JP2004113116A - 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 - Google Patents
哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004113116A JP2004113116A JP2002280687A JP2002280687A JP2004113116A JP 2004113116 A JP2004113116 A JP 2004113116A JP 2002280687 A JP2002280687 A JP 2002280687A JP 2002280687 A JP2002280687 A JP 2002280687A JP 2004113116 A JP2004113116 A JP 2004113116A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- mammal
- derived
- cytosine
- specimen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
【課題】癌を早期に発見するための診断方法や治療方法等の評価に適する、遺伝子異常の検出に基づいた哺乳動物由来の検体の癌化度評価方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法
等に関する。
【選択図】 なし
【解決手段】本発明は、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法
等に関する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌が遺伝子異常を原因とする疾病であること等が次第に明らかになりつつあるが、癌患者の死亡率は未だ高く、現在利用可能な診断方法や治療方法等の評価が必ずしも十分に満足できるものではないことを示している。その１つの原因として癌組織の種類に基づく多様性、マーカーとなる遺伝子等の低い正確性や低い検出感度等が考えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、癌を早期に発見するための診断方法や治療方法等の評価に適する、遺伝子異常の検出に基づいた哺乳動物由来の検体の癌化度評価方法の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、癌細胞株においてＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が、健常者の組織検体と比較して有意に高い頻度でメチル化されていること、そして、この癌細胞株においては、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現レベルが健常者の組織検体と比較して有意に低いことを見出し、さらに、癌細胞株にＤＮＡメチル化阻害剤を作用させることにより、かかる遺伝子の発現レベルを増加させ得ることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
２．哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
３．哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
４．哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
５．哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
６．哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする前項４記載の評価方法；
７．哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
８．哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項４記載の評価方法；
９．組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする前項８記載の評価方法；
１０．遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１又は４記載の評価方法；
１１．組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする前項１０記載の評価方法；
１２．遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１又は４記載の評価方法；
１３．遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１又は４記載の評価方法；
１４．遺伝子のメチル化頻度が、配列番号１で示される塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
１５．組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする前項１４記載の評価方法；
１６．哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
１７．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量であることを特徴とする前項１６記載の評価方法；
１８．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の転写産物の量であることを特徴とする前項１７記載の評価方法；
１９．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の翻訳産物の量であることを特徴とする前項１７記載の評価方法；
２０．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって、
（１）癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程（１）後に、前記癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を測定する第二工程、
（３）測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定する第三工程
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
２１．癌細胞が胃癌細胞であることを特徴とする前項２０記載の探索方法；
２２．有効成分として、前項２０の探索方法により見出された能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤：
２３．有効成分として、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤；
２４．癌マーカーとしての、メチル化されたＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の使用；
２５．癌マーカーが胃癌マーカーであることを特徴とする前項２４記載の使用；
２６．癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする癌化抑制方法；
２７．癌が胃癌であることを特徴とする前項２６記載の癌化抑制方法；
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、癌マーカー（例えば、胃癌マーカー等）としての、メチル化されたＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子（以下、ＴＨＢＤ遺伝子と記すこともある。） の使用等に関連する発明である。
本発明においてマーカー遺伝子として用いられるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子としては、例えば、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）とその５’上流に位置するプロモーター領域とを含む遺伝子をあげることができる。ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１等に記載されている。また、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む非翻訳領域及び翻訳領域（コーディング領域）のうち、最も５’上流側に位置するエクソン（以下、エクソン１と記す。）と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１等に記載されている。Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される配列番号において、例えば、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ酸配列の末端に位置するメチオニンをコードするＡＴＧコドンは、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。本発明において利用されるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子には、上記の公知の塩基配列を有する遺伝子のほか、かかる塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
【０００６】
哺乳動物では、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する４種類の塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象がある。哺乳動物由来の、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子では、当該遺伝子のゲノムＤＮＡの一部のシトシンがメチル化されている。そして、ＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列をＣｐＧと記すこともある。）中のシトシンに限られる。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖のＣｐＧ中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖のＣｐＧ中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。
【０００７】
本発明評価方法の第一工程において「メチル化頻度」とは、例えば、調査対象となるＣｐＧ中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、当該シトシンがメチル化されているハプロイドの割合で表される。
また本発明評価方法の第一工程において「（メチル化頻度）に相関関係がある指標値」とは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量（より具体的には、当該遺伝子の転写産物の量や、当該遺伝子の翻訳産物の量）等をあげることができる。このような発現産物の量の場合には、上記メチル化頻度が高くなればそれに伴い減少するような負の相関関係が存在する。
【０００８】
本発明評価方法の第一工程における哺乳動物由来の検体としては、例えば、胃癌細胞等の癌細胞若しくはそれを含む組織、及び、胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる可能性のある、細胞、それを含む組織（ここでの組織とは、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料をあげることができる。具体的には、例えば、癌が胃癌である場合、被験動物から採取された胃粘膜層（表層上皮、腺組織、粘膜固有層及び粘膜筋板）、胃粘膜下組織層、（固有）筋層及び漿膜層等をあげることができる。
これらの生体試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる生体試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いてもよい。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明評価方法の利用が期待できる。
【０００９】
本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する方法は、例えば、以下のように行えばよい。
【００１０】
第一の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。次いで、抽出されたＤＮＡを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡを、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプライマーを用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）で増幅し、得られる増幅産物の量を調べる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１１】
非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。
【００１２】
非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたＤＮＡを接触させるには、例えば、まず当該ＤＮＡをアルカリ溶液（ｐＨ９〜１４）で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（溶液中の濃度：例えば、終濃度３Ｍ）等で約１０〜１６時間（一晩）程度、５５℃で処理する。反応を促進するため、９５℃での変性と、５５℃での反応を１０−２０回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列［メチル化される位置のシトシン（ＣｐＧ中のシトシン）はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン（ＣｐＧに含まれないシトシン）はウラシルとなった塩基配列］とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対のメチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲ（以下、メチル化特異的ＰＣＲとも記すこともある。）、と、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対の非メチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲ（以下、非メチル化特異的ＰＣＲとも記すこともある。）とを行う。
上記ＰＣＲにおいて、メチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲの場合（前者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されているＤＮＡが増幅され、一方、非メチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲの場合（後者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないＤＮＡが増幅される。これらの増幅産物の量を比較することにより、対象となるシトシンのメチル化の有無を調べる。このようにしてメチル化頻度を測定することができる。
【００１３】
ここで、メチル化特異的プライマーは、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して、メチル化を受けているシトシンを含む塩基配列に特異的なＰＣＲプライマー（メチル化特異的プライマー）を設計し、また、メチル化を受けていないシトシンを含む塩基配列に特異的なＰＣＲプライマー（非メチル化特異的プライマー）を設計する。重亜硫酸塩処理により化学的に変換され相補的ではなくなったＤＮＡ鎖を基に設計することから、元来二本鎖であったＤＮＡのそれぞれの鎖を基に、それぞれからメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを作製することもできる。かかるプライマーは、メチル、非メチルの特異性を高めるために、プライマーの３’末端近傍にＣｐＧ中のシトシンを含むように設計することが好ましい。また、解析を容易にするために、プライマーの一方を標識してもよい。
【００１４】
より具体的には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度をメチル化特異的ＰＣＲで測定するためのプライマーは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域又は非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）にある塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシン、具体的には、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプライマーの例を以下に示す。
＜非メチル化特異的プライマー＞
Ｕ１：５’−ＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２）
Ｕ２：５’−ＣＡＴＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３）
＜メチル化特異的プライマー＞
Ｍ１：５’−ＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
Ｍ２：５’−ＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号５）
【００１５】
メチル化特異的ＰＣＲにおける反応液としては、例えば、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、１０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー溶液を各１μｌと、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとした反応液をあげることができる。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５５〜６５℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３０〜４０サイクル行う条件があげられる。
かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物の量を比較する。例えば、メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲと非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲで得られた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法（変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動）である場合には、電気泳動後のゲルをＤＮＡ染色して増幅産物のバンドを検出し、検出されたバンドの濃度を比較する。ここでＤＮＡ染色の代わりに予め標識されたプライマーを使用してその標識を指標としてバンドの濃度を比較することもできる。
【００１６】
このような方法は、一般にメチル化特異的ＰＣＲとも呼ばれ、Ｈｅｒｍａｎ等（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９３， ９８２１−９８２６， １９９６）等により報告されている方法であって、シトシンと５−メチルシトシンとの化学的性質の違いを利用する方法である。
【００１７】
第二の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたＤＮＡを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡを基にして後述するように設計されるプライマーを用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）で増幅し、得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する方法をあげることもできる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１８】
当該ＰＣＲに用いられるプライマーは、解析対象とするシトシンの５’上流の塩基配列と３’下流の塩基配列を基にして当該シトシンを含む塩基配列を有するＤＮＡを増幅可能なプライマー対を設計するとよい。プライマー設計のための塩基配列は、解析対象とするＣｐＧ中のシトシンを含まないように選定する。そして、プライマー設計のために選定された塩基配列が、シトシンを全く含まない場合には、選定された塩基配列及びかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれそのままプライマーの塩基配列とすることができる。また、プライマー設計のために選定された塩基配列が解析対象以外のシトシンを含むが当該シトシンはＣｐＧ中のシトシンでない場合には、これらシトシンがウラシルに変換されることを考慮してプライマーを設計する。即ち、全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれ有する一対のプライマーを設計する。さらに、プライマー設計のために選定された塩基配列が解析対象以外のシトシンを含み当該シトシンはＣｐＧ中のシトシンである場合には、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮してプライマーを設計する。即ち、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列［メチル化される位置のシトシン（ＣｐＧ中のシトシン）はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン（ＣｐＧに含まれないシトシン）はウラシルとなった塩基配列］とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選定された一対のメチル化特異的プライマーと、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれ有する一対の非メチル化特異的プライマーとを設計する。この場合、上記のＰＣＲには、メチル化特異的プライマー対と非メチル化特異的プライマー対とを等量ずつ混合して用いる。
