JP5127108B2 - 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 - Google Patents
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Description
即ち、本発明は、
1.哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1)哺乳動物由来の検体に含まれるHAND1遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
(2)測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法(以下、本発明評価方法と記すこともある。);
2.哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする前項1記載の評価方法;
3.哺乳動物由来の検体が組織(ここでの組織とは、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液、リンパ節等を含む広義の意味である。)であることを特徴とする前項1記載の評価方法;
4.哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1)哺乳動物由来の検体に含まれるHAND1遺伝子のメチル化頻度を測定する第一工程、及び
(2)測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法;
5.哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする前項1記載の評価方法;
6.哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする前項4記載の評価方法;
7.哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項1記載の評価方法;
8.哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項4記載の評価方法;
9.組織および癌が、以下の(a)〜(d)から選ばれる1以上の種類の組織および癌であることを特徴とする前項8記載の評価方法:
(a)組織が胃組織であり、癌が胃癌である;
(b)組織が結腸組織であり、癌が結腸癌である;
(c)組織が膵臓組織であり、癌が膵臓癌である;
(d)組織が腎臓組織であり、癌が腎臓癌である;
10.遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項1又は4記載の評価方法;
11.組織および癌が、以下の(a)〜(d)から選ばれる1以上の種類の組織および癌であることを特徴とする前項10記載の評価方法
(a)組織が胃組織であり、癌が胃癌である;
(b)組織が結腸組織であり、癌が結腸癌である;
(c)組織が膵臓組織であり、癌が膵臓癌である;
(d)組織が腎臓組織であり、癌が腎臓癌である;
12.遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項1又は4記載の評価方法;
13.遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項1又は4記載の評価方法;
14.遺伝子のメチル化頻度が、配列番号1で示される塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項1記載の評価方法;
15.組織および癌が、以下の(a)〜(d)から選ばれる1以上の種類の組織および癌あることを特徴とする前項14記載の評価方法
(a)組織が胃組織であり、癌が胃癌である;
(b)組織が結腸組織であり、癌が結腸癌である;
(c)組織が膵臓組織であり、癌が膵臓癌である;
(d)組織が腎臓組織であり、癌が腎臓癌である;
16.哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
(1)哺乳動物由来の検体に含まれるHAND1遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
(2)測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法;
17.HAND1遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、HAND1遺伝子の発現産物の量であることを特徴とする前項16記載の評価方法;
18.HAND1遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の転写産物の量であることを特徴とする前項17記載の評価方法;
19.HAND1遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の翻訳産物の量であることを特徴とする前項17記載の評価方法;
20.HAND1遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって、
(1)癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
(2)第一工程(1)後に、前記癌細胞に含まれるHAND1遺伝子の発現産物量を測定する第二工程、
(3)測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するHAND1遺伝子の発現を促進する能力を判定する第三工程
を有することを特徴とする探索方法(以下、本発明探索方法と記すこともある。);
21.癌細胞が胃癌細胞であることを特徴とする前項20記載の探索方法;
22.有効成分として、前項20の探索方法により見出された能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤:
23.有効成分として、HAND1のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドを含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤;
24.癌マーカーとしての、メチル化されたHAND1遺伝子の使用;
25.癌マーカーが、胃癌マーカー、結腸癌マーカー、膵臓癌マーカー及び腎腺癌マーカーから選ばれる1以上の癌マーカーであることを特徴とする前項24記載の使用;
26.癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、HAND1遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする癌化抑制方法;
27.癌が胃癌であることを特徴とする前項26記載の癌化抑制方法;
等を提供するものである。
本発明は、癌マーカー(例えば、胃癌マーカー、結腸癌マーカー、膵臓癌マーカー、腎腺癌マーカー等)としての、メチル化されたHAND1遺伝子の使用等に関連する発明である。
