ES2583084T3

ES2583084T3 - NNMT como marcador para la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)

Info

Publication number: ES2583084T3
Application number: ES12708006.7T
Authority: ES
Inventors: Johann Karl; Julia Riedlinger; Wolfgang Rollinger
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-03-11
Filing date: 2012-03-07
Publication date: 2016-09-19
Anticipated expiration: 2032-03-07
Also published as: CA2826818A1; HK1187105A1; EP2684054A1; JP5976694B2; CN103415770B; JP2014509740A; EP2684054B1; CN103415770A; WO2012123297A1; US20130344504A1

Abstract

Un método in vitro para diferenciar la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) del asma en un sujeto humano, que comprende a) determinar la concentración de la proteína NNMT en una muestra de suero, plasma o sangre completa, y b) comparar la concentración de la proteína NNMT determinada en el paso (a) con una de la proteína NNMT, en la que la concentración de proteína NNMT por encima de la concentración de referencia es indicativa de EPOC.

Description

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utilizarse como un marcador en el sentido de la presente invención. El término "marcaje" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier sustancia que es capaz de producir una señal a través de la detección directa o indirecta.

Para la detección directa, el grupo marcador o marcaje adecuado para su uso en la presente invención se puede seleccionar de cualquier grupo marcador detectable conocido, pero no se limita a, cromógenos, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo ésteres de acridinio o dioxetanos), compuestos electroquimioluminiscentes, catalizadores, enzimas, sustratos enzimáticos, colorantes, tintes fluorescentes (por ejemplo fluoresceína, cumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina y derivados de los mismos), partículas metálicas y no metálicas coloidales, y partículas de látex de polímero orgánico. Otros ejemplos de grupos marcadores son los complejos metálicos luminiscentes, tales como rutenio o europio, complejos de enzimas, por ejemplo los utilizados para ELISA, y radioisótopos.

Los sistemas de detección indirectos comprenden, por ejemplo, que el reactivo de detección, por ejemplo, el anticuerpo de detección, esté marcado con un primera parte de una pareja de unión bioafín. Los ejemplos de pares de unión adecuados son hapteno o antígeno/anticuerpo, biotina o análogos de biotina tales como aminobiotina, iminobiotina o destiobiotina/avidina o estreptavidina, azúcar/lectina, ácido nucleico o análogo de ácido nucleico/ácido nucleico complementario, y receptor/ligando, por ejemplo, receptor de hormona esteroide/hormona esteroide. Los miembros preferidos de primera parte de unión comprenden hapteno, antígeno y hormona. Especialmente preferidos son los haptenos como la digoxina y la biotina y análogos de los mismos. El segundo miembro de dicho par de unión es, por ejemplo, un anticuerpo, estreptavidina, etc., por lo general marcado para permitir la detección directa, por ejemplo, mediante los marcadores mencionados anteriormente.

Además, o como alternativa, un polipéptido marcador o una variante del mismo puede llevar una modificación posterior a la traducción. Las modificaciones postraduccionales preferidas son glicosilación, acilación, o fosforilación.

El término " evaluación de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica" o "la evaluación de la EPOC" se utiliza para indicar que el método según la presente invención solo o junto con otros marcadores o variables, por ejemplo, ayuda al médico para establecer o confirmar la ausencia o la presencia de la EPOC. El método, por ejemplo, será útil para establecer o confirmar la ausencia o presencia de la EPOC.

Un "marcador para la EPOC" en el sentido de la presente invención es un marcador que, como único marcador o si se combina con el marcador NNMT, añade la información pertinente en la evaluación de la EPOC a la pregunta de diagnóstico bajo investigación. La información se considera relevante o de valor adicional si en una especificidad determinada, la sensibilidad, o si en una sensibilidad determinada, la especificidad, respectivamente, para la evaluación de la EPOC se puede mejorar mediante la inclusión de dicho marcador en un panel de marcadores (combinación de marcadores) que ya comprenda el marcador NNMT. Preferiblemente, la mejora en la sensibilidad o especificidad, respectivamente, es estadísticamente significativa a un nivel de significación de p = 0,05, 0,02, 0,01 o inferior.