【００１９】
非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを修飾する試薬を用いても良い。
【００２０】
非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたＤＮＡを接触させるには、例えば、まず当該ＤＮＡをアルカリ溶液（ｐＨ９〜１４）で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（溶液中の濃度：例えば、終濃度３Ｍ）等で約１０〜１６時間（一晩）程度、５５℃で処理する。反応を促進するため、９５℃での変性と、５５℃での反応を１０−２０回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、上述するように設計されるプライマーを用いるＰＣＲを行う。得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル化頻度を測定することができる。
【００２１】
より具体的には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子遺伝子のメチル化頻度を塩基配列の直接的解析で測定するためのプライマーは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）にある塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシン、具体的には、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプライマーの例を以下に示す。
因みに、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６ で示されるシトシンのメチル化頻度を調べるために、上記のようにして設計されたプライマーを用いると、配列番号１における塩基番号１５１２〜１７８７のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後の塩基配列に相当するＤＮＡ（２７６ｂｐ）が増幅される。
＜プライマー＞
Ｂ１：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号６）
Ｂ２：５’−ＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号７）
【００２２】
ＰＣＲにおける反応液としては、例えば、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、２０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー溶液を各１μｌと、２ｍＭ ｄＮＴＰを３μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとした反応液をあげることができる。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５５℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３０〜４０サイクル行う条件があげられる。
かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル化頻度を測定する。
即ち、当該増幅産物の塩基配列を直接的に解析することにより、解析対象とするシトシンに相当する位置の塩基がシトシンであるかチミン（ウラシル）であるかを判定する。得られた増幅産物における塩基を示すピークのチャートにおいて、解析対象とするシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミン（ウラシル）を示すピークの面積とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。また、塩基配列を直接的に解析する方法として、ＰＣＲで得られた増幅産物を一旦大腸菌等を宿主としてクローニングして得られた複数のクローンから、それぞれクローニングされたＤＮＡを調製し、当該ＤＮＡの塩基配列を解析してもよい。解析される試料のうちの解析対象とするシトシンに相当する位置に検出された塩基がシトシンである試料の割合を求めることにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することもできる。
【００２３】
第三の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたＤＮＡを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとをハイブリダイゼーションさせ、前記ＤＮＡと当該プローブとの結合の有無を調べる方法をあげることもできる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２４】
当該ハイブリダイゼーションに用いられるプローブは、解析対象とするシトシンを含む塩基配列を基にして、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して設計するとよい。即ち、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列［メチル化される位置のシトシン（ＣｐＧ中のシトシン）はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン（ＣｐＧに含まれないシトシン）はウラシルとなった塩基配列］又はかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するメチル化特異的プローブと、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）又はかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する非メチル化特異的プローブを設計する。尚、このようなプローブは、ＤＮＡとプローブとの結合の有無についての解析を容易にするために標識してから用いてもよい。またプローブを通常の方法に準じて担体上に固定して用いてもよいが、この場合には、哺乳動物由来の検体から抽出されたＤＮＡを予め標識しておくとよい。
【００２５】
非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。
【００２６】
非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたＤＮＡを接触させるには、例えば、まず当該ＤＮＡをアルカリ溶液（ｐＨ９〜１４）で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（溶液中の濃度：例えば、終濃度３Ｍ）等で約１０〜１６時間（一晩）程度、５５℃で処理する。反応を促進するため、９５℃での変性と、５５℃での反応を１０−２０回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。
必要に応じて、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型として第二の方法と同様にＰＣＲを行うことにより当該ＤＮＡを予め増幅させておいてもよい。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡ又は前記ＰＣＲで予め増幅されたＤＮＡと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとのハイブリダイゼーションを行う。メチル化特異的プローブと結合するＤＮＡの量と、非メチル化特異的プローブと結合するＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。
【００２７】
より具体的には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を測定するためのプローブは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）にある塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシン、具体的には、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプローブの例を以下に示す。
＜セット１＞
非メチル化特異的プローブ：５’−ＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号８）
メチル化特異的プローブ ：５’−ＡＣＧＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＣ−３’（配列番号９）
＜セット２＞
非メチル特異的プローブ：５’−ＴＣＧＧＧＴＴＣＧＧＡＴＴＴＣＧＧＣＧＴ−３’（配列番号１０）
メチル化特異的プローブ：５’−ＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＴ−３’（配列番号１１）
【００２８】
ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。ハイブリダイゼーションは、通常ストリンジェントな条件下に行われる。ここで「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度との両方を変えることもできる。
かかるハイブリダイゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合したＤＮＡの量と、非メチル化特異的プローブと結合したＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシン（即ち、プローブの設計の基となった塩基配列に含まれるＣｐＧ中のシトシン）のメチル化の頻度を測定することができる。
【００２９】
第四の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたＤＮＡを、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素に作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる方法をあげることもできる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００３０】
当該方法で用いられる「シトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素」（以下、メチル化感受性制限酵素と記すこともある。）とは、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化することのできる制限酵素を意味する。認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させても当該ＤＮＡは切断されず、一方、認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させれば当該ＤＮＡは切断される。メチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、ＨｐａＩＩ、ＢｓｔＵＩ、ＮａｒＩ、ＳａｃＩＩ等をあげることができる。
【００３１】
当該制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、例えば、前記ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含み、当該認識配列以外には前記制限酵素の認識配列を含まないＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。
例えば、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５９５及び１６４５で示されるシトシンの場合には、当該シトシンはＮａｒＩの認識配列に含まれており、上記方法により当該シトシンのメチル化頻度を測定することができる。
【００３２】
また、当該制限酵素による消化の有無を調べる他の方法としては、例えば、解析対象とするシトシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させたＤＮＡに対して、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に由来し、かつ、当該制限酵素の認識配列を含まないＤＮＡをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしたＤＮＡの長さを調べる方法をあげることもできる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、当該シトシンがメチル化されていない場合よりも長いＤＮＡが検出される。検出された長いＤＮＡの量と短いＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。
【００３３】
以上のような各種方法を用いて、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を測定する。測定されたメチル化頻度と、例えば、胃癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。仮に、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度が対照と比較して高ければ（Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が対照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高いと判定することができる。
ここで「癌化度」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における癌細胞の存在量等を意味している。
【００３４】
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現は、健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体においてよりも胃癌細胞等の癌細胞において低い。これは、胃癌細胞等の癌細胞において当該遺伝子のメチル化頻度が高いために、当該遺伝子が正常に発現できずその結果として当該遺伝子の発現産物の量（より具体的には、転写産物の量や翻訳産物の量）が減少する。このように本発明評価方法等では、メチル化頻度の代わりに、それに相関関係がある指標値（上記の場合には、発現産物の量であって、負の相関関係がある指標値である。）を測定してもよい。
つまり、本発明評価方法では、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値（例えば、発現産物の量）を測定し、測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値（例えば、発現産物の量）と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定することができる。
【００３５】
本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法としては、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンブロット法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）〕、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３１５９−３１６６（１９９３）〕、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＮＡＳＢＡ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｎａｔｕｒｅ，３５０，９１−９２（１９９１）〕等の公知な方法を用いればよい。
哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを含む試料は、通常の方法に準じて当該検体から抽出、精製等により調製すればよい。
調製された試料中に含まれるｍＲＮＡの量を測定するためにノザンブロット法が用いられる場合には、検出用プローブはＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子又はその一部（Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の制限酵素切断、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の塩基配列に従い化学合成した約１００ｂｐ〜約１０００ｂｐ程度のオリゴヌクレオチド等）を含むものであればよく、前記試料中に含まれるｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにおいて用いられる検出条件下に検出可能な特異性を与えるものであれば特に制限はない。
また調製された試料中に含まれるｍＲＮＡの量を測定するためにＲＴ−ＰＣＲ法が用いられる場合には、使用されるプライマーは、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のみを特異的に増幅できるものであればよく、その増幅する領域や塩基長等には特に制限はない。かかるプライマーとしては、例えば、以下に示すプライマー（Ｓ：ｓｅｎｓｅ、Ａ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）等をあげることができる。これらのプライマーを用いて後述の実施例に示すようにしてＲＴ−ＰＣＲ法による転写産物の量を測定することもできる。
Ｓ：５’−ＧＧＴＧＡＴＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１２）
Ａ：５’−ＣＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＧＴＴＡ−３’（配列番号１３）
【００３６】
また本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する他の方法としては、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の翻訳産物であるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質の量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質に対する特異的抗体（モノクロナル抗体、ポリクロナル抗体）を用いた、細胞工学ハンドブック、羊土社、２０７（１９９２）等に記載されるイムノブロット法、免疫沈降による分離法、間接競合阻害法（ＥＬＩＳＡ 法）等の公知な方法を用いればよい。
因みに、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質に対する特異的抗体は、当該タンパク質を免疫抗原として用いる通常の免疫学的な方法に準じて製造することができる。
【００３７】
以上のような各種方法を用いて、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する。測定されたメチル化頻度に相関関係がある指標値と、例えば、胃癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。仮に、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に正の相関関係がある指標値が対照と比較して高ければ又は負の相関関係がある指標値が対照と比較して低ければ（Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が対照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高いと判定することができる。
【００３８】
本発明評価方法における、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定するための各種方法で使用し得るプライマー、プローブ又は特異的抗体は、胃癌細胞等の癌細胞の検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等を試薬として含有する胃癌細胞等の癌細胞の検出用キットや、これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等が担体上に固定化されてなる胃癌細胞等の癌細胞の検出用チップも提供しており、本発明評価方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
【００３９】