本発明において癌マーカーとして用いられるHAND1遺伝子としては、例えば、HAND1のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むmRNAの鋳型となる非翻訳領域及び翻訳領域(コーディング領域)と、その5’上流に位置するプロモーター領域とを含むヒト由来の遺伝子をあげることができる。具体的には、Gene, 224, 77-86 (1998)に記載されるヒト由来のHAND1遺伝子等があげられる。ヒト由来のHAND1のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列は、例えば、Genbank Accession No.NM_004821等に記載されている。また、ヒト由来のHAND1のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むmRNAの鋳型となる非翻訳領域及び翻訳領域(コーディング領域)を担うエクソンのうち、最も5’上流側に位置するエクソン(以下、エクソン1と記す。)と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列は、例えば、Genbank Accession No.AC026688等に記載されている。Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列において塩基番号24303〜26500で示される塩基配列に相補的な配列を配列番号1に示す。配列番号1で示される塩基配列において、例えば、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端に位置するメチオニンをコードするATGコドンは、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。本発明において利用されるHAND1遺伝子には、上記の公知の塩基配列を有する遺伝子のほか、かかる塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
また本発明評価方法の第一工程において「(メチル化頻度)に相関関係がある指標値」とは、例えば、HAND1遺伝子の発現産物の量(より具体的には、当該遺伝子の転写産物の量や、当該遺伝子の翻訳産物の量)等をあげることができる。このような発現産物の量の場合には、上記メチル化頻度が高くなればそれに伴い減少するような負の相関関係が存在する。
これらの生体試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる生体試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いてもよい。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等で採取される血液試料をあげることができる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出する。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離DNA(胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたDNAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、該DNAを鋳型として、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプライマーを用いてPCRで増幅し、得られる増幅産物の量を調べる。解析対象とするシトシンは、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号1で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号1で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号1で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号1で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号1で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたDNAを鋳型とし、かつ、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列[メチル化される位置のシトシン(CpG中のシトシン)はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン(CpGに含まれないシトシン)はウラシルとなった塩基配列]とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対のメチル化特異的プライマーを用いるPCR(以下、メチル化特異的PCRとも記すこともある。)、と、重亜硫酸塩等で処理されたDNAを鋳型とし、かつ、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列(全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列)とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対の非メチル化特異的プライマーを用いるPCR(以下、非メチル化特異的PCRとも記すこともある。)とを行う。
上記PCRにおいて、メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合(前者)には、解析対象とするシトシンがメチル化されているDNAが増幅され、一方、非メチル化特異的プライマーを用いるPCRの場合(後者)には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないDNAが増幅される。これらの増幅産物の量を比較することにより、対象となるシトシンのメチル化の有無を調べる。このようにしてメチル化頻度を測定することができる。
<非メチル化特異的プライマー>
U1:5'-AATAGTTTAGGGTGTTGGTT-3'(配列番号2)
U2:5'-AATTTTACACTCAACCCA-3'(配列番号3)
<メチル化特異的プライマー>
M1:5'-AATAGTTTAGGGCGTTGGTC-3'(配列番号4)
M2:5'-AATTTTACGCTCAACCCG-3'(配列番号5)