El término "muestra" o "muestra de ensayo", como se usa aquí, se refiere a una muestra biológica obtenida de un individuo con el propósito de la evaluación in vitro. En los métodos de la presente invención, la muestra o la muestra del paciente puede comprender en una realización de la presente invención cualquier líquido corporal. Las muestras preferidas son líquidos corporales, tales como suero, plasma o sangre completa, suero o plasma son los más preferidos.

La proteína NNMT, en particular las formas solubles de la proteína NNMT, se determina in vitro en una muestra adecuada. Preferiblemente, la muestra deriva de un sujeto humano, por ejemplo, un paciente con EPOC o una persona en riesgo de EPOC o una persona sospechosa de tener EPOC. También se determina la proteína NNMT de forma preferida en una muestra de suero o plasma.

El término "muestra de referencia" como se usa aquí, se refiere a una muestra biológica proporcionada por un grupo de referencia de individuos aparentemente sanos con el propósito de la evaluación in vitro. El término "concentración de referencia" como se usa aquí se refiere a un valor establecido en un grupo de referencia de individuos aparentemente sanos.

Es conocido para un experto en la técnica que los resultados de la medición del paso (a) de acuerdo con el método de la presente invención será comparado con una concentración de referencia. Tal concentración de referencia puede ser determinada usando una muestra negativa de referencia, una muestra de referencia positiva, o una muestra de referencia mixta que comprende uno o más de uno de estos tipos de controles. Una muestra de referencia negativa preferiblemente comprenderá una muestra de no fumador, fumadores control sin diagnóstico de EPOC, asma o diversas combinaciones de los mismos. Una muestra de referencia positiva preferiblemente comprenderá una muestra de un sujeto con EPOC diagnosticada.

La expresión "comparar la concentración determinada con una concentración de referencia" se utiliza simplemente para ilustrar adicionalmente lo que es evidente para el experto en la materia de todos modos. Una concentración de

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referencia se establece en una muestra de control. La muestra de control puede ser una muestra de control interno o una muestra de control externo. En una realización se usa una muestra de control interno, es decir, el nivel del marcador se evaluado en la muestra de prueba, así como en una o más muestras tomadas del mismo sujeto para determinar si hay algún cambio en el nivel de dicho marcador. En otra realización se usa una muestra de control externo. Para una muestra de control externo la presencia o cantidad de un marcador en una muestra derivada del individuo se compara con su presencia o cantidad en un individuo que se sabe que sufre de, o que se sabe que está en riesgo de una condición determinada; o un individuo que se sabe que está libre de una condición determinada, es decir, un "individuo normal". Por ejemplo, un nivel de marcador en una muestra de paciente se puede comparar con un nivel conocido que se asocia con un curso específico de la EPOC. Por lo general, el nivel de marcador de la muestra está directamente o indirectamente correlacionado con un diagnóstico y el nivel del marcador se utiliza, por ejemplo para determinar si un individuo está en riesgo de EPOC. Por otra parte, el nivel de marcador de la muestra puede ser comparado, por ejemplo, con un nivel de marcador que se sabe que está asociado con una respuesta a la terapia en pacientes con EPOC, el diagnóstico de la EPOC, la guía para la selección de un medicamento apropiado para la EPOC, la valoración del riesgo de progresión de la enfermedad, o en el seguimiento de pacientes con EPOC. Dependiendo del uso previsto del diagnóstico se elige una muestra de control apropiado y un valor de control o de referencia para el marcador establecido en el mismo. Se apreciará por el experto en la materia que dicha muestra de control en una realización se obtiene de una población de referencia que está emparejado por la edad y libre de confundir enfermedades. También queda claro para el experto en la materia, que los valores de los marcadores absolutos en una muestra control dependerán del ensayo utilizado. Se utilizan preferiblemente muestras de 100 individuos bien caracterizados de la población de referencia apropiada para establecer un valor (de referencia) de control. También se prefiere que la población de referencia se elija entre 20, 30, 50, 200, 500 o 1000 individuos. Los individuos sanos representan una población de referencia preferida para establecer un valor de control.

El término "medición", "medir" o "determinación" comprende preferentemente una medición cualitativa, semicuanitativa o cuantitativa. En la presente invención la proteína NNMT se mide en una muestra de fluido corporal. En una realización preferida, la medición es una medida semicuantitativa, es decir, se determina si la concentración de proteína NNMT está por encima o por debajo de un valor de corte. Como el experto en la materia apreciará, en un ensayo de Si-(presencia) o No-(ausencia), la sensibilidad del ensayo se ajusta usualmente para que coincida con el valor de corte.