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現は、健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体においてよりも胃癌細胞等の癌細胞において低い。一方、後述の実施例でも示すように、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に係るＤＮＡメチル化を阻害する物質を胃癌細胞等の癌細胞に作用させることにより、当該遺伝子の発現産物の量を増加させることができる。これは、胃癌細胞等の癌細胞におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現レベルの低下又はそれに伴う機能低下を補うことのできる物質−例えば、非メチル化（或いは、癌で認められるようなメチル化異常を起こしていない）Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子、当該遺伝子の発現産物、当該遺伝子の発現を促進する能力を有する物質（例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に係るＤＮＡメチル化を阻害する物質、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質）−等は、胃癌等の癌の治療や、胃粘膜層（表層上皮、腺組織、粘膜固有層及び粘膜筋板）、胃粘膜下組織層、（固有）筋層及び漿膜層等の正常組織の癌化抑制に有用であることを意味している。
例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に投与することにより癌化は抑制されるだろう。また例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に係るＤＮＡメチル化を阻害する物質を胃癌細胞等の癌細胞に提供することにより、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域又はコーディング領域にある塩基配列中に存在するＣｐＧ中のシトシンを正常組織と同様に低メチル化状態（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）とし、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量を増大させ、ひいてはＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の翻訳産物であるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質の発現量を増大させることができるだろう。また例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子又はＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｃＤＮＡを胃癌細胞等の癌細胞に導入することにより、胃癌細胞等の癌細胞におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質の発現量を増大させることができるだろう。
【００４０】
つまり、本発明では、（１）有効成分として、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤や、（２）有効成分として、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤も提供している（以下総じて、本発明抗癌剤と記すこともある。）。
【００４１】
本発明抗癌剤の剤型としては通常の製剤であれば特に制限はないが、このような製剤は、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に有効成分を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。）には、当該抗癌剤を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
本発明抗癌剤は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物（例えば、癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞）に対し投与することができる。例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、注射（皮下、静脈内、局所）等を挙げることができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明抗癌剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において有効成分が細胞内で有効に働くような濃度レベルと等しい細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【００４２】
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子を細胞に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、非ウイルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））等の方法をあげることができる。
前者の遺伝子導入方法としては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、ＴＲ４又は変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法等があげられる。また非ウイルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法としては、例えば、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等があげられる。
また、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のＤＮＡを抗癌剤としての遺伝子治療剤の有効成分として利用する方法としては、当該遺伝子のＤＮＡを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、ヒトから特定な細胞を取り出し体外で当該遺伝子のＤＮＡを当該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４））等をあげることができる。
前者のｉｎ ｖｉｖｏ法の場合には、前記遺伝子のＤＮＡが疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、胃癌細胞、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射により投与することができる。
前記抗癌剤としての遺伝子治療剤の剤型としては、注射剤、他には懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることもできる。このような製剤は、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に前記遺伝子（ベクター型若しくはウィルス型、又はプラスミド型の前記遺伝子の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。）には、当該抗癌剤を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
【００４３】
本発明探索方法は、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって、（１）癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、（２）第一工程（１）後に、前記癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を測定する第二工程、（３）測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定する第三工程を有する。
本発明探索方法の第一工程における癌細胞としては、特に制限はなく、哺乳動物由来の癌組織から分離された癌細胞であってもよいし、またセルラインとして確立された哺乳動物由来の癌細胞株であってもよい。前記哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等をあげることができる。癌の種別としては、胃癌等が好ましくあげられる。具体的には、例えば、ＭＫＮ２８（ＪＣＲＢから入手可能）、ＭＫＮ７４（ＪＣＲＢから入手可能）、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（ＡＴＣＣから入手可能）、ＡＧＳ（ＡＴＣＣから入手可能）、Ｈｓ−７４６Ｔ（ＡＴＣＣから入手可能）等の公知なヒト由来の胃癌細胞株をあげることができる。
本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための、癌細胞の量としては、通常約１０４〜１０８細胞あればよく、約１０５〜１０７細胞が好ましい。また被験物質の濃度としては、通常約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌであればよく、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌが好ましい。癌細胞に被験物質を接触させる時間は、通常１時間以上５日程度であり、好ましくは数時間から２日程度である。癌細胞に被験物質を接触させる回数は、一回であってもよいし、複数回であってもよい。
癌細胞に被験物質を接触させる環境としては、癌細胞の生命活動を維持させるような環境が好ましく、例えば、当該癌細胞のエネルギー源が共存するような環境をあげることができる。具体的には、培地中で第一工程が行なわれることが好都合である。
本発明探索方法の第二工程において癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を測定するには、前述にある「本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法」等に準じて測定すればよい。
本発明探索方法の第二工程において測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定するには、前述のように、測定された発現産物量と、例えば、本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための被験物質の濃度をゼロとした場合（即ち、癌細胞に被験物質を接触させてない場合）でのＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定する。仮に、被験物質を接触させた癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量が対照（この場合には、被験物質を接触させていない癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量）と比較して高ければ、当該被験物質はＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有すると判定することができる。もちろん対照として、癌細胞に他の被験物質を接触させた際の、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を用いてもよく、この場合には、予め当該他の被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力が判っていることが好ましい。
このようにして、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質を探索することが可能である。尚、バックグランド又はコントロールとして、正常胃細胞株等の正常細胞株や、胃癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を、被験物質を接触させた場合及び接触させない場合の両者において測定することが好ましい。
【００４４】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４５】
実施例１ （胃癌細胞株におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化状態の確認試験（その１））
ヒト由来の胃癌細胞株２種［ＭＫＮ２８（ＪＣＲＢ）及びＭＫＮ７４（ＪＣＲＢ）］をＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ）のカタログに記載された、それぞれの細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養した後、各々約１ｘ１０７細胞を集めた。集められた細胞又はヒト由来の正常胃粘膜上皮組織［患者からインフォームドコンセントを得て入手］に、ＳＥＤＴＡバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ］を１０倍容量加えた後、これをホモジナイズした。得られた混合物に、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ）を５００μｇ／ｍｌ、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール［１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱を回収した。回収された沈澱をＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）に溶解し、これに４０μｇ／ｍｌになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスしてゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩにて消化した後、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， ２２， ２９９０−２９９７， １９９４； Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３， ９８２１−９８２６， １９９６に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。即ち、制限酵素処理後のゲノムＤＮＡ（約１μｇ）を蒸留水に溶解して２０μｌのゲノムＤＮＡ溶液を調製し、これに６Ｍ水酸化ナトリウムを約１μｌ加えた後、当該混合物を室温で１５分間放置した。放置された混合物に、１２０μｌの［０．６ｍＭヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ）、 ３．６Ｎ亜硫酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）］を加えた後、これを９５℃にて３０秒、５０℃にて１５分を１サイクルとする保温を１５サイクル行った。インキュベートされた液からＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｎ−ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡを５０μｌのＴＥバッファーに溶解し、これに２．５μｌの６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた後、当該混合物を室温で５分間放置した。次いで、放置された混合物をエタノール沈澱することにより沈澱（ＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を２０μｌのＴＥバッファーに懸濁した。
【００４６】
得られたＤＮＡを鋳型とし、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５１２〜１７８７で示される塩基配列を有するＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２７０６４５で示されるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の塩基番号１５１２〜１７８７に相当するＤＮＡ；２７６ｂｐ）のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅するために、以下の塩基配列からなるプライマーを合成した。
Ｂ１：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号６）
Ｂ２：５’−ＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号７）
【００４７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、２０ｐｍｏｌ／μｌの上記プライマー溶液各１μｌと、ｅａｃｈ ２ｍＭ ｄＮＴＰを３μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５５℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションした後、これを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ株に導入した。形質転換された大腸菌のコロニーを、胃癌細胞株１株につき１０個ずつピックアップし、それぞれ溶菌させた。得られた大腸菌溶菌液を鋳型とし、上記と同様な条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液を上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供した後、２７６ｂｐのＤＮＡを含む部分を切り出し、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１０型、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって解析した。各コロニーから調製されたＤＮＡのシークエンス結果について、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５１２〜１７８７で示される領域に存在するＣｐＧ中のシトシンがウラシルに置換されているか否かを調べて、試験した１０コロニーから調製されたＤＮＡのうち、シトシンがウラシルに置換されていないＤＮＡの頻度、即ち、当該シトシンのメチル化頻度を測定した。
その結果を表１に示した。正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）から調製されたＤＮＡの場合には、塩基番号１５１２〜１７８７で示される領域に存在するＣｐＧ中のシトシン２２個（塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６）には、ウラシルに置換されていないＤＮＡ（即ち、メチル化されているＤＮＡ）がほとんど見出されなかった。一方、胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）から調製されたＤＮＡの場合には、当該領域に存在するＣｐＧ中のシトシンのほとんどがウラシルに置換されていないＤＮＡ（即ち、メチル化されているＤＮＡ）であることが判った。
【００４８】
【表１】
＊各シトシンについて、１０コロニーから調製されたＤＮＡのうち、当該シトシンがウラシルに置換されていないＤＮＡの数を示す。また解析対象のシトシンは、配列番号１で示される塩基配列における塩基番号で示す。
【００４９】
実施例２ （胃癌細胞株におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現状態の確認試験と当該遺伝子の発現に対するメチル化阻害剤の効果））
ヒト由来の胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）を専用培地で７０％コンフルエントになるまで培養した後、各々の細胞を集めた。集められた各々の細胞（約１００ｍｇ湿重量）及びヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ：約５０ｍｇ）を１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ溶液（ニッポンジーン）を混合してホモジネートした後、これに０．２ｍｌのクロロホルムを加えて懸濁した。懸濁後、当該混合物を遠心分離（４℃、１５０００ｘｇ、１５分間）することにより、上清を回収した。回収された上清に０．５ｍｌのイソプロパノールを加えて懸濁した後、遠心分離（４℃、１５０００ｘｇ、１５分間）することにより、沈澱（ＲＮＡ）を回収した。回収された沈澱を７５％エタノールでリンスした後、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水に溶解した。
また、ヒト由来の胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）を約３ｘ １０５細胞／１０ｃｍプレートの密度で接種し、専用培地を用いて培養した。接種後１日目に、メチル化阻害剤である５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ製）（以下、５Ａｚａ−ｄＣと記す。）を１μＭの濃度となるよう培地に添加した。５Ａｚａ−ｄＣの添加から２４時間後に、５Ａｚａ−ｄＣが添加されていない上記の培地に交換し、培養を継続した。次いで、接種後３日目及び５日目に、同様に５Ａｚａ−ｄＣを培地に添加した。接種後６日目に細胞を回収し、回収された細胞から上記と同様な方法でＲＮＡを抽出・回収した。
