CN112553326B

CN112553326B - 检测新生儿黄疸ugt1a1基因型和gst基因缺失型的引物、探针及荧光pcr试剂盒

Info

Publication number: CN112553326B
Application number: CN202011601718.8A
Authority: CN
Inventors: 吕小波; 李泽东; 刘芳黎; 黄和飞; 谷叶; 李佳兴
Original assignee: Kunming Harmony Health Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Kunming Harmony Health Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112553326A

Abstract

本发明提供一种用于同时检测与新生儿黄疸相关基因UGT1A1基因型和GST基因缺失型的引物、探针、荧光PCR试剂盒。所提供的引物、探针可在实时荧光定量PCR技术平台上检测UGT1A1基因*6型与*28型，GST基因GSTT1型与GSTM1型两个多态性位点及两个缺失型核苷酸类型。使用所述的引物、探针、试剂盒其检测结果具有快速高效、准确便捷、灵敏度高、特异性好、且费用低的特点。

Description

检测新生儿黄疸UGT1A1基因型和GST基因缺失型的引物、探针及荧光PCR试剂盒

技术领域

本发明涉及基因型检测技术领域，特别涉及新生儿黄疸类型(生理性及病理性)相关基因的多态性检测试剂盒、引物、反应体系、探针。

背景技术

新生儿黄疸是新生儿时期最常见临床症状之一，是由于新生儿血清胆红素代谢异常引起血液中胆红素水平升高，而出现以皮肤、黏膜及巩膜黄染为特征的病症。新生儿黄疸分为生理性和病理性，生理性黄疸是指单纯因胆红素代谢特点引起的暂时性黄疸，而当血清胆红素超过生理性黄疸的诊断标准后，可发展成为病理性高胆红素血症(即病理性黄疸)，若得不到及时诊断和治疗，可能会引起重症胆红素脑病，该病可严重影响新生儿神经系统，导致核黄疸，并遗留不同程度的神经系统后遗症。因此，对新生儿黄疸进行诊断和治疗时首先需确定其患病类型，并进行早期识别与干预，对患儿的长期预后具有重要的意义。目前，有关胆红素代谢关键酶的基因多态性研究是新生儿黄疸遗传因素研究的热点，而今后研究将进一步揭示基因与环境在新生儿黄疸中的作用，探索其潜在的表观遗传修饰。

人类尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A(uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A，UGT1A)家族的成员由同一基因编码，经不同RNA剪切形成各具有其自身独特的启动子区域和外显子1区域和共享外显子2-5的9种UGT1A同工酶。UGT1A1是其中一种重要的同工酶，是肝脏中参与胆红素葡萄糖醛酸化反应唯一的相关酶类，此酶活性的完全或部分缺失使胆红素不能与葡萄糖醛酸结合形成结合胆红素，使非结合胆红素在体内堆积，导致非结合型高胆红素血症的发生。

新生儿高胆红素血症即新生儿黄疸，是新生儿期最常见的症状，发病率约60％-80％。尽管新生儿黄疸通常是良性的，但少数新生儿黄疸会发展为严重的胆红素脑病(核黄疸)，如果不及时处理，常导致死亡或严重的后遗症。研究表明，新生儿黄疸原因除了与母乳喂养、低体重、脱水、早产等有关外，更主要的是与肝脏UGT1A1发育不完善、酶活性缺失相关。而UGT1A1表达水平及酶活性的不同则会导致成人和儿童在药物代谢及疗效上的差异。婴幼儿特别是新生儿由于代谢酶发育不成熟，容易发生药物不良反应。因此对于儿童人群，除遗传因素外，发育对药物代谢酶的影响可能起着关键作用。因此进行UGT1A1发育调控的研究是控制新生儿血胆红素在正常水平的关键环节。