かかるPCRを行った後、得られた増幅産物の量を比較する。例えば、メチル化特異的プライマーを用いたPCRと非メチル化特異的プライマーを用いたPCRで得られた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法(変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動)である場合には、電気泳動後のゲルをDNA染色して増幅産物のバンドを検出し、検出されたバンドの濃度を比較する。ここでDNA染色の代わりに予め標識されたプライマーを使用してその標識を指標としてバンドの濃度を比較することもできる。定量を必要とする場合は、PCR反応産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、例えば2倍の遺伝子量の差を検出できる高精度の定量が可能なPCR法であるリアルタイムPCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもできる。リアルタイムPCRを行う方法としては、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法あるいはサイバーグリーンなどのインターカレーターを用いる方法等が挙げられる。リアルタイムPCR法のための装置及び試薬としては、市販の装置及びキットを利用することができる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出する。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離DNA(胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたDNAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、該DNAを鋳型として、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンを含む塩基配列を基にして後述するように設計されるプライマーを用いてPCRを行うことにより、解析対象とするシトシンを含むDNAを増幅し、得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する。
ここで、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号1で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号1で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号1で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号1で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号1で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたDNAを鋳型とし、かつ、上述するように設計されるプライマーを用いるPCRを行う。得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル化頻度を測定することができる。
<プライマー>
B1:5'-TAGAGTAGGGAGTTGAGTGGGAG-3'(配列番号6)
B2:5'-ACCCAAAAACCTATTTAACCCTTCTA-3'(配列番号7)
かかるPCRを行った後、得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル化頻度を測定する。
即ち、当該増幅産物の塩基配列を直接的に解析することにより、解析対象とするシトシンに相当する位置の塩基がシトシンであるかチミン(ウラシル)であるかを判定する。得られた増幅産物における塩基を示すピークのチャートにおいて、解析対象とするシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミン(ウラシル)を示すピークの面積とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。また、塩基配列を直接的に解析する方法として、PCRで得られた増幅産物を一旦大腸菌等を宿主としてクローニングして得られた複数のクローンから、それぞれクローニングされたDNAを調製し、当該DNAの塩基配列を解析してもよい。解析される試料のうちの解析対象とするシトシンに相当する位置に検出された塩基がシトシンである試料の割合を求めることにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することもできる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出する。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離DNA(胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたDNAを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、該DNAと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとをハイブリダイゼーションさせ、前記DNAと当該プローブとの結合の有無を調べる。解析対象とするシトシンは、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号1で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号1で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号1で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号1で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号1で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
必要に応じて、重亜硫酸塩等で処理されたDNAを鋳型として第二の方法と同様にPCRを行うことにより当該DNAを予め増幅させておいてもよい。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたDNA又は前記PCRで予め増幅されたDNAと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとのハイブリダイゼーションを行う。メチル化特異的プローブと結合するDNAの量と、非メチル化特異的プローブと結合するDNAの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。
<セット1>
非メチル化特異的プローブ:5'-AAGTATGTAGTTTTTGTGTTTG-3'(配列番号8)
メチル化特異的プローブ :5'-AAGTACGTAGTTTTCGTGTTCG-3'(配列番号9)
<セット2>
非メチル特異的プローブ:5'-TGTGGGTTGAGTGTAAAATT-3'(配列番号10)
メチル化特異的プローブ:5'-CGCGGGTTGAGCGTAAAATT-3'(配列番号11)
かかるハイブリダイゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合したDNAの量と、非メチル化特異的プローブと結合したDNAの量とを比較することにより、解析対象となるシトシン(即ち、プローブの設計の基となった塩基配列に含まれるCpG中のシトシン)のメチル化の頻度を測定することができる。
まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のDNA抽出用キット等を用いてDNAを抽出する。血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離DNA(胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAが含まれる)を分析すると、血球由来のDNAを避けて胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞由来のDNAを解析することができ、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたDNAに、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素を作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる。解析対象とするシトシンは、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列中のシトシンの中から選ぶことができる。
ここで、HAND1遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域(コーディング領域)の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン1と、その5’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムDNAの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号1で示される塩基配列(Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。)があげられる。配列番号1で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン1の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号1で示される塩基配列中に存在するCpGで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号1で示される塩基配列においてCpGが密に存在する領域中に存在するCpG中のシトシンは、例えば、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度(即ち、高メチル化状態(hypermethylation))を示す。さらに具体的には、胃癌、結腸癌、膵臓癌又は腎腺癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号1で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
定量を必要とする場合は、PCR反応産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、例えば2倍の遺伝子量の差を検出できる高精度の定量が可能なPCR法であるリアルタイムPCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもできる。リアルタイムPCRを行う方法としては、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法あるいはサイバーグリーンなどのインターカレーターを用いる方法等が挙げられる。リアルタイムPCR法のための装置及び試薬としては、市販の装置及びキットを利用することができる。
例えば、配列番号1で示される塩基配列において塩基番号1272および1377で示されるシトシンの場合には、当該シトシンはHpaIIの認識配列に含まれており、上記方法により当該シトシンのメチル化頻度を測定することができる。
ここで「癌化度」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における癌細胞の存在量等を意味している。
つまり、本発明評価方法では、哺乳動物由来の検体に含まれるHAND1遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値(例えば、発現産物の量)を測定し、測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値(例えば、発現産物の量)と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定することができる。
哺乳動物由来の検体に含まれるHAND1遺伝子の転写産物であるmRNAを含む試料は、通常の方法に準じて当該検体から抽出、精製等により調製すればよい。
調製された試料中に含まれるmRNAの量を測定するためにノザンブロット法が用いられる場合には、検出用プローブはHAND1遺伝子又はその一部(HAND1遺伝子の制限酵素切断、HAND1遺伝子の塩基配列に基づき化学合成された約100bp〜約1000bp程度のオリゴヌクレオチド等)を含むものであればよく、前記試料中に含まれるmRNAとのハイブリダイゼーションにおいて用いられる検出条件下に検出可能な特異性を与えるものであれば特に制限はない。
また調製された試料中に含まれるmRNAの量を測定するためにRT−PCR法が用いられる場合には、使用されるプライマーは、HAND1遺伝子のみを特異的に増幅できるものであればよく、その増幅する領域や塩基長等には特に制限はない。かかるプライマーとしては、例えば、以下に示すプライマー(S:sense、A:antisense)等をあげることができる。これらのプライマーを用いて後述の実施例に示すようにしてRT-PCR法による転写産物の量を測定することもできる。
定量を必要とする場合は、PCR反応産物をリアルタイムでモニタリングしカイネティックス分析を行うことにより、例えば2倍の遺伝子量の差を検出できる高精度の定量が可能なPCR法であるリアルタイムPCRを用いて、それぞれの産物の量を比較することもできる。リアルタイムPCRを行う方法としては、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法あるいはサイバーグリーンなどのインターカレーターを用いる方法等が挙げられる。リアルタイムPCR法のための装置及び試薬としては、市販の装置及びキットを利用することができる。
S:5'-GTGAGAGCAAGCGGAAAAG-3’(配列番号12)
A:5'-GTGCGTCCTTTAATCCTCTTC-3'(配列番号13)
因みに、HAND1タンパク質に対する特異的抗体は、当該タンパク質を免疫抗原として用いる通常の免疫学的な方法に準じて製造することができる。