このようにして得られたＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した後、これを鋳型としＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて当該酵素に添付されたプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型として、かつ、以下に示したＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ ＳとＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ａとをプライマー対として用いたＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行うことにより、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅した。この際、コントロールとして、上記のｃＤＮＡを鋳型として、かつ、以下に示したＰＣＮＡ ＳとＰＣＮＡ Ａとをプライマー対として用いたＰＣＲを行うことにより、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅した。
＜プライマー（Ｓ：ｓｅｎｓｅ、Ａ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）＞
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ｓ：５’−ＧＧＴＧＡＴＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１２）
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ａ：５’−ＣＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＧＴＴＡ−３’（配列番号１３）
ＰＣＮＡ Ｓ： ５’−ＡＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号１４）
ＰＣＮＡ Ａ： ５’−ＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＡ−３’（配列番号１５）
【００５０】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするｃＤＮＡを５０ｎｇと、１０ｐｍｏｌ／μｌの上記プライマー溶液２種を各１μｌと、ｅａｃｈ ２．５ ｍＭ ｄＮＴＰを４μｌと、５ ｍＭ ｄＵＴＰを４μｌと、１０×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ を５μｌと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を６μｌと、耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）５ Ｕ／μｌを０．３μｌと、ＡｍＥｒａｓｅＵＮＧを０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲは、ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実施した。Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅する場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間を１サイクルとしてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、ＰＣＮＡ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅する場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間を１サイクルとしてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子及びＰＣＮＡ遺伝子を定量した。
その結果を図１に示した。ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡが検出されたのに対し、胃癌細胞株２種のいずれの場合においても、当該ＤＮＡは検出されなかった。即ち、ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）では、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現が確認されたのに対し、胃癌細胞株２種のいずれにおいても、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現が認められなかった。
１μＭ ５Ａｚａ−ｄＣの存在下に培養されたＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡが検出された。尚、ＰＣＮＡ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡは、正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合並びに５Ａｚａ−ｄＣ非存在下に培養された胃癌細胞株ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合或いは１μＭ ５Ａｚａ−ｄＣ存在下に培養されたＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合のいずれにおいても同様に検出された。即ち、胃癌細胞株ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合には、メチル化阻害剤の存在下にＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現が認められた。
以上の結果から、胃癌細胞株における上記シトシンのメチル化は、メチル化阻害剤により阻害され、かつ、メチル化阻害剤の存在下でＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が発現することが明らかとなった。
【００５１】
実施例３ （胃癌細胞株におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化状態の確認試験（その２）と当該遺伝子の発現に対するメチル化阻害剤の効果）
ヒト由来の胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）を約３ｘ １０５細胞／１０ｃｍプレートの密度で接種し、専用培地を用いて培養した。接種後１日目に、メチル化阻害剤である５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ製）（以下、５Ａｚａ−ｄＣと記す。）を１μＭの濃度となるよう培地に添加した。５Ａｚａ−ｄＣの添加から２４時間後に、５Ａｚａ−ｄＣが添加されていない上記の培地に交換し、培養を継続した。次いで、接種後３日目及び５日目に、同様に５Ａｚａ−ｄＣを培地に添加した。接種後６日目に細胞を回収し、回収された細胞から実施例１と同様な方法でゲノムＤＮＡを抽出・回収した。
抽出・回収されたゲノムＤＮＡを、実施例１と同様な方法で亜硫酸水素ナトリウム処理した。得られたＤＮＡを鋳型とし、以下に示す非メチル化特異的プライマーＵ１とＵ２、又は、メチル化特異的プライマーＭ１とＭ２を用いてＰＣＲを行った。非メチル化特異的プライマーＵ１とＵ２とを使用した場合には、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５７８〜１７４５のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後の塩基配列に相当する１６８ｂｐのＤＮＡが増幅され、一方、メチル化特異的プライマーＭ１とＭ２とを使用した場合には、配列番号１で示される塩基番号１５８１〜１６９８のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後の塩基配列に相当する１１８ｂｐのＤＮＡが増幅される。
＜非メチル化特異的プライマー＞
Ｕ１：５’−ＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２）
Ｕ２：５’−ＣＡＴＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３）
＜メチル化特異的プライマー＞
Ｍ１：５’−ＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
Ｍ２：５’−ＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号５）
メチル化特異的プライマー及び非メチル化特異的プライマーに、特異性があることを確認するため、まず、正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）から通常の方法でゲノムＤＮＡを抽出してＤＮＡ（１）を得、さらに得られたＤＮＡ（１）の一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（ＮＥＢ社）により処理しゲノムＤＮＡの５’−ＣＧ−３’ 全てをメチル化してＤＮＡ（２）を得た。得られたＤＮＡ（１）及びＤＮＡ（２）についても、メチル化特異的ＰＣＲ及び非メチル化特異的ＰＣＲを行った。
【００５２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、２０ｐｍｏｌ／μｌの上記プライマー溶液を各１μｌと、ｅａｃｈ ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。上記の非メチル化特異的プライマーを使用した場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３３サイクル行う条件でＰＣＲを行った。また、上記のメチル化特異的プライマーを使用した場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６４℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３３サイクル行う条件でＰＣＲを行った。いずれの場合も、ＰＣＲを行った後、増幅産物を含むＰＣＲの反応液を２％ アガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図２に示した。ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合において、非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＵ）には増幅されたＤＮＡのバンドが認められ、メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＭ）には増幅されたＤＮＡのバンドが検出されなかった。従って、ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合において、少なくとも、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１７２４及び１７２６でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていないと判断された。また、メチル化阻害剤の非存在下（５Ａｚａ−ｄＣ ０μＭ）に培養された胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８、ＭＫＮ７４）の場合において、非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＵ）には増幅されたＤＮＡのバンドが検出されず、メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＭ）には増幅されたＤＮＡのバンドが認められた。従って、当該条件においては、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６８０及び１６９８でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていると判断された。
一方、１μＭ ５Ａｚａ−ｄＣの存在下に培養された胃癌細胞株 ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合には、非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＵ）には増幅されたＤＮＡのバンドが認められ、メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＭ）には弱いバンドが検出されたのみであった。従って、当該条件下においては、多くのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１７２４及び１７２６でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていないと判断された。
以上の結果から、胃癌細胞株における上記のシトシンのメチル化は、メチル化阻害剤により阻害されることが明らかとなった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等が提供可能となる。
【００５４】
［配列表フリーテキスト］
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号９
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１０
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１１
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）、胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）、及び、メチル化阻害剤である５Ａｚａ−ｄＣを１μＭの濃度で添加した胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）において、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡをＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲで増幅して得られたＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子量を示した図である。使用した細胞の名前を図の最下部に示した。（−）は、メチル化阻害剤である５Ａｚａ−ｄＣ非存在下、（＋）は、５Ａｚａ−ｄＣ存在下（１μＭ）を示す。縦軸は、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子をＰＣＮＡ遺伝子量で除した値を示す。
【図２】ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）及び胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）から調製され、かつ、亜硫酸水素ナトリウム処理されたゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ後のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した図である。使用した細胞の名前を最下部に示した。なお、ＳｓｓＩと記載された図は、２１ＮのゲノムＤＮＡをメチル化酵素ＳｓｓＩで処理して得られたＤＮＡを示す。また、−Ａｚａと記載された図は、当該細胞の培養時に５Ａｚａ−ｄＣを１μＭの割合で添加処理した細胞を示す。レーンＵ、非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲのＰＣＲ反応液；レーンＭ、非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲのＰＣＲ反応液。
【発明の属する技術分野】
本発明は、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌が遺伝子異常を原因とする疾病であること等が次第に明らかになりつつあるが、癌患者の死亡率は未だ高く、現在利用可能な診断方法や治療方法等の評価が必ずしも十分に満足できるものではないことを示している。その１つの原因として癌組織の種類に基づく多様性、マーカーとなる遺伝子等の低い正確性や低い検出感度等が考えられる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、癌を早期に発見するための診断方法や治療方法等の評価に適する、遺伝子異常の検出に基づいた哺乳動物由来の検体の癌化度評価方法の開発が切望されている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、癌細胞株においてＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が、健常者の組織検体と比較して有意に高い頻度でメチル化されていること、そして、この癌細胞株においては、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現レベルが健常者の組織検体と比較して有意に低いことを見出し、さらに、癌細胞株にＤＮＡメチル化阻害剤を作用させることにより、かかる遺伝子の発現レベルを増加させ得ることを見出し、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法（以下、本発明評価方法と記すこともある。）；
２．哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
３．哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
４．哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
５．哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
６．哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする前項４記載の評価方法；
７．哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
８．哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする前項４記載の評価方法；
９．組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする前項８記載の評価方法；
１０．遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１又は４記載の評価方法；
１１．組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする前項１０記載の評価方法；
１２．遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１又は４記載の評価方法；
１３．遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１又は４記載の評価方法；
１４．遺伝子のメチル化頻度が、配列番号１で示される塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする前項１記載の評価方法；
１５．組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする前項１４記載の評価方法；
１６．哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法；
１７．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量であることを特徴とする前項１６記載の評価方法；
１８．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の転写産物の量であることを特徴とする前項１７記載の評価方法；
１９．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の翻訳産物の量であることを特徴とする前項１７記載の評価方法；
２０．Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって、
（１）癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程（１）後に、前記癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を測定する第二工程、
（３）測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定する第三工程
を有することを特徴とする探索方法（以下、本発明探索方法と記すこともある。）；
２１．癌細胞が胃癌細胞であることを特徴とする前項２０記載の探索方法；
２２．有効成分として、前項２０の探索方法により見出された能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤：
２３．有効成分として、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤；
２４．癌マーカーとしての、メチル化されたＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の使用；
２５．癌マーカーが胃癌マーカーであることを特徴とする前項２４記載の使用；
２６．癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする癌化抑制方法；
２７．癌が胃癌であることを特徴とする前項２６記載の癌化抑制方法；
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、癌マーカー（例えば、胃癌マーカー等）としての、メチル化されたＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子（以下、ＴＨＢＤ遺伝子と記すこともある。） の使用等に関連する発明である。