Los valores de proteína NNMT como se determina en un grupo de control o de una población de control se utilizan por ejemplo para establecer un valor de corte o un rango de referencia. Un valor por encima de dicho valor de corte

o fuera del rango de referencia en su extremo superior está considerado como elevado o como indicativo de la presencia de EPOC.

En una realización, se estableció un valor fijo de corte. Dicho valor de corte se elige para que coincida con la cuestión de diagnóstico de interés.

En una realización, el corte se establece para dar lugar a una especificidad del 90%, también se prefiere establecer la línea de corte para dar lugar a una especificidad del 95%, o también se prefiere establecer la línea de corte para dar lugar a una especificidad del 98%.

En una realización, se utilizan los valores de proteína NNMT como se determina en un grupo de control o de una población de control para establecer un rango de referencia. En una realización preferida una concentración de proteína NNMT se considera elevada si el valor determinado está por encima del percentil 90% del rango de referencia. En realizaciones preferidas adicionales una concentración de proteína NNMT se considera elevada si el valor determinado está por encima del percentil 95%, del percentil 96%, del percentil 97% o el percentil 97,5% del rango de referencia.

Un valor por encima del valor de corte puede ser indicativo, por ejemplo de la presencia de EPOC. Un valor por debajo del valor de corte puede ser indicativo por ejemplo de la ausencia de la EPOC.

En una realización preferida adicional, la medición de la proteína NNMT es una medida cuantitativa. En otras formas de realización la concentración de proteína NNMT se correlaciona a una pregunta de diagnóstico subyacente.

Una muestra proporcionada de un paciente con EPOC ya confirmada puede utilizarse en ciertas configuraciones como una muestra de control positivo y analizarse preferiblemente en paralelo con la muestra a analizar. En tales configuraciones un resultado positivo para la proteína marcadora NNMT en la muestra de control positivo indica que el procedimiento de prueba ha funcionado en el plano técnico.

Como el experto en la materia apreciará, cualquiera de tales análisis se realiza in vitro. La muestra (muestra de ensayo) se desecha después. La muestra se utiliza únicamente para el método diagnóstico in vitro de la invención y

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extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que determinados residuos de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada.

La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede ser denominado como "VH". El dominio variable de la cadena ligera puede ser denominado como "VL". Estos dominios son generalmente las partes más variables de un anticuerpo y contienen los sitios de unión a antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre anticuerpos y se utilizan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR), ambos en los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios variables se denominan las regiones marco (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando en gran parte una configuración de hoja beta, conectadas por tres HVR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina beta. Las HVR en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con la HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno de los anticuerpos (véase Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological interest, quinta edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están implicados directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno, pero presentan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de anticuerpo.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de vertebrado se pueden asignar a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa (κ) y lambda (λ), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos (inmunoglobulinas) pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidos y se describen generalmente en, por ejemplo, Abbas, et al., Celular y Mol. Immunology, 4ª ed., W. B. Saunders, Co. (2000). Un anticuerpo puede ser parte de una molécula de fusión mayor, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo completo" se usan en este documento indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, no a fragmentos de anticuerpo como se define a continuación. Los términos particularmente se refieren a un anticuerpo con cadenas pesadas que contienen una región Fc.

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región de unión a antígeno del mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos idénticos de unión a antígeno, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un fragmento residual "Fc", cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación a antígeno y todavía es capaz de unirse al antígeno.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio completo de unión al antígeno. En una realización, una especie de Fv de dos cadenas consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en estrecha asociación no covalente. En una especie de Fv de una sola cadena (scFv), un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera pueden estar unidos covalentemente por un conector peptídico flexible tal que las cadenas ligera y pesada pueden asociarse en una estructura "dimérica" análoga a la de una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión completo.

El fragmento Fab contiene los dominios variables de las cadenas pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi terminal de la cadena

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El nivel de proteína NNMT parece ser apropiada para controlar la respuesta de un paciente a la terapia. La presente invención por lo tanto también se refiere al uso de proteína NNMT en el seguimiento de la respuesta de un paciente a la terapia, en el que una disminución del nivel de proteína NNMT es un indicador positivo de un tratamiento eficaz de la EPOC.