例えば、HAND1遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に投与することにより癌化は抑制されるだろう。また例えば、HAND1遺伝子に係るDNAメチル化を阻害する物質を胃癌細胞等の癌細胞に提供することにより、HAND1遺伝子のプロモーター領域又はコーディング領域にある塩基配列中に存在するCpG中のシトシンを正常組織と同様に低メチル化状態(hypomethylation)とし、HAND1遺伝子の転写産物であるmRNAの発現量を増大させ、ひいてはHAND1遺伝子の翻訳産物であるHAND1タンパク質の発現量を増大させることができるだろう。また例えば、HAND1遺伝子又はHAND1タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるcDNAを胃癌細胞等の癌細胞に導入することにより、胃癌細胞等の癌細胞におけるHAND1タンパク質の発現量を増大させることができるだろう。
本発明抗癌剤は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物(例えば、癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞)に対し投与することができる。例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、注射(皮下、静脈内、局所)等を挙げることができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明抗癌剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において有効成分が細胞内で有効に働くような濃度レベルと等しい細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。また、前記の1日の投与量を1回または数回に分けて投与することができる。
前者の遺伝子導入方法としては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のDNAウイルス又はRNAウイルスに、TR4又は変異TR4をコードするDNAを組み込んで導入する方法等があげられる。また非ウイルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法としては、例えば、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法(DNAワクチン法)、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等があげられる。
また、HAND1のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを抗癌剤としての遺伝子治療剤の有効成分として利用する方法としては、当該ポリヌクレオチドを直接体内に導入するin vivo法、ヒトから特定な細胞を取り出し体外で当該ポリヌクレオチドを当該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法(日経サイエンス,1994年4月号,20-45頁、月刊薬事,36(1),23-48(1994)、実験医学増刊,12(15)(1994))等をあげることができる。
前者のin vivo法の場合には、HAND1のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、胃癌細胞、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射により投与することができる。
前記抗癌剤としての遺伝子治療剤の剤型としては、注射剤、他には懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることもできる。このような製剤は、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に前記遺伝子(ベクター型もしくはウィルス型、又はプラスミド型の前記遺伝子の形態を含む)を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合(一般的には注射等が好ましい。)には、当該抗癌剤を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
本発明探索方法の第一工程における癌細胞としては、特に制限はなく、哺乳動物由来の癌組織から分離された癌細胞であってもよいし、またセルラインとして確立された哺乳動物由来の癌細胞株であってもよい。前記哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等をあげることができる。癌の種別としては、胃癌等が好ましくあげられる。具体的には、例えば、MKN28(JCRBから入手可能)、MKN74(JCRBから入手可能)、KATO-III(ATCCから入手可能)、AGS(ATCCから入手可能)、Hs746T(ATCCから入手可能)等の公知なヒト由来の胃癌細胞株をあげることができる。
本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための、癌細胞の量としては、通常約104〜108細胞あればよく、約105〜107細胞が好ましい。また被験物質の濃度としては、通常約0.1ng/ml〜約100μg/mlであればよく、約1ng/ml〜約50μg/mlが好ましい。癌細胞に被験物質を接触させる時間は、通常1時間以上5日程度であり、好ましくは数時間から2日程度である。癌細胞に被験物質を接触させる回数は、一回であってもよいし、複数回であってもよい。
癌細胞に被験物質を接触させる環境としては、癌細胞の生命活動を維持させるような環境が好ましく、例えば、当該癌細胞のエネルギー源が共存するような環境をあげることができる。具体的には、培地中で第一工程が行なわれることが好都合である。
本発明探索方法の第二工程において癌細胞に含まれるHAND1遺伝子の発現産物量を測定するには、前述にある「本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるHAND1遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法」等に準じて測定すればよい。
本発明探索方法の第二工程において測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するHAND1遺伝子の発現を促進する能力を判定するには、前述のように、測定された発現産物量と、例えば、本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための被験物質の濃度をゼロとした場合(即ち、癌細胞に被験物質を接触させてない場合)でのHAND1遺伝子の発現産物量(対照)とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき被験物質が有するHAND1遺伝子の発現を促進する能力を判定する。仮に、被験物質を接触させた癌細胞に含まれるHAND1遺伝子の発現産物量が対照(この場合には、被験物質を接触させていない癌細胞に含まれるHAND1遺伝子の発現産物量)と比較して高ければ、当該被験物質はHAND1遺伝子の発現を促進する能力を有すると判定することができる。もちろん対照として、癌細胞に他の被験物質を接触させた際のHAND1遺伝子の発現産物量を用いてもよく、この場合には、予め当該他の被験物質が有するHAND1遺伝子の発現を促進する能力が判っていることが好ましい。
