CN105256019A

CN105256019A - Mthfr和mtrr基因多态性检测引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN105256019A
Application number: CN201510660680.4A
Authority: CN
Inventors: 胡利红; 段卫涛; 赵平锋
Original assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Current assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Priority date: 2015-10-14
Filing date: 2015-10-14
Publication date: 2016-01-20
Anticipated expiration: 2035-10-14
Also published as: CN105256019B

Abstract

本发明公开了MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组及试剂盒，针对三个基因位点的突变引物和探针，具有特异性强，灵敏度高的优点，制备的试剂盒可以检测出MTHFR677、MTHFR1298和MTRR66基因多态性情况，操作简单、实验周期短、安全无毒、成本低，适合于临床大范围推广使用。

Description

MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组及试剂盒

技术领域

本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组及试剂盒。

背景技术

SNP，单核苷酸多态性(全称SingleNucleotidePolymorphisms)，是指在基因组上单个核苷酸的变异(包括置换、颠换、缺失和插入)形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看，每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为1:2。SNP在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T，原因是CG中的C常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指变异频率大于1％的单核苷酸变异。在人类基因组中大概每1000个碱基就有一个SNP，人类基因组上的SNP总量大概是3×10⁶个。因此，SNP成为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

叶酸及其代谢中间产物在机体生理生化反应中具有重要作用，一旦机体发生叶酸缺陷或者叶酸代谢酶的缺陷，就会导致细胞周期不正常，DNA、蛋白质甲基化反应异常、DNA碱基无法正常合成等多种生化反应异常，从而直接或间接地导致新生儿或胎儿神经管缺陷以及成年人的癌症、心血管疾病的发生。

科学研究发现，叶酸利用能力受遗传结构(基因)影响，如果与叶酸代谢相关的酶活性偏低(即相关基因功能异常)，这一人群如按常量(400微克/天)补充叶酸，机体叶酸水平也会不足。而叶酸补充过量同样会带来一定危害。因此，遗传体质的差异导致了机体对叶酸利用能力的差异，叶酸增补应因人而异，增补过多或过少都不利于胎儿健康和孕妇健康。随着生命科学技术的发展，叶酸利用能力基因检测与风险评估于2008年即已被中国疾病预防控制中心妇幼保健中心列为临床应用指南(参见《妇幼保健医疗临床遗传检测项目资料汇编》第六卷临床应用指南之二十一《叶酸利用能力》)。这一崭新的生命科学技术成果近两年来已在国内部分妇幼保健院取得较大成效，为个体化(差异化)增补叶酸、预防新生儿出生缺陷提供了更高水平的科学手段和临床依据。

目前，经证实与叶酸代谢密切相关的基因有：5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶还原酶基因(MTRR)。

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)位于第一号染色体1p36.3位置，是参与体内叶酸代谢的关键酶，与体内叶酸/同型半胱氨酸(HCY)的代谢和蛋氨酸的合成有关，催化5,10-亚甲基四氢叶酸转换成5-甲基四氢叶酸盐，使之能为同型半胱氨酸提供甲基形成甲硫氨酸，并且使血液中的同型半胱氨酸量保持在一个较低的水平。

rs1801131是位于MTHFR基因第八个外显子上第1298(1337)核苷酸的一个A/C多态位点，引起MTHFR基因编码的蛋白质第429个氨基酸由Glu变为Ala。在世界人群中的该多态的频率分布，A占77％，C占23％。中国人群中的分布A占81％，C为19％。研究发现，rs1801131位点的多态性是影响该酶的活性的一个重要因素。携带MTHFR1298C等基因的酶活性为野生型的68％左右，因而阻碍了叶酸代谢，引起一系列疾病发病风险增加。

rs1801133是位于MTHFR基因第五个外显子上的716(677)位mRNA上一个C/T多态，引起MTHFR基因编码的蛋白质第222个氨基酸由Ala(A)变为Val(V)。在世界人群中的该多态的频率分布，A占78％，T占22％。中国人群中的分布A占67％，C为34％。研究发现，MTHFR677位点的多态性是影响该酶活性的一个重要因素，导致酶活性和热稳定性下降。若以个体携带677CC基因型时其MTHFR活性为100％，携带CT基因型的活性则为CC的71％，基因型为TT型的只有34％。