Combinaciones de marcadores

Como el experto en la técnica apreciará, hay muchas maneras de utilizar las mediciones de dos o más marcadores con el fin de mejorar la respuesta diagnóstica bajo investigación.

Los marcadores bioquímicos se pueden determinar individualmente, o en una forma de realización de la invención, se pueden determinar de forma simultánea, por ejemplo, mediante el uso de una tecnología de array basada en un chip o en cuentas. Las concentraciones de los biomarcadores se interpretan entonces de forma independiente, por ejemplo, usando un valor umbral individual para cada marcador, o se combinan para la interpretación.

Como el experto en la materia apreciará, el paso de correlacionar un nivel de marcador con una cierta probabilidad o riesgo puede realizarse y conseguirse de diferentes maneras. Preferiblemente, la concentración determinada de la proteína NNMT y el uno o más marcadores se combinan matemáticamente y el valor combinado se correlaciona con la cuestión diagnóstica subyacente. Los valores de los marcadores se pueden combinar con la determinación de NNMT mediante cualquier método matemático actual adecuado.

Preferiblemente, el algoritmo matemático aplicado en la combinación de marcadores es una función logística. El resultado de aplicar tal algoritmo matemático o tal función logística preferiblemente es un solo valor. Dependiendo de la cuestión diagnóstica subyacente, tal valor puede correlacionarse fácilmente con, por ejemplo, el riesgo de un individuo de padecer EPOC o de otro tipo de usos diagnósticos previstos útiles en la evaluación de pacientes con EPOC. En una forma preferible, tal función logística se obtiene mediante a) la clasificación de los individuos en grupos, por ejemplo, normales, personas en situación de riesgo de EPOC, pacientes con inflamación aguda o crónica de los pulmones y así sucesivamente, b) la identificación de marcadores que difieren significativamente entre estos grupos mediante análisis univariado, c) el análisis de regresión logística para evaluar los valores discriminativos independientes de los marcadores útiles en la evaluación de estos diferentes grupos y d) la construcción de la función logística para combinar los valores discriminativos independientes. En este tipo de análisis, los marcadores ya no son independientes sino que representan una combinación de marcadores.

La función logística se utiliza para combinar los valores de NNMT y el valor de al menos otro marcador se obtiene mediante a) la clasificación de los individuos en los grupos de normales e individuos que puedan tener EPOC, respectivamente, b) el establecimiento de los valores de NNMT y el valor de al menos un marcador adicional c) llevar a cabo un análisis de regresión logística y d) la construcción de la función logística para combinar los valores de los marcadores de NNMT y el valor de la al menos un marcador adicional.

Una función logística para correlacionar una combinación de marcadores con una enfermedad emplea preferentemente un algoritmo desarrollado y obtenido mediante la aplicación de métodos estadísticos. Son métodos estadísticos apropiados, por ejemplo, el análisis discriminante (DA) (es decir, DA lineal, cuadrático, regularizado), los métodos de Kernel (es decir, SVM), los métodos no paramétricos (es decir, los clasificadores del vecino más próximo k), PLS (mínimos cuadrados parciales), los métodos basados en árboles (es decir, lógica de regresión, CART, métodos de bosque al azar, métodos de impulsado/embolsado), modelos lineales generalizados (es decir, de regresión logística), métodos basados en componentes principales (es decir, SIMCA), modelos aditivos generalizados, métodos basados en la lógica difusa, redes neuronales y métodos basados en algoritmos genéticos. El experto en la materia no tendrá ningún problema en la selección de un método estadístico adecuado para evaluar una combinación de marcadores de la presente invención y para obtener con ello un algoritmo matemático adecuado. En una realización, el método estadístico empleado para obtener el algoritmo matemático utilizado en la evaluación de la EPOC se selecciona de entre DA (es decir, análisis discriminante lineal, cuadrática, regularizada), métodos de Kernel (es decir, SVM), métodos no paramétricos (es decir, clasificadores del vecino más próximo k), PLS (mínimos cuadrados parciales), métodos basados en árboles (es decir, lógica de regresión, CART, métodos de bosque al azar, métodos de impulsado), o modelos lineales generalizados (es decir, de regresión logística). Los detalles relativos a estos métodos estadísticos se encuentran en las siguientes referencias: Ruczinski, I., et al., J. de Computational and Graphical Statistics 12 (2003) 475-511; Friedman, J. H., J. de la American Statistical Association 84 (1989) 165-175; Hastie, T., et al., The Elements of Learning, Springer Verlag (2001); Breiman, L., et al., Clasification and regression trees, Wadsworth International Group, California (1984); Breiman, L., Machine Learning 45 (2001) 5-32; Pepe, M. S., The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction, Oxford Statistical Science Series, 28, Oxford University Press (2003); y Duda, R.O., et al., Pattern Classification, John Wiley & Sons, Inc., 2ª Ed. (2001).