遗传多态性是导致药物疗效及毒性反应个体差异的重要原因之一，因为我国人群中主要存在的基因型是UGT1A1*6(rs 4148323)，因此我们应着手开发适合中国人群特点的UGT1A1*6及UGT1A1*28(rs 8175347)联合检测试剂盒，在临床上用于检测新生儿黄疸基因。UGT1A1基因1号外显子的211G>A(UGT1A1*6，rs 4148323)错义突变在一个大规模的全基因组关联研究分析中发现与血清胆红素浓度密切相关。而UGT1A1基因启动子区A(TA)6TAA-A(TA)7TAA(UGT1A1*28，rs 8175347)变异位点通过影响UGT1A1基因启动子区TATA盒，影响UGT1A1基因的表达，进而增加新生儿核黄疸的发生率。

UGT1A1基因位于染色体2q37，有5个外显子组成，是UGT1家族的重要基因，主要分布于肝脏，是肝脏中唯一具有胆红素葡萄糖醛酸化反应活性的酶，可使胆红素与葡萄糖醛酸结合形成结合胆红素；同时也是调节胆红素清除的关键酶，在胆红素代谢中起重要作用。UGT1A1*6的多态性是指在第一个外显子211位，野生型：G/G，杂合突变型：G/A，纯合型A/A。该基因第一外显子转录起始点上游为启动子区域，其突变类型包括启动子区域“TA”碱基序列插入突变((TA)6TAA>(TA)7TAA)；外显子区域的单碱基杂合突变Gly71Arg(211G>A)、Pro229Gln、Arg367Gly等。该基因编码序列的突变可导致UGT结构异常，出现酶结合功能的缺陷或丧失，而启动序列核苷酸的多态性则导致表达能力下降引起酶活性降低，从而使非结合胆红素在体内蓄积，是新生儿黄疸发生发展的高危因素。

谷胱甘肽硫基转移酶(glutathione S-transferase，GST)是参与机体解毒的重要超家族酶系，是Ⅱ相代谢的核心酶之一。GSTM1和GSTT1是GST超基因家族中的明星基因，GSTM1主要在肝脏中表达，GSTT1则主要在肝脏和肾脏中表达。若机体内GSTM1和GSTT1基因片段缺失会导致GST活性降低，从而影响胆红素从血浆转运至肝细胞滑面内质网，导致新生儿黄疸的发生。有相关研究资料表明，GSTM1和GSTT1缺失型比列较高且具有明显的种族和地域差异，且GSTM1缺失基因型新生儿总胆红素水平较GSTM1野生型新生儿高。因此，GSTM1和GSTT1基因突变是影响新生儿黄疸发病的因素之一。但目前，大多数学者将GST基因突变的研究主要集中在与肿瘤的关系，而在与新生儿高胆红素血症方面的相关研究相对较少。

目前，对新生儿黄疸检测的主要基因有UGT1A1*6及UGT1A1*28，检测方法主要有血清胆红素测定、血清PCT检测及PCR-Sanger测序法，而传统常规的PCR-Sanger测序法虽然是公认的检测基因分型的“金标准”，但检测周期长、检测通量低，所以对于多基因多位点的检测并不适用，而与普通PCR相比，实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Real-timeQuantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)是对整个PCR过程中扩增DNA的累计速率绘制动态变化图，消除在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题，且其具有分型准确，操作简便快捷、精确性好、敏感度高、支持批量检测及使用广泛等优点。特异性MGB探针是在普通Taqman探针的5’端添加MGB基团，提高探针与模板结合物的退火温度(10℃左右)，探针与模板单碱基不匹配即可抑制两者的结合，从而提高了探针与DNA模板结合的特异性，适合靶基因单个碱基突变的基因型检测。同时，利用特异性MGB探针对扩增产物进行检测，结合特别的PCR反应程序和高特异性Taq酶的使用，在实时PCR技术平台上实现对样本DNA靶序列基因型进行定性检测。

Taqman-MGB探针法是商业化试剂盒最主流的检测方法，是采用两种荧光基团(常用FAM、VIC)分别标记野生型与突变型：1)检测野生型样本时，仅有野生型探针与野生型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的野生型探针的荧光基团被切割，从而发出单色光；2)检测突变型样本时，仅有突变型探针与突变型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的突变型探针的荧光基团被切割，从而发出单色光；3)检测杂合型样本时，野生型探针与野生型模板DNA形成稳定退火结构，同时，突变型探针与突变型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的两条探针各自的荧光基团均被切割，从而发出双色光。其核心是在Taqman探针3’端偶联有MGB(minor groovebinder)基团，这样的设计大大提高了探针检测单碱基差异的分辨率，显著提高了单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)检测的特异性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是通过多重PCR反应开发用于同时检测新生儿黄疸相关的UGT1A1基因rs 8175347和rs 4148323位点和GST基因GSTM1和GSTT1位点缺失的检测试剂。