MTRR全称5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferasereductase，编码甲硫氨酸合成酶还原酶，位于5p15.3-p15.2。MTRR基因全长32021kb，mRNA全长3274bp，共有15个外显子，编码具有726个氨基酸的蛋白质，是参与体内叶酸代谢和同型半胱氨酸代谢的关键酶。

rs1801394位于MTRR基因第2个外显子处的一个A/G多态性(66A→G)，引起MTRR基因编码的蛋白第22个氨基酸由Ile变为Met(Ile22Met)。在dbSNP数据库中，世界人群中的该多态的频率分布为，A占57.4％，G占42.6％左右。在中国人群中该多态的频率分布为：A占76％，G占24％左右。

通过对叶酸代谢相关的MTHFR和MTRR基因位点进行检测，从分子水平上评估个体对叶酸的利用能力，通过检测可以判读个人叶酸代谢能力的高低。可辅助医生对孕围产期新生儿神经管畸形、妊娠高血压病等疾病的发病风险进行评估，指导叶酸的个体化服用。

目前，针对MTHFR和MTRR基因多态性检测的方法有多种，最简单的方法是PCR-RFLP，但该方法操作复杂，样本多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性的结果，可靠性低。DNA测序法虽然是金标准，但步骤繁琐，过程复杂，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败，另外测序仪价格超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率溶解曲线法快速、简便、经济实用，但是受仪器温度控制，假阳性高。

发明内容

为了解决现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种利用Taqman探针原理检测MTHFR和MTRR基因多态性的引物。本发明还提供了含有该引物的试剂盒。具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单等优点。

本发明提供的MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组，包括以下核苷酸序列的引物和探针：

MTHFR基因A1298C野生型ARMS引物：上游引物SEQIDNO:1，下游引物SEQIDNO:3；

MTHFR基因A1298C突变型ARMS引物：上游引物SEQIDNO:2，下游引物SEQIDNO:3；

MTHFR基因A1298C探针：SEQIDNO:4；

MTHFR基因C677T野生型ARMS引物：上游引物SEQIDNO:5，下游引物SEQIDNO:7；

MTHFR基因C677T突变型ARMS引物：上游引物SEQIDNO:6，下游引物SEQIDNO:7；

MTHFR基因C677T探针：SEQIDNO:8；

MTRR基因A66G野生型ARMS引物：上游引物SEQIDNO:9，下游引物SEQIDNO:11；

MTRR基因A66G突变型ARMS引物：上游引物SEQIDNO:10，下游引物SEQIDNO:11；

MTHFR基因A66G探针：SEQIDNO:12；

所述探针的核苷酸序列5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团。

优选5’端标记荧光报告基团为FAM，3’端标记荧光淬灭基团为MGB。

本发明的具体原理是：针对不同基因位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman-MGB探针，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血细胞或口腔拭子中提取的基因组DNA进行检测，可以一次性在一条6联PCR反应条上实现对5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T和A1298C、甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因A66G的基因多态性进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。

本发明提供的检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，包含有权利要求1所述的MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组。

优选地，上述检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，还包括内部质控引物以及内部质控探针，内部质控引物的核苷酸序列如SEQIDNO:13～14所示，内部质控探针的核苷酸序列如SEQIDNO:15所示，探针5’端标记荧光报告基团JOE，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。

优选地，上述检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，还包括PCR反应体系和Taq酶，其中所述PCR反应体系含有PCR缓冲液、dNTPs和Mg²⁺。