本発明においてマーカー遺伝子として用いられるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子としては、例えば、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）とその５’上流に位置するプロモーター領域とを含む遺伝子をあげることができる。ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列とそれをコードする塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１等に記載されている。また、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む非翻訳領域及び翻訳領域（コーディング領域）のうち、最も５’上流側に位置するエクソン（以下、エクソン１と記す。）と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１等に記載されている。Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される配列番号において、例えば、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ酸配列の末端に位置するメチオニンをコードするＡＴＧコドンは、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。本発明において利用されるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子には、上記の公知の塩基配列を有する遺伝子のほか、かかる塩基配列に、生物の種差、個体差若しくは器官、組織間の差異等により天然に生じる変異による塩基の欠失、置換若しくは付加が生じた塩基配列を有する遺伝子も含まれる。
【０００６】
哺乳動物では、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する４種類の塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象がある。哺乳動物由来の、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子では、当該遺伝子のゲノムＤＮＡの一部のシトシンがメチル化されている。そして、ＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列をＣｐＧと記すこともある。）中のシトシンに限られる。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖のＣｐＧ中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖のＣｐＧ中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。
【０００７】
本発明評価方法の第一工程において「メチル化頻度」とは、例えば、調査対象となるＣｐＧ中のシトシンのメチル化の有無を複数のハプロイドについて調べたときの、当該シトシンがメチル化されているハプロイドの割合で表される。
また本発明評価方法の第一工程において「（メチル化頻度）に相関関係がある指標値」とは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量（より具体的には、当該遺伝子の転写産物の量や、当該遺伝子の翻訳産物の量）等をあげることができる。このような発現産物の量の場合には、上記メチル化頻度が高くなればそれに伴い減少するような負の相関関係が存在する。
【０００８】
本発明評価方法の第一工程における哺乳動物由来の検体としては、例えば、胃癌細胞等の癌細胞若しくはそれを含む組織、及び、胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる可能性のある、細胞、それを含む組織（ここでの組織とは、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料をあげることができる。具体的には、例えば、癌が胃癌である場合、被験動物から採取された胃粘膜層（表層上皮、腺組織、粘膜固有層及び粘膜筋板）、胃粘膜下組織層、（固有）筋層及び漿膜層等をあげることができる。
これらの生体試料はそのまま検体として用いてもよく、また、かかる生体試料から分離、分画、固定化等の種々の操作により調製された生体試料を検体として用いてもよい。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明評価方法の利用が期待できる。
【０００９】
本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する方法は、例えば、以下のように行えばよい。
【００１０】
第一の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。次いで、抽出されたＤＮＡを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡを、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプライマーを用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）で増幅し、得られる増幅産物の量を調べる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１１】
非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。
【００１２】
非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたＤＮＡを接触させるには、例えば、まず当該ＤＮＡをアルカリ溶液（ｐＨ９〜１４）で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（溶液中の濃度：例えば、終濃度３Ｍ）等で約１０〜１６時間（一晩）程度、５５℃で処理する。反応を促進するため、９５℃での変性と、５５℃での反応を１０−２０回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列［メチル化される位置のシトシン（ＣｐＧ中のシトシン）はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン（ＣｐＧに含まれないシトシン）はウラシルとなった塩基配列］とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対のメチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲ（以下、メチル化特異的ＰＣＲとも記すこともある。）、と、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選ばれる一対の非メチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲ（以下、非メチル化特異的ＰＣＲとも記すこともある。）とを行う。
上記ＰＣＲにおいて、メチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲの場合（前者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されているＤＮＡが増幅され、一方、非メチル化特異的プライマーを用いるＰＣＲの場合（後者）には、解析対象とするシトシンがメチル化されていないＤＮＡが増幅される。これらの増幅産物の量を比較することにより、対象となるシトシンのメチル化の有無を調べる。このようにしてメチル化頻度を測定することができる。
【００１３】
ここで、メチル化特異的プライマーは、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して、メチル化を受けているシトシンを含む塩基配列に特異的なＰＣＲプライマー（メチル化特異的プライマー）を設計し、また、メチル化を受けていないシトシンを含む塩基配列に特異的なＰＣＲプライマー（非メチル化特異的プライマー）を設計する。重亜硫酸塩処理により化学的に変換され相補的ではなくなったＤＮＡ鎖を基に設計することから、元来二本鎖であったＤＮＡのそれぞれの鎖を基に、それぞれからメチル化特異的プライマーと非メチル化特異的プライマーとを作製することもできる。かかるプライマーは、メチル、非メチルの特異性を高めるために、プライマーの３’末端近傍にＣｐＧ中のシトシンを含むように設計することが好ましい。また、解析を容易にするために、プライマーの一方を標識してもよい。
【００１４】
より具体的には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度をメチル化特異的ＰＣＲで測定するためのプライマーは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域又は非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）にある塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシン、具体的には、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプライマーの例を以下に示す。
＜非メチル化特異的プライマー＞
Ｕ１：５’−ＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２）
Ｕ２：５’−ＣＡＴＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３）
＜メチル化特異的プライマー＞
Ｍ１：５’−ＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
Ｍ２：５’−ＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号５）
【００１５】
メチル化特異的ＰＣＲにおける反応液としては、例えば、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、１０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー溶液を各１μｌと、２．５ｍＭ ｄＮＴＰを４μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとした反応液をあげることができる。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５５〜６５℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３０〜４０サイクル行う条件があげられる。
かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物の量を比較する。例えば、メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲと非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲで得られた各々の増幅産物の量を比較することができる分析方法（変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動やアガロースゲル電気泳動）である場合には、電気泳動後のゲルをＤＮＡ染色して増幅産物のバンドを検出し、検出されたバンドの濃度を比較する。ここでＤＮＡ染色の代わりに予め標識されたプライマーを使用してその標識を指標としてバンドの濃度を比較することもできる。
【００１６】
このような方法は、一般にメチル化特異的ＰＣＲとも呼ばれ、Ｈｅｒｍａｎ等（Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ９３， ９８２１−９８２６， １９９６）等により報告されている方法であって、シトシンと５−メチルシトシンとの化学的性質の違いを利用する方法である。
【００１７】
第二の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたＤＮＡを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡを基にして後述するように設計されるプライマーを用いてポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）で増幅し、得られる増幅産物の塩基配列を直接的に解析する方法をあげることもできる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００１８】
当該ＰＣＲに用いられるプライマーは、解析対象とするシトシンの５’上流の塩基配列と３’下流の塩基配列を基にして当該シトシンを含む塩基配列を有するＤＮＡを増幅可能なプライマー対を設計するとよい。プライマー設計のための塩基配列は、解析対象とするＣｐＧ中のシトシンを含まないように選定する。そして、プライマー設計のために選定された塩基配列が、シトシンを全く含まない場合には、選定された塩基配列及びかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれそのままプライマーの塩基配列とすることができる。また、プライマー設計のために選定された塩基配列が解析対象以外のシトシンを含むが当該シトシンはＣｐＧ中のシトシンでない場合には、これらシトシンがウラシルに変換されることを考慮してプライマーを設計する。即ち、全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれ有する一対のプライマーを設計する。さらに、プライマー設計のために選定された塩基配列が解析対象以外のシトシンを含み当該シトシンはＣｐＧ中のシトシンである場合には、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮してプライマーを設計する。即ち、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列［メチル化される位置のシトシン（ＣｐＧ中のシトシン）はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン（ＣｐＧに含まれないシトシン）はウラシルとなった塩基配列］とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列からそれぞれ選定された一対のメチル化特異的プライマーと、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）とかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列をそれぞれ有する一対の非メチル化特異的プライマーとを設計する。この場合、上記のＰＣＲには、メチル化特異的プライマー対と非メチル化特異的プライマー対とを等量ずつ混合して用いる。
【００１９】
非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを修飾する試薬を用いても良い。
【００２０】
非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたＤＮＡを接触させるには、例えば、まず当該ＤＮＡをアルカリ溶液（ｐＨ９〜１４）で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（溶液中の濃度：例えば、終濃度３Ｍ）等で約１０〜１６時間（一晩）程度、５５℃で処理する。反応を促進するため、９５℃での変性と、５５℃での反応を１０−２０回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型とし、かつ、上述するように設計されるプライマーを用いるＰＣＲを行う。得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル化頻度を測定することができる。
【００２１】
より具体的には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子遺伝子のメチル化頻度を塩基配列の直接的解析で測定するためのプライマーは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）にある塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシン、具体的には、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプライマーの例を以下に示す。
因みに、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６ で示されるシトシンのメチル化頻度を調べるために、上記のようにして設計されたプライマーを用いると、配列番号１における塩基番号１５１２〜１７８７のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後の塩基配列に相当するＤＮＡ（２７６ｂｐ）が増幅される。
＜プライマー＞
Ｂ１：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号６）
Ｂ２：５’−ＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号７）
【００２２】
ＰＣＲにおける反応液としては、例えば、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、２０ｐｍｏｌ／μｌの各プライマー溶液を各１μｌと、２ｍＭ ｄＮＴＰを３μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとした反応液をあげることができる。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５５℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３０〜４０サイクル行う条件があげられる。
かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物の塩基配列を比較し当該比較からメチル化頻度を測定する。
即ち、当該増幅産物の塩基配列を直接的に解析することにより、解析対象とするシトシンに相当する位置の塩基がシトシンであるかチミン（ウラシル）であるかを判定する。得られた増幅産物における塩基を示すピークのチャートにおいて、解析対象とするシトシンに相当する位置に検出されたシトシンを示すピークの面積とチミン（ウラシル）を示すピークの面積とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。また、塩基配列を直接的に解析する方法として、ＰＣＲで得られた増幅産物を一旦大腸菌等を宿主としてクローニングして得られた複数のクローンから、それぞれクローニングされたＤＮＡを調製し、当該ＤＮＡの塩基配列を解析してもよい。解析される試料のうちの解析対象とするシトシンに相当する位置に検出された塩基がシトシンである試料の割合を求めることにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することもできる。
【００２３】
第三の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたＤＮＡを、非メチル化シトシンを修飾する試薬と接触させた後、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとをハイブリダイゼーションさせ、前記ＤＮＡと当該プローブとの結合の有無を調べる方法をあげることもできる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００２４】
当該ハイブリダイゼーションに用いられるプローブは、解析対象とするシトシンを含む塩基配列を基にして、メチル化を受けていないシトシンがウラシルに変換され、かつ、メチル化を受けているシトシンはウラシルに変換されないことを考慮して設計するとよい。即ち、メチル化されたシトシンが含まれる場合の塩基配列［メチル化される位置のシトシン（ＣｐＧ中のシトシン）はシトシンのままであり、メチル化されていないシトシン（ＣｐＧに含まれないシトシン）はウラシルとなった塩基配列］又はかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するメチル化特異的プローブと、シトシンがメチル化されていない場合の塩基配列（全てのシトシンがウラシルとなった塩基配列）又はかかる塩基配列に対して相補的な塩基配列を有する非メチル化特異的プローブを設計する。尚、このようなプローブは、ＤＮＡとプローブとの結合の有無についての解析を容易にするために標識してから用いてもよい。またプローブを通常の方法に準じて担体上に固定して用いてもよいが、この場合には、哺乳動物由来の検体から抽出されたＤＮＡを予め標識しておくとよい。
【００２５】
非メチル化シトシンを修飾する試薬としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）等を用いることができる。因みに、原理的には、メチル化シトシンのみを特異的に修飾する試薬を用いても良い。
【００２６】
非メチル化シトシンを修飾する試薬に抽出されたＤＮＡを接触させるには、例えば、まず当該ＤＮＡをアルカリ溶液（ｐＨ９〜１４）で変性した後、亜硫酸水素ナトリウム等の重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（溶液中の濃度：例えば、終濃度３Ｍ）等で約１０〜１６時間（一晩）程度、５５℃で処理する。反応を促進するため、９５℃での変性と、５５℃での反応を１０−２０回繰り返すことも出来る。この場合、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、一方、メチル化されているシトシンはウラシルに変換されず、シトシンのままである。
