP73在不同疾病程度组中的变化和良好区分也充分说明本领域技术人员可以基于本发明实验结果将GP73作为肝脏疾病(例如，非乙型肝炎病毒感染的肝脏疾病)辅助治疗或预后判断的标志物。
上述应用中，所述检测高尔基体蛋白73含量的物质包括高尔基体蛋白73和/或高尔基体蛋白73的抗体；
所述高尔基体蛋白73为人高尔基体蛋白73，所述高尔基体蛋白73的抗体为人高尔基体蛋白73的抗体；
所述人高尔基体蛋白73的抗体具体为人高尔基体蛋白73单克隆抗体、多克隆抗体或基因工程抗体。
上述任一所述应用中，所述的检测高尔基体蛋白73的物质还包括除高尔基体蛋白73和/或高尔基体蛋白73的抗体以外的测定高尔基体蛋白73含量所需的试剂和所需仪器。
含有高尔基体蛋白73编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌作为制备高尔基体蛋白73所需的生物材料在制备筛查、辅助诊断肝脏疾病或辅助判定肝脏疾病预后的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
含有高尔基体蛋白73抗体编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或高尔基体蛋白73抗体的免疫原或抗原作为制备高尔基体蛋白73抗体所需的生物材料在制备筛查、辅助诊断肝脏疾病或辅助判定肝脏疾病预后的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中，所述的疾病为肝硬化或肝纤维化，优选所述的肝硬化或肝纤维化为非乙型肝炎病毒感染的肝硬化或肝纤维化。
上述任一所述的应用中，所述产品的筛查或诊断对象为肝硬化、肝纤维化患者或健康人。
上述任一所述的应用中，所述产品以血清、血浆或组织间隙液位待测样本，优选以人血清、血浆或组织间隙液位待测样本。
上述任一所述的应用中，所述产品为试剂盒。
本发明还提供了一种筛查或辅助诊断肝脏疾病或辅助判断肝脏疾病的预后的试剂盒，该试剂盒包括检测高尔基体蛋白73含量的物质。
上述试剂盒中，所述的检测高尔基体蛋白73含量的物质包括高尔基体蛋白73和/或高尔基体蛋白73的抗体。
上述任一所述的试剂盒中，所述的疾病为肝硬化或肝纤维化，优选所述的肝硬化或肝纤维化为非乙型肝炎病毒感染的肝硬化或肝纤维化。
上述任一项所述的试剂盒中，使用所述试剂盒的检测方法包括酶联免疫吸附法、化学发光法、电化学发光、酶促化学发光、时间分辨荧光或上转发光法。
发明的有益效果
本发明的有益效果在于发明GP73对肝癌的诊断价值较为一般，并不能将肝癌患者与肝炎、肝硬化患者区别开，其区分能力还不及AFP的效果好。相反，GP73诊断肝硬化的灵敏度高于血清AFP，区分肝炎或肝硬化患者的能力较强。
附图说明
图1示出的是GP73对肝细胞癌的诊断价值ROC曲线的图。(A)非肝硬化的慢性肝病组、肝硬化组、肝细胞癌HCC、非肝硬化的HCC、由肝硬化转变的HCC组中分别检测GP73在样本中的浓度。(B)区别HCC和非肝硬化的慢性肝病的灵敏度。(C)区别HCC和肝硬化的灵敏度。(D)-(E)不同程度疾病下肝脏的免疫组化图。
图2示出的是GP73对肝硬化的诊断价值ROC曲线的图。(A)GP73对所纳入人群肝硬化的诊断价值(B)慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)中不同标志物的ROC曲线。(C)慢性酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)中不同标志物的ROC曲线。(D)GP73对所其他人群肝硬化的诊断价值(自身免疫性肝病、非酒精性脂肪肝及原发性胆汁性肝硬化等)
图3示出的是血清GP73对肝纤维化诊断价值比较的图。(A)不同程度的肝纤维化组(F＝0、1、2、3、4)中分别检测GP73在样本中的浓度。(B)-(D)不同程度的肝纤维化组中的ROC曲线。(E)不同程度肝纤维化下肝脏的免疫组化图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式及实验数据对本发明作进一步的说明。尽管为了清楚的目的，在下文中使用了专用术语，但这些术语并不意味着定义或限制本发明的范围。
如本文中所使用，术语“灵敏度”也叫“真阳性率”，指代实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％，