本发明经过大量试验、研究和分析成功研究出该能够用于快速、灵敏、有效的检测MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒。利用这个试剂盒可以检测出MTHFR677、MTHFR1298和MTRR66基因多态性情况。

优选地，上述检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，所述Taq酶和PCR反应体系集成在一起，为ABI公司的产品FastmasterPremix。

本发明所述的检测试剂盒组成至少有2种，分别见表1和表2。

表1试剂盒组成一

表2试剂盒组成二

优选地，上述检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，还包括阳性质控品，是含有MTHFR基因A1298C野生型基因序列、MTHFR基因A1298C突变型基因序列、MTHFR基因C677T野生型基因序列、MTHFR基因C677T突变型基因序列、MTRR基因A66G野生型基因序列、MTRR基因A66G突变型基因序列以及GAPDH基因第8外显子一段碱基序列的DNA混合物，总浓度为1ng/μL。

所述GAPDH基因第8外显子一段碱基序列为NCBI数据库中基因序列编号为NG_007073.2第8161到8400位。

本发明还提供以上任一所述的试剂盒的使用方法，是提取待检样本DNA后，稀释到浓度为1ng/μL，使用试剂盒中各检测引物，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；

JOE是内控信号，用于检测体系是否正常，样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值，即CT值小于25；FAM是检测信号，用于检测样本的基因多态性；在内控信号达到要求后，以每个SNP位点的突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值的差值作为判断标准；

选择装有各基因野生型ARMS引物的管和装有该基因突变型ARMS引物的管，根据FAM信号△Ct值判断检测样本该基因的基因多态性；

△Ct＝|野生型CT值-突变型CT值|≤2.5为杂合型样本，△Ct＝野生型CT值-突变型CT值>2.5为突变型样本，△Ct＝突变型CT值-野生型CT值>2.5为野生型样本。

优选地，上述试剂盒的使用方法，荧光定量PCR的条件设置为：

第一阶段：95℃5min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

第三阶段:35个循环时，72℃30s收集FAM和JOE信号。

本发明涉及的检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，主要是荧光定量PCR试剂，不包括对待测样品处理和模板提取的步骤，但对EDTA抗凝血和口腔拭子提取的基因组DNA以及全血细胞去红细胞后的白细胞都具有检测能力。

与现有技术相比，本发明运用ARMS引物区分野生型和突变型基因，以及设计的检测试剂盒，有如下有益效果和显著进步：

(1)灵敏度高，可以准确检出低至1ng的基因组DNA。对于保存时间过长以及口腔拭子这些提取浓度很低的样本能准确检出；

(2)特异性强，对于高至500ng及以上的基因组DNA不会出现非特异性的结果。可以减少稀释样本的过程，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现非特异性；

(3)适用于多种样本类型：本发明不仅能检测常规的EDTA抗凝的全血细胞DNA，还能检测提取质量差的口腔拭子，还可以直接检测全血细胞裂解红细胞后的白细胞，检测结果准确度高。

(3)成本低，ARMS分型法相对于Taqman探针分型法，不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性，而且还能节约成本，ARMS引物合成快速简单，合成成本低，扩增效果更佳。

(4)检测速度快，整个检测过程只需要90分钟。

(5)应用Fastpremix预混在反应体系中，减少了酶与样本混合的步骤，减少了样本的污染，操作更简单，一步加样，避免了气溶胶污染引起的假阳性。

(6)安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。

总之，本发明涉及的MTHFR和MTRR基因多态性检测试剂盒适用于临床多种样本类型选择，具有特异性强，灵敏度高，实验周期短，操作简单，安全无毒，成本低等显著优点。

附图说明

图1为实施例1中EDTA抗凝的全血提取的基因组DNA样本(编号1)的扩增曲线。样本1的基因多态性为：MTHFR677CC；MTHFR1298AC；MTRR66AG；