本发明采用两种荧光基团(常用FAM、VIC)分别标记野生型与突变型：1)检测野生型样本时，仅有野生型探针与野生型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的野生型探针的荧光基团被切割，从而发出单色光；2)检测突变型样本时，仅有突变型探针与突变型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的突变型探针的荧光基团被切割，从而发出单色光；3)检测杂合型样本时，野生型探针与野生型模板DNA形成稳定退火结构，同时，突变型探针与突变型模板DNA形成稳定退火结构，PCR时退火的两条探针各自的荧光基团均被切割，从而发出双色光。

本发明其核心优势技术之一是在Taqman探针3’端偶联有MGB基团，这样的设计提高了探针检测单碱基差异的分辨率，显著提高了SNP检测的特异性，而且运用两个探针对新生儿黄疸基因进行检测，提高了检测灵敏度和准确性；大大降低了检测过程中的假阴性的影响。

本文本中所使用的术语如下：

“UGT1A1”是指：尿苷二磷酸葡糖醛酸转移酶。

“GST”是指：谷胱甘肽S-转移酶。

“RT-PCR”是指：实时荧光定量聚合酶链式反应。

“FAM”是指：6-羧基荧光素。

“HEX”是指：六氯-6-甲基荧光素。

“ROX”是指：羧基-X-罗丹明。

“NFQ”是指：非荧光猝灭基团。

“MGB”是指：小沟结合物。

“BHQ2”是指：荧光猝灭基团。

新生儿黄疸相关2个基因(2个基因：UGT1A1基因和GST基因)及其对应的6个多态性位点(6个多态性位点：UGT1A1*6(211G/G)、UGT1A1*6(211G/A)、UGT1A1*28[(TA)6TAA/(TA)6TAA]、UGT1A1*28[(TA)6TAA/(TA)7TAA]、UGT1A1*28[(TA)7TAA/(TA)7TAA]、GSTM1、GSTT1)以及这些多态性位点的突变类型分别如下表1和表2所示。

表1 UGT、GST基因型

序号	基因型
		1	UGT1A1*6(211G>A)
2	UGT1A1*28(TA)6TAA>(TA)7TAA
		3	GSTM1
4	GSTT1

表2 UGT、GST突变类型

序号	突变	突变类型
			1	211G>A	杂合突变
2	(TA)6TAA>(TA)7TAA	插入突变
			3	GSTM1	插入/缺失
4	GSTT1	插入/缺失

为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针，其特征在于：

(1)检测基因UGT1A1*6SNP位点rs 4148323多态性的引物和探针，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的UGT1A1 G211A上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的UGT1A1 G211A下游引物，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示的UGT1A1 G211A211G探针、核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示的UGT1A1 G211A 211A探针，且UGT1A1 G211A211G探针的5’端标记有HEX，3’端标记有MGB；UGT1A1 G211A 211A探针的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；

(2)检测基因UGT1A1*28SNP位点rs 8175347多态性的引物和探针，所述引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的UGT1A1*28上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的UGT1A1*28下游引物，所述探针为核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的UGT1A1 A(TA)6TAA探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的UGT1A1 A(TA)7TAA探针，且UGT1A1 A(TA)6TAA探针的5’端标记有HEX，3’端标记有MGB，UGT1A1 A(TA)7TAA探针的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB；

(3)检测GSTM1、GSTT1基因缺失型的引物与内对照引物：检测GSTM1基因缺失型的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的GSTM1上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的GSTM1下游引物；检测GSTT1基因缺失型的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的GSTT1上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的GSTT1下游引物；所述内对照引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的内对照β-Albumin上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的内对照β-Albumin下游引物。

本发明还提供一种同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括上述用于同时检测UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针。

