CN105112545A - 检测人类idh1基因突变的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒。该试剂盒包括IDH1？R132H反应混合液和IDH1内标反应混合液，该方法包括以下步骤：(1)在IDH1？R132H反应混合液中加入人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩增；(2)对Ct值进行分析。本发明中的检测方法和试剂盒可以克服IDH1基因序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，对R132H位点突变实现有效的鉴别，检测灵敏度达到1％。

Description

检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别涉及一种检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒。
背景技术
神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，广义上是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义上则是指源于各类胶质细胞的肿瘤。通用WHO分级根据非典型性、核分裂指数、内皮细胞增殖和坏死程度分为4级：I级：以良性毛细胞型星形细胞瘤为主，占胶质瘤5％左右，通常可以治愈；II级：为一般的星形细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤，占胶质瘤的30～40％左右；III级：为间变型星形细胞瘤，占胶质瘤的15～25％左右，一般由II级演变而来；IV级：为胶质母细胞瘤，占胶质瘤的1/3左右。低级别的胶质瘤在临床上主要是指WHO分类为星形细胞瘤I与II级，也包括少突胶质细胞瘤及混合性少突星形细胞瘤。
异柠檬酸脱氢酶(IDH)家族包括以NAD或NADP为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸的酶类，同时分别生成NADH或NADPH。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的胞质IDH3。编码依赖NAD的人IDH1的IDH1基因位于染色体2q33.3，并且定位于细胞质和过氧化物酶体中；编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26.1。尽管IDH1和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制，但IDH1在脂质的代谢机制中也发挥了重要作用。
大量研究证实，代谢的异常是引发肿瘤发生、发展的因素之一。IDH基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的IDH基因高度保持一致。一般认为，IDH基因状态不会因治疗而发生变化。IDH基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40％，胰腺癌为90％以上，肺癌约为15％。IDH1基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子R>H(≥90％)称为R132H，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南(第二版，2014)将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别胶质瘤患者风险级别的指标之一。
以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学，但仅靠组织形态学，特别是立体定向取材小标本，使组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异型性、血管增生、坏死等进行分级。当取材为肿瘤(尤其低级别胶质瘤)边缘时，或肿瘤治疗后判断是否存在复发情况时，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生就显得十分困难。而直接测序法检测基因突变则存在步骤繁琐、工序复杂、费时费力的不足。
扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变特异性ARMS引物，其3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶、镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA发生错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2-3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。相比于组织病理学诊断方法，应用ARMS将显著提高IDH1基因突变检测的效率、灵敏度及特异性。
荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用最广的技术之一，该方法灵敏度高、可实时定量，是适合临床大规模使用的方法。IDH1基因序列中GC含量很高，因此片段扩增的难度很大。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺陷，同时实现对人类IDH1基因突变的检测并计算样本的突变率，从而为肿瘤预后判断、靶向用药提供参考，本发明提供了一种检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒，该检测方法和应用该方法的试剂盒将特异性引物用于荧光定量PCR方法中，可以克服IDH1基因序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，对R132H位点突变实现有效的鉴别，检测灵敏度达到1％。
一种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：
(1)在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述IDH1R132H反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述IDH1内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的IDH1内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
