CN114250277A

CN114250277A - 一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法

Info

Publication number: CN114250277A
Application number: CN202111635886.3A
Authority: CN
Inventors: 倪润芳; 郭婷婷; 赵菁; 康金妹; 李官林
Original assignee: XIAMEN ZEESAN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: XIAMEN ZEESAN BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2021-12-29
Filing date: 2021-12-29
Publication date: 2022-03-29

Abstract

一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，将探针结合锁核酸LNA修饰，以提高Tm1与Tm2的差异，所述Tm1为探针与完全匹配的序列结合时的Tm值，所述Tm2为探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，将修饰后的探针对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。本发明对探针中的核苷酸进行了LNA锁核酸修饰，提高了Tm1与Tm2间的温度差异，所以提升了探针对单核苷酸变异序列的区分能力，可以检测到更低突变含量的模板。

Description

一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法。

背景技术

单核苷酸变异的识别在用药监控等方面有重要意义。如特定的基因突变是肿瘤靶向治疗的重要生物标记物，基因突变检测可在疾病进展前尽早发现耐药突变，帮助医生制定临床治疗决策，为患者争取治疗时机。

目前单核苷酸变异的检测主要用实时荧光定量PCR(polymerase chainreaction，聚合酶链式反应)平台。实时荧光定量PCR平台是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测定每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。其结果以扩增曲线的形式呈现，结果以Ct值表示，其检测灵敏度高，在结合Taqman荧光探针的使用后，可以特异性地表征待测基因的扩增情况。

现有检测和定量单核苷酸变异的技术是等位基因特异性扩增法(amplificationrefractory mutation system，ARMS)。ARMS-PCR的基本原理为：如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热DNA聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3′端碱基分别与突变和无突变的模板碱基互补，从而将有特定点突变的模板与无突变的模板区分开来。

目前ARMS技术具有以下缺点：1、ARMS技术受限于引物末端的序列，设计局限性较大；2、ARMS引物需要严格控制反应液配比与反应温度才能达到所需检测要求，重现性较差；3、ARMS引物的特异性有限，特异性指耐受的非检测核苷酸位点的浓度，可耐受的浓度越高，可以检测到的突变占比约低，越有利于低突变含量样本的准确检出。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，与现有技术相比，本发明在准确性和敏感性与其相当，在特异性、反应程序耐受度和重现性方面会更优。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，将探针结合锁核酸LNA(lockednucleic acid)修饰，以提高Tm1与Tm2的差异，所述Tm1为探针与完全匹配的序列结合时的Tm(melting temperature熔解温度)值，所述Tm2为探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，将修饰后的探针对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。

本发明中，检测序列为COSV61615239(c.395G>A)，即待测核酸片段1在395位点的核苷酸为G，而待测核酸片段2在395位点的核苷酸为A，片段1与片段2在395位点之外的序列是一样的。

如图1所示，本发明中，引物为IDH1-F和IDH1-R；探针为突变型探针IDH1-MT-P和野生型探针IDH1-WT-P；引物IDH1-F与IDH1-R可对片段1与片段2扩增，突变型探针IDH1-MT-P和野生型探针IDH1-WT-P可分别与片段1和片段2特异结合，IDH1-MT-P和IDH1-WT-P的5’与3’分别带有荧光基团与淬灭基团，所以探针在反应中不能扩增，当所述探针与其模板特异结合时可检测相应片段的有无。

不同DNA寡核苷酸链之间的结合力不同，寡核苷酸链之间的结合力越强，双链的热稳定性越高，从而双链的Tm值越高。将探针与完全匹配的序列结合时的Tm值，记为Tm1，探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，记为Tm2。理论上，将退火温度设置于Tm2与Tm1之间，且Tm1高于退火温度在3℃以上，退火温度高于Tm2在3℃以上时，可以保证探针极大部分与完全匹配的模板序列相结合，而不与或极少与单核苷酸变异序列相结合。这需要Tm1与Tm2的差异足够大(约6℃及以上)，常规设计的探针，对于单核苷酸变异的位点，Tm1与Tm2的差异一般在4℃左右。本发明中，将探针结合锁核酸LNA修饰，提高了Tm1与Tm2的差异，修饰后的探针可以达到上述的理论要求，所以本发明中仅依靠探针即可对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。

相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：

本发明利用LNA修饰的探针对单核苷酸变异位点实现识别与定量检测，相较现有技术，本发明具有更优的性能，可以达到更优的特异性和反应程序兼容性，极大限度地解决了现有技术的缺点。

本发明中，片段1和片段2在实际应用场景中会同时存在，需要通过检测手段得到片段1和片段2的混合物中两者的相对含量，尤其需要对极微量含量的模板得到有效定值，现有方法的单核苷酸变异序列的区分能力有赖于引物(即ARMS方法)，本发明的单核苷酸变异序列的区分能力有赖于探针，与现有方法相比有更优的定值能力。