如本文中所使用，术语“特异性”也叫“真阴性率”，指代实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。
约登指数(Youden Index)也叫正确诊断指数，其取值范围在(0～1)之间，越接近于1代表诊断准确性越好，本发明方法中将诊断标准定在正确诊断指数最大处。
受试者工作特征(receiver(relative)operating characteristic,ROC)反映了灵敏度与特异度间的平衡，ROC曲线下面积是重要的试验准确度指标。分别计算各个试验的ROC由线下的面积(AUCROC)进行比较，面积大者，试验的诊断价值大。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径买到。
具体实施例：
实施例1血清GP73、AFP、AFP-L3、AFP-L3对原发性肝癌诊断价值的比较
1)研究对象和样本的基线资料
血液样本来自：肝炎患者805例；肝硬化患者2015例；肝癌患者1102例，共3922名患者，患者具体信息见表1。
其中样本均为临床确诊病人的血清，这三种临床样本由解放军第302医院提供，患者于2013年12月至2014年12月就诊于解放军第302医院。
2)统计学方法
应用SPSS21.0(SPSS，Chicago，Illinois，USA)统计软件进行统计学分析，连续变量根据其分布特征选择描述方法，近似服从正态分布的定量资料采用表示，呈偏态分布的定量资料采用中位数(M)及四分位间距描述其分布特征，定性资料组间比较采用χ2检验，两独立样本间比较采用Mann-WhitnyU检验，多组样本之间采用Kruskal Wallis检验。建立受试者工作特征曲线(ROC曲线)，根据曲线下面积比较不同指标对原发性肝癌诊断的价值，以为α＝0.05检验水准。
3)结果
采用北京热景生物技术股份有限公司商品化的ELISA试剂盒，根据试剂盒说明书的具体实验过程，检测血清样本中GP73的含量。结果显示，慢性肝炎，肝硬化以及肝癌中GP73含量分别为45.20±0.78ng/mL、150.32±1.78ng/mL、121.32±2.47ng/mL，见表1。而慢性肝炎，肝硬化以及肝癌中甲胎蛋白AFP3的含量分别是3.12±0.23ng/mL、33.51±4.64ng/mL、567.36±40.71ng/mL。
表1研究对象的检测结果
注：ALT是谷丙转氨酶；AST是谷草转氨酶；PLT是血小板；APRI是一种评分方法，是天冬氨酸氨基转移酶(AST)和血小板(PLT)比率指数；FIB-4是肝病评价指数。
4)血清GP73，AFP，AFP-L3与AFP-L3对原发性肝癌诊断价值的比较
以病理诊断结果为金标准运用ROC曲线分别计算血清GP73，AFP，AFP-L3与AFP-L3的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、假阳性率、Youden指数，并计算其最佳诊断值，结果显示血清高尔基体蛋白73(GP73)，甲胎蛋白(AFP)与甲胎蛋白异质体(AFP-L3)的ROC曲线下面积分别为0.527(95％CI，0.503-0.552)，0.826(95％CI，0.808-0.843P<0.001)和0.824(95％CI，0.806-0.841P<0.001)，见图1，表2。
表2 AFP、AFP-L3、AFP-L3(％)与GP73对肝细胞癌的诊断价值
实施例2血清GP73，AFP，AFP-L3(％)在肝炎，肝硬化及肝癌患者的分布特征
研究对象和统计方法与实施例1相同。实验中，以四分位间距描述AFP，AFP-L3(％)与GP73在肝炎，肝硬化以及肝癌患者中的变化趋势，结果显示GP73在肝炎、肝硬化以及肝癌中的变化趋势都较为明显，但不能很好的将肝癌与肝炎及肝硬化患者区分开来，AFP及AFP-L3(％)仅在肝癌患者中变化明显，能够很好的将肝癌与肝炎及肝硬化患者区分开来，见表3。
表3 GP73，AFP，AFP-L3(％)在肝炎，肝硬化及肝癌患者中的四分位间距
实施例3血清GP73与LSM，FIB4，APRI对肝硬化诊断价值的比较
研究对象和统计方法与实施例1相同。
本部分结果表明GP73诊断肝硬化的灵敏度与特异度分别为83.97％和93.54％，曲线下面积为0.927(95％CI，0.917-0.937)(图2)，其诊断价值优于肝脏硬度测定LSM、FIB-4指数、血小板(PLT)比值指数APRI，见表4，说明GP73区分肝硬化患者的能力较强。
表4 GP73，LSM，APRI与FIB4对肝硬化的诊断价值