(2)结果判断：首先确定人类基因组DNA在R132H反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值，然后确定同一样本在内标反应体系的Ct值，对Ct值进行分析。
一种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其中：
所述在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在10μLIDH1R132H反应混合液中加入5μL、浓度为10ng/μL的人类基因组DNA，其中：在IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；在IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；
所述在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在14μLIDH1内标反应混合液中加入1μL、浓度为10ng/μL的从同一样品中提取的人类基因组DNA，其中：每14μLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物0.3-0.5μL、IDH1内标反向引物0.3-0.5μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7-8μL，不足14μL的体积用水或缓冲液补足，优选的每14μLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物0.3125μL、IDH1内标反向引物0.3125μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7.5μL；在IDH1内标反应混合液中IDH1内标前向引物和IDH1内标反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
一种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其中所述荧光定量PCR方法的扩增过程为：(1)95℃、3min、循环数为1；(2)95℃、15s，68℃、20s，循环数为18；(3)95℃、15s，57.6℃、20s，循环数为24；(4)升温至95℃。
一种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其中所述对Ct值进行分析的步骤为：
当样品在R132H反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值19时，则该样品的R132H突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在R132H反应体系的突变Ct值小于阴性临界值19时，按照以下标准进行判断：当该样品在R132H反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值16时，则该样品的R132H突变为阳性，即强阳；当该样品在R132H反应体系的突变Ct值大于阳性临界值16时，则计算R132H反应体系的△Ct，ΔCt值＝R132H反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值,若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值9，则该样品的R132H突变也为阳性，即弱阳，若反应体系的△Ct值大于或等于相应的△CtCut-off值9，则该样品的R132H突变为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。
一种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，包括IDH1R132H反应混合液，还包括IDH1内标反应混合液，其中:
所述IDH1R132H反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述IDH1内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的IDH1内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液。
IDH1基因突变上、下游引物序列
一种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其中所述IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在IDH1R132H反应混合液中的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物在IDH1R132H反应混合液中的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
一种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其中所述IDH1内标前向引物、IDH1内标反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在IDH1内标反应混合液中的体积比为(0.3-0.5)：(0.3-0.5)：(7-8)，优选为0.3125：0.3125：7.5；IDH1内标前向引物和IDH1内标反向引物在IDH1内标反应混合液中的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
本发明中所述PCR预混液可通过商业化渠道购买得到，包含DNA聚合酶，SYBRGreen荧光染料，Mg2+，dNTPs和稳定剂；如：KAPABIOSYSTEMS厂家的KAPASYBRFASTqPCRKitMasterMix(2×)Universal试剂盒。
一种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，还包括阳性质控品、阴性对照品和/或野生型质控品。
一种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其中所述阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2，阳性质控品1为发生50％IDH1R132H突变的基因组DNA，阳性质控品2为发生1％IDH1R132H突变的基因组DNA；所述野生型质控品为无IDH1R132H突变的野生型样品基因组DNA；所述阴性对照品为TE缓冲液；各阳性质控品、野生型质控品和阴性对照品的浓度都为5-15ng/μL，优选10ng/μL。