进一步，所述的试剂盒，还包括内标GAPDH系统，所述内标GAPDH系统包括内标引物和内标探针，内标引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的内标正引物F和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的内标反引物R组成、内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，且内标探针的5’端修饰有ROX荧光基团，3’端修饰有BHQ2。

进一步，所述检测试剂盒中还包括阳性对照样本，所述阳性对照样本为UGT1A1*6、UGT1A1*28、GSTM1、GSTT1和GAPDH基因的5种混合液，其混合体积比为1:1:1:1:1；UGT1A1*6对照样本、UGT1A1*28对照样本、GSTM1基因对照样本、GSTT1基因对照样本。

进一步，所述的试剂盒还包括50μl RT-PCR反应液体系，所述50μl RT-PCR反应液体系中含RT-PCR缓冲液12.5μl，1μM样本3μl，各引物1μl，各引物的终浓度均为0.5μM，各探针1μl，各探针的终浓度均为0.2μM，1.5U Taq DNA聚合酶2.5μl，加ddH₂O至50μl。

本发明还提供一种用于同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性检测方法，该方法使用上述用于同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针或上述试剂盒，包括以下步骤：

(1)获得待测样本基因组DNA；

(2)用所述的用于检测UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针或所述的试剂盒对待测样本基因组DNA进行实时荧光定量RT-PCR检测；

(3)所述实时荧光定量RT-PCR检测的反应程序为：

UGT1A1的实时荧光定量RT-PCR检测反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性30s；58℃退火1min，40个循环后，于58℃时收集FAM、HEX的信号；

GST的实时荧光定量RT-PCR检测反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min；60℃退火1min，35个循环后，于60℃时保存检测结果。

本发明还提供一种非疾病诊断目的同时检测新生儿血样UGT1A1和GST基因多态性检测方法，用上述用于同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针对新生儿血样样本基因组DNA进行实时荧光定量RT-PCR检测。

本发明还提供另一种非疾病诊断目的同时检测新生儿血样UGT1A1和GST基因多态性检测方法，用上述的同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的试剂盒对新生儿血样样本基因组DNA进行实时荧光定量RT-PCR检测。

在上述两种非疾病诊断目的同时检测新生儿血样UGT1A1和GST基因多态性检测方法中，均采用50μl RT-PCR反应液体系，所述50μl RT-PCR反应液体系中含RT-PCR缓冲液12.5μl，1μM样本3μl，各引物1μl，各引物的终浓度均为0.5μM，各探针1μl，各探针的终浓度均为0.2μM，1.5U Taq DNA聚合酶2.5μl，ddH₂O至50μl。

在上述两种非疾病诊断目的同时检测新生儿血样UGT1A1和GST基因多态性检测方法中，UGT1A1的实时荧光定量RT-PCR检测反应条件均为：95℃预变性1min；94℃变性30s；58℃退火1min，40个循环后，于58℃时收集FAM、HEX的信号；GST的实时荧光定量RT-PCR检测反应条件均为：95℃预变性5min；94℃变性1min；60℃退火1min，35个循环后，于60℃时保存检测结果。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)扩增结果判读直观准确：本发明提供了可同时检测针对新生儿黄疸相关的2个UGT1A1基因和GST基因的UGT1A1*6 SNP位点rs 4148323、UGT1A1*28 SNP位点rs 8175347、GSTM1、GSTT1缺失型的6个多态性位点的特异性引物和相应的特异性探针、多态性检测试剂盒、多态性检测反应体系和非疾病诊断目的的多态性检测方法。通过NCBI查找各外显子的DNA序列，设计并合成设计特异性扩增基因多态性位点区域的最佳的特异性引物和探针组合，提供的各技术方案能够使各个引物对的扩增产物大小充分区分，保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，确保了结果的准确性。

(2)检测时间短，操作简便快捷，易于普及。本发明采用实时荧光定量RT-PCR技术和多重PCR扩增反应结合的方法，将UGT1A1基因和GST基因联合检测新生儿黄疸，使用本发明的特异性引物和相应的特异性探针组合，扩增体系及程序优化，可同时检测新生儿黄疸相关的UGT1A1和GST基因2个基因的6个多态性位点，操作起来非常简便，有效的缩短了扩增时间，整个检测流程2～3h便可完成。

