CN106970232A - 一种新的肝星状细胞标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到生物医药技术领域，本发明涉及HLF在肝星状细胞活化过程中的表达、作用及其应用。本发明提供了HLF作为肝星状细胞标志物的应用价值，以及HLF在肝纤维化病理诊断和治疗中的应用。

Description

一种新的肝星状细胞标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新的肝星状细胞的标志物及其应用。

背景技术

肝纤维化是肝脏对慢性损伤做出反应所导致的肝细胞外基质堆积，其主要病因是慢性肝炎、慢性胆汁阻塞性疾病和慢性代谢性疾病等。早期肝纤维化往往不易被察觉，一旦进入进展期，就会因疤痕组织的堆积而破坏肝脏的正常结构和功能，最终发展为肝硬化。肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化增殖是肝纤维化的关键环节，正常肝脏中HSC处于静息状态，增殖活性较低；在肝损伤及各种慢性肝病时HSC被激活，变成具有分泌功能的肌成纤维样细胞，合成和释放细胞外基质，同时分泌基质金属蛋白酶抑制因子，使细胞外基质降解减少，最终导致细胞外基质积聚而发生肝纤维化。

临床研究表明早期的肝纤维化是可逆的，肝纤维化的精准诊断能够更好的指导临床治疗。目前，病理学、影像学及血清学诊断是临床所采用的肝纤维化主要诊断方法。肝穿活检虽然具有损伤性，会引起部分病人的不适，但仍然是肝纤维化诊断的金标准。过去十年，在肝纤维化基础和临床研究中，发现了多种潜在的非侵袭性纤维增生标志物，但其临床应用效果不够理想。因此，寻找新的肝纤维化标志物对于肝纤维化的精准诊断非常重要。

肝白血病因子(hepatic leukemia factor，HLF)属于脯氨酸和酸性氨基酸含量丰富的碱性亮氨酸拉链转录因子家族成员，能够通过形成同型或异型二聚体的方式，结合靶基因启动子区特异的DNA序列并激活转录。国内外研究表明HLF在正常组织中不表达，在白血病细胞中有表达；我们也发现正常肝脏不表达HLF，HLF在肝纤维化中的作用未见报道。由于目前商品化的HLF抗体很少且均不能用于HLF的免疫组化检测，因此我们按照多抗制备的标准流程，利用大肠杆菌原核表达了HLF蛋白，纯化后免疫多只新西兰兔，蛋白A纯化阳性血清获得了多株多克隆抗体，并从中筛选到一株可检测组织中HLF表达的多克隆抗体。利用该抗体我们开展研究发现，相对于小鼠正常肝组织，小鼠肝纤维化组织中HLF表达升高；进一步研究显示，HLF在活化的HSC中呈高表达，并与临床肝纤维化进展有关，可以作为HSC活化与肝纤维化的新标志物。

目前，HLF作为HSC活化标志物及其在肝纤维化诊断中的应用未见文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供HLF的新用途，即HLF在HSC活化和肝纤维化过程中的应用。

本发明提供了HLF在HSC活化过程中的应用。

本发明提供了HLF在肝纤维化病理诊断中的应用。

本发明所述的HLF分子，是一种转录因子，属于碱性亮氨酸拉链转录因子家族成员。

本发明采用CCL4和BDL诱导的小鼠肝纤维化模型，经实验发现在对照组正常肝脏中HLF蛋白表达几乎检测不到，而在小鼠肝纤维化标本中HLF的mRNA和蛋白表达均明显上调。对分离的原代正常小鼠肝细胞、小鼠原代HSC检测后发现，正常小鼠肝细胞及静息状态下的HSC不表达HLF蛋白，只有活化的原代HSC表达HLF蛋白。由于目前市场上HLF的抗体均不能识别组织中HLF的表达，因此我们自行制备了可检测肝组织中HLF表达的多克隆抗体。利用该抗体我们开展研究发现，正常肝组织中HLF的表达水平极低，而在肝纤维化组织中表达升高，同时HLF仅在肝纤维化区域表达，且与HSC标志物a-SMA的表达基本重合。