Es una realización de la invención el uso de un valor umbral multivariante optimizado para la combinación subyacente de marcadores biológicos y para discriminar el estado A del estado B, por ejemplo, individuos normales de personas en riesgo de EPOC, pacientes con EPOC que responden a la terapia de los que la terapia falla, los pacientes que tienen una inflamación aguda de pulmón de los pacientes con EPOC, los pacientes con EPOC que

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muestran progresión de la enfermedad y los pacientes con EPOC que no muestra progresión de la enfermedad, respectivamente.

El área bajo la curva operadora del receptor (= AUC) es un indicador del rendimiento o precisión de un procedimiento de diagnóstico. La exactitud de un método diagnóstico se describe mejor mediante sus características operadoras del receptor (ROC) (ver especialmente Zweig, M. H., y Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577). El gráfico ROC es una representación de todos los pares de sensibilidad/ especificidad resultantes de variar continuamente el umbral de decisión en toda la gama de datos observados.

El rendimiento clínico de una prueba de laboratorio depende de su exactitud diagnóstica, o la capacidad de clasificar correctamente a los sujetos en subgrupos clínicamente relevantes. La exactitud diagnóstica mide la capacidad de la prueba de distinguir correctamente dos condiciones diferentes en los sujetos investigados. Tales condiciones son, por ejemplo, salud y enfermedad, o progresión de la enfermedad frente a ninguna progresión de la enfermedad.

En cada caso, el gráfico ROC indica la superposición entre las dos distribuciones representando la sensibilidad frente a 1 -especificidad para el rango completo de umbrales de decisión. El eje y es la sensibilidad, o la fracción de verdaderos positivos [definida como (número de resultados positivos verdaderos de la prueba)/(número de resultados verdaderos positivos + falsos negativos de la prueba)]. Esto también ha sido denominado positividad en presencia de una enfermedad o condición. Se calcula únicamente a partir del subgrupo afectado. El eje x es la fracción de falsos positivos, o 1 – especificidad [definida como (número de resultados falsos positivos)/(número de resultados falsos positivos + verdaderos negativos)]. Es un índice de especificidad y se calcula por completo del subgrupo no afectado. Debido a que las fracciones de positivos verdaderos y de falsos positivos se calculan enteramente por separado, mediante el uso de los resultados de la prueba de dos subgrupos diferentes, el gráfico ROC es independiente de la prevalencia de la enfermedad en la muestra. Cada punto de la gráfica ROC representa un par de sensibilidad/ 1-especificidad correspondiente a un umbral de decisión particular. Una prueba con discriminación perfecta (sin solapamiento en las dos distribuciones de resultados) tiene una línea ROC que pasa por la esquina izquierda superior, en la que la fracción de positivos verdaderos es 1,0 o 100% (sensibilidad perfecta), y la fracción de falsos positivos es 0 (especificidad perfecta). La representación teórica para una prueba sin discriminación (distribuciones idénticas de resultados para los dos grupos) es una línea diagonal de 45º desde la esquina inferior izquierda a la esquina superior derecha. La mayoría de representaciones se ubican entre estos dos extremos. (Si la línea ROC cae completamente por debajo de la diagonal de 45°, esto se soluciona fácilmente invirtiendo el criterio de "positividad" de "mayor que" a "menor que", o viceversa.) Cualitativamente, cuanto más cerca está la representación a la parte superior esquina izquierda, mayor es la exactitud global de la prueba.

