JP7055778B2 - ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤に応答する患者を同定するためのアッセイ - Google Patents

Description

米国における急性骨髄性白血病（「ＡＭＬ」）の患者は約５万人とその有病率は低く、これは希少疾病として指定されるのに必要とされる２０万人を大きく下回ると考えられる。ＡＭＬの有病率は高齢の患者において大きくなり、また、こうした患者では、この疾患の治療ははるかに困難となる傾向がある。一般的に少なくとも６０才と定義される高齢患者（ただし分類によっては、患者は少なくとも６５才、又は更には７０才以上である必要がある）では、この疾患による死亡率ははるかに高率である。高齢のＡＭＬ患者における（治療に対する）奏功率及び生存率は、完全回復では平均で３０％～５０％であり、無再発生存期間（ＲＦＳ）の中央値はわずか約９～１２ヶ月に過ぎない。２年を越えて生存する高齢患者は極めて希である。

高齢のＡＭＬ患者の治療の管理には多くの課題がある。約７０％の患者が従来の誘導療法によってＡＭＬの寛解を達成するが、この治療法の毒性作用及び高齢患者における極めて低い治療成績のため、従来の誘導療法は、高齢者にはしばしば適用されない。このため、高齢患者における治療選択肢は多くの場合、治験的治療又は緩和ケアの域をでない。しかしながら、従来の誘導療法に応答する確率が高い高齢患者のサブグループを同定することが可能である。例えば、好ましい細胞遺伝学的特性を有し、多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ１）の発現レベルの上昇が見られない高齢患者は、誘導療法に対してよく応答する。しかしながら、例えば、完了に１週間余りを要し得る細胞遺伝学的検査の結果を待つ間など、誘導療法の開始の遅れにつながるこうした患者の同定における遅れは、予後に重大な悪影響を及ぼす。低い応答性の他のマーカーとしては、ＦＬＴ３／ＩＴＤ変異の存在、又はＣＤ３４抗原の発現が挙げられる。したがって、高齢のＡＭＬ患者の治療の効果的を管理を行うためには速やかな判断が求められるが、これには適切な治療を選択するための迅速なアッセイが必要とされる。患者によって治療によく応答する場合もあれば、治療に応答を示さずに副作用に苦しむ者もいる。

ＡＭＬの患者は、再発性／不応性疾患を有する患者と、新たに疾患が診断された患者とに分けることもできる。再発性又は不応性の疾患状態の患者では、治療に対して応答を示さなくなっているか、あるいは疾患が再発している。再発性状態又は不応性状態のいずれも予後は芳しくない。

残念なことに、多くのＡＭＬ治療では最初の成功の後、しばしば再発が起こる。更に、大部分の治療はすべての患者において有効であるとはかぎらず、部分寛解は生存率を延ばすのにほとんど効果がない。

ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）は、高齢患者にも代替療法を提供するものである。ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）は、各種のタンパク質のＣ末端のＣＡＡＸモチーフへの炭素ファルネシル部分の共有結合を阻害する。重要な点として、ＦＴＩは、従来の誘導療法よりも高齢患者による忍容性がより高いと考えられる。しかし、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤による治療に対して応答を示すのは患者の約１５％～２５％に過ぎない。チピファルニブなどのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤は、癌に関連するＲＡＳなどのシグナル伝達分子に対するファルネシル部分の付加を競合阻害することによって機能する。このような阻害は、これらのシグナル伝達分子の機能を低下させるものと予想される。本開示において対象とする多くのＦＴＩが、米国特許出願公開第２００３００５０３２３号に述べられている。

Ｒ１１５７７７又はその商品名であるＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（商標）とも呼ばれるチピファルニブは、臨床試験が行われた最初のファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（ＦＴＩ）であり、多くの疾患の治療に有望であることが示されている。チピファルニブは、ＡＭＬ、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、骨髄化生をともなう骨髄線維症（ＭＭＭ）、及び慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む血液疾患に顕著な活性を示しており、ＡＭＬ及びＭＤＳでは完全奏功率は最大で約１５％となっている。更にチピファルニブは、他の治療法としばしば相乗的に作用する。この相乗作用は、高齢患者に幾つかの他の選択肢、すなわち、ファルネシル阻害剤と別の薬剤との組み合わせによる治療を行い、忍容される副作用及び１種類の薬剤のみを単独で用いた治療を行った場合よりも優れた治療成績を有する可能性をしばしばもたらすものである。注目すべき点として、これまでに行われたチピファルニブ単独の臨床試験では生存率の顕著な増大は認められず、シタラビン（「ａｒａ－Ｃ」）などの他の薬剤とのいくつかの組み合わせでは死亡率が高まる可能性すらある。チピファルニブとエトポシドとの組み合わせは、このような問題がないものと考えられる。

好ましいＦＴＩであるチピファルニブは、多くの腫瘍／細胞系統の増殖を阻害する。特にＮ－ｒａｓ又はＨ－ｒａｓ変異を発現している細胞系統では、細胞増殖が顕著に阻害される。しかしながら、試験を行った場合にＦＴＩであるＲ１１５７７７によって阻害されたのは、Ｋ－ｒａｓ変異を有する細胞系統の半分程度に過ぎず、大幅に高い用量でも同様であった。ＦＴＩであるＲ１１５７７７はまた、腫瘍／細胞系統の増殖の阻害において多くの薬剤と相乗作用を示している。注目すべき点として、一部の癌及び他の増殖性疾患は、異なる種類のｒａｓ変異における突然変異又はそれに対する感受性によって特徴付けられることがある。したがって、Ｒ１１５７７７を含むＦＴＩは、すべての種類の癌及び増殖性疾患の治療に同様に有効であるとは考えられない。実際、Ｋ－ｒａｓが重要な役割を担っている場合、ＦＴＩがＮ－ｒａｓ又はＨ－ｒａｓのみが重要な役割を有する場合と同様に有効である可能性は低い。

従来の誘導療法に代わる別の一群の代替療法として、ポドフィロトキシンに基づいたものがあり、米国特許出願公開第２００３００５０３２３号に述べられている。ポドフィロトキシンは、マンドレイクという植物から抽出される。ポドフィロトキシンは、小児白血病、肺の小細胞癌、睾丸腫瘍、ホジキン病、及び大細胞リンパ腫などの複数のヒトの腫瘍において顕著な治療活性を示す２種類のグリコシドがこれから開発された親化合物である。これらの誘導体は、化学名４１－テメチルエピポドフィロトキシン－９－［４，６－０－（Ｒ）－エチリデン－β－Ｄ－グルコピラノシド］を有するエトポシド（ＶＰ－１６）、及び化学名４１－デメチルエピポドフィロトキシン－９－［４，６－０－（Ｒ）－テニリデン－β－Ｄ－グリコピラノシド］を有するテニポシド（ＶＭ－２６）である。これらの化合物の作用機序には、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩとの相互作用又はフリーラジカルの生成によるＤＮＡ鎖の切断の誘導が含まれる。しかしながら、エトポシド及びテニポシドはいずれも毒性副作用、特に骨髄抑制を引き起こす。

腫瘍の増殖に対する抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体の阻害作用を高め、更により低用量の抗腫瘍ポドフィロトキシン誘導体を使用するための手段を提供する目的で、他の治療との相乗的な組み合わせが検討されてきた。ＦＴＩ、特にチピファルニブはエトポシドとの相乗作用を示すため、より毒性の低い有効量の使用を可能とするが、これは高齢のＡＭＬ患者では重要な考慮点である。

チピファルニブとエトポシドなどのポドフィロトキシンの誘導体との組み合わせによる副作用は、より忍容性が高い。しかしながら、若年のＡＭＬ患者における７０％の奏功率と異なり、エトポシドとチピファルニブとの組み合わせに対する奏功率は一般的に約１５％～２５％の範囲である。すべてのＡＭＬ患者がＦＴＩによる治療に応答するわけではないことから、患者が応答する確率が低い場合には、患者をＦＴＩで治療することは望ましくないが、これはＦＴＩを投与するのに先立つ課題となる。

好ましいＦＴＩであるＲ１１５７７７は併用治療において有効であったが、Ｒ１１５７７７と他の薬剤とのこのような相乗作用を特定の患者において高い信頼性で予測することは、１つにはファルネシルトランスフェラーゼ活性の阻害の程度と臨床的な変化との相関があまり見られないという理由により可能ではなかった。例えば、ＲＡＳ遺伝子の突然変異状態が、ＦＴＩに対する患者の応答の候補バイオマーカーとなると考えられた。その理論的な根拠は、ＲＡＳ遺伝子内の特定の点突然変異が多くの癌においてＲＡＳ経路の構成的な活性化を引き起こすという、前臨床的な証拠に基づいたものであった。１乃至２つの経路の活性化に大きく依存している腫瘍では、こうした腫瘍を有する患者は、これらの経路を阻害する薬剤に応答するはずであると一般的に認識されている。しかしながら、時として多くの経路が複数の事象によって活性化される場合があり、活性化に働くＲＡＳ変異がない場合にＲＡＳの発現が上昇し得ることが示されている。更に、本願にその全容を援用するところの米国特許出願公開第２００７００４８７８２号において指摘されているように、臨床試験においてＲＡＳ変異とＦＴＩに対する応答との間に相関は示されていない。実際、ＦＴＩの複数の初期の臨床試験がＲＡＳ変異を高頻度で示す癌に着目したが、これらの試験では奏功率は失望的に低かった。したがって、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と他の治療法との組み合わせに対する特定の患者の応答を予測するという課題により、その予測能力を臨床的に有用なものとするうえで迅速かつ正確で低コストの好適な診断アッセイが待たれるところである。