(3)本发明检测试剂盒同时设计了管家基因β-Albumin内控基因检测系统，内控基因检测系统和靶基因检测系统位于同一管中，用于排除因样本提取问题或漏加样本而导致的假阴性结果。靶基因监测体系采用荧光较强的FAM荧光基团，而内控基因检测体系的探针采用荧光较弱的HEX荧光基团，避免了内控信号影响检测信号的收集。

附图说明

图1是拍摄的PCR产物片段的大小反映在凝胶上的结果，M为Marker，1自上而下条带依次是GSTT1野生型(480bp)、GSTM1缺失型(350bp)、空白对照(315bp)；2自上而下条带依次是GSTM1缺失型(350bp)、空白对照(315bp)、GSTM1野生型(215bp)；3自上而下条带依次是GSTT1缺失型(350bp)、空白对照(315bp)；4自上而下条带依次是GSTT1野生型(480bp)、GSTM1缺失型(350bp)、空白对照(315bp)；5为空白对照(315bp)。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明，但是应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明本发明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明实验中所使用的材料以及实验方法进行描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法有些是本领域公知的，但仍在此作尽可能详细描述。实施所采用的试剂均为市售商品，本发明实施所采用的数据库均为公开的在线数据库。

实施例1新生儿黄疸相关基因的多态性检测

(1)获得待测样本基因组DNA：

采集年龄段一致的新生儿黄疸新鲜外周全血样本，并采用TianGen血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA，并采用NP80-touch(德国IMPLEN)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。

(2)特异性引物和探针设计：

根据文献调研选择2个与新生儿黄疸相关UGT1A1基因和GST基因的6种基因多态性位点如上述表1和表2所示，通过NCBI查找各多态性位点的DNA序列，设计并合成本发明实施例的扩增引物，对于设计引物来说，可采用Primer Quest、Primer Premier 5.0、DNAMAN等在线/离线的数据库或软件对引物进行设计及二聚体、茎环错配等分析，并保证各扩增片段之间不会相互作用产生非特异性产物或二聚体，然后，根据需要稀释到所需的浓度。本实施例所提供的引物组覆盖了表1和表2所示的所有基因突变位点。

各特异性引物为：UGT1A1 G211A上游引物、UGT1A1 G211A下游引物、UGT1A1*28上游引物、UGT1A1*28下游引物、GSTM1上游引物、GSTM1下游引物、GSTT1上游引物、GSTT1下游引物、内对照β-Albumin上游引物、内对照β-Albumin下游引物。

为同时检测新生儿黄疸UGT1A1基因*6和*28两个SNPs位点的多态性还设计了2组特异性探针，第1组特异性探针是：UGT1A1 G211A 211G探针和UGT1A1 G211A 211A探针用于特异性检测UGT1A1*6基因型，在UGT1A1 G211A 211G探针的5’端标记有HEX，3’端标记有MGB；在UGT1A1 G211A 211A探针的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。

第2组特异性探针是：UGT1A1 A(TA)6TAA和UGT1A1 A(TA)7TAA探针用于特异性检测UGT1A1*28基因型，且UGT1A1 A(TA)6TAA探针的5’端标记有HEX，3’端标记有MGB，UGT1A1A(TA)7TAA探针的5’端标记有FAM，3’端标记有MGB。NFQ-MGB基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时前述特异性探针上还连接有MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。

本实施例中，使用内标系统监测该荧光定量PCR反应是否存在抑制、仪器误差及人为因素造成的假阴性结果，保证检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物(内标反引物F和内标反引物R)、内标探针，所述内标引物是针对人类基因组中相对保守的基因GAPDH的保守区域设计的，且内标探针的5’端修饰有ROX荧光基团，3’端修饰有BHQ2。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是UGT1A1 G211A上游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是UGT1A1 G211A下游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是UGT1A1*28上游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是UGT1A1*28下游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是GSTM1上游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是GSTM1下游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：7所示的是GSTT1上游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：8所示的是GSTT1下游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：9所示的是内对照β-Albumin上游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：10所示的是内对照β-Albumin下游引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：11所示的是内标正引物F的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：12所示的是内标反引物R的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：13所示的是UGT1A1 G211A 211G探针的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:14所示的是UGT1A1 G211A 211A探针的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:15所示的是UGT1A1 A(TA)6TAA探针的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:16所示的是UGT1A1 A(TA)7TAA探针的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO:17所示的是内标探针的核苷酸序列。