Un objetivo conveniente para cuantificar la precisión diagnóstica de una prueba de laboratorio es expresar su rendimiento con un solo número. La medida global más común es el área bajo el gráfico ROC (AUC). Por convención, esta área es siempre ≥ 0,5 (si no lo es, se puede invertir la regla de decisión para que así sea). Los valores oscilan entre 1,0 (separación perfecta de los valores de prueba de los dos grupos) y 0,5 (sin diferencia de distribución aparente entre los dos grupos de valores de prueba). El área no depende solamente de una parte particular de la representación, como el punto más cercano a la diagonal o la sensibilidad al 90% de especificidad, sino de toda la representación. Esta es una expresión cuantitativa, descriptiva de la proximidad de la línea ROC a la perfección (área = 1,0).

La sensibilidad global del ensayo dependerá de la especificidad requerida para la práctica del método aquí descrito. En ciertas configuraciones preferibles, una especificidad del 75% puede ser suficiente y los métodos estadísticos y algoritmos resultantes pueden basarse en este requisito de especificidad. En una realización preferida, el método utilizado para evaluar los individuos en riesgo de EPOC se basa en una especificidad del 80%, del 85% o también preferiblemente del 90% o del 95%.

Ciertas combinaciones de marcadores serán ventajosas en el cribado de la EPOC.

Marcador de inflamación

Actualmente se conocen muchos marcadores séricos para el diagnóstico de una inflamación. El experto en la materia está familiarizado con el término "marcador de inflamación". Dicho marcador de inflamación, por ejemplo, se selecciona de entre interleucina-6, proteína C reactiva, amiloide A sérica, sE-selectina y una proteína S100.

La interleuquina-6 (IL-6) es una proteína secretada de 21 kDa que tiene numerosas actividades biológicas que pueden dividirse entre las que participan en la hematopoyesis y las que participan en la activación de la respuesta inmune innata. IL-6 es un reactante de fase aguda y estimula la síntesis de una variedad de proteínas, incluyendo moléculas de adhesión. Su función principal es mediar en la producción de proteínas hepáticas de fase aguda, y su síntesis está inducida por las citoquinas IL-1 y TNF-α. IL-6 es producida normalmente por los macrófagos y los linfocitos T. La concentración normal de IL-6 en suero es <5 pg/ml.

La proteína C reactiva (CRP) es una proteína de fase aguda homopentamérica de unión a Ca2+ con subunidades de 21 kDa que está involucrado en la defensa del huésped. La síntesis de la CRP está inducida por IL-6, e

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indirectamente por IL-1, ya que IL-1 puede activar la síntesis de IL-6 en las células de Kupffer en los sinusoides hepáticos. La concentración plasmática normal de CRP es <3 g/ ml (30 nM) en un 90% de la población sana, y <10 g/ ml (100 nM) en un 99% de los individuos sanos. Las concentraciones plasmáticas de CRP pueden, por ejemplo, medirse mediante un inmunoensayo. Las concentraciones plasmáticas de CRP pueden, por ejemplo, medirse mediante formatos de ensayo homogéneo o ELISA.

La amiloide A sérica (SAA) es una proteína de fase aguda de bajo peso molecular de 11,7 kDa. Es predominantemente sintetizada por el hígado en respuesta a la estimulación de IL-1, IL-6 o TNF-α, y está implicada en la regulación de la respuesta inmune dependiente de células T. Tras eventos agudos la concentración de SAA aumenta hasta 1000 veces alcanzando un miligramo por mililitro. Se utiliza para monitorizar la inflamación en enfermedades tan diversas como la fibrosis quística, rechazo de injerto renal, trauma o infecciones. En la artritis reumatoide, en ciertos casos se han utilizado como sustituto de la CRP, pero la SAA aún no está tan ampliamente aceptada.

Las proteínas S100 forman una familia cada vez mayor de proteínas de unión a Ca2+ que hoy incluye más de 20 miembros. La estructura fisiológicamente relevante de las proteínas S100 es un homodímero, pero algunas pueden formar también heterodímeros entre sí, por ejemplo, S100A8 y S100A9. Las funciones intracelulares van desde la regulación de la fosforilación de proteínas, de actividades enzimáticas, o de la dinámica del citoesqueleto a la implicación en la proliferación celular y la diferenciación. Como algunas proteínas S100 también se liberan de células, se han descrito también funciones extracelulares, por ejemplo, de supervivencia neuronal, proliferación de astrocitos, inducción de apoptosis y regulación de los procesos inflamatorios. S100A8, S100A9, el heterodímero S100A8/A9 y S100A12 se han encontrado en la inflamación, respondiendo S100A8 a inflamación crónica, mientras que S100A9, S100A8/A9 y S100A12 aumentan en la inflamación aguda. S100A8, S100A9, S100A8/A9 y S100A12 se han relacionado con diferentes enfermedades con componente inflamatorio, incluyendo algunos tipos de cáncer, rechazo a aloinjerto renal, colitis y sobretodo con la RA (Burmeister, G., y Gallacchi, G., Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230; Foell, D., et al., Rheumathology 42 (2003) 1383-1389).