实施例4血清GP73对肝纤维化诊断价值的比较
血清GP73可以很好的区分显著肝纤维化(F≥2)、严重肝纤维化(F≥3)及早期肝硬化(F＝4)，血清GP73水平(Means±SE)随着肝纤维化程度升高而升高F0(n＝21，5.74％)：35.18±2.95；F1(n＝97,26.50％)：42.73±2.57；F2(n＝67,18.31％)：50.59±3.48；F3(n＝66,18.03％)：79.93±5.67；F4(n＝115,31.42％)：169.26±7.31(P<0.001)。血清GP73对F≥2、F≥3及F＝4诊断的灵敏度，特异度及AUROC分别为F≥2：64.92％，90.68％，0.828(95％CI:0.785–0.865)；F≥3：80.66％，86.49％，0.895(95％CI:0.859–0.924)；F＝4：82.61％，91.24％，0.933(95％CI:0.902–0.956)，见图3。
上述结果说明GP73可用作从健康人以及肝纤维化、肝硬化患者中筛查判别诊断肝纤维化、肝硬化(非乙型肝炎病毒感染的)的潜在标志物，且依靠检测筛查对象样本中的GP73蛋白浓度进行筛查诊断不同程度肝纤维化或肝硬化(非乙型肝炎病毒感染的)的方法结果准确、操作简便。
以上，基于本发明的实施方式进行了说明，但本发明不限定于此，本领域的技术人员应该明白，在本发明的主旨的范围内能够以进行变形和变更的方式实施，这样的变形和变更的方式，理应属于本发明的保护范围。

Claims (13)

1.用于检测高尔基体蛋白73含量的物质在制备筛查、辅助诊断肝脏疾病或辅助判定肝脏疾病预后的产品中的应用。
2.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的检测高尔基体蛋白73含量的物质包括高尔基体蛋白73和/或高尔基体蛋白73的抗体。
3.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的检测高尔基体蛋白73含量的物质还包括除高尔基体蛋白73和/或高尔基体蛋白73的抗体以外的测定高尔基体蛋白73含量所需的试剂和所需仪器。
4.含有高尔基体蛋白73编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌作为制备高尔基体蛋白73所需的生物材料在制备筛查、辅助诊断肝脏疾病或辅助判定肝脏疾病预后的产品中的应用。
5.含有高尔基体蛋白73抗体编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或高尔基体蛋白73抗体的免疫原或抗原作为制备高尔基体蛋白73抗体所需的生物材料在制备筛查、辅助诊断肝脏疾病或辅助判定肝脏疾病预后的产品中的应用。
6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述的疾病为肝硬化或肝纤维化，优选所述的肝硬化或肝纤维化为非乙型肝炎病毒感染的肝硬化或肝纤维化。
7.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述产品的筛查或诊断对象为肝硬化、肝纤维化患者或健康人。
8.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述产品以血清、血浆或组织间隙液位待测样本，优选以人血清、血浆或组织间隙液位待测样本。
9.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒。
10.一种筛查或辅助诊断肝脏疾病或辅助判断肝脏疾病的预后的试剂盒，该试剂盒包括检测高尔基体蛋白73含量的物质。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：所述的检测高尔基体蛋白73含量的物质包括高尔基体蛋白73和/或高尔基体蛋白73的抗体。
12.如权利要求10或11任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的疾病为肝硬化或肝纤维化，优选所述的肝硬化或肝纤维化为非乙型肝炎病毒感染的肝硬化或肝纤维化。
13.如权利要求10或11任一项所述的试剂盒，其特征在于：使用所述试剂盒的检测方法包括酶联免疫吸附法、化学发光法、电化学发光、酶促化学发光、时间分辨荧光或上转发光法。
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