本发明中Ct值是指反应体系中的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。阈值设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品及阴性样本的扩增曲线中无规则噪音线的最高点、不出现Ct值且与阳性质控品的指数期相交为准。取3-15个循环的荧光信号确定基线。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明将申请人从大量引物中筛选获得的、基于等位基因ARMS法的针对IDH1基因R132H位点突变进行扩增的引物用于荧光定量PCR技术中即可达到对IDH1基因R132H位点突变的检测，从而达到IDH1癌症基因筛查、指导靶向用药、提供预后判断信息的目的；同时，对IDH1基因R132H位点突变的检测灵敏度达到1％，可以检测到Sanger测序无法检测(Sanger测序灵敏度约为20％)、但对癌症诊断治疗有重要价值的低频基因突变，此灵敏度已经接近或达到了BEAMing等昂贵、费时、专门检测低频突变的检测技术的水平；
2、本发明克服IDH1基因序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，通过不断摸索反应条件和参数，建立荧光定量PCR扩增反应体系。
附图说明
图1是本发明荧光定量PCR扩增过程示意图；
图2是本发明试剂盒R132H反应体系中检测灵敏度的荧光定量PCR扩增示意图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1试剂盒检测步骤
1、参照如下PCR96孔板布局表：
在96孔板1-6列每个反应空位分别加入10μLR132H反应混合液(IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在IDH1R132H反应混合液中的体积比为1.25：1.25：7.5，IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物在IDH1R132H反应混合液中的浓度均为4.8μM)，7-12列每个反应空分别加入14μL内标反应混合液(每14μLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物0.3125μL、IDH1内标反向引物0.3125μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7.5μL，不足14μL的体积用水补足，在IDH1内标反应混合液中IDH1内标前向引物和IDH1内标反向引物的浓度均为4.8μM)，然后快速离心15秒；
2、临床患者离体肿瘤组织样本基因组DNA提取：参照所购买的Qiagen的商用基因组DNA提取试剂盒进行操作；
3、加样：参照上述PCR96孔板布局表，在1-6列反应空位中按照96孔板1-6列布局表的文字指示加入5μL、10ng/μl的待测样本基因组DNA或5μL、10ng/μl的阳性质控品1或5μL、10ng/μl的阳性质控品2或5μL、10ng/μl的野生型质控品或5μL、10ng/μl的阴性对照品；在7-12列反应空位中按照96孔板7-12列布局表的文字指示加入1μL、10ng/μl待测样本基因组DNA或1μL、10ng/μl的阳性质控品1或1μL、10ng/μl的阳性质控品2或1μL、10ng/μl的野生型质控品或1μL、10ng/μl的阴性对照品。
a)推荐的待测样本基因组DNA浓度为10ng/μL，即在IDH1R132H反应体系中每单个反应体系添加的基因组DNA量为50ng；在IDH1R132H内标反应体系中每单个反应体系添加的基因组DNA量为10ng。
b)推荐使用TEbuffer(pH8.0)稀释DNA；
4、将加好样的PCR96孔板放入qPCR仪样品槽，开启连接qPCR仪的计算机，并打开qPCR控制程序，参照以下扩增程序进行设置。
5、信号收集阶段：步骤4中第2阶段68℃时收集SYBRGreen信号，第3阶段57.6℃收集SYBRGreen信号，第四阶段反应体系温度每上升0.5℃收集一次SYBRGreen荧光信号。运行上述PCR程序直至结束，并保存检测结果电子版原始文件。
实施例2结果判断与分析方法
1、突变结果的确定：首先确定样品在R132H反应体系突变Ct值(简写为A)，然后确定该样品在内标反应体系的Ct值和阳性质控品的Ct值，内标反应体系的Ct值在后期计算突变比例中发挥了至关重要的作用，具体作用请见后续步骤，阳性质控品1和阳性质控品2的Ct值可以直接判断此次结果的有效性，属于反应体系中的质控点。不同的Ct值代表不同的突变程度，可根据结果判定标准(表1)，对检测结果进行分析：
表1结果判定标准
*ΔCt值的计算：ΔCt值＝R132H反应体系突变Ct值(A)-该样本在内标反应体系的Ct值。
2、突变结果的分析：a)当样品在R132H反应体系突变的Ct值大于或等于阴性临界值19，则该样品为R132H阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值；b)当样品在R132H反应体系突变的Ct值小于阴性临界值19，按照以下标准进行判断：当某个样品在R132H反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值16时，则该样品为R132H突变阳性，即强阳；当某个样品在R132H反应体系的突变Ct值大于阳性临界值16时，则计算该反应体系的△Ct，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值9，则该样品也为R132H的突变阳性，即弱阳，若反应体系的△Ct值大于或等于相应的△CtCut-off值9则为R132H的突变阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。
实施例3反应体系的优化
1、待测样本人类基因组DNA加入量确认：将实施例1中10ng/μl的样品人类基因组DNA，分别设置1ng、5ng、10ng、50ng4个加入量梯度加入R132H反应体系，最终确认以50ng(5μl浓度为10ng//μl的模板)作为R132H反应体系的最终加入量，此加入量可以排除人为操作因素的影响。
2、循环数摸索：A代表实施例1步骤4中第2阶段退火条件；B代表实施例1步骤4中第3阶段退火条件，按照以下组合搭配，最终验证结果显示A为18与B为24的搭配为最佳反应过程。
A:18repeats(19total)B:24(23total)