本開示では、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤とエトポシドとの組み合わせによる治療に対する応答を予測するマーカーを同定する。これらのマーカーは、応答を示さない確率が高い患者を望ましくない副作用にさらすことを回避する一方で、潜在的な応答患者に対する使用が見合わされない低い応答プロファイルを示す癌の治療法を同定することを可能とする。

好ましい実施形態は、ＦＴＩを、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムのうちの１つ又は２つ以上とともに含むＦＴＩ併用治療に特定の患者が応答する確率が高いか否かを、高い信頼性でかつ迅速に予測することを可能とする。好ましいＦＴＩ併用治療は、チピファルニブをエトポシドとともに含む。更に本開示は、多くの可能な治療法の中でも最も有効な治療法を選択し、より効果的な治療法に切り換える必要を満たすものである。多くの原因、合併症、及び治療法を有するＡＭＬを治療する目的の１つは、特に患者が高齢である場合に、患者の特定の治療法の有効性をタイムリーかつ正確に予測することである。開示される、ＦＴＩ併用治療に対して生じ得る応答の個別の予測は、潜在的に応答を示さない患者に代替的な治療法を提供する一方で、応答を示す確率の高い患者をＦＴＩ併用治療により治療することを可能とするものである。

好ましい治療法は、従来の細胞毒性療法の候補とならないＡＭＬを有する高齢者におけるものを含む骨髄性悪性疾患においてＡＭＬ及びＭＤＳの実証された完全回復率が最大で１５％である、経口投与可能な非ペプチド模倣性ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤であるチピファルニブを含む。チピファルニブは、高リスク型の骨髄異形成、並びに、原発性骨髄線維症及びイマチニブ耐性慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患においても有効である。この奏功率における大幅な改善は、チピファルニブに対して応答を示さない確率が極めて高い患者にチピファルニブを投与することを回避するうえで望ましい。

骨髄性疾患と診断された患者がＦＴＩ併用治療の候補となるか否かを同定するための方法は、第１の治療成績を有する第１のアッセイを投与することを含む。この治療成績、又はこの治療成績の逆数が所定の閾値未満である場合、患者は、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される薬剤との組み合わせの投与をそれぞれ必要とする第１の治療群による効果が得られる確率が低いものとしてフラグ付けされる。患者がフラグ付けされない場合、患者に投与するための治療が治療群から選択される。

妥当な範囲でできるだけ大きな群に対して有効な治療が否定されることを避けるためには、所定の閾値の選択は、治療群から選択される治療の効果について高い陰性予測値が存在する場合に患者がフラグ付けされるようなものであることが好ましい。したがって、高い陰性予測値によれば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と別の薬剤との組み合わせによる治療による効果が得られる確率が最も低い患者をフラグ付けすることが求められ、効果的である。注意すべき点として、患者のフラグ付けは、患者が治療による効果を得る確率が高いことを判定するという正の行為であってもよく、あるいは患者が治療による効果を得ないことを判定するという負の行為であってもよい。したがって、フラグ付けは、群を同定すること又は更には群を規定することとしても理解されるべきである。

また、治療による効果が得られる確率を高めるためには、所定の閾値の選択は、治療群から選択される治療による効果について高い陽性予測値が存在する場合に患者がフラグ付けされるようなものとすることもできる。これは、互いに区別することが可能な多くの競合する治療がある場合に一般的に好ましい。

更に、治療群から選択される治療による効果が得られる確率が高いと同定された患者についても、治療は、その治療の相対的な陽性予測値に基づいて、好ましくはその群の他の治療に対する陽性予測値に基づいて選択される。好ましい一実施形態では、骨髄性疾患は急性骨髄性白血病である。

別の態様では、開示される方法を用いて、過去の治療に対する患者の応答の低下が検出されることに応じて、患者を異なる今後の治療に切り換えるべきか否かを同定することもできる。異なる治療には緩和治療が含まれうる。また、異なる治療は、ＦＴＩと、エトポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムなどの薬剤との異なる組み合わせを含んでもよい。

ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と別の薬剤との組み合わせによる治療の陽性予測値は、治療に対して陽性応答を示すことが予想される患者の割合に基づいて決定され、ここで陽性応答とは完全寛解を含み、その際、更に、完全寛解とは、５％未満の骨髄芽球が存在し、いずれの細胞系統も正常に成熟していること、ＡＮＣが少なくとも１０００／μＬであり、血小板数が少なくとも１００，０００／μＬであること、末梢血中に芽球が存在しないこと、骨髄中に同定可能な白血病細胞が存在しないこと、疾患に関連した細胞遺伝学的異常が認められないこと、及び以前に存在していたあらゆる髄外疾患が認められないことによって定義される。

更に、好ましい一実施形態では、陽性応答には更に部分寛解が含まれ、ここで部分寛解とは、ＡＮＣ及び血小板の、上記に述べたレベルまでの回復をともなうが、骨髄芽球は５～２５％である、骨髄中に三血球系造血の存在、及び骨髄芽球の比率のベースラインから少なくとも５０％の減少により定義される。更に、別の好ましい実施形態では、陽性応答には更に血液学的改善が含まれる。血液学的改善とは、骨髄芽球の少なくとも５０％の減少若しくは任意の測定可能な髄外疾患の減少、ＡＮＣの５００～１０００／μＬへの回復、血小板数の２０，０００～１００，０００／μＬへの回復、又は輸血の必要性における改善によって定義される。

開示される方法の好ましい一実施形態では、ＲＡＳＧＰＲ１及びＡＰＴＸ遺伝子の発現レベルをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて推定する。このＰＣＲ反応は、参照ＰＣＲ反応とともに１個のチューブ内で行うことができる。このような増幅反応用の試料は、（ｉ）骨髄試料、及び／又は（ｉｉ）血液試料の１つ又は２つ以上とすることができる。ＲＡＳＧＰＲ１及びＡＰＴＸの２つのマーカーの発現レベルの比は、外部正規化コントロールを用いて推定することができる。好ましい一実施形態では、ＲＡＳＧＲＰ１について、ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＴＴＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＣＧＡＡＧＴＡＡＣＣＡＡＣＴＧＴＴＧＣＡＡＧ（配列番号１）、及びＡＰＴＸについて、ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＧＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＴＧＴＧＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴ（配列番号２）からなるアンプリコンの増幅を、
（ｉ）５’－ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’（配列番号３）（ＡＰＴＸ上流プライマー）
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ－３（配列番号４）（ＡＰＴＸ下流プライマー）、
（ｉｉｉ）５’－ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ－３’（配列番号５）（ＲＡＳＧＰＲ１上流プライマー）、及び
（ｉｖ）５’－ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧ－３’（配列番号６）（ＲＡＳＧＰＲ１下流プライマー）からなる群から選択されるプライマーペアを用いて行う。

Ｒ１１５７７７、ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸなどのＦＴＩに対する臨床的に有意な応答を予測するうえでの２遺伝子の発現比（ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ）の効果及び実用性は、以前に治療が行われていない低リスク型の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する高齢者からの骨髄を、網羅的遺伝子発現及び／又は特定の遺伝子の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いてＮ－ＲＡＳ変異について調べることによって同定されている。マイクロアレイプロファイリングによって、２遺伝子発現比（ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ）は、チピファルニブに対する応答を予測するうえで最も高い精度をもたらすものとして同定されている。この分類試験によって、再発性又は不応性のＡＭＬを有する患者におけるチピファルニブに対する応答が予測されており、陰性予測値及び陽性予測値はそれぞれ９２％及び２８％であった（オッズ比＝４．４）。したがって、新たに診断されたＡＭＬ及び再発性又は不応性のＡＭＬの両者において、この分類試験により、高いＮＰＶを維持しながら全体の奏功率が約５０％高められ、患者の全体の生存率が大幅に向上する。このような２遺伝子分類試験はｑＰＣＲの助けによって行うことができるが、ｑＰＣＲを用いた場合、ある研究では、それぞれ８１％及び５０％の陰性予測値（ＮＰＶ）及び陽性予測値（ＰＰＶ）が観察されている（オッズ比＝４．３）。このデータは、単純な２遺伝子発現アッセイを用いて、チピファルニブ（Ｒ１１５７７７）に応答する確率が高いＡＭＬ患者を同定することができることを示している。更に、このような２遺伝子アッセイは、新たに診断された患者においてばかりではなく、再発性又は不応性のＡＭＬを有する患者においても、例えば誘導療法の後、また、維持療法を行う目的で用いることができる。