实验所有引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(3)RT-PCR

以下所述UGT1A1*6、UGT1A1*28、GSTM1、GSTT1和GAPDH基因5种质粒为市售，购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

待测样本DNA和对照检测样本如下：

1.待测样本DNA：实施例1步骤(1)采集的年龄段一致的新生儿黄疸新鲜外周全血样本提取保存的基因组DNA。

2.阳性对照样本：UGT1A1*6、UGT1A1*28、GSTM1、GSTT1和GAPDH基因的5种质粒混合液，其混合体积比为1:1:1:1:1。

3.阴性对照：ddH₂O。

4.UGT1A1*6基因对照样本。

5.UGT1A1*28基因对照样本。

6.GSTM1基因对照样本。

7.GSTT1基因对照样本。

8.空白对照：RT-PCR缓冲液12.5μl，各引物1μl，各引物的终浓度均为0.5μM，各探针1μl，各探针的终浓度均为0.2μM，1.5U Taq DNA聚合酶2.5μl，不含有UGT1A1*6、UGT1A1*28、GSTM1、GSTT1和GAPDH基因，最后加ddH₂O至50μl。

具体操作包括：

上述待测样本和各对照样本分别各为一个PCR管，除阴性对照和空白对照外，每个PCR试管中均加入表3所述的RT-PCR反应液体系，其每个PCR管内只加入一种待测样本或一种对照样本，且均只加入3μl，每个PCR管中RT-PCR反应液体系总体积50μl，待测样本的浓度1μM用量3μl或各对照样本的浓度均分别为1μM和用量3μl，各引物的终浓度为0.5μM，各探针的终浓度为0.2μM。RT-PCR缓冲液(市售)。

表3 RT-PCR反应液体系

表3中所述的各引物的终浓度为0.5μM，各探针的终浓度为0.2μM。

内标系为保守的GAPDH基因，包括内标引物(内标正引物F和内标反引物R)和内标探针，内标探针5’端修饰有ROX荧光基团，3’端修饰有BHQ2。

所述实时荧光定量RT-PCR反应的程序为：

UGT1A1的实时荧光定量RT-PCR检测反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性30s；58℃退火1min，40个循环后，于58℃时收集FAM、HEX的信号。

程序运行完毕后，按表4、表5进行判定：

表4 UGT PCR反应结果的判读

本实施例1的检测结果：

1.待测样本DNA的检测结果HEX通道Ct＜35，FAM通道Ct≥35且ROX通道Ct＜35，表明待测样本DNA基因型为211G/G。

2.阳性对照样本的检测结果FAM和HEX通道Ct＜35且ROX通道Ct＜35。

3.阴性对照的检测结果仅有ROX通道Ct＜35。

4.UGT1A1*6对照样本的检测结果HEX通道Ct＜35，FAM通道Ct＜35，表明样本DNA基因型为211G/A。

5.UGT1A1*28对照样本的检测结果HEX通道Ct＜35，FAM通道Ct≥35，表明样本DNA基因型为(TA)6TAA/(TA)6TAA。

6.GSTM1基因对照样本的检测结果FAM和HEX通道Ct＜35且ROX通道Ct＜35。

7.GSTT1基因对照样本的检测结果FAM和HEX通道Ct＜35且ROX通道Ct＜35。

8.空白对照的检测结果无无扩增。

实验表明：本发明的结果一次性可以扩增出新生儿黄疸相关2个基因及其对应的6个多态性位点。而采用的普通PCR和多重PCR测序方法操作，多重PCR方法是通过多个待检位点设计特异性引物，再进行PCR扩增，得到的结果是一次性可以扩增出所有待检位点基因。通过比较普通PCR和多重PCR测序方法，所获得的结果一致，但是，本发明有检测时间短(时间是41min)，一次性可以同时检测UGT和GST2个基因及其对应的6个多态性位点，大大缩短了检测时间(缩短时间41min)、具有较高的特异性，大大缩短了检测周期。表明：本发明所提供的检测方案具有更好的特异性和适用性。