图2是实施例1中口腔拭子提取的基因组DNA样本(编号2)的扩增曲线。其基因多态性为：MTHFR677CT；MTHFR1298AA；MTRR66AG。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1：临床样本DNA的提取

一、EDTA抗凝血

本实施例是从EDTA抗凝血中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用天根(TIANGEN)公司的血液基因组DNA提取试剂盒(TIANampDNABloodMiniKit)，按照试剂盒说明进行操作，具体详述如下。

1.处理血液材料：

a.当血液样品体积小于200μL时，可加缓冲液GS补足体积至200μL，再进行下一步实验(如血液样品体积为200μL，可直接进行下一步实验，不需加入GS)。

b.当血液样品体积超过200μL时，需用细胞裂解液CL处理，具体步骤如下：在样品中加入1～2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000rpm(～11,500×g)离心1min，吸去上清，留下细胞核沉淀(如果裂解不彻底，可重复以上步骤一次)，向离心收集到的细胞核沉淀中加200μL缓冲液GS，振荡至彻底混匀。

2.加入20μLProteinaseK溶液，混匀。

3.加200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮，

4.加200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

5.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱CB3放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

6.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10.将吸附柱CB3转入1.5mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TB，室温放置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

定量：将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

二、口腔拭子样本

从口腔拭子中提取基因组DNA,并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用康为世纪的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，具体详述如下。

1.将口腔拭子的棉签用剪刀从杆上剪下，置于2mL的离心管(自备)中，加入400μLBufferGR。

注意：如需无RNA污染的基因组DNA，可加入4μL浓度为100mg/mL的RNaseA溶液(货号：CW0601)，震荡混匀。

2.加入20μLProteinaseK和400μLBufferGL，立即涡旋震荡15秒，充分混匀。

注意：加入BufferGL后立即充分混匀；不可将ProteinaseK直接加入BufferGL中使用。

3.56℃放置10分钟，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

4.加入400μL无水乙醇，涡旋震荡充分混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。

5.将上步所得溶液和沉淀分两次加入到已装入收集管(CollectionTube2ml)的吸附柱(SpinColumnDS)中，一次最多不超过700μL。12,000rpm(～13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.向吸附柱中加入500μLBufferGW1(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.向吸附柱中加入500μLBufferGW2(使用前检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心3分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需进一步提高DNA纯度，可重复步骤7。

8.12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

9.将吸附柱置于一个新的1.5mL离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入50μLBufferGE或灭菌水，室温放置2～5分钟，12,000rpm离心1分钟，收集DNA溶液，-20℃保存。

10、定量

将提取的DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

实施例2：实时荧光PCR法扩增临床样本DNA

本实施例为采用本发明所提供的引物、探针扩增实施例1所提取的DNA样品。2份基因组DNA，用TE稀释液稀释到浓度1ng/μL，用本发明的试剂盒在ABI7300荧光定量PCR仪上进行扩增。

荧光定量PCR反应体系为：

PCR反应液：

MgCl₂：2.0～5.0mmol

dNTPs：0.2～0.8mmol

各条引物：0.1～1.0μmol

各条探针：0.1～1.0μmol

ABIFastmasterpremix：6～10μL

模板：10μL

总体积：40μL。

优选PCR反应管件为：

第一阶段：95℃5min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

第三阶段:35个循环时，收集FAM和JOE信号。

检测方法如下：

(1)每次PCR反应中，同时进行非模板对照(NoTemplateControl；NTC)、阳性对照和待测样本的检测。

(2)将阳性对照取出解冻后震荡混匀，并离心30s。

(3)将6联PCR反应管取出解冻后离心30s，防止反应液在开盖时溅出。

(4)将ddH₂O(NTC)、待测样本、阳性对照分别加入6联PCR反应管，每孔10μL。

(5)将以上6联PCR反应管盖好管盖于离心机上离心30S，确保管壁上不沾有液滴。

(6)将6联PCR反应管放于实时PCR仪器中。

反应条件的设置

第一阶段：95℃4min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第二阶段：95℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