例示的な一実施形態では、末梢全血試料を採取する工程と、試料からＲＮＡを単離する工程と、上記に述べたプライマーを用いて、上記に述べたアンプリコンを増幅する工程と、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ又は別の外因性コントロール（ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸ ＲＮＡ化学種を含む参照群）において、上記に述べたアンプリコンを同じ反応のセットで増幅する工程と、各反応についてＣ_ｔ値を測定する工程と、Ｃｔが４０サイクルよりも高い試料又は反応を棄却する、より好ましくはＣｔが３７サイクルよりも高い試料又は反応を棄却する、更により好ましくはＣｔが３５サイクルよりも高い試料又は反応を棄却する、最も好ましくはＣｔが３０サイクルよりも高い試料又は反応を棄却する工程と、によって迅速に２遺伝子比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸを求める。次に、ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ比を次に述べるようにして計算する。
ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ比＝２＾－（（Ａ－Ｂ）－（Ｃ－Ｄ））
式中、Ａ：試料のＲａｓＧＲＰ１のＣｔ値
Ｂ：ＪＹ（又はＵｎｉｖｅｒｓａｌ）ＲＮＡ（＋）のＲａｓＧＲＰ１のＣｔ値
Ｃ：試料のＡＰＴＸのＣｔ値
Ｄ：ＪＹ（又はＵｎｉｖｅｒｓａｌ）ＲＮＡ（＋）ＡＰＴＸのＣｔ値。

アッセイによって得られた結果を応答と比較する。アッセイの性能を推定するには、曲線下面積（ＡＵＣ）値を、例えばＭｅｄＣａｌｃソフトウェアパッケージを用いた受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析に基づいて好ましくは計算する。

好ましい本方法では、比が所定の閾値を上回る場合には、患者は高確率応答患者として分類される。そうでない場合には、患者は非応答患者である。所定の閾値は、所望のアッセイ性能、又は感度若しくは特異度又は感度及び特異度の最大和などの別の性能基準に対応したＡＵＣによって好ましくは定義される。したがって、特定の閾値は使用される参照ＲＮＡ（Ｙ若しくはＵｎｉｖｅｒｓａｌ又は別のＲＮＡセット）によって異なり得るが、本明細書において望ましい、患者の層別化における閾値の性能は、同等な患者の層別化を行いながらＲＴＰＣＲアッセイにおいて異なる参照ＲＮＡ及び他の実験条件の使用を可能とするものである。

本開示は閾値の選択を可能とするものであり、ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現レベルの比をこの閾値と比較することによって、ファルネシル阻害剤と、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択されるか又はこれらの群から選択される要素の誘導体である別の薬剤との組み合わせによる治療に対する応答患者が同定される。好ましい例示的な実施形態において、閾値の選択は、血液試料を処理してＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現レベルの比を得ることを含む。閾値は、治療の陽性予測値、応答患者を同定する陰性予測値、ＲＯＣ分析におけるＡＵＣ、感度及び特異度からなる群からの測定値の１つ又は２つ以上のものを高めるように選択される。好ましい一実施形態では、ＲＡＳＧＲＰ１又はＡＰＴＸの発現レベルはＲＴ－ＰＣＲを用いて測定されるが、対象となる遺伝子の発現を測定する他の方法で代用することもできる。

Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ（ストラタジーン社（STRATAGENE）（商標）より販売）の代わりに、別の外因性コントロールＲＮＡを一般性を失うことなく使用することができる点に留意されたい。しかしながら、ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ比の所定の閾値は調整を必要とする場合もある。所定の閾値は、ＡＵＣを一定に保つために、ＲＯＣ分析を用いて評価することができる。例えば、参照としてＪＹ ＲＮＡ（ＪＹ細胞系統より得たもの）を用いることにより、５．２の閾値が求められている。より幅広く利用されている標準化されたＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡに切り換えることにより、閾値が７．３に調整され、ＡＵＣが一定となった。このような閾値の差は、参照ＲＮＡ中のＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの異なる相対量を反映したものである。他の試薬も、閾値の計算において更に差を生じうる。

更に、閾値は、感度又は特異度の必要条件がある場合、それに基づいて調整することもできる。したがって、推定される非応答患者が代替的な療法の候補である場合には、最大多数の患者においてＡＭＬが治療される全体の確率を高めるために、いずれかの治療法に適した患者の数が最大となるような閾値を選択することが推奨される。この点に関して、比較的高い寛解率で誘導療法を行うことが可能な若年患者の能力を考慮すると、こうした若年患者をＦＴＩ単独、又は別の薬剤との組み合わせによる治療について評価する場合には、誘導療法が適用されない高齢患者を評価するために用いられる閾値とは異なる閾値を用いることができる。こうした閾値は、高い特異度を反映するように選択することによって、チピファルニブのようなＦＴＩによる治療に応答する確率が極めて高い患者を同定することができる。また、誘導療法とＦＴＩとの組み合わせは、相乗的ではないことが知られているが、患者に効果的な治療をタイムリーに提供するものである（ＡＭＬの治療ではタイムリー性が重要な因子である）。これにより、患者に可能な治療が行われないということがなくなる。

場合により、例示的な一実施形態では、ＨＭＢＳからのＲＮＡを更に増幅及び検出することで、ＨＭＢＳ ＲＮＡの値が異常に低い場合に試料が疑わしいものとしてフラグ付けされるように、試料の完全性が調べられる。ＨＭＢＳ ＲＮＡの場合の好ましいアンプリコンは、ＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴ（配列番号７）であり、以下のプライマー：ＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＴＣＣＴ（配列番号８）（ＨＭＢＳ上流プライマー）及びＡＴＣＡＴＧＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＧＣＴ（配列番号９）（ＨＭＢＳ下流プライマー）を用いて増幅される。

アンプリコンの検出は、好ましくは以下のプローブを用いて行われる。
ＦＡＭ－ＣＡＴＴＣＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＧＡＡＡＣＣＴＧ－ＢＨＱ１，ＲＡＳＧＰＲ１，Ｔａｑｍａｎプローブ（配列番号１０）、
Ｇｏｌｄ ５４０－ＣＡＣＧＣＣＡＴＴＣＣＧＡＧＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣ－ＢＨＱ２，ＡＰＴＸ，ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１１）、及び
Ｃｙ５－ＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＣＡ－ＢＨＱ１，ＨＭＢＳ，ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１２）。直ちに認識されるように、プローブは、配列の選択においてのみでなく、それらに用いられる特定のタグに関しても一般性をほとんど失わずに異なり得る。

本開示はまた、２遺伝子の比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸが、標準化された試薬を用いて１個のチューブ内で行われるｑＰＣＲによって迅速にアッセイすることが可能であることを実証するものである。このアッセイは、高齢患者を含む、新たに診断されたＡＭＬ患者、及び再発性又は不応性のＡＭＬ患者の中から高確率応答患者を同定するうえで予測的な実用性を有するものである。更に、このアッセイでは、末梢血試料を得るのに必要とされる手技よりもはるかに侵襲性の高い手技を必要とする、従来の骨髄試料の代わりに末梢血試料を使用することができる。

このような２遺伝子の比は、骨髄性疾患と診断された患者にチピファルニブを処方するための方法において有用である。このような方法の１つでは、ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現の評価は、骨髄又は血液などの試料において、
（ｉ）５’－ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ－３’、
（ｉｉｉ）５’－ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ－３’、及び
（ｉｖ）５’－ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧ－３’からなる群からの少なくとも１つのプライマーを用いて標的リボ核酸からのシグナルを増幅することにより行われる。

次いでＲＡＳＧＲＰ１遺伝子の発現レベルを、ＡＰＴＸ、β－アクチン及びＨＭＢＳの発現レベルからなる群の１つ又は２つ以上に対して、好ましくは１個のチューブ内で多重フォーマットで推定する。ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を決定する。患者におけるこの比が、好ましくは約５．１又は約５．２である閾値よりも大きい場合、患者にチピファルニブを処方する。好ましい一実施形態では、チピファルニブは、チピファルニブと相乗作用を示す別の薬剤とともに処方される。このような薬剤は、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される要素の１つ又はその誘導体であってよい。最も好ましい投与は、チピファルニブとエトポシドとによるものである。

本発明はまた、チピファルニブとエトポシドを骨髄性疾患と診断された患者に投与するための方法を促進する。上記と同様、ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現比が約５．１又は約５．２の閾値を上回るか否かを最初に判定する。比がこの閾値を上回る場合には、チピファルニブを投与する。これら及び他の詳細を下記に以下の図面の助けにより説明するが、これらの図面の多く並びに本明細書の各部分は本明細書に援用するところの米国特許第７，９３２，０３６号に基づき、当該特許と共有されるものである。