GST的RT-PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳检验，其目的是为了验证所扩增产物是否符合预期结果。

预先配制1.5％的琼脂糖凝胶，取上一步扩增的PCR扩增产物6.5μL点样于凝胶上，电压110V，电泳40min后于紫外凝胶成像仪上观察PCR产物片段的大小，并拍摄清晰照片保存，其拍摄的PCR产物片段的大小反映在凝胶上的结果如图1所示。

表5 GST PCR反应结果的判读

基因型	GSTM1(215bp)	GSTT1(480bp)	β-Albumin(315bp)
				GSTM1缺失	无条带	有条带	有条带
GSTT1缺失	有条带	无条带	有条带
				GSTM1和GSTT1均缺失	无条带	无条带	有条带
操作有误	无条带	无条带	无条带

根据空白对照的电泳结果可知，环境因素对待测样本的电泳检测结果无不良影响。根据各个检测样本的电泳结果可知，存在的亮带分别对应于扩增引物对分别对应的PCR扩增产物，亮带数量与理论保持一致；亮带清晰且间隔明显，不同亮带间无重叠、无拖影等，亮带效果良好。如此，可以说明上述利用本发明引物组进行PCR扩增时，仅生成了预期的目标产物，而未生成其他无关产物，表明：本发明各引物和对应的探针组合合理，在含有GSTT1野生型、GSTM1缺失型、空白对照的体系中扩增出了明显的目标基因，在含有GSTT1缺失型、GSTM1野生型、空白对照的体系中扩增出了相应的目标基因，在含有GSTT1和GSTM1缺失型、空白对照体系中扩增出了明显的目标基因，在含有GSTT1和GSTM1野生型、空白对照体系中扩增出了目标基因，只含有空白对照β-Albumin扩增出了目标基因。

实施例2新生儿黄疸相关基因的多态性检测试剂盒的组装及使用方法

本发明所述试剂盒包含：引物与探针，内标系统，RT-PCR反应液体系、阳性对照样本、阴性对照，根据RT-PCR反应液体系各成分使用量，计算24人份和48人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。反应具体成分及配比过程如下所述：

1.引物与探针：设计并合成5组特异性引物和2组特异性探针：

5组特异性引物：UGT1A1 G211A上游引物(SEQ ID NO:1)、UGT1A1 G211A下游引物(SEQ ID NO:2)、UGT1A1*28上游引物(SEQ ID NO:3)、UGT1A1*28下游引物(SEQ ID NO:4)、GSTM1上游引物(SEQ ID NO:5)、GSTM1下游引物(SEQ ID NO:6)、GSTT1上游引物(SEQ IDNO:7)、GSTT1下游引物(SEQ ID NO:8)、内对照β-Albumin上游引物(SEQ ID NO:9)、内对照β-Albumin下游引物(SEQ ID NO:10)。

第1组特异性探针：UGT1A1 G211A 211G探针(SEQ ID NO:13)、UGT1A1 G211A 211A探针(SEQ ID NO:14)。

第2组特异性探针：UGT1A1 A(TA)6TAA探针(SEQ ID NO:15)、UGT1A1 A(TA)7TAA探针(SEQ ID NO:16)。

将上述每个特异性引物、每个探针分别用无菌去离子水制备成100μM的母液储存。

2.内标系统：

内标系统由内标正引物F、内标反引物R和内标探针组成，设计并合成针对人类基因组设计的1对内标引物为内标正引物F和内标反引物R，内标正引物F核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示、内标反引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；设计并合成内标探针，该内标探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，且内标探针的5’端修饰有ROX荧光基团，3’端修饰有BHQ2。将内标正引物F、内标反引物R、内标探针分别用无菌去离子水制备成100μM的母液储存。