このようにして、HAND1遺伝子の発現を促進する能力を有する物質を探索することが可能である。尚、バックグランド又はコントロールとして、正常胃細胞株等の正常細胞株や、胃癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるHAND1遺伝子の発現産物量を、被験物質を接触させた場合及び接触させない場合の両者において測定することが好ましい。
ヒト由来の胃癌細胞株2種[MKN28(JCRB)およびMKN74(JCRB)]をJCRB(Japan Cancer Research Resources Bank)のカタログに記載された、それぞれの細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養した後、各々約1x107細胞を集めた。集められた細胞あるいはヒト由来の正常胃粘膜上皮組織[患者からインフォームドコンセントを得て入手]に、SEDTAバッファー[10mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)、100mM NaCl]を10倍容量加えた後、これをホモジナイズした。得られた混合物に、proteinase K(Sigma)を500μg/ml、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱を回収した。回収された沈澱をTEバッファー(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0)に溶解し、これに40μg/mlになるようにRNase A(Sigma)を加えて37℃で1時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱(ゲノムDNA)を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスしてゲノムDNAを得た。
得られたゲノムDNAを、制限酵素BamHIにて消化後、Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9821-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。即ち、制限酵素処理後のゲノムDNA(約1μg)を蒸留水に溶解して20μlのゲノムDNA溶液を調製し、これに6M水酸化ナトリウムを約1μl加えた後、当該混合物を室温で15分間放置した。放置された混合物に、[0.6mMヒドロキノン(Sigma)、と3.6N亜硫酸水素ナトリウム(Sigma)]120μlを加えた後、これを95℃30秒間次いで50℃で15分間を1サイクルとする保温を15サイクル行った。保温された液からWizard DNA clean-up system(Promega)を用いてDNAを精製した。精製されたDNAを50μlのTEバッファーに溶解し、これに2.5μlの6M水酸化ナトリウムを加えた後、当該混合物を室温で5分間放置した。次いで、放置された混合物をエタノール沈澱することにより沈澱(DNA)を回収した。回収された沈澱を20μlのTEバッファーに懸濁した。
B1:5'-TAGAGTAGGGAGTTGAGTGGGAG-3'(配列番号6)
B2:5'-ACCCAAAAACCTATTTAACCCTTCTA-3'(配列番号7)
PCR産物をpGEM-T-Easy(Promega)にライゲーションした後、これを大腸菌XL1Blue株に導入した。形質転換された大腸菌のコロニーを、胃癌細胞株1株につき10個ずつピックアップし、それぞれ溶菌させた。得られた大腸菌溶菌液を鋳型とし、上記と同様な条件でPCRを行った。PCRの反応液を上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供した後、228bpのDNAを含むゲル部分を切り出し、これからDNAを抽出した。抽出されたDNAの塩基配列をDNAシークエンサー(ABI310型、PE Biosystems)によって解析した。各コロニーから調製されたDNAのシークエンス結果について、配列番号1で示される塩基配列において塩基番号1234〜1461で示される領域に存在するCpG中のシトシンがウラシルに置換されているか否かを調べて、試験した10コロニーから調製されたDNAのうち、シトシンがウラシルに置換されていないDNAの頻度、即ち、当該シトシンのメチル化頻度を測定した。
その結果を表1に示した。正常胃粘膜上皮組織(21N)から調製されたDNAの場合には、塩基番号1234〜1461で示される領域に存在するCpG中のシトシン12個(塩基番号1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434)には、ウラシルに置換されていないDNA(即ち、メチル化されているDNA)がほとんど見出されなかった。一方、胃癌細胞株2種(MKN28およびMKN74)から調製されたDNAの場合には、当該領域に存在するCpG中のシトシンのほとんどがウラシルに置換されていないDNA(即ち、メチル化されているDNA)であることが判った。
ヒト由来の胃癌細胞株2種(MKN28およびMKN74)を専用培地で70%コンフルエントになるまで培養した後、各々の細胞を集めた。集められた各々の細胞(約100mg湿重量)及びヒト由来の正常胃粘膜上皮組織(21N:約50mg)にそれぞれ1mlのISOGEN溶液(ニッポンジーン)を混合してホモジネートした後、これに0.2mlのクロロホルムを加えて懸濁した。懸濁後、当該混合物を遠心分離(4℃、15000xg、15分間)することにより、上清を回収した。回収された上清に0.5mlのイソプロパノールを加えて懸濁した後、遠心分離(4℃、15000xg、15分間)することにより、沈澱(RNA)を回収した。回収された沈澱を75%エタノールでリンスした後、DEPC(ジエチルピロカーボネート)処理水に溶解した。
また、ヒト由来の胃癌細胞株2種(MKN28、MKN74)を約3x 105細胞/10cmプレートの密度で接種し、専用培地を用いて培養した。接種後1日目に、メチル化阻害剤である5-aza-2'-deoxycytidine(Sigma製)(以下、5Aza-dCと記す。)を1μMの濃度となるよう培地に添加した。5Aza-dCの添加から24時間後に、5Aza-dCが添加されていない上記の培地に交換し、培養を継続した。次いで、接種後3日目および5日目に、同様に5Aza-dCを培地に添加した。接種後6日目に細胞を回収し、回収された細胞から上記と同様な方法でRNAを抽出・回収した。
このようにして得られたRNAをDNaseI(Ambion)で処理した後、これを鋳型としSuperscriptII(Invitrogen)を用いて当該酵素に添付されたプロトコールに従いcDNAを合成した。合成されたcDNAを鋳型として、かつ、以下に示したHAND1 SとHAND1 Aとをプライマー対として用いたReal Time PCRを行うことにより、HAND1遺伝子のmRNAに由来するDNA(88bp)を増幅した。この際、コントロールとして、上記のcDNAを鋳型として、かつ、以下に示したPCNA SとPCNA Aとをプライマー対として用いたPCRを行うことにより、Proliferating cell nuclear antigen(PCNA)遺伝子のmRNAに由来するDNAを増幅した。