La sE-selectina (molécula de adhesión a los leucocitos endotelial soluble-1, ELAM-1) es una glicoproteína transmembrana de tipo I de 115 kDa, que se expresa sólo en las células endoteliales y sólo tras la activación por citoquinas inflamatorias (IL-1ß, TNF-α) o endotoxina. La E-selectina de la superficie celular es un mediador de la unión rodante de los leucocitos al endotelio, un paso esencial en la extravasación de leucocitos hacia el sitio de la inflamación, y por lo tanto juega un papel importante en la respuesta inflamatoria localizada. La E-selectina soluble se encuentra en la sangre de individuos sanos, probablemente derivada de la escisión proteolítica de la molécula expresada en la superficie. Los niveles elevados de sE-selectina en suero se han reportado en una variedad de condiciones patológicas (Gearing, A. J., y Hemingway, I., Ann. N.Y. Acad. Sci. 667 (1992) 324-331).

Un array es una colección de marcadores individuales ordenables. Tales marcadores pueden estar dispuestos espacialmente, como en los arrays contenidos en placas de microtitulación o impresos sobre superficies planas, donde cada marcador está presente en distintas coordenadas X e Y. Alternativamente, los marcadores pueden estar ordenados en base a etiquetas, cuentas, nanopartículas o propiedades físicas. Un array de bio-chip se puede preparar según métodos conocidos por el experto en la técnica (véase, por ejemplo, la US 5.807.522; Robinson, WH, et al., Nat Med 8 (2002) 295-301; Robinson, WH, et al., Arthritis Rheum. 46 (2002) 885-893). Un array como se utiliza aquí se refiere a cualquier ensayo inmunológico con múltiples marcadores ordenables. Un array de bio-chip, también conocido por el experto en la materia como microarray, es una forma miniaturizada de un array.

Los términos "chip", "bio-chip", "polímero-chip" o "proteína-chip" se usan indistintamente y se refieren a una colección de un gran número de sondas, marcadores o marcadores bioquímicos dispuestos sobre un sustrato común, que podría ser una parte de una lámina de silicio, una tira de nylon, una tira de plástico o un portaobjetos de vidrio.

Un "array", "macroarray" o "microarray" es una colección creada intencionalmente de sustancias, tales como moléculas, marcadores, aberturas, microbobina, detectores y/ o sensores, conectados a o fabricados sobre un sustrato o superficie sólida, tal como vidrio, plástico, chip de silicio u otro material que forma una matriz. Los arrays se pueden utilizar para medir los niveles de un gran número, por ejemplo, decenas de miles o millones, de reacciones o combinaciones simultáneamente. Un array también puede contener un pequeño número de sustancias, por ejemplo, una, algunas o una docena. Las sustancias del array pueden ser iguales o diferentes unas de otras. El array puede adoptar una variedad de formatos, por ejemplo, bibliotecas de moléculas solubles, bibliotecas de moléculas inmovilizadas, bibliotecas de anticuerpos inmovilizados, bibliotecas de compuestos unidos a cuentas de resina, chips de sílice u otros soportes sólidos. El array podría ser un macroarray o un microarray, dependiendo del tamaño del soporte del array. Un macroarray generalmente contiene tamaños de pastilla de alrededor de 300 micras

o más grandes para poder tomar imágenes fácilmente con escáneres de gel y de transferencia. Un microarray contendría generalmente tamaños de pastilla de menos de 300 micras.

Un "soporte sólido" es material polimérico insoluble funcionalizado, al que se pueden adherir o unir covalentemente (a menudo a través de un enlazante) miembros de la biblioteca o reactivos para ser inmovilizados o para permitir que

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En el siguiente paso, los pocillos se incubaron con 30 mU/ml de conjugado anti-digoxigenina con HRP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº Catálogo 1633716) en tampón de conjugación universal (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº Catálogo 11684825) durante 60 minutos y se lavó como antes.