3.阳性对照样本：

阳性对照样本为市售的UGT1A1*6、UGT1A1*28、GSTM1、GSTT1和GAPDH基因的5种混合液，其混合体积比为1:1:1:1:1。

4.阴性对照：所述阴性对照为ddH₂O。

5.UGT1A1*6对照样本。

6.UGT1A1*28对照样本。

7.GSTM1基因对照样本。

8.GSTT1基因对照样本。

9.RT-PCR反应液体系(见表6)：

表6 RT-PCR反应液体系

试剂	用量
		RT-PCR缓冲液	12.5μl
UGT1A1 G211A上游引物(SEQ ID NO:1)	1μl
		UGT1A1 G211A下游引物(SEQ ID NO:2)	1μl
UGT1A1*28上游引物(SEQ ID NO:3)	1μl
		UGT1A1*28下游引物(SEQ ID NO:4)	1μl
GSTM1上游引物(SEQ ID NO:5)	1μl
		GSTM1下游引物(SEQ ID NO:6)	1μl
GSTT1上游引物(SEQ ID NO:7)	1μl
		GSTT1下游引物(SEQ ID NO:8)	1μl
内对照β-Albumin上游引物(SEQ ID NO:9)	1μl
		内对照β-Albumin下游引物(SEQ ID NO:10)	1μl
内标正引物F(SEQ ID NO:11)	1μl
		内标反引物R(SEQ ID NO:12)	1μl
UGT1A1 G211A 211G探针(SEQ ID NO:13)	1μl
		UGT1A1 G211A 211A探针(SEQ ID NO:14)	1μl
UGT1A1 A(TA)6TAA探针(SEQ ID NO:15)	1μl
		UGT1A1 A(TA)7TAA探针(SEQ ID NO:16)	1μl
内标探针(SEQ ID NO:17)	1μl
		1.5U Taq DNA聚合酶	2.5μl
目的DNA	3μl
		加ddH<sub>2</sub>O至	50μl

10.RT-PCR扩增，反应的程序如下：

UGT1A1实时荧光检测的反应条件为：95℃预变性1min；94℃变性30s；58℃退火1min；40个循环后，于58℃时收集FAM和HEX信号；

GST的RT-PCR检测反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性1min；60℃退火1min；35个循环后，于60℃时保存检测结果。

序列表

<110> 昆明和合医学检验所有限公司

<120> 检测新生儿黄疸UGT1A1基因型和GST基因缺失型的引物、探针及荧光PCR试剂盒

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gccagttcaa ctgttgttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtccgtcagc atgacatcaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggttctgg aagtactttg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccgtctctg atgtacaacg 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaactacctg aaaagctaaa g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttgggctca aatatacggt g 21

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttccttactg gtcctcacat ctc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaccggatc atggccagca 20

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccctctgct aacaagtcct ac 22

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccctaaaaa gaaaatcgcc aatc 24

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cccttcatac cctcacgtat tc 22

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccattgatg acaagcttcc 20

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcttcaagg tgtagcatgc acc 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctcttcaagg tgtagcatgc act 23

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tctcctactt atatatatat atatggca 28

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tctcctactt atatatatat atatatggca 30

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

caaattccat ggcaccgtca aggc 24

Claims

1.一种用于同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针，其特征在于：

2.一种同时检测新生儿血样样本UGT1A1和GST基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的用于同时检测UGT1A1和GST基因多态性的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括内标GAPDH系统，所述内标GAPDH系统包括内标引物和内标探针，内标引物由核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的内标正引物F和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的内标反引物R组成、内标探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.17所示，且内标探针的5’端修饰有ROX荧光基团，3’端修饰有BHQ2。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还包括阳性对照样本，所述阳性对照样本为UGT1A1*6、UGT1A1*28、GSTM1、GSTT1和GAPDH基因的5种混合液，其混合体积比为1:1:1:1:1；UGT1A1*6对照样本、UGT1A1*28对照样本、GSTM1基因对照样本、GSTT1基因对照样本。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于；还包括50μl RT-PCR反应液体系，所述50μl RT-PCR反应液体系中含RT-PCR缓冲液12.5μl，1μM样本3μl，各引物1μl，各引物的终浓度均为0.5μM，各探针1μl，各探针的终浓度均为0.2μM，1.5U Taq DNA聚合酶2.5μl，加ddH₂O至50μl。