ＡＭＬにおけるチピファルニブに対する応答の予測指標としてのＲＡＳＧＲＰ１遺伝子の性能を示す。新たに診断されたＡＭＬにおいてＲＡＳＧＲＰ１遺伝子分類指標を用いた確度（Ａ）及びカプラン・マイヤー生存曲線（Ｂ）。 ＡＭＬにおけるチピファルニブに対する応答の予測指標としてのＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸの遺伝子ペアの性能を示す。２遺伝子分類指標により層別化した新たに診断されたＡＭＬ患者（Ａ）及び再発性／不応性ＡＭＬ患者（Ｃ）の全生存期間を、カプラン・マイヤー分析を用いてプロットしてある。新たに診断されたＡＭＬ（Ｂ）及び再発性／不応性ＡＭＬ（Ｄ）の確度が示されている。 ｑＰＣＲを用いたＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ遺伝子分類指標の性能を示す。（Ａ）２０人の応答患者及び１０人の進行疾患状態の患者における正規化されたＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ Ｃｔ値。マイクロアレイで使用した２０人分の独立した試料及び１０人分の訓練試料を別々に示してある。横棒は、群の平均を示す。（Ｂ）３０人の患者すべてについて新たに診断されたＡＭＬにおけるＲＡＳＧＲＰ１遺伝子分類指標の確度を、患者を層別化するために用いたカットオフ０を用いて示したものである。（Ｃ）層別化した患者のそれぞれの全生存期間を、カプラン・マイヤー分析を用いてプロットしたもの。 再発性及び不応性ＡＭＬにおけるチピファルニブに対する応答の予測指標としてのＲＡＳＧＲＰ１遺伝子の性能を示す。再発性／不応性ＡＭＬにおいてＲＡＳＧＲＰ１遺伝子を用いた確度（Ａ）及びカプラン・マイヤー生存曲線（Ｂ）。 ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ遺伝子発現比により層別化したＦＴＩ以外の治療を受けたＡＭＬ患者の全生存期間を示す。ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの両方について３つのｃＤＮＡプローブが、利用可能なデータセットに存在する。最初に各遺伝子について平均値を計算し、次いでこれらの値のＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ比を計算した。比が１を上回った患者は進行患者として分類し、比が１を下回った患者は応答患者として分類した。次いで、カプラン・マイヤー分析を行った。 ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘとｑＰＣＲデータの相関を示す。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ及びｑＰＣＲの両方によって分析した９個のＲＮＡ試料を、線形回帰分析によって比較した。Ｙ軸は、ｑＰＣＲ値を、ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸの比に対応した正規化ΔＣｔとしてプロットするために用いられている。厳密に言えば、この値は比ではなく、比に対応した正規化されたΔＣｔであるが、これらの用語は互換可能に使用されている。その結果、ＲＡＳＧＲＰ１のレベルが高くなるにしたがって、これに対応するＣｔ値は低くなり、他はすべて同じであるのでΔＣｔ値は小さくなる。Ｘ軸は、同じ試料についてアレイデータから得られた対応するＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ比の値を表しており、この値は、比が大きくなるに従って大きくなる。その結果、正規化されたΔＣｔとアレイから得られたＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ比との相関を示す直線の傾きは負となっている。 １個のチューブ内におけるＲａｓＧＲＰ１、ＡＰＴＸ及びＨＭＢＳ ＲＮＡの３重フォーマットでの増幅を示したものであり、求められる近接した一致性、低い変動性、及び高い再現性を示している。 最適な比のカットオフ５．２を用いて層別化した患者のカプラン・マイヤー分析を用いた、高齢のＡＭＬにおけるチピファルニブ＋エトポシド試験の第２相試験における改良されたｑＰＣＲアッセイの精度を示す。 応答基準として用いられた完全寛解（ＣＲ）患者群による全体の応答を予測するための２遺伝子比の差別値を８０％（ＡＵＣ＝０．８０）として示したＲＯＣ分析を示したもの。 ＦＴＩにより治療されない患者では、２遺伝子比と臨床応答又は全生存期間との間に相関が見られないことを示している。ａｒａ－Ｃ、アントラサイクリン、及び第３の薬剤（フラボピリドール又はエトポシド）による集中的な誘導化学療法により治療された４１人のＡＭＬ患者の全体生存率であり、２遺伝子比が高いか低いかで層別化を行っている。 好ましい試料採取プロトコールを比較及び決定するためのワークフローを示す。 ２遺伝子アッセイの結果に対する試料採取プロトコールの影響を示す。図１２Ｂは、試料採取プロトコールの影響を示す、各患者についてのばらつきを特に示している。Ｙ軸は、この場合はＪＹ ＲＮＡである検量／参照ＲＮＡ中のＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸに対する試料中のＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸの比を示す。すなわち、Ｙ軸上の値は、ΔΔＣｔ法によって得られる各比の比である。好ましいアッセイにおいて用いられる閾値は、ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸのレベルを定量化するためのΔΔＣｔ法を用いた、望ましい患者の層別化に基づいた閾値。 ２遺伝子アッセイの結果に対する試料採取プロトコールの影響を示す。図１２Ｂは、試料採取プロトコールの影響を示す、各患者についてのばらつきを特に示している。Ｙ軸は、この場合はＪＹ ＲＮＡである検量／参照ＲＮＡ中のＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸに対する試料中のＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸの比を示す。すなわち、Ｙ軸上の値は、ΔΔＣｔ法によって得られる各比の比である。好ましいアッセイにおいて用いられる閾値は、ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸのレベルを定量化するためのΔΔＣｔ法を用いた、望ましい患者の層別化に基づいた閾値。 最適な比のカットオフ５．２を用いて層別化した患者のカプラン・マイヤー分析を用いた、高齢のＡＭＬにおけるチピファルニブ＋エトポシド試験の第２相試験における改良されたｑＰＣＲアッセイの精度を示す。 応答基準として用いられた完全寛解（ＣＲ）患者群による全体の応答を予測するための２遺伝子比の差別値を８０％（ＡＵＣ＝０．８０）として示したＲＯＣ分析を示したもの。 ＦＴＩにより治療されない患者では、２遺伝子比と臨床応答又は全生存期間との間に相関が見られないことを示している。ａｒａ－Ｃ、アントラサイクリン、及び第３の薬剤（フラボピリドール又はエトポシド）による集中的な誘導化学療法により治療された４１人のＡＭＬ患者の全体生存率であり、２遺伝子比が高いか低いかで層別化を行っている。

本明細書において言及する治療薬剤にはＦＴＩが含まれる。ＦＴＩは様々な形態を取りうるが、癌及び増殖性疾患に関連するタンパク質のファルネシル化を阻害又は低減させる基本的な阻害機能を共有している。好ましくはＦＴＩは、ＡＭＬなどの白血病の治療に適用されるものである。

多くのＦＴＩが本開示の範囲に含まれるが、米国特許第５，９７６，８５１号、同第５，９７２，９８４号、同第５，９７２，９６６号、同第５，９６８，９６５号、同第５，９６８，９５２号、同第６，１８７，７８６号、同第６，１６９，０９６号、同第６，０３７，３５０号、同第６，１７７，４３２号、同第５，９６５，５７８号、同第５，９６５，５３９号、同第５，９５８，９３９号、同第５，９３９，５５７号、同第５，９３６，０９７号、同第５，８９１，８８９号、同第５，８８９，０５３号、同第５，８８０，１４０号、同第５，８７２，１３５号、同第５，８６９，６８２号、同第５，８６１，５２９号、同第５，８５９，０１５号、同第５，８５６，４３９号、同第５，８５６，３２６号、同第５，８５２，０１０号、同第５，８４３，９４１号、同第５，８０７，８５２号、同第５，７８０，４９２号、同第５，７７３，４５５号、同第５，７６７，２７４号、同第５，７５６，５２８号、同第５，７５０，５６７号、同第５，７２１，２３６号、同第５，７００，８０６号、同第５，６６１，１６１号、同第５，６０２，０９８号、同第５，５８５，３５９号、同第５，５７８，６２９号、同第５，５３４，５３７号、同第５，５３２，３５９号、同第５，５２３，４３０号、同第５，５０４，２１２号、同第５，４９１，１６４号、同第５，４２０，２４５号、同第５，２３８，９２２号、及び米国特許出願公開第２００３００５０３２３号に述べられるものが挙げられる。非ペプチド性のいわゆる「小分子」治療薬が好ましい。より好ましいＦＴＩは、キノリン、又は
７－（３－クロロフェニル）－９－［（４－クロロフェニル）－１Ｈ－イミダゾル－１－ｙｌメチル］－２，３－ジヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ベンゾ［ｉｊ］キノリジン－５－オン、
７－（３－クロロフェニル）－９－［（４－クロロフェニル）－１Ｈ－イミダゾル－１－ｙｌメチル］－１，２－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［３，２，１－ｉｊ］キノリン－４－オン、
８－［アミノ（４－クロロフェニル）（１－メチル－１Ｈ－イミダゾル－５－ｙｌ），メチル］－６－（３－クロロフェニル）－１，２－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［３，２，１－ｉｊ］キノリン－４－オン、及び
８－［アミノ（４－クロロフェニル）（１－メチル－１Ｈ－イミダゾル－５－ｙｌ）メチル］－６－（３－クロロフェニル）－２，３－ジヒドロ－１Ｈ，５Ｈ－ベンゾ［ｉｊ］キノリジン－５－オンなどのキノリン誘導体である。最も好ましいＦＴＩは、（Ｂ）－６－［アミノ（４－クロロフェニル）（１－メチル－１Ｈ－イミダゾル－５－ｙｌ）メチル］－４－（３－クロロフェニル）－１－メチル－２（１Ｈ）－キノリノン）である。