Los pocillos se incubaron a continuación durante 30 min. con 100 l de solución de sustrato TMB (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania, nº Catálogo 12034425). La adición de ácido sulfúrico 2 N (50 l) detuvo el desarrollo del color y cambió el color azul a amarillo. Se midió la DO a 450 nm con un lector de ELISA.

Todas las incubaciones fueron a temperatura ambiente. Las muestras de suero o plasma humano se prediluyeron con tampón de incubación hasta 5%. Para la calibración, se utilizó un suero humano como un estándar. Se diluyó con tampón de incubación hasta 2/4/8/16/32% para hacer calibradores con valores arbitrariamente proporcionados de 2/4/8/16/32 unidades/ml, respectivamente.

La ecuación de la curva de calibración se calculó mediante ajuste de curvas de mínimos cuadrados no lineales (Wiemer-Rodbard) y se utiliza para convertir la lectura de la absorbancia de un pocillo en el valor de la concentración correspondiente. El resultado se multiplica por el factor de predilución para obtener la concentración de la correspondiente muestra.

Ejemplo 4

NNMT como marcador de suero para la EPOC

Se utilizaron muestras de suero derivadas de 123 pacientes bien caracterizados con EPOC de estadío de EPOC según clasificación ATS entre 0 y IV que figura en la tabla 1. La población de estudio se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2: Población de estudio

Tipo de muestra: Número de muestras

Estadío de la EPOC 0 -IV (según la clasificación de la ATS que se muestra en la tabla 1): 123

Control 1: sanos no fumadores (función pulmonar normal): 50

Control 2: fumadores sanos y ex fumadores (función pulmonar normal): 88

Control 3: individuos sanos con riesgos laborales (amianto, sílice, polvo, ...): 48

Control 4: pacientes con asma: 26

La concentración sérica de proteína NNMT en las muestras de la EPOC se evalúa en comparación con muestras control (Control 1, 2 y 3) obtenidas de individuos evidentemente sanos (=cohorte control), y los pacientes de asma (Control 4), con un AUC de 0,88 (Tabla 3). Una curva de características operadoras del receptor (ROC) de los resultados representados en la Tabla 3 de NNMT marcador se muestra en la Fig. 1. Los datos determinados para el marcador de la inflamación CRP se muestran en la Fig. 2. El AUC del marcador NNMT es mayor que la AUC de CRP.

Tabla 3: Análisis ROC de la proteína marcadora en comparación con CRP

Marcador: NNMT CRP

ROC: 88% 74%

El valor de corte se determinó en el colectivo de control mediante el cálculo del cuantil del 95%, resultando en una especificidad del 95%. El potencial de diagnóstico del biomarcador se evaluó ya sea mediante el cálculo de las curva de características operadoras del receptor (ROC) (Tabla 3) o la sensibilidad clínica a la especificidad preestablecida de 95% (Tabla 4). La sensibilidad para una línea de corte vs individuos sanos (Control 1) para la EPOC del marcador NNMT es del 67%. Con un valor de corte que produce una especificidad del 95% en la correspondiente cohorte de control (Control 1, 2 y 3: es decir, los no fumadores sanos, fumadores, ex fumadores y personas con riesgo ocupacional para desarrollar EPOC), la sensibilidad del marcador NNMT para un valor de corte para el cribado general para la EPOC es del 53%.

Tabla 4 : Sensibilidad y especificidad de la proteína marcadora en comparación con CRP

Marcador: NNMT CRP

especificidad: 95% 95%

sensibilidad(control de corte de 1): 67% 31%

sensibilidad (control de corte de 1, 2 y 3): 53% 24%

Cuando se aplica un valor de corte (95% de especificidad) basado en el control 1 (control sano según la tabla 2) o basado en el control 1, 2 y 3 (controles de cribado de acuerdo con la tabla 2), la sensibilidad del marcador NNMT es mayor que la sensibilidad de CRP (Tabla 4). Esto también se refleja mediante el análisis ROC, en el que el marcador NNMT presenta una AUC mayor que el marcador CRP (Tabla 3).

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Claims

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