必要に応じて、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡを鋳型として第二の方法と同様にＰＣＲを行うことにより当該ＤＮＡを予め増幅させておいてもよい。
次いで、重亜硫酸塩等で処理されたＤＮＡ又は前記ＰＣＲで予め増幅されたＤＮＡと、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能なプローブとのハイブリダイゼーションを行う。メチル化特異的プローブと結合するＤＮＡの量と、非メチル化特異的プローブと結合するＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。
【００２７】
より具体的には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を測定するためのプローブは、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）にある塩基配列内に存在するＣｐＧ中のシトシンを１以上含む塩基配列を基にして、上記のようにして設計することができる。例えば、配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシン、具体的には、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示されるシトシンを１以上含む塩基配列を基に設計することができる。かかるプローブの例を以下に示す。
＜セット１＞
非メチル化特異的プローブ：５’−ＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号８）
メチル化特異的プローブ ：５’−ＡＣＧＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＣ−３’（配列番号９）
＜セット２＞
非メチル特異的プローブ：５’−ＴＣＧＧＧＴＴＣＧＧＡＴＴＴＣＧＧＣＧＴ−３’（配列番号１０）
メチル化特異的プローブ：５’−ＴＴＧＧＧＴＴＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＴ−３’（配列番号１１）
【００２８】
ハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， Ｆｒｉｓｃｈ Ｅ． Ｆ．， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．著、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー発行（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。ハイブリダイゼーションは、通常ストリンジェントな条件下に行われる。ここで「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）を含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ． Ｙ． （１９８９）， ６．３．１−６．３．６）等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、２×ＳＳＣで５０℃の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣで５０℃までの条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度との両方を変えることもできる。
かかるハイブリダイゼーションを行った後、メチル化特異的プローブと結合したＤＮＡの量と、非メチル化特異的プローブと結合したＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシン（即ち、プローブの設計の基となった塩基配列に含まれるＣｐＧ中のシトシン）のメチル化の頻度を測定することができる。
【００２９】
第四の方法として、まず哺乳動物由来の検体から、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出する。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体としてその中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
次いで、抽出されたＤＮＡを、解析対象とするシトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素に作用させた後、当該制限酵素による消化の有無を調べる方法をあげることもできる。
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列をあげることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ４９５４７１に記載される塩基配列の塩基番号１〜６０９６で示される塩基配列に相当する。）があげられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするＡＴＧコドンが、塩基番号２５９０〜２５９２に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号２０４８〜６０９６に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６等で示される塩基番号であるシトシンをあげることができる。
【００３０】
当該方法で用いられる「シトシンのメチル化の有無を識別可能な制限酵素」（以下、メチル化感受性制限酵素と記すこともある。）とは、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を消化することのできる制限酵素を意味する。認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させても当該ＤＮＡは切断されず、一方、認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合、メチル化感受性制限酵素を作用させれば当該ＤＮＡは切断される。メチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、ＨｐａＩＩ、ＢｓｔＵＩ、ＮａｒＩ、ＳａｃＩＩ等をあげることができる。
【００３１】
当該制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、例えば、前記ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含み、当該認識配列以外には前記制限酵素の認識配列を含まないＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法をあげることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。
例えば、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５９５及び１６４５で示されるシトシンの場合には、当該シトシンはＮａｒＩの認識配列に含まれており、上記方法により当該シトシンのメチル化頻度を測定することができる。
【００３２】
また、当該制限酵素による消化の有無を調べる他の方法としては、例えば、解析対象とするシトシンを認識配列に含むメチル化感受性制限酵素を作用させたＤＮＡに対して、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に由来し、かつ、当該制限酵素の認識配列を含まないＤＮＡをプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイズしたＤＮＡの長さを調べる方法をあげることもできる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、当該シトシンがメチル化されていない場合よりも長いＤＮＡが検出される。検出された長いＤＮＡの量と短いＤＮＡの量とを比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化の頻度を測定することができる。
【００３３】
以上のような各種方法を用いて、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を測定する。測定されたメチル化頻度と、例えば、胃癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。仮に、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度が対照と比較して高ければ（Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が対照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高いと判定することができる。
ここで「癌化度」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、哺乳動物由来の検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、哺乳動物由来の検体が組織である場合には当該組織における癌細胞の存在量等を意味している。
【００３４】
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現は、健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体においてよりも胃癌細胞等の癌細胞において低い。これは、胃癌細胞等の癌細胞において当該遺伝子のメチル化頻度が高いために、当該遺伝子が正常に発現できずその結果として当該遺伝子の発現産物の量（より具体的には、転写産物の量や翻訳産物の量）が減少する。このように本発明評価方法等では、メチル化頻度の代わりに、それに相関関係がある指標値（上記の場合には、発現産物の量であって、負の相関関係がある指標値である。）を測定してもよい。
つまり、本発明評価方法では、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値（例えば、発現産物の量）を測定し、測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値（例えば、発現産物の量）と対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定することができる。
【００３５】
本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法としては、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノザンブロット法〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）〕、ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＴ−ＰＣＲ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２１，３１５９−３１６６（１９９３）〕、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ＮＡＳＢＡ法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｎａｔｕｒｅ，３５０，９１−９２（１９９１）〕等の公知な方法を用いればよい。
哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを含む試料は、通常の方法に準じて当該検体から抽出、精製等により調製すればよい。
調製された試料中に含まれるｍＲＮＡの量を測定するためにノザンブロット法が用いられる場合には、検出用プローブはＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子又はその一部（Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の制限酵素切断、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の塩基配列に従い化学合成した約１００ｂｐ〜約１０００ｂｐ程度のオリゴヌクレオチド等）を含むものであればよく、前記試料中に含まれるｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションにおいて用いられる検出条件下に検出可能な特異性を与えるものであれば特に制限はない。
また調製された試料中に含まれるｍＲＮＡの量を測定するためにＲＴ−ＰＣＲ法が用いられる場合には、使用されるプライマーは、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のみを特異的に増幅できるものであればよく、その増幅する領域や塩基長等には特に制限はない。かかるプライマーとしては、例えば、以下に示すプライマー（Ｓ：ｓｅｎｓｅ、Ａ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）等をあげることができる。これらのプライマーを用いて後述の実施例に示すようにしてＲＴ−ＰＣＲ法による転写産物の量を測定することもできる。
Ｓ：５’−ＧＧＴＧＡＴＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１２）
Ａ：５’−ＣＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＧＴＴＡ−３’（配列番号１３）
【００３６】
また本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する他の方法としては、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の翻訳産物であるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質の量を測定する方法をあげることができる。当該測定には、例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質に対する特異的抗体（モノクロナル抗体、ポリクロナル抗体）を用いた、細胞工学ハンドブック、羊土社、２０７（１９９２）等に記載されるイムノブロット法、免疫沈降による分離法、間接競合阻害法（ＥＬＩＳＡ 法）等の公知な方法を用いればよい。
因みに、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質に対する特異的抗体は、当該タンパク質を免疫抗原として用いる通常の免疫学的な方法に準じて製造することができる。
【００３７】
以上のような各種方法を用いて、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する。測定されたメチル化頻度に相関関係がある指標値と、例えば、胃癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する。仮に、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に正の相関関係がある指標値が対照と比較して高ければ又は負の相関関係がある指標値が対照と比較して低ければ（Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が対照と比較の上で高メチル化状態であれば）、当該検体の癌化度が対照と比較の上で高いと判定することができる。
【００３８】
本発明評価方法における、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定するための各種方法で使用し得るプライマー、プローブ又は特異的抗体は、胃癌細胞等の癌細胞の検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等を試薬として含有する胃癌細胞等の癌細胞の検出用キットや、これらプライマー、プローブ又は特異的抗体等が担体上に固定化されてなる胃癌細胞等の癌細胞の検出用チップも提供しており、本発明評価方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
【００３９】
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現は、健常な哺乳動物由来の細胞や組織等の検体においてよりも胃癌細胞等の癌細胞において低い。一方、後述の実施例でも示すように、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に係るＤＮＡメチル化を阻害する物質を胃癌細胞等の癌細胞に作用させることにより、当該遺伝子の発現産物の量を増加させることができる。これは、胃癌細胞等の癌細胞におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現レベルの低下又はそれに伴う機能低下を補うことのできる物質−例えば、非メチル化（或いは、癌で認められるようなメチル化異常を起こしていない）Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子、当該遺伝子の発現産物、当該遺伝子の発現を促進する能力を有する物質（例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に係るＤＮＡメチル化を阻害する物質、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質）−等は、胃癌等の癌の治療や、胃粘膜層（表層上皮、腺組織、粘膜固有層及び粘膜筋板）、胃粘膜下組織層、（固有）筋層及び漿膜層等の正常組織の癌化抑制に有用であることを意味している。
例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に投与することにより癌化は抑制されるだろう。また例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子に係るＤＮＡメチル化を阻害する物質を胃癌細胞等の癌細胞に提供することにより、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のプロモーター領域又はコーディング領域にある塩基配列中に存在するＣｐＧ中のシトシンを正常組織と同様に低メチル化状態（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）とし、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現量を増大させ、ひいてはＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の翻訳産物であるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質の発現量を増大させることができるだろう。また例えば、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子又はＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるｃＤＮＡを胃癌細胞等の癌細胞に導入することにより、胃癌細胞等の癌細胞におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎタンパク質の発現量を増大させることができるだろう。
【００４０】
つまり、本発明では、（１）有効成分として、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤や、（２）有効成分として、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤も提供している（以下総じて、本発明抗癌剤と記すこともある。）。
【００４１】
本発明抗癌剤の剤型としては通常の製剤であれば特に制限はないが、このような製剤は、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に有効成分を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。）には、当該抗癌剤を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
本発明抗癌剤は、その有効量を非経口的にヒト等の哺乳動物（例えば、癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞）に対し投与することができる。例えば、非経口的に投与する方法としては、例えば、注射（皮下、静脈内、局所）等を挙げることができる。
投与量は、投与される哺乳動物の年令、性別、体重、疾患の程度、本発明抗癌剤の種類、投与形態等によって異なるが、通常は、患者細胞において有効成分が細胞内で有効に働くような濃度レベルと等しい細胞内レベルをもたらす有効成分量を投与すればよい。また、前記の１日の投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【００４２】
ここで、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子を細胞に導入する方法としては、ウイルスベクターを利用した遺伝子導入方法、非ウイルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４）、実験医学別冊「遺伝子治療の基礎技術」，羊土社（１９９６））等の方法をあげることができる。
前者の遺伝子導入方法としては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに、ＴＲ４又は変異ＴＲ４をコードするＤＮＡを組み込んで導入する方法等があげられる。また非ウイルス性ベクターを利用した遺伝子導入方法としては、例えば、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等があげられる。