治療の効果の理解を助け、異なる治療同士を比較するために治療に対する応答を分類することが望ましい。各治療を評価するための多くの基準が存在する。例えば、ある実施形態では好中球数が１，０００であれば応答を同定するうえで充分であり、他の実施形態では１，４００又は１，５００の好中球が必要とされる場合もある。同様に、血小板数は１００，０００～１４０，０００の間で異なりうる。更に、１つの細胞系統における一定の割合（％）の改善が必要とされる場合もあり、あるいは他の評価では、２つの細胞系統における改善、又は更には３つの細胞系統のすべてにおける改善が必要とされる場合もある。こうした変化が求められる時間の長さは、１ヶ月又は２ヶ月更にはそれ以上の範囲であり得る。好ましい一実施形態では、ＦＴＩに応答する患者は、ＦＴＩによる治療後に、骨髄において少なくとも芽球細胞の５０％よりも大きな減少が見られる患者である。通常、部分的な応答に必要とされる改善度は変動しやすい傾向があり、血液学的改善によって表される改善は、異なる研究者及び／又は医師による評価間で極めて変動しやすい。ＦＴＩの投与に対する応答を評価するための代替的な同様の基準は、そうでない旨が明示されていないかぎりは、治療に対する応答の予測に関する「特許請求の範囲」の範囲に含まれるものとする。

好ましい一実施形態では、治療に対する陽性応答は、完全寛解（ＣＲ）、部分寛解（ＰＲ）、及び血液学的改善（ＨＩ）の比率を含む。残りの疾患記述子としては進行疾患状態（ＰＤ）があり、残りの非応答患者は安定疾患状態（ＳＤ）を呈しているとみなされる。陽性応答患者の各分類について次に述べる。

完全寛解（ＣＲ）は、骨髄芽球が５％未満でいずれの細胞系統も正常に成熟しており、ＡＮＣが少なくとも１０００／μＬかつ血小板数が１００，０００μＬであり、末梢血中に芽球が存在せず、骨髄中に同定可能な白血病細胞が存在せず、疾患に関連した細胞遺伝学的異常が認められず、及び以前に存在していたあらゆる髄外疾患が認められない骨髄によって特徴付けられる。ＣＲは、最初の判定の４～６週間後に確認されなければならない。可能な場合には、少なくとも１回の骨髄生検を行ってＣＲを確認するべきである。ＣＲでは、骨髄の所見は正常であり、芽球は５％未満、正常な成熟を示し、異形成は認められないことが予想される。末梢血では、１平方ミリメートル当たり、ヘモグロビンは１１グラムよりも多く、好中球は１，５００個以上、血小板は１００，０００個以上であり、芽球は認められず、異形成も認められない。更に、ＡＭＬが治癒したとみなされるためには、理想的にはＣＲの患者における再発のリスクが一般集団におけるＡＭＬのリスクと同じでなければならない。

部分寛解（ＰＲ）は、ＡＮＣ及び血小板が上記に述べたレベルまでの回復をともなうが、骨髄芽球が５～２５％である、骨髄中の三血球系造血の存在、及び骨髄芽球の比率のベースラインから少なくとも５０％の減少によって好ましくは同定される。ＰＲは、最初の判定の４～６週間後に確認されなければならない。

血液学的改善（ＨＩ）とは、骨髄芽球の少なくとも５０％の減少若しくは任意の測定可能な髄外疾患の減少、ＡＮＣの５００～１０００μＬへの回復、血小板数の２０，０００～１００，０００μＬへの回復、又は輸血の必要性における改善によって好ましくは特徴付けられる。

安定疾患状態（ＳＤ）は、ＣＲ、ＰＲ、ＨＩ、又はＰＲの基準を満たさない治療に対する任意の応答によって同定される。

進行疾患状態（ＰＤ）は、以下のいずれかによって特徴付けられる。
・最良の評価からの骨髄芽球の比率（％）の５０％よりも大きな増加、
・循環中の芽球の５０％よりも大きな増加、
・循環中の芽球の新たな出現（少なくとも２回連続して）、
・髄外疾患の発症、
・骨髄芽球の比率（％）の５０％よりも大きな増加を疾患の進行の基準として用いることができないくらいに高い初期の骨髄芽球の比率（％）を示す患者においては、疾患の進行の基準としては、末梢血の基準、循環中の芽球の新たな出現（少なくとも２回連続して）、及び／又は髄外疾患の発症を用いるべきである。

応答の長さは、ＣＲ又はＰＲについて測定基準が満たされた時点から（いずれか最初に記録された方）再発性又は進行性疾患が客観的に判定される最初の日までとすることが好ましい。ＣＲの長さは、ＣＲについて最初に測定基準が満たされた時点から再発性疾患が客観的に判定される最初の日までである。

安定疾患状態の長さは、安定疾患状態を有する患者において、治療の開始から進行状態の基準が満たされるまでである。

無増悪生存期間（「ＰＦＳ」）は、治験への組み入れと、再発性又は進行性疾患が客観的に判定された最初の日又はあらゆる原因による死亡との間の時間を表す。全生存期間は、この治験への組み入れ時から死亡時までである。

ゲノム内にタンパク質又はペプチドを発現する能力を有する核酸配列（「遺伝子」）が存在するというだけで、タンパク質又はペプチドが特定の細胞で発現されるか否かを決定することはできない。タンパク質又はペプチドを発現することが可能な特定の遺伝子がタンパク質又は遺伝子を発現するか否か、及びそのような発現が生じるとすればどのような程度で生じるかは、様々な複雑な因子によって決定される。これらの因子を理解及び評価することは困難であるにも関わらず、遺伝子発現をアッセイすることによって、薬剤又は他の治療薬の導入などの所定の刺激に対する細胞応答について有用な情報を得ることができる。遺伝子の活性度又は不活性度の相対的な目安は、遺伝子発現プロファイルに見ることができる。遺伝子発現プロファイルを用いることにより、特定の療法による効果が得られる確率が高い患者を同定及び治療するか、又は、患者が薬剤又は療法に対する有益な応答をほとんどあるいはまったく示さない確率が高い場合に、その患者をその療法から除外することができる。

遺伝子発現プロファイルを確立するための好ましい方法（関連のある生物学的経路に到達するために用いられるものを含む）は、タンパク質又はペプチドをコードし得る生成されたＲＮＡの量を決定することを含む。これは、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合的ＲＴ－ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ、ディファレンシャルディスプレイＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、及び他の関連した試験によって行うことができる。個々のＰＣＲ反応を用いてこれらの方法を行うことが可能であるが、ｍＲＮＡより調製されるコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）又はコピーＲＮＡ（ｃＲＮＡ）を増幅することが最適である。遺伝子発現を決定するためのいくつかの方法を、米国特許第６，２７１，００２号、同第６，２１８，１２２号、同第６，２１８，１１４号、及び同第６，００４，７５５に見ることができる。