因此，本发明认为，HLF特异表达于活化的HSC，并且HLF的表达与临床肝纤维化进展有关，可以作为HSC活化与肝纤维化的新标志物。

本发明的第一方面，提供了HLF可作为HSC活化标志物。

本发明的第二方面，提供了HLF可作为诊断肝纤维化的标志物。

本发明所述的临床样本，为人正常肝及人纤维化肝的石蜡包埋组织及冰冻组织。

附图说明

图1为小鼠肝正常组织、肝纤维化组织和原代正常肝细胞中HLF蛋白的表达变化。

图2为小鼠的原代HSC在0周和1周时HLF蛋白的表达水平；

图3为人正常肝组织(n＝8)和人肝纤维化样本(n＝48)中HLF mRNA的表达，p＜0.05；

图4为免疫荧光染色检测人肝纤维化组织中α-SMA与HLF的表达与定位；

图5为免疫组化检测人正常及人肝纤维化组织连续切片中胶原沉积(Sirius Red染色)、α-SMA和HLF表达的情况。

图6为HLF对人肝星状细胞(LX2)增殖的影响。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

实施例1：HLF在活化肝星状细胞中特异表达

我们通过分离小鼠原代正常肝细胞，利用Western-blot技术检测发现，小鼠的正常肝细胞中并不表达HLF蛋白(图1)。进一步，我们分离小鼠原代HSC，并进行培养，利用Western-blot技术检测，我们发现HLF在活化的HSC中特异表达(图2)。

相关检测方法如下：

小鼠原代HSC分离步骤：

FVB敲除小鼠和对照小鼠10％戊巴比妥钠腹腔麻醉，然后打开腹腔。需将小鼠的肠管推向腹腔一侧，即可暴露门静脉及下腔静脉，然后用剪刀剪一小口，将已经充满肝脏灌流液的小针头经小口插入门静脉，用止血夹夹住。打开恒流泵的开关开始灌流，同时迅速剪断下腔静脉。肝脏在灌注开始几秒内会变成黄白色。待灌注结束，将肝脏移至培养皿中，加入少量(4ml左右)solutionII，需剪碎肝组织。将搅碎的肝组织倒入50ml的离心管，加入solutionII至40ml，加入4型胶原酶，pronase和DNase，37度水浴消化15min。待消化结束的时候能够看到部分未消化完的肝组织。加入15ml血清终止反应。70μm过滤网过滤，20G，4min离心，去除肝细胞。收集悬浮液，450G，7min使悬浮液中的细胞都沉下去。先用1ml移液器吸掉悬浮液，再加入optiprep液，充分吹打，再加入相应混合液，1500G，20min离心。吸掉悬浮液，加入适当的DMEM培养液，计数，培养。

免疫印记(Western Blot)步骤：

(1)、蛋白提取：细胞用PBS洗一遍后，加入相应量的IP裂解液或SDS裂解液，然后吸入到1.5ml的EP管中；

(2)、蛋白浓度测定：蛋白样品超声后用BCA法进行蛋白浓度测定；

(3)、蛋白样品的处理：吸取蛋白样品总体积三分之一的4×上样缓冲液混合，100℃变性5min，取出后先在冰上放置5min，离心后备用；

(4)、制备SDS-PAGE凝胶：首先配制下层的分离胶(10％SDS、TEMED、的去离子双蒸水、30％PAA、10％过硫酸胺和1.5mol/L Tris-HCl(PH8.8)按照相应的比例配置，一般根据所需蛋白分子量的大小配置不同浓度的分离胶)，在常温放置30min后，然后制备上层的积层胶(10％SDS、TEMED、去离子双蒸水、30％丙烯酰胺、10％过硫酸胺和Tris-HCl(PH6.8)按照一定的比例配置)，再根据所上样量决定10孔或者15孔的梳子，室温放置30min即可使用，也可在4度放置一段时间备用；

(5)、电泳：先将电泳槽安装好，然后上样(20μg)，接通电源，电泳开始电压85V，等样品进入分离胶后可电压调整至125V，等溴酚蓝染色条带距硅胶框底部约1.0cm左右时，关闭电泳仪电源，终止电泳；

(6)、转膜和封闭：低分子量蛋白常规转膜，高分子量蛋白可用湿转；

(7)、一抗孵育：按照抗体稀释比1∶500的浓度加入兔抗人HLF抗体3ml(其他抗体根据稀释比例加入即可)，在37度摇床上2hr；

(8)、二抗：TBST在室温下充分清洗膜3次，每次5min。加入相应的荧光二抗，孵育1.5h，TBST洗三次，每次5min；

(9)、Odyssey红外荧光扫描成像系统扫膜。

实施例2：HLF在肝纤维化临床样本中的表达

前期我们收集部分临床肝纤维化样本，通过Realtime-PCR对收集的肝纤维化临床样本进行检测，发现HLF在正常肝脏组织中表达很低，而在肝纤维化组织中表达升高(图3)。同时制作冰冻切片，通过免疫荧光实验发现，HLF与肝纤维常见标志物a-SMA在肝纤维化区域存在着共定位(图4)。

进一步，我们对肝纤维化临床样本的病理标本连续切片进行免疫组织化学染色，结果显示HLF在正常肝脏组织中几乎不表达，而仅在肝纤维化区域表达，并且与HSC标志物a-SMA的表达范围基本重合(图5)。