本发明对探针中的核苷酸进行了LNA锁核酸修饰，提高了Tm1与Tm2间的温度差异，所以提升了探针对单核苷酸变异序列的区分能力，可以检测到更低突变含量的模板。

附图说明

图1为本发明片段1和片段2与引物、探针的作用示意图；

图2为突变型标准品的检测结果；

图3为突变型标准品的标准曲线；

图4为野生型标准品的检测结果；

图5为野生型标准品的标准曲线；

图6为突变型检测体系在退火温度60℃下的检测结果；

图7为突变型检测体系在退火温度57℃下的检测结果；

图8为突变型ARMS-PCR体系在退火温度60℃下的检测结果；

图9为突变型ARMS-PCR体系在退火温度57℃下的检测结果；

图10为各突变含量的模拟阳性样本的检测结果；

图11为已知阴性结果的突变型体系样本的检测结果；

图12为已知阴性结果的野生型体系样本的检测结果。

具体实施方式

为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。

一、引物和探针的设计

检测序列见COSMIC数据库(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)中的序列号COSV61615239。用Primer Premier5.0软件设计引物和探针。用Tm Utility2.0确定探针与待测序列、单核苷酸变异序列结合的Tm值。

二、组分配制

1、引物和探针

经筛选及优化，本实施例中使用的引物和探针序列具体如表1：

表1引物及探针序列

	序列
		引物IDH1-F	TGCCACTATCACTCCTGATGAG
引物IDH1-R	ATGGGTGTAGATACCAAAAGATAAGAA
		突变型探针IDH1-MT-P	FAM-CATCATAGGT+C+A+TCATGCTTA-BHQ1
野生型探针IDH1-WT-P	FAM-CATAAGCATGA+CGACCTATGAT-BHQ1

2、反应液配制

本实施例中所用的10×PCR缓冲液的配方为：(NH₄)₂SO₄ 21.142g，Tris 81.164g，Tween-20 1.0mL，pH8.8。Taq酶为TaKaRa Taq^TM Hot Start Version(Takara，R007Q)。ddH₂O：去离子水。反应液配比见表2和表3。

表2突变型反应液配比

IDH1突变型试剂	用量(μL)
		ddH<sub>2</sub>O	13.6
10×PCR缓冲液	2.5
		MgCl<sub>2</sub>(25mM)	3
dNTP mix(25mM)	0.2
		IDH1-F	0.2
IDH1-R	0.2
		IDH1-MT-P	0.1
Taq酶(5U/μL)	0.2

表3野生型反应液配比

IDH1野生型试剂	用量(μL)
		ddH<sub>2</sub>O	13.6
10×PCR缓冲液	2.5
		MgCl<sub>2</sub>(25mM)	3
dNTP mix(25mM)	0.2
		IDH1-F	0.2
IDH1-R	0.2
		IDH1-WT-P	0.1
Taq酶(5U/μL)	0.2

3、对照品

突变性对照品：含有IDH1-R132H突变型序列的质粒。

野生型对照品：与突变质粒对应的含有IDH1-WT野生型序列的质粒。

质粒均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，用1M Tris-HCl缓冲液(pH7.6)稀释至所需浓度，对照品的浓度设置为常见的样本检测浓度，即2×10⁴拷贝/μL。

空白对照品：去离子水。

野生型体系和突变型体系在每次实验中均需要带入以上三种对照品。

4、标准品

以梯度稀释的IDH1-R132H突变型质粒作为突变型标准品，以梯度稀释的IDH1-WT野生型质粒的浓度作为野生标准品，均设置5个浓度梯度，分别为2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹、2×10⁰拷贝/μL。标准品仅用于对应检测通道的检测。

三、检测及分析

1、加样：向20μL的PCR试剂中加入5μL模板，模板包括对照品、标准品和待测核酸。盖紧PCR管盖，使用涡旋振荡器混匀试剂，将试剂短暂离心至PCR管底。

2、反应：将配好的反应体系置于荧光定量PCR仪(宏石荧光PCR仪SLAN-96S)中进行反应，反应程序如表4所示。实验结果用配套的分析软件SLAN全自动医用PCR分析系统8.2.2进行分析。

表4反应程序

3、结果判断：

标准品会在对应反应管的相应通道产生扩增曲线，对其Ct值和浓度进行标准曲线的计算，依照qPCR定量指南(Bustin S A,Vladimir B,Garson J A,et al.The MIQEGuidelines:Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCRExperiments[J].Clinical Chemistry,2009(4):611.)中的计算方法及参数要求进行计算和判定。当其相关系数R的平方大于0.99，扩增效率大于85％，斜率在-3.0至-4.0之间时，该标准曲线可用于同批次样本的未知样品的定量计算。其中，斜率即为拟合的标准曲线的直线斜率，PCR扩增效率＝10^-1/斜率-1，相关系数由标准曲线在线性拟合时获得，其定义式为：

若结果出现异常，需查明原因后做出调整后重新检测。标准品的定量及标准曲线结果见图2～5，模拟融合基因阳性样本的结果见图10。

突变含量的计算：IDH1-R132H(％)＝IDH1-R132H拷贝数/(IDH1-WT拷贝数+IDH1-R132H拷贝数)×100％。

对照品仅在对应反应管的相应通道产生扩增曲线，若在非待测反应管中出现信号，当次检测结果作废，需查明原因后做出调整后重新检测。对照品在对应反应的定量结果需≥99％，在非待测反应管的定量结果需<0.01％。