好ましい一方法では、患者がＦＴＩ治療薬の使用に対して応答する確率が高いか否かを判定するために、２遺伝子の比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸを計算する。遺伝子発現の値に対して用いられる「比」又は「２遺伝子の比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ」なる用語は、本開示においては文脈より直ちに明らかとなる一定範囲の技術的解釈を有する。基本的レベルにおいて、形態は異なり得るもののその意味は同じである。例えば、ｑＰＣＲ技術を用いる場合、対象となる２遺伝子の比に相当するΔＣ_ｔ値は、当業者には周知のように容易に得られる。この値は、例えば、その遺伝子について平均のＣ_ｔ値を引き、その遺伝子についてＣ_ｔ値の標準偏差によって割ることによって、各遺伝子の発現レベルについて正規化したＣ_ｔ値を用いることによって得ることができる。このような２遺伝子の正規化されたＣ_ｔ値の間の差であるΔＣ_ｔ値は、遺伝子の発現の比と、この比が大きくなるに従ってΔＣ_ｔ値が小さくなる（及びその逆）という点で対応している。このような正規化されたΔＣ_ｔ値の例が、ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸについて図６のＹ軸上に示されている。このようなΔＣ_ｔ値、更には正規化されたΔＣ_ｔ値を、本開示では２遺伝子比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸと呼ぶ場合がある。１つの例が図３Ａに示されており、Ｙ軸上にΔＣ_ｔ値に関して閾値０が示され、応答患者は閾値の下となっている。この閾値０は、２遺伝子の比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸを図６のＸ軸に沿ってプロットされたデータのようなアレイデータとして表した場合に閾値１と一致する。図６は、比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸを決定する１つの方法から別の方法への移行が容易に可能であることを示しているのに過ぎない。また、この比は、異なる試料を基準検量用／参照ＲＮＡと比較するΔΔＣ_ｔ値に基づいた正の数として表すこともできる。閾値は試験環境下で患者を層別化するその性能によって主として定義されるため、閾値は実験条件に基づいて変化し得るものであり、また実際に変化することから、このような共通の検量用試料の使用によりアッセイの携帯性及び信頼性がより高くなる。ＲＴＰＣＲを使用する好ましい一実施形態では、本開示の他の箇所で説明するΔΔＣ_ｔ値に基づく正の値として表される２遺伝子比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸは、チピファルニブに対する応答患者をチピファルニブに対する非応答患者から層別化するため５．２の値となる。ΔΔＣ_ｔ値に基づく正の値として表されるＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸの２遺伝子比の値の例が図１２ＢのＹ軸上にプロットされており、やはり２遺伝子比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸと呼ばれているが、文脈よりどの解釈が用いられるべきかは明らかであろう。厳密に言えば、ΔΔＣ_ｔ値の１つ又は２つ以上に基づいた値として、アレイデータに関してはΔＣ_ｔ値及び単にΔΔＣ_ｔ値として表される閾値、すなわち２遺伝子比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸは、比較可能ではあるが、こうしたマッピングを助ける更なる情報がない場合には、それら自体は直ちに相互変換可能ではない場合があることは当業者であれば認識されるであろう。本明細書における「特許請求の範囲」及び説明は、このような考慮点を踏まえたうえで読まれるべきである。２遺伝子比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸは説明を分かりやすくするため、２遺伝子のΔΔＣ_ｔ比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ若しくは２遺伝子のΔＣ_ｔ比ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ、又はΔΔＣ_ｔ閾値又はΔＣ_ｔ閾値として示されるが、このような説明が与えられていない場合には、文脈によって正しい解釈が直ちに与えられる。

応答患者を非応答患者から区別するための閾値が確立されたなら、下記に述べるようにして２遺伝子比をコンピュータ読み取り可能な媒体などの媒体中に保存する。異常細胞（ＡＭＬの場合では造血芽球細胞など）を含む患者試料を得る。好ましい一実施形態では、次に異常な患者細胞から試料ＲＮＡを得て増幅し、更にＰＣＲによって増幅し、外部正規化コントロールの助けにより２遺伝子比を計算する。次いで、好ましい一実施形態では、２遺伝子比が所定の閾値よりも大きい場合、その患者を高確率応答患者として同定し、そうではない場合には非応答患者として同定する。

同様にして、２遺伝子比を用いて、治療の経過全体を通じて異なる時間においてＦＴＩを含む治療に対する応答を監視することができる。２遺伝子比が応答患者に適応している場合、患者の治療は継続される。２遺伝子比が適応していない場合には、患者の治療は変更される。このような分析は、検出可能な臨床的指標に先立って、又は不明瞭な臨床的指標に際して、介入及び療法の調整を行うことを可能とするものである。

好ましい実施形態は、コンピュータ読み取り可能な媒体（磁気、光学など）などの自動的に読み取り可能な媒体に縮小された、疾患を治療、診断、予知、ステージ分類、及び他の方法で評価するうえで有用な遺伝子発現プロファイルの表現を含み得る。好ましい実施形態は、こうした媒体中の遺伝子発現プロファイルを評価するための命令を更に含み得る。例えば、好ましい実施形態は、上記に述べた遺伝子のポートフォリオの遺伝子発現プロファイルを比較するためのコンピュータ命令を有するＣＤ ＲＯＭを含み得る。好ましい実施形態は更に、デジタル記録された遺伝子発現プロファイルを有してもよく、これらを患者試料からの遺伝子発現データと比較することができる。また、これらのプロファイルは、異なる表現フォーマットで記録されてもよい。そのようなフォーマットの１つとしてグラフィック記録がある。上記に述べた「ＯＭＮＩＶＩＺ」及び「ＴＲＥＥ ＶＩＥＷ」コンピュータプログラムに組み込まれたものなどのアルゴリズムをクラスター化することにより、こうしたデータの可視化を最も効果的に助けることができる。

薬剤の生物学的作用は、１つ又は２つ以上のＲＮＡ種の転写又は分解の速度、１つ又は２つ以上のポリペプチドの翻訳又は翻訳後プロセシングの速度若しくは程度、１つ又は２つ以上のタンパク質の分解の速度又は程度、１つ又は２つ以上のタンパク質の作用又は活性の阻害若しくは刺激などにおける薬剤による変化の結果として生じ得る。好ましいＦＩＴ以外に、好ましい薬剤としては、ＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路、ＴＧＦ－β、ＷＮＴ又はアポトーシス経路を調節するものが含まれる。これらの薬剤には、これらに限定されるものではないが、チロシンキナーゼ阻害剤、ＭＥＫキナーゼ阻害剤、Ｐ１３Ｋキナーゼ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、アポトーシス調節物質、及びこれらの組み合わせが含まれる。これらの中でも最も好ましい代表的な薬剤は、ノバルティス社（Novartis）の「ＧＬＥＥＶＥＣ」チロシンキナーゼ阻害剤、Ｕ－０１２６ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＰＤ－０９８０５９ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＳＢ－２０３５８０ＭＡＰキナーゼ阻害剤、並びにアンチセンス、リボザイム、及びＤＮＡザイムＢｃｌ－ＸＬ抗アポトーシス剤である。他の有用な薬剤としての例としては、これらに限定されるものではないが、米国特許第６，３０６，８９７号のカラノライド、米国特許第６，２８４，７６４号の置換二環式化合物、米国特許第６，１３３，３０５号のインドリン、及び米国特許第６，２７１，２１０号のアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。

本明細書に述べられる薬剤を含む薬学的に有用な組成物は、薬学的に許容される担体の混合物によるなどの公知の方法に従って製剤化することができる。このような担体及び製剤化の方法の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見ることができる。有効な投与に適した薬学的に許容される組成物を形成するには、こうした組成物は有効量の薬剤を含有する。薬剤の有効量は、患者の状態、体重、性別及び年齢などの様々な因子によって異なり得る。他の因子としては投与方法がある。医薬組成物は、皮下、局所、経口、及び筋肉内などの様々な経路によって患者に投与することができる。

本明細書に述べられる薬剤には、薬剤のベース分子の化学的誘導体が含まれる。すなわち、薬剤は、通常はベース分子の一部ではない付加的な化学部分を有し得る。こうした部分は、ベース分子の溶解度、半減期、吸収性などを高め得る。また、これらの部分は、ベース分子の望ましくない副作用を低減させるか、又はベース分子の毒性を低下させることができる。このような部分の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓなどの様々な文献に述べられている。

本明細書に開示される方法に従って同定される化合物は、あらゆる潜在的毒性を最小に抑える一方で最適な阻害又は活性を得るため、定期試験によって規定される適当な用量で単独で使用することができる。更に、他の薬剤の同時投与又は連続投与が望ましい場合もある。

本明細書に述べられる薬剤は、従来の投与用の賦形剤中で広範な治療用剤形で投与することができる。例えば、薬剤は、錠剤、カプセル剤（それぞれ持続放出性、及び徐放性製剤を含む）、丸剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ、溶液、懸濁液、シロップ剤及びエマルションなどの経口投与剤形として、又は注射により投与することができる。同様に、薬剤は、いずれも製薬業界の当業者には周知の形態を用いた、静脈内（ボーラス及び点滴の両方）、腹腔内、皮下、被覆を用いる又は用いない局所投与、又は筋肉内形態として投与することもできる。望ましい化合物の有効であるが無毒性の量を、調節剤として使用することができる。

有効成分が別々の投与製剤中に含まれる２種以上の有効成分を含む併用治療では、各有効成分を同時に投与してもよく、又は各有効成分を別々に時間差で投与してもよい。

本明細書に述べられる化合物又は調節物質を用いる投与計画は、患者のタイプ、人種、年齢、体重、性別、及び医学的状態、治療すべき状態の重症度、投与経路、患者の腎及び肝機能、並びに使用される特定の薬剤を含む様々な因子に基づいて選択される。通常の技能を有する医師又は獣医師であれば、状態の進行を予防、阻止、又は抑制するのに必要な薬剤の有効量を容易に決定及び処方することが可能である。毒性をともなわずに効果が得られる範囲内の薬剤の濃度を実現するうえでの最適な精度は、標的部位に対する薬剤のアベイラビリティーの動態に基づいた投与計画を必要とする。その際、薬剤の分布、平衡、及び排出が考慮される。