相关检测方法如下：

Real-Time PCR步骤：

(1)反应体系：

(2)将上述液体混匀，首先需要94℃预变性4min，然后进入下列循环中，即94℃变性15sec，60℃退火30sec(退火的温度和时间需要根据不同的产物长度设定)，72℃延伸40sec，40-50个循环，72℃终末延伸10min。

Applied Biosystems 7300/7900 Fast Real-Time PCR System软件分析结果。

免疫荧光实验步骤：

(1)、冰冻组织切片置于丙酮中，4℃固定15min。；

(2)、弃去丙酮，1X TBS清洗组织5min；

(3)、加入0.4％Triton-100处理组织5min，破膜，1X TBS清洗组织3次，每次5min；

(4)、加入100ul用10％山羊血清和1％BSA配制的封闭液，室温下封闭1h；

(5)、1X TBS清洗组织5min，加入事先准备好的一抗稀释液100ul，放于湿盒中4℃环境下过夜；

(6)、4℃取出，室温复温15min，1X TBS清洗组织3次，每次5min，加入事先用1X TBS稀释的荧光二抗，室温条件下，避光孵育30-45min；

(7)、1X TBS清洗细胞3次，加入事先用1X TBS稀释的DAPI染料，染核45s-60s，并置于普通荧光显微镜下观察，待细胞核染好后弃去DAPI，加入抗淬灭封片甘油，进行拍照。

免疫组化染色步骤：

1.脱蜡至水

(1)4μm厚石蜡切片，每个肿瘤组织2张连续切片，60℃烤箱烤1h；

(2)二甲苯10minx3次；

(3)依次经过100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、双蒸水，各5min。

2.抗原修复

(1)3％H₂O₂甲醇液20min；

(2)双蒸水洗5minx 3次；

(3)抗原修复(高压修复)：

切片放入盛有EDTA碱性修复液(2mM EDTA、2mM Na₂HPO₄)的高压锅中，高压煮沸2min，自然冷却至室温。

3.一抗孵育

(1)PBS洗5min；

(2)50μl 1％BSA覆盖组织，37℃封闭30min；

(3)吸去封闭液，2张连续切片分别滴加CK19、OV6一抗50μl，湿盒中4℃孵育过夜。

4.二抗孵育

(1)吸走一抗，PBS洗5minx 4次；

(2)滴加50μl带HRP标记的二抗，37℃孵育30-45min；

5.显色、反蓝

(1)PBS洗5minx 4次；

(2)DAB(1∶50)显色3-10min，至出现砖红色沉淀，双蒸水终止显色；

(3)苏木素复染10min，盐酸酒精分化后自来水冲洗反蓝20-30min。

6.脱水封片

(1)依次经过双蒸水、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、石炭酸、二甲苯，各5min。滴加树脂封片。

7.分析

Sirius Red染色步骤

(1)4μm厚石蜡切片，每个肿瘤组织2张连续切片，60℃烤箱烤1h；

(2)二甲苯10min x 3次；

(3)依次经过100％乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、双蒸水，各5min。

(4)将石蜡切片置于0.1％苦味酸天狼星红染液中30min-1h；

(5)自来水流水冲洗4min；

(6)将石蜡切片置于Hartis’s苏木素染液中5min-10min；

(7)依次经过双蒸水、75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、100％乙醇、石炭酸、二甲苯，各5min。滴加树脂封片。

实施例3：HLF对人肝星状细胞(LX2)增殖的影响

我们采用siRNA技术敲减人肝星状细胞(LX2)中HLF的表达水平(siHLF sequence：sense(5’-3’)GCUGGGCAAAUGCAAGAACAU，antisense(5’-3’)CGACCCGUUUACGUUCUUGUA)，检测细胞增殖状况并进行结晶紫染色，结果显示，敲减人肝星状细胞(LX2)中HLF后，LX2细胞增殖减慢(图6)，提示HLF在肝纤维化治疗中具有应用价值。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.HLF在判断肝星状细胞活化中的应用。

2.HLF在肝纤维化病理诊断中的应用。

3.根据权利要求1所述的HLF在肝星状细胞活化中的应用，其特征在于，HLF在活化的肝星状细胞中特异性表达。

4.根据权利要求2所述的HLF在肝纤维化病理诊断中的应用，其特征在于，HLF特异性表达于小鼠及病人肝纤维化区域。

5.根据权利要求1或2所述的HLF在肝星状细胞或肝纤维化病理诊断中的应用，其特征在于，所述的HLF抗体为发明人制备的多克隆抗体。

6.根据权利要求1所述的HLF在肝星状细胞活化中的应用，其特征在于，所述的肝星状细胞可来源于肝纤维化的实验动物或病人。

7.根据权利要求2所述的HLF在肝纤维化病理诊断中的应用，其特征在于，所述的肝纤维化样本为病人的肝纤维化组织的穿刺或手术样本。