信号收集：第三阶段72℃时收集FAM和JOE信号。

利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测体系是否正常，样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(CT值小于25)；FAM是检测信号，用于检测样本的基因多态性；在内控信号达到要求后，以每个SNP位点的突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数CT值的差值作为判断标准。选择①、②号管，根据FAM信号△Ct值判断检测样本MTHFR677的基因多态性；选择③、④号管，根据FAM信号△Ct值判断检测样本MTHFR1298的基因多态性；选择⑤、⑥号管，根据野生型和突变型FAM信号△Ct值判断检测样本MTRR66的基因多态性。△Ct＝|野生型CT值-突变型CT值|≤2.5为杂合型样本，△Ct＝野生型CT值-突变型CT值>2.5为突变型样本，△Ct＝突变型CT值-野生型CT值>2.5为野生型样本，样本结果判定具体见表3。

两样本扩增曲线见附图1～2，基因多态性见表4。

表3基因多态性检测结果判定

表4样本检测结果

表4说明：EDTA抗凝血提取的基因组DNA和口腔拭子提取的基因组DNA用本发明的试剂盒检测的结果和“金标准”sanger测序的结果完全一致，试剂盒准确度高，适应样本广。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

SEQUENCELISTING

<110>武汉海吉力生物科技有限公司

<120>MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组及试剂盒

<130>

<160>15

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aggagctgaccagtggagc19

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gaggagctgaccagtgaaga20

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ctttgtgaccattccgg17

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ctttgaagtcttcgttc17

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

agaaggtgtctgcgcgagt19

<210>6

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

agaaggtgtctgcgggaac19

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

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<210>8

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

caaaggccatcgcagaagaactg23

<210>10

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

caaaggccatcgcagaagaaaca23

<210>11

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

ccttatcggattcactaatacag23

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

caagctgtggtacatggatt20

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

cgctgccaaggctgtgggcaag22

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

gccgtctagaaaaacctgccaaat24

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

aacgggaagctcactggcatggcc24

Claims

1.MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组，其特征在于，包括以下核苷酸序列的引物和探针：

MTHFR基因A1298C探针：SEQIDNO:4；

MTHFR基因C677T探针：SEQIDNO:8；

MTHFR基因A66G探针：SEQIDNO:12；

2.一种检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含有权利要求1所述的MTHFR和MTRR基因多态性检测引物组。

3.根据权利要求2所述的检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，还包括内部质控引物以及内部质控探针，内部质控引物的核苷酸序列如SEQIDNO:13～14所示，内部质控探针的核苷酸序列如SEQIDNO:15所示，探针5’端标记荧光报告基团JOE，3’端标记荧光淬灭基团BHQ1。

4.根据权利要求2或3所述的检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应体系和Taq酶，其中所述PCR反应体系含有PCR缓冲液、dNTPs和Mg²⁺。

5.根据权利要求4所述的检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述Taq酶和PCR反应体系集成在一起，为ABI公司的产品FastmasterPremix。

6.根据权利要求4或5所述的检测MTHFR和MTRR基因多态性的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品，是含有MTHFR基因A1298C野生型基因序列、MTHFR基因A1298C突变型基因序列、MTHFR基因C677T野生型基因序列、MTHFR基因C677T突变型基因序列、MTRR基因A66G野生型基因序列、MTRR基因A66G突变型基因序列以及GAPDH基因第8外显子一段碱基序列的DNA混合物，总浓度为1ng/μL。

7.权利要求3～6任一所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，提取待检样本DNA后，稀释到浓度为1ng/μL，使用试剂盒中各检测引物，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；

8.根据权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，荧光定量PCR的条件设置为：

第一阶段：95℃5min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

第三阶段:35个循环时，72℃30s收集FAM和JOE信号。