A:16repeats(17total)B:26(26total)
A:14repeats(15total)B:28(29total)
A:12repeats(13total)B:30(31total)
A:10repeats(11total)B:32(33total)
实施例4灵敏度检测
按照实施例1和实施例2的方法对不同突变率的样品基因组DNA进行荧光定量PCR以检测本发明试剂盒检测的灵敏度，R132H反应体系中荧光定量PCR扩增图见图2。在荧光定量PCR扩增图2中：G曲线为突变率为1％的样本在IDH1内标反应体系的扩增曲线，其他ABCDEFG曲线为IDH1R132H反应体系的扩增曲线(A曲线代表突变率为50％的样本，B曲线代表突变率为10％的样本，C曲线代表突变率为5％的样本，D曲线代表突变率为1％的样本，E曲线代表野生型样本，F曲线代表阴性对照样本)。D曲线在IDH1R132H反应体系的突变Ct值小于阳性临界值16，Ct值为15.3，可以很明确判断，该试剂盒检测灵敏度为1％。
A中有5000突变拷贝和5000野生型拷贝，突变率50％，
该样本在R132H反应体系的突变Ct值远小于阳性临界值16，Ct值为9，则可以判断为强阳样本。
B中有5000突变拷贝和45000野生型拷贝，突变率10％，
该样本在R132H反应体系的突变Ct值远小于阳性临界值16，Ct值为12，可以判断为强阳样本。
C中有5000突变拷贝和95000野生型拷贝，突变率5％，
该样本在R132H反应体系的突变Ct值远小于阳性临界值16，Ct值为13.7，则可以判断为强阳样本。
D中有5000突变拷贝和495000野生型拷贝，突变率1％，
该样本在R132H反应体系的突变Ct值小于阳性临界值16，Ct值为15.3，则可以判断为强阳样本。
E中有0突变拷贝和100000野生型拷贝，突变率0％，
该样本的突变Ct值大于阳性临界值16并且小于阴性临界值19，Ct-值为18，则通过计算R132H反应体系的△Ct来判断，ΔCt值＝R132H反应体系突变Ct值(18)-该样本在内标反应体系的Ct值(8.5),反应体系的△Ct值9.5大于相应的△CtCut-off值9，则该样品的R132H突变为阴性。
F为阴性对照TE缓冲液，在R132H反应体系的突变Ct值远大于阴性临界值19，则该样本的R132H突变为阴性。
实施例5荧光PCR方法对比Sanger的方法学验证
按照实施例1和实施例2中的步骤进行荧光定量PCR检测和数据分析，并同时开展Sanger验证，验证数据与结果如下：通过对比方法学对人类IDH1基因突变检测试剂盒的方法确认进行评估，采用与Sanger方法学对比研究的方式进行，计划采用盲法对脑胶质瘤患者冰冻组织样本平行开展qPCR与Sanger方法学对比，得到qPCR与参考方法符合率的验证结果。对于与参考方法不符的病例，继续采用深度测序的方法进行验证。
从目前已获得的脑胶质瘤患者的临床样本研究结果显示，共获得370例有效检测数据，与Sanger检测方法学对比验证结果显示，qPCR检测与Sanger验证一致率达到97.84％，两种方法学具有较高的一致性。
用于盲法对比的样本来源于脑胶质瘤样本，包括：间变性少突胶质瘤、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突细胞瘤、部分脑胶质瘤前体组织和少量正常脑组织、垂体瘤组织样本。
验证分析结果
表2R132H位点统计数据
备注：PPA:阳性符合率；NPA:阴性符合率；OPA:总体符合率
从上表可知，在总共370例有效对比数据中，qPCR方法与Sanger方法相比，总体阳性符合率为100％，95％置信区间范围为97.64％-100％。阴性符合率为96.21％，95％置信区间范围为92.70％-98.07％。总体符合率为97.84％，95％置信区间范围为95.79-98.90％。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：
所述IDH1R132H反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述IDH1内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的IDH1内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
(2)结果判断：首先确定人类基因组DNA在R132H反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值，然后确定同一样本在内标反应体系的Ct值，对Ct值进行分析。
2.根据权利要求1所述的检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，
所述在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在10μLIDH1R132H反应混合液中加入5μL、浓度为10ng/μL的人类基因组DNA，其中：在IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；在IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；
所述在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在14μLIDH1内标反应混合液中加入1μL、浓度为10ng/μL的同一样品中提取的人类基因组DNA，其中：每14μLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物0.3-0.5μL、IDH1内标反向引物0.3-0.5μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7-8μL，不足14μL的体积用水或缓冲液补足，优选的每14μLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物0.3125μL、IDH1内标反向引物0.3125μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7.5μL；在IDH1内标反应混合液中IDH1内标前向引物和IDH1内标反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
3.根据权利要求1或2所述的检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法的扩增过程为：(1)95℃、3min、循环数为1；(2)95℃、15s，68℃、20s，循环数为18；(3)95℃、15s，57.6℃、20s，循环数为24；(4)升温至95℃。