本明細書において述べられる薬剤は有効成分を構成し、意図される投与の形態、すなわち経口錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、シロップ剤などに関して適宜選択された、従来の製薬上の慣例と適合する適当な製薬上の希釈剤、賦形剤又は担体（これらをまとめて本明細書では「担体」物質と呼ぶ）との混合物として一般的に投与される。

例えば、錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与するためには、有効薬剤成分を、エタノール、グリセロール、水などの毒性のない薬学的に許容される経口不活性担体と加え合わせることができる。更に、望ましい又は必要な場合には、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤及び着色剤を混合物に取り入れてもよい。適当な結合剤としては、これらに限定されるものではないが、デンプン、ゼラチン、グルコース又はβ－ラクトースなどの天然糖、トウモロコシ甘味剤、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、蝋などが挙げられる。これらの剤形に使用される潤滑剤としては、これらに限定されるものではないが、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、これらに限定されるものではないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムなどが挙げられる。

液体の形態では、有効薬剤成分を、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロースなどの合成及び天然ゴムのような適宜風味添加された懸濁剤又は分散剤に加えることができる。使用可能な他の分散剤としてはグリセリンなどが含まれる。非経口投与用には、無菌懸濁液及び溶液が望ましい。静脈内投与が望ましい場合には、適当な保存剤を一般的に含む等張製剤が用いられる。

また、本化合物又は調節物質は、有効成分を不活性の液体担体に溶解した製剤を注射することによって非経口的に投与することもできる。注射は、筋肉内、腔内、気管内、又は皮下のいずれかであってよい。注射可能な製剤は、有効成分を適当な不活性液体担体に混合したものである。許容される液体担体としては、落花生油、綿実油、ゴマ油などの植物油、並びに、ソルケタール、グリセロールホルマールなどの有機溶媒が挙げられる。これらの代わりに、水性の非経口製剤を使用することもできる。植物油は好ましい液体担体である。これらの製剤は、最終的な製剤が０．００５～１０重量％の有効成分を含むように、有効成分を液体担体に溶解又は懸濁することによって調製される。

本明細書におけるすべての引用文献をここに援用するものである。更に、以前に出願されている２００１年１０月３０日出願の米国特許出願第６０／３４０，９３８号、２００１年１０月３０日出願の米国特許出願第６０／３３８，９９７号、２００１年１０月３０日出願の米国特許出願第６０／３４０，０８１号、２００１年１０月３０日の米国特許第６０／３４１，０１２号、２００２年１０月３０日出願の米国特許出願第１０／２８３，９７５号、及び、２００６年１０月３０日出願の米国特許出願第１１／５８９，６６０号を、これらの出願に引用されるすべての参照文献を含め、援用するものである。本開示を以下の非限定的な実施例によって更に説明する。

（実施例１）
材料及び方法
臨床評価
代表的な一実施例では、過去に治療歴のない低リスク型ＡＭＬを有する高齢者においてチピファルニブ（Ｒ１１５７７７、ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（登録商標））によるファルネシルトランスフェラーゼ阻害の有効性及び安全性を調べる非盲検、多施設共同、非比較対照の第２相試験において、骨髄試料を採取した。

試料の採取及び処理
同意を得た患者から、チピファルニブによる治療を行う前に骨髄試料を採取した後、好ましくはその場で単核細胞を処理した。骨髄穿刺液をＰＢＳで希釈し、フィコール－ジアトリゾ酸（１．０７７ｇ／ｍＬ）とともに遠心した。濃縮された白血病血液細胞をＰＢＳで２回洗い、１０％ ＤＭＳＯを含むＦＢＳに再懸濁し、－７０℃～－８０℃で直ちに凍結した。全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌキット（キアゲン社（Qiagen）カリフォルニア州サンタクララ）を使用して細胞試料から抽出した。ＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上でリボソームのバンドの存在を評価することによって調べることができる。良好な品質の試料を更にマイクロアレイ分析用に処理した。製造者の指示（キアゲン社（Qiagen）カリフォルニア州サンタクララ）に従って、Ｔｒｉｚｏｌ処理した骨髄の同じ試料からＤＮＡを単離した。試料を特定の遺伝子の網羅的遺伝子発現、Ｎ－ＲＡＳ変異、及び／又はｑＰＣＲについてアッセイした（図１）。

Ｎ－ＲＡＳ変異の状態
Ｎ－ＲＡＳの突然変異の活性化の分析を、上記に述べたようなＰＣＲ及びＲＦＬＰ分析によって調べた。エンド（End）ら（２００１）。Ｎ－ＲＡＳ遺伝子のエクソン１及び２を１回の多重反応において同時に増幅し、アリコートを２ラウンド目のＰＣＲで使用した。２ラウンド目のアンプリコンの天然の制限酵素部位又はプライマーにより誘導した制限酵素部位における切断に対する耐性は、分析される遺伝子座のその部位を破壊した突然変異の存在を示している。特定の遺伝子座の分析に用いた制限酵素は、Ｂｓｌ Ｉ（Ｎ－ｒａｓコドン１２及び１３）、Ｍｓｃ Ｉ（Ｎ－ｒａｓコドン６１、１番目及び２番目）、並びにＢｆａ Ｉ（Ｎ－ｒａｓコドン６１、３番目）であった。反応物を一晩消化し、ＰＣＲ産物をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した。

マイクロアレイ分析
アフィメトリックス社（Affymetrix）（カリフォルニア州サンタクララ）のプロトコールに従ってｃＤＮＡ及びＲＮＡの合成を行った。多くの試料の収率は低かったため、米国特許出願公開第２００７００４８７８２号に以前に述べられているようにして２ラウンドの線形増幅を行った。ハイブリダイゼーションを行うため、１１μｇのｃＲＮＡを、４０ｍＭのＴｒｉｓ－酢酸（ｐＨ８．１）、１００ｍＭの酢酸カリウム、及び３０ｍＭの酢酸マグネシウム中、９４℃で３５分間インキュベートすることによってランダムにフラグメント化した。フラグメント化されたｃＲＮＡを、６０ｒｐｍに設定したロティサリーオーブン中で、４５℃で１６時間、Ｕ１３３Ａアレイとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、アレイを洗い（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（０．００５％）を含む６×ＳＳＰＥ及び０．５×ＳＳＰＥにより）、ストレプトアビジン－フィコエリスリン（ＳＡＰＥ、モレキュラープローブズ社（Molecular Probes）オレゴン州ユージーン）により染色した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５００Ａ ＧｅｎｅＡｒｒａｙスキャナー（アジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies）カリフォルニア州パロアルト）を使用して、結合した標識プローブの定量化を行った。

各アレイについて全蛍光強度を、均一な値６００にスケーリングした。チップの性能を、信号対雑音比（生の平均信号対雑音比）を計算することによって定量化した。チップの信号対雑音比が２０未満であるか、又はチップ上でのプレゼントコール（present call）が３０％未満である場合に、チップを取り出して更なる分析を行った。遺伝子は、チップの少なくとも１０％に「プレゼント」コールが付いた場合に限り更なる分析に含めた。約１２，０００個のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブセットが、このカットオフ後に残った。遺伝子発現データの品質を、主成分分析に基づいた外れ値を同定し、遺伝子強度の正規分布を分析することによって更に管理した（Ｐａｒｔｅｋ Ｐｒｏ Ｖ５．１）。このマイクロアレイデータは、ＮＣＢｌのＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）に登録されている。

応答の定義
チピファルニブに対する応答は、完全応答（ＣＲ）、部分応答（ＰＲ）、及び血液学的改善（ＨＩ）を有する患者として定義した。簡単に言うと、ＨＩは、５％未満の任意の骨髄芽球数又は骨髄芽球の少なくとも半分の減少として定義した。進行疾患状態（ＰＤ）は、骨髄又は循環芽球の比率（％）の、ベースラインからの５０％よりも大きい増大、又は循環芽球の新たな出現（少なくとも連続して２回）によって定義した。安定疾患状態（ＳＤ）は、ＣＲ、ＰＲ、ＨＩ、又はＰＤの基準を満たさない任意の応答として定義した。

統計分析
受信者操作特性（ＲＯＣ）分析を用いて、個々の遺伝子及び／又は多重遺伝子分類指標の全体の予測値を検定した。以下の遺伝子フィルタリング基準を用いて、応答患者と進行疾患状態の患者との間で発現に差が見られる遺伝子を同定した。すなわち、感度１００％で「応答患者」を同定する特異度≧４０％、Ｔ検定のｐ値（不等分散によりｌｏｇ２変換したデータ）＜０．０５、倍率変化（fold change）＞２。これらの基準をパスした遺伝比をＡＵＣ（ＲＯＣ曲線下面積）によってランク付けした。