<プライマー(S:sense、A:antisense)>
HAND1 S:5'-GTGAGAGCAAGCGGAAAAG-3’(配列番号12)
HAND1 A:5'-GTGCGTCCTTTAATCCTCTTC-3'(配列番号13)
PCNA S: 5'-ATGTCGATAAAGAGGAGGAA-3'(配列番号14)
PCNA A: 5'-AGAGTGGAGTGGCTTTTGTA-3'(配列番号15)
その結果を図1に示した。ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織(21N)の場合には、HAND1遺伝子のmRNAに由来するDNAが検出されたのに対し、胃癌細胞株2種のいずれの場合においても、当該DNAは検出されなかった。即ち、ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織(21N)では、HAND1遺伝子の発現が確認されたのに対し、胃癌細胞株2種のいずれにおいても、HAND1遺伝子の発現が認められなかった。
1μM 5Aza-dCの存在下に培養されたMKN28およびMKN74の場合には、HAND1遺伝子のmRNAに由来するDNAが検出された。尚、PCNA遺伝子のmRNAに由来するDNAは、正常胃粘膜上皮組織(21N)の場合、5Aza-dC非存在下に培養された胃癌細胞株MKN28及びMKN74の場合、1μM 5Aza-dC存在下に培養されたMKN28及びMKN74の場合のいずれにおいても同様に検出された。即ち、胃癌細胞株MKN28及びMKN74の場合には、メチル化阻害剤の存在下にHAND1遺伝子の発現が認められた。
以上の結果から、胃癌細胞株における上記シトシンのメチル化は、メチル化阻害剤により阻害され、かつ、メチル化阻害剤の存在下でHAND1遺伝子が発現することが明らかとなった。
ヒト由来の胃癌細胞株2種(MKN28、MKN74)を約3x 105細胞/10cmプレートの密度で接種し、専用培地を用いて培養した。接種後1日目に、メチル化阻害剤である5Aza-dCを1μMの濃度となるよう培地に添加した。5Aza-dCの添加から24時間後に、5Aza-dCが添加されていない上記の培地に交換し、培養を継続した。次いで、接種後3日目および5日目に、同様に5Aza-dCを培地に添加した。接種後6日目に細胞を回収し、回収された細胞から実施例1と同様な方法でゲノムDNAを抽出・回収した。
抽出・回収されたゲノムDNAを、実施例1と同様な方法で亜硫酸水素ナトリウム処理した。得られたDNAを鋳型とし、以下に示す非メチル化特異的プライマーU1とU2、又は、メチル化特異的プライマーM1とM2を用いてPCRを行った。非メチル化特異的プライマーU1とU2とを使用した場合、メチル化特異的プライマーM1とM2とを使用した場合共に、配列番号1で示される塩基配列の塩基番号1141〜1324で示される塩基配列を有するDNAをbiisulfite処理した後の塩基配列を有する184bpのDNAが増幅される。
<非メチル化特異的プライマー>
U1:5'-AATAGTTTAGGGTGTTGGTT-3'(配列番号2)
U2:5'-AATTTTACACTCAACCCA-3'(配列番号3)
<メチル化特異的プライマー>
M1:5'-AATAGTTTAGGGCGTTGGTC-3'(配列番号4)
M2:5'-AATTTTACGCTCAACCCG-3'(配列番号5)
メチル化特異的プライマーおよび非メチル化特異的プライマーに、特異性があることを確認するため、まず、正常胃粘膜上皮組織(21N)から通常の方法でゲノムDNA[ゲノムDNA(1)]を抽出し、この一部をメチル化酵素SssI(NEB社)により処理しゲノムDNAの5'-CG-3' 全てをメチル化してDNA[DNA(2)]を得た。得られたDNA(1)及びDNA(2)についても、上記のメチル化特異的PCRおよび非メチル化特異的PCRを行った。
一方、1μM 5Aza-dCの存在下に培養された胃癌細胞株 MKN28およびMKN74の場合には、非メチル化特異的プライマーを使用した場合(レーンU)には増幅されたDNAのバンドが認められ、メチル化特異的プライマーを使用した場合(レーンM)には弱いバンドが検出されたのみであった。従って、当該条件下においては、多くのゲノムDNAにおいて、配列番号1で示される塩基配列の塩基番号1153、1160、1307、及び1316でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていないと判断された。
以上の結果から、胃癌細胞株における上記のシトシンのメチル化は、メチル化阻害剤により阻害されることが明らかとなった。
ヒト由来の膵臓癌細胞株3種(HPAF-II、Mia PaCa-2及びHPAC)、結腸腺癌細胞株3種(HT-29、COLO205及びSW1116)、及び腎腺癌細胞株(ACHN)[いずれもAmerican Type Culture Collection(ATCC)から入手]をATCCのカタログに記載された、それぞれの細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養した後、各々約1x107細胞を集めた。集められた細胞に、SEDTAバッファー[10mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)、100mM NaCl]を10倍容量加えた後、これをホモジナイズした。得られた混合物に、proteinase K(Sigma)を500μg/ml、ドデシル硫酸ナトリウムを1%(w/v)になるように加えた後、これを55℃で約16時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl(pH8.0)にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱を回収した。回収された沈澱をTEバッファー(10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0)に溶解し、これに40μg/mlになるようにRNase A(Sigma)を加えて37℃で1時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにNaClを0.5Nとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱(ゲノムDNA)を回収した。回収された沈澱を70%エタノールでリンスしてゲノムDNAを得た。