また、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のＤＮＡを抗癌剤としての遺伝子治療剤の有効成分として利用する方法としては、当該遺伝子のＤＮＡを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、ヒトから特定な細胞を取り出し体外で当該遺伝子のＤＮＡを当該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法（日経サイエンス，１９９４年４月号，２０−４５頁、月刊薬事，３６（１），２３−４８（１９９４）、実験医学増刊，１２（１５）（１９９４））等をあげることができる。
前者のｉｎ ｖｉｖｏ法の場合には、前記遺伝子のＤＮＡが疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、胃癌細胞、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内等に注射により投与することができる。
前記抗癌剤としての遺伝子治療剤の剤型としては、注射剤、他には懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤とすることもできる。このような製剤は、薬学的に許容される、例えば、水溶性溶剤、非水溶性溶剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤、安定剤等の担体に前記遺伝子（ベクター型若しくはウィルス型、又はプラスミド型の前記遺伝子の形態を含む）を配合することにより製造することができる。必要に応じて、防腐剤、懸濁化剤、乳化剤等の補助剤を添加してもよい。また、非経口的に投与する場合（一般的には注射等が好ましい。）には、当該抗癌剤を溶液等の通常の液剤の形態で使用することができる。
【００４３】
本発明探索方法は、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって、（１）癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、（２）第一工程（１）後に、前記癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を測定する第二工程、（３）測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定する第三工程を有する。
本発明探索方法の第一工程における癌細胞としては、特に制限はなく、哺乳動物由来の癌組織から分離された癌細胞であってもよいし、またセルラインとして確立された哺乳動物由来の癌細胞株であってもよい。前記哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター等をあげることができる。癌の種別としては、胃癌等が好ましくあげられる。具体的には、例えば、ＭＫＮ２８（ＪＣＲＢから入手可能）、ＭＫＮ７４（ＪＣＲＢから入手可能）、ＫＡＴＯ−ＩＩＩ（ＡＴＣＣから入手可能）、ＡＧＳ（ＡＴＣＣから入手可能）、Ｈｓ−７４６Ｔ（ＡＴＣＣから入手可能）等の公知なヒト由来の胃癌細胞株をあげることができる。
本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための、癌細胞の量としては、通常約１０４〜１０８細胞あればよく、約１０５〜１０７細胞が好ましい。また被験物質の濃度としては、通常約０．１ｎｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌであればよく、約１ｎｇ／ｍｌ〜約５０μｇ／ｍｌが好ましい。癌細胞に被験物質を接触させる時間は、通常１時間以上５日程度であり、好ましくは数時間から２日程度である。癌細胞に被験物質を接触させる回数は、一回であってもよいし、複数回であってもよい。
癌細胞に被験物質を接触させる環境としては、癌細胞の生命活動を維持させるような環境が好ましく、例えば、当該癌細胞のエネルギー源が共存するような環境をあげることができる。具体的には、培地中で第一工程が行なわれることが好都合である。
本発明探索方法の第二工程において癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を測定するには、前述にある「本発明評価方法の第一工程において、哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する方法」等に準じて測定すればよい。
本発明探索方法の第二工程において測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定するには、前述のように、測定された発現産物量と、例えば、本発明探索方法の第一工程において癌細胞に被験物質を接触させるための被験物質の濃度をゼロとした場合（即ち、癌細胞に被験物質を接触させてない場合）でのＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量（対照）とを比較して、当該比較により得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定する。仮に、被験物質を接触させた癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量が対照（この場合には、被験物質を接触させていない癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量）と比較して高ければ、当該被験物質はＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有すると判定することができる。もちろん対照として、癌細胞に他の被験物質を接触させた際の、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を用いてもよく、この場合には、予め当該他の被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力が判っていることが好ましい。
このようにして、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質を探索することが可能である。尚、バックグランド又はコントロールとして、正常胃細胞株等の正常細胞株や、胃癌細胞等の癌細胞を持たないと診断され得る健常な哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を、被験物質を接触させた場合及び接触させない場合の両者において測定することが好ましい。
【００４４】
【実施例】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４５】
実施例１ （胃癌細胞株におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化状態の確認試験（その１））
ヒト由来の胃癌細胞株２種［ＭＫＮ２８（ＪＣＲＢ）及びＭＫＮ７４（ＪＣＲＢ）］をＪＣＲＢ（Ｊａｐａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ）のカタログに記載された、それぞれの細胞株のための専用培地でコンフルエントになるまで培養した後、各々約１ｘ１０７細胞を集めた。集められた細胞又はヒト由来の正常胃粘膜上皮組織［患者からインフォームドコンセントを得て入手］に、ＳＥＤＴＡバッファー［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ］を１０倍容量加えた後、これをホモジナイズした。得られた混合物に、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（Ｓｉｇｍａ）を５００μｇ／ｍｌ、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール［１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱を回収した。回収された沈澱をＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０）に溶解し、これに４０μｇ／ｍｌになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Ｓｉｇｍａ）を加えて３７℃で１時間インキュベートした。インキュベートされた混合物をフェノール・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱することにより沈澱（ゲノムＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスしてゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩにて消化した後、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ．， ２２， ２９９０−２９９７， １９９４； Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３， ９８２１−９８２６， １９９６に記載される方法に準じて亜硫酸水素ナトリウム処理した。即ち、制限酵素処理後のゲノムＤＮＡ（約１μｇ）を蒸留水に溶解して２０μｌのゲノムＤＮＡ溶液を調製し、これに６Ｍ水酸化ナトリウムを約１μｌ加えた後、当該混合物を室温で１５分間放置した。放置された混合物に、１２０μｌの［０．６ｍＭヒドロキノン（Ｓｉｇｍａ）、 ３．６Ｎ亜硫酸水素ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）］を加えた後、これを９５℃にて３０秒、５０℃にて１５分を１サイクルとする保温を１５サイクル行った。インキュベートされた液からＷｉｚａｒｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｎ−ｕｐ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＤＮＡを精製した。精製されたＤＮＡを５０μｌのＴＥバッファーに溶解し、これに２．５μｌの６Ｍ水酸化ナトリウムを加えた後、当該混合物を室温で５分間放置した。次いで、放置された混合物をエタノール沈澱することにより沈澱（ＤＮＡ）を回収した。回収された沈澱を２０μｌのＴＥバッファーに懸濁した。
【００４６】
得られたＤＮＡを鋳型とし、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５１２〜１７８７で示される塩基配列を有するＤＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ２７０６４５で示されるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の塩基番号１５１２〜１７８７に相当するＤＮＡ；２７６ｂｐ）のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後のＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅するために、以下の塩基配列からなるプライマーを合成した。
Ｂ１：５’−ＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＴＡＡＧＡＡＧＴＡＴＴＡＴ−３’（配列番号６）
Ｂ２：５’−ＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＡＡＣＣＴＡＡＣＡＣ−３’（配列番号７）
【００４７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、２０ｐｍｏｌ／μｌの上記プライマー溶液各１μｌと、ｅａｃｈ ２ｍＭ ｄＮＴＰを３μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５５℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションした後、これを大腸菌ＸＬ１Ｂｌｕｅ株に導入した。形質転換された大腸菌のコロニーを、胃癌細胞株１株につき１０個ずつピックアップし、それぞれ溶菌させた。得られた大腸菌溶菌液を鋳型とし、上記と同様な条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応液を上記と同様にアガロースゲル電気泳動に供した後、２７６ｂｐのＤＮＡを含む部分を切り出し、ＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡの塩基配列をＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３１０型、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって解析した。各コロニーから調製されたＤＮＡのシークエンス結果について、配列番号１で示される塩基配列において塩基番号１５１２〜１７８７で示される領域に存在するＣｐＧ中のシトシンがウラシルに置換されているか否かを調べて、試験した１０コロニーから調製されたＤＮＡのうち、シトシンがウラシルに置換されていないＤＮＡの頻度、即ち、当該シトシンのメチル化頻度を測定した。
その結果を表１に示した。正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）から調製されたＤＮＡの場合には、塩基番号１５１２〜１７８７で示される領域に存在するＣｐＧ中のシトシン２２個（塩基番号１５３９、１５５１、１５７１、１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６２１、１６３２、１６３８、１６４５、１６４８、１６６５、１６６７、１６８０、１６９８、１７１０、１７２４、１７２６、１７５６）には、ウラシルに置換されていないＤＮＡ（即ち、メチル化されているＤＮＡ）がほとんど見出されなかった。一方、胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）から調製されたＤＮＡの場合には、当該領域に存在するＣｐＧ中のシトシンのほとんどがウラシルに置換されていないＤＮＡ（即ち、メチル化されているＤＮＡ）であることが判った。
【００４８】
【表１】
【００４９】
実施例２ （胃癌細胞株におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現状態の確認試験と当該遺伝子の発現に対するメチル化阻害剤の効果））
ヒト由来の胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）を専用培地で７０％コンフルエントになるまで培養した後、各々の細胞を集めた。集められた各々の細胞（約１００ｍｇ湿重量）及びヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ：約５０ｍｇ）を１ｍｌのＩＳＯＧＥＮ溶液（ニッポンジーン）を混合してホモジネートした後、これに０．２ｍｌのクロロホルムを加えて懸濁した。懸濁後、当該混合物を遠心分離（４℃、１５０００ｘｇ、１５分間）することにより、上清を回収した。回収された上清に０．５ｍｌのイソプロパノールを加えて懸濁した後、遠心分離（４℃、１５０００ｘｇ、１５分間）することにより、沈澱（ＲＮＡ）を回収した。回収された沈澱を７５％エタノールでリンスした後、ＤＥＰＣ（ジエチルピロカーボネート）処理水に溶解した。
また、ヒト由来の胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）を約３ｘ １０５細胞／１０ｃｍプレートの密度で接種し、専用培地を用いて培養した。接種後１日目に、メチル化阻害剤である５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ製）（以下、５Ａｚａ−ｄＣと記す。）を１μＭの濃度となるよう培地に添加した。５Ａｚａ−ｄＣの添加から２４時間後に、５Ａｚａ−ｄＣが添加されていない上記の培地に交換し、培養を継続した。次いで、接種後３日目及び５日目に、同様に５Ａｚａ−ｄＣを培地に添加した。接種後６日目に細胞を回収し、回収された細胞から上記と同様な方法でＲＮＡを抽出・回収した。
このようにして得られたＲＮＡをＤＮａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した後、これを鋳型としＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて当該酵素に添付されたプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。合成されたｃＤＮＡを鋳型として、かつ、以下に示したＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ ＳとＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ａとをプライマー対として用いたＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行うことにより、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅した。この際、コントロールとして、上記のｃＤＮＡを鋳型として、かつ、以下に示したＰＣＮＡ ＳとＰＣＮＡ Ａとをプライマー対として用いたＰＣＲを行うことにより、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＣＮＡ）遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅した。
＜プライマー（Ｓ：ｓｅｎｓｅ、Ａ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）＞
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ｓ：５’−ＧＧＴＧＡＴＴＡＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１２）
Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ Ａ：５’−ＣＧＣＡＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＴＣＧＴＴＡ−３’（配列番号１３）
ＰＣＮＡ Ｓ： ５’−ＡＴＧＴＣＧＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号１４）
ＰＣＮＡ Ａ： ５’−ＡＧＡＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＡ−３’（配列番号１５）
【００５０】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするｃＤＮＡを５０ｎｇと、１０ｐｍｏｌ／μｌの上記プライマー溶液２種を各１μｌと、ｅａｃｈ ２．５ ｍＭ ｄＮＴＰを４μｌと、５ ｍＭ ｄＵＴＰを４μｌと、１０×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ を５μｌと、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２を６μｌと、耐熱性ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）５ Ｕ／μｌを０．３μｌと、ＡｍＥｒａｓｅＵＮＧを０．５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲは、ｉＣｙｃｌｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて実施した。Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅する場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間、５７℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間を１サイクルとしてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、ＰＣＮＡ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡを増幅する場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間、５５℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間を１サイクルとしてＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子及びＰＣＮＡ遺伝子を定量した。
その結果を図１に示した。ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡが検出されたのに対し、胃癌細胞株２種のいずれの場合においても、当該ＤＮＡは検出されなかった。即ち、ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）では、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現が確認されたのに対し、胃癌細胞株２種のいずれにおいても、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現が認められなかった。