四、试剂性能评价

1、试剂的定量性能：标准品的结果如图2～5所示，体系标准曲线的各项指标符合检测要求，定量能力良好。

2、试剂的特异性：指可耐受的非检测核苷酸位点的浓度。具体为，向突变型体系中加入2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴和2×10³拷贝/μL的野生型对照品检测，同样地，向野生型体系中加入2×10⁶、2×10⁵、2×10⁴和2×10³拷贝/μL的突变型对照品检测。以普通ARMS体系作为对照，同样进行上述检测。

3、试剂的反应程序兼容性：将PCR程序更改至非最优的反应条件，考察体系的各项检测性能，以普通ARMS体系作为对照体系。因为退火温度是决定ARMS方法的检测性能的最关键的程序参数，所以考察时将PCR循环中的60℃1min的反应步骤，设置为57℃1min。

突变型体系的结果如图6～9所示，在最优反应条件下，本发明的特异性优于普通ARMS方法；在非最优条件下，ARMS-PCR会产生非特异性扩增，而本发明不会。对突变和野生型体系在不同退火温度下的性能参数统计见表5～6所示：本发明的各项检测性能在非最优的反应条件下仍与最优条件下相当，但普通ARMS方法在非最优反应条件下，各项性能衰退明显。结果说明本发明的特异性和反应程序兼容性明显优于现有技术。

表5本发明试剂的各项性能与反应程序兼容性

表6普通ARMS体系试剂的各项性能与反应程序兼容性

五、各突变含量的模拟阳性样本的检测

用已知浓度的野生型与突变型标准品混合得到各突变含量的模拟阳性样本。模拟阳性样本的总拷贝数为2×10⁴拷贝/μL，突变含量设定为0.01％，0.05％，0.1％，0.5％，1％，5％，10％，50％和100％。每一个浓度的样本设置两个复孔检测，结果见表7和图10，以测算平均值与理论值做回归分析，得到相关系数(R)的平方为0.9993，相关系数(R)的平方大于0.99代表两者的相关性良好。结果说明体系测定的突变含量是准确的。

表7各突变含量的模拟阳性样本的检测结果

六、已知阴性结果的样本的检测

对人类慢性髓原白血病细胞K-562细胞系(购于ATCC细胞库，编号：CCL-243)进行培养，使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(购于天根生化科技有限公司，货号DP304)从细胞中提取其基因组DNA，稀释至10ng/μL的浓度检测。检测结果见图11～12，经计算，样本拷贝数约3000拷贝/μL，突变含量0％，检测结果符合预期，说明体系可以准确检测和定量真实样本。

本实施例中，使用的反应液和反应酶不限于上述限定的溶液，可以用其他PCR缓冲液、DNA聚合酶替代；荧光探针也可以使用包含未经修饰的核苷酸，非天然的核苷酸(例如肽核酸PNA或锁核酸)，或其任何组合组成；荧光PCR仪可以使用任何具有此功能的仪器；结果分析可以用其他配套软件或导出原始数据自行计算。本实施例也可采用数字PCR的检测方案，无需标准曲线即可定量检测。本发明还可应用到其他技术领域，比如其他微小核酸变异(如插入、缺失或重复等核酸变异)的检测与定量。本发明所保护的单核酸变异位点的检测方法，包括但不限于实施例中涉及的突变类型、探针序列、方法等。

序列表

<110> 厦门致善生物科技股份有限公司

<120> 一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

tgccactatc actcctgatg ag 22

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

atgggtgtag ataccaaaag ataagaa 27

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

catcataggt catcatgctt a 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

cataagcatg acgacctatg at 22

Claims

1.一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，其特征在于：将探针结合锁核酸LNA修饰，以提高Tm1与Tm2的差异，所述Tm1为探针与完全匹配的序列结合时的Tm值，所述Tm2为探针与单核苷酸变异序列匹配的Tm值，将修饰后的探针对单核苷酸变异的位点进行区分和定量。

2.如权利要求1所述的一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，其特征在于：检测序列为COSV61615239(c.395G>A)，即待测核酸片段1在395位点的核苷酸为G，而待测核酸片段2在395位点的核苷酸为A，片段1与片段2在395位点之外的序列是一样的。

3.如权利要求2所述的一种新的检测和定量单核苷酸变异的方法，其特征在于：引物为IDH1-F和IDH1-R；探针为突变型探针IDH1-MT-P和野生型探针IDH1-WT-P；引物IDH1-F与IDH1-R可对片段1与片段2扩增，突变型探针IDH1-MT-P和野生型探针IDH1-WT-P可分别与片段1和片段2特异结合，IDH1-MT-P和IDH1-WT-P的5’与3’分别带有荧光基团与淬灭基团，当所述探针与其模板特异结合时可检测相应片段的有无。