上記の癌細胞株から得られたゲノムDNA、あるいは正常組織(結腸、腎臓、膵臓)由来のゲノムDNA(BioChain社)を、Clark et al., Nucl. Acids. Res., 22, 2990-2997, 1994; Herman et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9821-9826, 1996に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。即ち、ゲノムDNA(約1μg)を蒸留水に溶解して20μlのゲノムDNA溶液を調製し、これに6M水酸化ナトリウムを約1μl加えた後、当該混合物を室温で15分間放置した。放置された混合物に、[0.6mMヒドロキノン(Sigma)、と3.6N亜硫酸水素ナトリウム(Sigma)]120μlを加えた後、これを95℃30秒間次いで50℃で15分間を1サイクルとする保温を15サイクル行った。保温された液からWizard DNA clean-up system(Promega)を用いてDNAを精製した。精製されたDNAを50μlのTEバッファーに溶解し、これに2.5μlの6M水酸化ナトリウムを加えた後、当該混合物を室温で5分間放置した。次いで、放置された混合物をエタノール沈澱することにより沈澱(DNA)を回収した。回収された沈澱を50μlのTEバッファーあるいは超純水に懸濁した。
<非メチル化特異的プライマー>
U1:5'-AATAGTTTAGGGTGTTGGTT-3'(配列番号2)
U2:5'-AATTTTACACTCAACCCA-3'(配列番号3)
<メチル化特異的プライマー>
M1:5'-AATAGTTTAGGGCGTTGGTC-3'(配列番号4)
M2:5'-AATTTTACGCTCAACCCG-3'(配列番号5)
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号3
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号4
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号5
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号6
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号7
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号8
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号9
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号10
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号11
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号12
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号13
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号14
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号15
PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
Claims (14)
- 哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体における癌細胞の存在を評価する方法であって、
(1)哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体に含まれるHAND1遺伝子のメチル化頻度又は発現産物の量を測定する第一工程、及び
(2)測定された前記メチル化頻度又は発現産物の量と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体における癌細胞の存在を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。 - 哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項1記載の評価方法。
- 哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体が組織であることを特徴とする請求項1記載の評価方法。
- 哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体における癌細胞の存在を評価する方法であって、
(1)哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体に含まれるHAND1遺伝子のメチル化頻度を測定する第一工程、及び
(2)測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体における癌細胞の存在を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。 - 哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項4記載の評価方法。
- 哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体が組織であることを特徴とする請求項4記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項1又は4記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項1又は4記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項1又は4記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、配列番号1で示される塩基配列内に存在する一つ以上の5'-CG-3'で示される塩基配列中のシトシンのうち、配列番号1で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422若しくは1434のいずれか1つ以上で示される塩基番号であるシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項1記載の評価方法。
- 哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体における癌細胞の存在を評価する方法であって、
(1)哺乳動物の胃、結腸又は膵臓由来の検体に含まれるHAND1遺伝子の発現産物の量を測定する第一工程、及び
(2)測定された前記発現産物の量と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体における癌細胞の存在を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。 - HAND1遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の転写産物の量であることを特徴とする請求項11記載の評価方法。
- HAND1遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の翻訳産物の量であることを特徴とする請求項11記載の評価方法。
- 胃癌マーカー、結腸癌マーカー又は膵臓癌マーカーとしての、メチル化されたHAND1遺伝子の使用。
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