１μＭ ５Ａｚａ−ｄＣの存在下に培養されたＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合には、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡが検出された。尚、ＰＣＮＡ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡは、正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合並びに５Ａｚａ−ｄＣ非存在下に培養された胃癌細胞株ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合或いは１μＭ ５Ａｚａ−ｄＣ存在下に培養されたＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合のいずれにおいても同様に検出された。即ち、胃癌細胞株ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合には、メチル化阻害剤の存在下にＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現が認められた。
以上の結果から、胃癌細胞株における上記シトシンのメチル化は、メチル化阻害剤により阻害され、かつ、メチル化阻害剤の存在下でＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子が発現することが明らかとなった。
【００５１】
実施例３ （胃癌細胞株におけるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化状態の確認試験（その２）と当該遺伝子の発現に対するメチル化阻害剤の効果）
ヒト由来の胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）を約３ｘ １０５細胞／１０ｃｍプレートの密度で接種し、専用培地を用いて培養した。接種後１日目に、メチル化阻害剤である５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ製）（以下、５Ａｚａ−ｄＣと記す。）を１μＭの濃度となるよう培地に添加した。５Ａｚａ−ｄＣの添加から２４時間後に、５Ａｚａ−ｄＣが添加されていない上記の培地に交換し、培養を継続した。次いで、接種後３日目及び５日目に、同様に５Ａｚａ−ｄＣを培地に添加した。接種後６日目に細胞を回収し、回収された細胞から実施例１と同様な方法でゲノムＤＮＡを抽出・回収した。
抽出・回収されたゲノムＤＮＡを、実施例１と同様な方法で亜硫酸水素ナトリウム処理した。得られたＤＮＡを鋳型とし、以下に示す非メチル化特異的プライマーＵ１とＵ２、又は、メチル化特異的プライマーＭ１とＭ２を用いてＰＣＲを行った。非メチル化特異的プライマーＵ１とＵ２とを使用した場合には、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５７８〜１７４５のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後の塩基配列に相当する１６８ｂｐのＤＮＡが増幅され、一方、メチル化特異的プライマーＭ１とＭ２とを使用した場合には、配列番号１で示される塩基番号１５８１〜１６９８のｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理後の塩基配列に相当する１１８ｂｐのＤＮＡが増幅される。
＜非メチル化特異的プライマー＞
Ｕ１：５’−ＡＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＧＧＴＧＴＴ−３’（配列番号２）
Ｕ２：５’−ＣＡＴＡＡＣＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡ−３’（配列番号３）
＜メチル化特異的プライマー＞
Ｍ１：５’−ＣＧＴＴＣＧＴＴＴＴＴＡＴＴＣＧＧＣＧＴＣ−３’（配列番号４）
Ｍ２：５’−ＧＣＣＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＧ−３’（配列番号５）
メチル化特異的プライマー及び非メチル化特異的プライマーに、特異性があることを確認するため、まず、正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）から通常の方法でゲノムＤＮＡを抽出してＤＮＡ（１）を得、さらに得られたＤＮＡ（１）の一部をメチル化酵素ＳｓｓＩ（ＮＥＢ社）により処理しゲノムＤＮＡの５’−ＣＧ−３’ 全てをメチル化してＤＮＡ（２）を得た。得られたＤＮＡ（１）及びＤＮＡ（２）についても、メチル化特異的ＰＣＲ及び非メチル化特異的ＰＣＲを行った。
【００５２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡを５０ｎｇと、２０ｐｍｏｌ／μｌの上記プライマー溶液を各１μｌと、ｅａｃｈ ２ｍＭ ｄＮＴＰを２．５μｌと、１０×緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を２．５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ５Ｕ／μｌを０．２μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を２５μｌとしたものを用いた。上記の非メチル化特異的プライマーを使用した場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３３サイクル行う条件でＰＣＲを行った。また、上記のメチル化特異的プライマーを使用した場合には、当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６４℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３３サイクル行う条件でＰＣＲを行った。いずれの場合も、ＰＣＲを行った後、増幅産物を含むＰＣＲの反応液を２％ アガロースゲル電気泳動に供した。 その結果を図２に示した。ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合において、非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＵ）には増幅されたＤＮＡのバンドが認められ、メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＭ）には増幅されたＤＮＡのバンドが検出されなかった。従って、ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）の場合において、少なくとも、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１７２４及び１７２６でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていないと判断された。また、メチル化阻害剤の非存在下（５Ａｚａ−ｄＣ ０μＭ）に培養された胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８、ＭＫＮ７４）の場合において、非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＵ）には増幅されたＤＮＡのバンドが検出されず、メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＭ）には増幅されたＤＮＡのバンドが認められた。従って、当該条件においては、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１６８０及び１６９８でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていると判断された。
一方、１μＭ ５Ａｚａ−ｄＣの存在下に培養された胃癌細胞株 ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４の場合には、非メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＵ）には増幅されたＤＮＡのバンドが認められ、メチル化特異的プライマーを使用した場合（レーンＭ）には弱いバンドが検出されたのみであった。従って、当該条件下においては、多くのゲノムＤＮＡにおいて、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５７９、１５８１、１５８５、１５９５、１５９８、１６０１、１７２４及び１７２６でそれぞれ示されるシトシンはメチル化されていないと判断された。
以上の結果から、胃癌細胞株における上記のシトシンのメチル化は、メチル化阻害剤により阻害されることが明らかとなった。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法等が提供可能となる。
【００５４】
［配列表フリーテキスト］
配列番号２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号８
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号９
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１０
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１１
プローブのために設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号１２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【００５５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）、胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）、及び、メチル化阻害剤である５Ａｚａ−ｄＣを１μＭの濃度で添加した胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）において、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のｍＲＮＡに由来するＤＮＡをＲｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲで増幅して得られたＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子量を示した図である。使用した細胞の名前を図の最下部に示した。（−）は、メチル化阻害剤である５Ａｚａ−ｄＣ非存在下、（＋）は、５Ａｚａ−ｄＣ存在下（１μＭ）を示す。縦軸は、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子をＰＣＮＡ遺伝子量で除した値を示す。
【図２】ヒト由来の正常胃粘膜上皮組織（２１Ｎ）及び胃癌細胞株２種（ＭＫＮ２８及びＭＫＮ７４）から調製され、かつ、亜硫酸水素ナトリウム処理されたゲノムＤＮＡをそれぞれ鋳型としてＰＣＲを行い、ＰＣＲ後のＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動で分析した結果を示した図である。使用した細胞の名前を最下部に示した。なお、ＳｓｓＩと記載された図は、２１ＮのゲノムＤＮＡをメチル化酵素ＳｓｓＩで処理して得られたＤＮＡを示す。また、−Ａｚａと記載された図は、当該細胞の培養時に５Ａｚａ−ｄＣを１μＭの割合で添加処理した細胞を示す。レーンＵ、非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲのＰＣＲ反応液；レーンＭ、非メチル化特異的プライマーを用いたＰＣＲのＰＣＲ反応液。
Claims (27)
- 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度又はそれに相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。 - 哺乳動物由来の検体が細胞であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
- 哺乳動物由来の検体が組織であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
- 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。 - 哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
- 哺乳動物由来の検体が細胞であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の細胞の悪性度であることを特徴とする請求項４記載の評価方法。
- 哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
- 哺乳動物由来の検体が組織であって、かつ、当該検体の癌化度が哺乳動物由来の組織における癌細胞の存在量であることを特徴とする請求項４記載の評価方法。
- 組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする請求項８記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項１又は４記載の評価方法。
- 組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする請求項１０記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項１又は４記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、当該遺伝子の非翻訳領域又は翻訳領域にある塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項１又は４記載の評価方法。
- 遺伝子のメチル化頻度が、配列番号１で示される塩基配列内に存在する一つ以上の５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列中のシトシンのメチル化頻度であることを特徴とする請求項１記載の評価方法。
- 組織が胃粘膜層、胃粘膜下組織層、筋層及び漿膜層であって、かつ、癌が胃癌であることを特徴とする請求項１４記載の評価方法。
- 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法であって、
（１）哺乳動物由来の検体に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値を測定する第一工程、及び
（２）測定された前記メチル化頻度に相関関係がある指標値と、対照とを比較することにより得られる差異に基づき前記検体の癌化度を判定する第二工程
を有することを特徴とする評価方法。 - Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度に相関関係がある指標値が、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量であることを特徴とする請求項１６記載の評価方法。
- Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の転写産物の量であることを特徴とする請求項１７記載の評価方法。
- Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物の量が、当該遺伝子の翻訳産物の量であることを特徴とする請求項１７記載の評価方法。
- Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を有する物質の探索方法であって、
（１）癌細胞に被験物質を接触させる第一工程、
（２）第一工程（１）後に、前記癌細胞に含まれるＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現産物量を測定する第二工程、
（３）測定された発現産物の量と対照とを比較することにより得られる差異に基づき被験物質が有するＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の発現を促進する能力を判定する第三工程
を有することを特徴とする探索方法。 - 癌細胞が胃癌細胞であることを特徴とする請求項２０記載の探索方法。
- 有効成分として、請求項２０の探索方法により見出された能力を有する物質を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤。
- 有効成分として、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎのアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる核酸を含み、当該有効成分が薬学的に許容される担体中に製剤化されてなることを特徴とする抗癌剤。
- 癌マーカーとしての、メチル化されたＴｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子の使用。
- 癌マーカーが胃癌マーカーであることを特徴とする請求項２４記載の使用。
- 癌であると診断されうる哺乳動物の体内にある細胞に、Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ遺伝子のメチル化頻度を低下させる物質を投与する工程を有することを特徴とする癌化抑制方法。
- 癌が胃癌であることを特徴とする請求項２６記載の癌化抑制方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002280687A JP2004113116A (ja) | 2002-09-26 | 2002-09-26 | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002280687A JP2004113116A (ja) | 2002-09-26 | 2002-09-26 | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004113116A true JP2004113116A (ja) | 2004-04-15 |
Family
ID=32275325
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002280687A Pending JP2004113116A (ja) | 2002-09-26 | 2002-09-26 | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004113116A (ja) |
-
2002
- 2002-09-26 JP JP2002280687A patent/JP2004113116A/ja active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100092981A1 (en) | Methods of detecting hypermethylation | |
| JP5116936B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP5127108B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP5116935B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP5116937B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2004113114A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| WO2012046871A1 (ja) | 癌化度評価方法 | |
| JP2004113109A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2004113116A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2005110645A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2004113112A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2004113113A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2004113110A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2004113115A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP2004113111A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| EP1426449A1 (en) | Method of evaluating degree of canceration of mammal-origin specimen | |
| JP5116939B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| WO2012046873A1 (ja) | 癌化度評価方法 | |
| JP2003144157A (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| WO2004029291A1 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| JP4682275B2 (ja) | 哺乳動物の神経芽細胞腫の予後を判定する方法 | |
| JP5116938B2 (ja) | 哺乳動物由来の検体の癌化度を評価する方法 | |
| US20120040854A1 (en) | Method for in vitro diagnosis or prognosis of testicular cancer | |
| WO2012046874A1 (ja) | 癌化度評価方法 | |
| WO2012046872A1 (ja) | 癌化度評価方法 |