4.根据权利要求3所述的检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述对Ct值进行分析的步骤为：
当样品在R132H反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值19时，则该样品的R132H突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，
当样品在R132H反应体系的突变Ct值小于阴性临界值19时，按照以下标准进行判断：当该样品在R132H反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值16时，则该样品的R132H突变为阳性，即强阳；当该样品在R132H反应体系的突变Ct值大于阳性临界值16时，则计算R132H反应体系的△Ct，ΔCt值＝R132H反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值9，则该样品的R132H突变也为阳性，即弱阳，若反应体系的△Ct值大于或等于相应的△CtCut-off值9，则该样品的R132H突变为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。
5.一种检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，包括IDH1R132H反应混合液，还包括IDH1内标反应混合液，其中:
所述IDH1R132H反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；
所述IDH1内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的IDH1内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液。
6.根据权利要求5所述的检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在IDH1R132H反应混合液中的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物在IDH1R132H反应混合液中的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
7.根据权利要求5或6所述的检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，IDH1内标前向引物、IDH1内标反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液在IDH1内标反应混合液中的体积比为(0.3-0.5)：(0.3-0.5)：(7-8)，优选为0.3125：0.3125：7.5；IDH1内标前向引物和IDH1内标反向引物在IDH1内标反应混合液中的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。
8.根据权利要求7所述的检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，所述PCR预混液包括了：DNA聚合酶，SYBRGreen荧光染料，Mg2+，dNTPs和稳定剂。
9.根据权利要求5或6所述的检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品、野生型质控品和/或阴性对照品。
10.根据权利要求9所述的检测人类IDH1基因突变的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品包括阳性质控品1和阳性质控品2，阳性质控品1为发生50％IDH1R132H突变的基因组DNA，阳性质控品2为发生1％IDH1R132H突变的基因组DNA，所述野生型质控品为无IDH1R132H突变的野生型样品基因组DNA，所述阴性对照品为TE缓冲液；各阳性质控品、野生型质控品和阴性对照品的浓度都为5-15ng/μL，优选10ng/μL。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434924A (zh) * 2016-09-29 2017-02-22 北京全式金生物技术有限公司 一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010028099A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 The Johns Hopkins University Genetic alterations in isocitrate dehydrogenase and other genes in malignant glioma
CN103436613A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 中国人民解放军第二军医大学 Idh1/idh2基因突变的荧光pcr检测试剂盒及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010028099A1 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 The Johns Hopkins University Genetic alterations in isocitrate dehydrogenase and other genes in malignant glioma
CN103436613A (zh) * 2013-08-21 2013-12-11 中国人民解放军第二军医大学 Idh1/idh2基因突变的荧光pcr检测试剂盒及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
朱剑: "R132H型IDH1突变在胶质瘤中作用的初步研究", 《苏州大学博士学位论文》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434924A (zh) * 2016-09-29 2017-02-22 北京全式金生物技术有限公司 一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法及试剂盒

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