分類指標を確立するため、応答スコアを用いて各患者がチピファルニブ療法に応答する確率を計算した。このスコアは、重み付けした発現シグナルと重みとしてのｔ統計量との線形の組み合わせとして定義した。閾値は、感度１００％及び最も高い特異度が得られるように訓練事例のＲＯＣ曲線から求めた。予測指標に含める必要のある遺伝子の数を求めるため、１つ抜き交差検証法（leave-one-out cross validation）（ＬＯＯＣＶ）を行った。異なる数の遺伝子に基づく「取り残された（left-out）」試料の応答スコアを記録した。異なる数の遺伝子を含む予測指標の性能を、誤分類誤差率、感度、特異度、２つの予測群のカプラン・マイヤー曲線の分離を測定したｐ値に基づいて評価した。この結果に応じて、最も優れた予測指標を選択した。

トップスコアペア（ＴＳＰ）アルゴリズムは、ゲマン（Geman）ら（２００４）により最初に導入された。基本的には、このアルゴリズムは、クラスＣ１～Ｃ２間の試料において遺伝子ｉが遺伝子ｊよりも高い発現の値を有する事象の頻度の絶対差（Ｄｉｊ）に基づいて、すべての遺伝子のペア（遺伝子ｉ及びｊ）をランク付けするものである。複数のトップスコアペア（すべてが同じＤｉｊを共有する）が存在する場合には、１つのペアの遺伝子内で一方のクラスから他方のクラスへと遺伝子の発現レベルの逆転が生じる度合いを測定する、二次的ランクスコアによる最上位のペアを選択する。全試料中、２倍を超える絶対Ｄｉｊの頻度が最も高い最上位のペアを、候補ペアとして選択する。次いで、候補ペアを独立した検定データセットにおいて評価した。

１つ抜き交差検証法（ＬＯＯＣＶ）を訓練データセットにおいて行って、アルゴリズムがどのように動作するかを評価した。この予測指標の性能を、最大の誤分類誤差率に基づいて評価した。統計的分析はすべて、Ｒ（アール・ディベロップメント・コア・チーム（（R Development Core Team）２００６年）を用いて行った。

リアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲ
各試料について１μｇの全ＲＮＡ（ＯＤ_２６０により評価したもの）を、製造者の指示に従ってＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）カリフォルニア州フォスターシティー）を使用して逆転写した。次いで試料を２５℃で１０分間、更に３７℃で３０分間インキュベートして、ＲＮＡの転換率を最適化した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ配列検出システム（アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）カリフォルニア州フォスターシティー）を使用してＱＰＣＲを行い、すべての試料について３重で行った。各反応液は、ＵＮＧを含む５μＬのＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）カリフォルニア州フォスターシティー）、４．５μＬのｃＤＮＡテンプレート、及び０．５μＬの２０×Ａｓｓａｙ ｏｎ Ｄｅｍａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｍｉｘ、又は９ｐｍｏｌの順方向及び逆方向プライマーの両方、及び２．５ｐｍｏｌのプローブ（アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）カリフォルニア州フォスターシティー）を、全反応体積１０μＬ中に含んでいた。すべてのプライマー、プローブセットは、小さいアンプリコンのサイズ（１００ヌクレオチド未満）のために選択されたものであり、ＦＡＭ蛍光性プローブを使用した。使用したプライマー及びプローブは、ＡＰＴＸ（製品番号４３３１１８２、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems））及びＲＡＳＧＲＰ１（製品番号４３５１３７２、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems））である。ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ発現比は、試料セットから平均Ｃｔを引き、標準偏差で割ることにより生のＣｔ値を正規化し、更に各遺伝子の正規化されたＣｔ値の差（ＡＰＴＸ－ＲＡＳＧＲＰ１）を計算することによって計算した。

結果
本研究では、過去に治療歴のない低リスク型の急性骨髄性白血病を有する高齢患者における、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤チピファルニブの第２相臨床試験に組み入れられた患者からの白血病骨髄試料の遺伝子発現プロファイルを調べた。ランセット（Lancet）ら（２００６）６７人の患者からチピファルニブによる治療を行う前に骨髄を採取し、白血病骨髄細胞をフィコール密度遠心分離によって濃縮した（表１）。１３人の応答患者（９人のＣＲ、４人のＨＩ）、８人の安定疾患状態、及び１３人の進行性疾患状態の患者から得た良好な品質の全ＲＮＡを、増幅、標識して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３Ａ ＧｅｎｅＣｈｉｐにハイブリダイズした。全部で３０個の試料をｑＰＣＲにより特異的遺伝子の検証について評価し、３２個の試料をＮ－ＲＡＳ変異状態について評価した。

ＣＲ＝完全応答、ＰＲ＝部分応答、ＨＩ＝血液学的改善、ＳＤ＝安定疾患状態、ＰＤ＝進行疾患状態、ＮＥ＝評価不能、ＰＧｘ＝薬理ゲノミクス

Ｒａｓ変異状態及び患者治療成績
３２人のＡＭＬ患者の骨髄からのＤＮＡを、Ｎ－ＲＡＳ活性化変異（コドン１２、１３、６１）についてスクリーニングした。患者の３４％（１１／３２）がＮ－Ｒａｓ変異を示し、１人の患者が複数のコドンに変異を有していた（表２）。Ｎ－ＲＡＳ変異状態と、チピファルニブに対する応答又は全生存期間との間に統計的に有意な相関は認められなかった。

ＮＤ＝未定、ＷＴ＝野生型、ＣＲ＝完全応答、ＰＲ＝部分応答、ＨＩ＝血液学的改善、ＳＤ＝安定疾患状態、ＰＤ＝進行疾患状態、ＯＳ＝全生存期間。

新たに診断されたＡＭＬコホートからの予測的遺伝子の同定
次の目的は、新たに診断されたＡＭＬ集団においてチピファルニブに対する応答を予測する遺伝子を同定することである。そのため、１３人の応答患者（９人のＣＲ及び４人のＨＩ）及び進行疾患状態の１３人の患者において発見実験を行った。安定疾患状態の患者は、応答患者とも非応答患者とも明確に定義することができないことから、この分析では用いなかった。本発明者らは、再発性及び不応性ＡＭＬに対するマーカーを同定するために用いられたもの（米国特許出願公開第２００７００４８７８２号）と同じアプローチを用いて、応答を予測する４５個のプローブセット（３８個の固有の遺伝子に対応する）を同定した（表３）。この選択基準は、特異度のカットオフ値が４０％であり、平均遺伝子発現差が少なくとも２倍となる高い感度（１００％に近づく）で応答患者を予測する遺伝子を同定することを狙ったものである。これらの遺伝子を、訓練セットの受信者操作特性（ＲＯＣ）分析から定義される曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいてランク付けした。この値は、完全な分類を表示するＡＵＣが１．０の遺伝子の全体的予測値を表す。各遺伝子を、ＬＯＯＣＶ法を用いて訓練セットで最初に検定した。最上位の遺伝子であるＲＡＳグアニル放出タンパク質１（ＲＡＳＧＲＰ１）は、ＡＵＣ ０．９５を示した。

Ｓｐｅｃ＝特異度、ＦＣ＝倍率変化（fold change）、ＡＵＣ＝受信者操作特性分析の曲線下面積。負のｔ統計値は、遺伝子が応答患者において発現低下していることを示す。

分類指標における遺伝子の数を増やすことによってその予測値が改善されるか否かを更に調べた。ＬＯＯＣＶ法を用い、次いで感度、特異度、及び各分類指標の全体の誤差率をプロットしたところ、最上位遺伝子は単独で最良の予測値をもたらすことが判明した（データは示さず）。分類指標に遺伝子を直線的に追加しても、その予測値は改善されなかった。高い感度にバイアスしたカットオフ値を使用することで、ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子の発現が、ＮＰＶ ８８．９％及びＰＰＶ ７０．６％で、全体の予測精度７６．９％を可能とすることがＬＯＯＣＶによって示された（図１Ａ）。更に、カプラン・マイヤー分析により、応答患者の全生存期間の中央値（３８６日）と、進行疾患状態の患者の全生存期間の中央値（６８日）との間に有意差が示された（図１Ｂ）。したがって、この１個の遺伝子の過剰発現によって、新たに診断されたＡＭＬにおいてチピファルニブに対する応答が高い陰性予測値で予測された。

最上位スコアペア分類指標の同定
ＲＡＳＧＲＰ１の予測値は、直線的な手法により分類指標に更なる遺伝子を追加した場合に改善されなかった。代替的な遺伝子選択アルゴリズムを用いて、ＲＡＳＧＲＰ１単独の予測値を高めると思われる遺伝子を選択した。そのため、最上位スコアペア（ＴＳＰ）アルゴリズムを用いて、最大の予測精度をもたらす最良の遺伝子のペアを同定した。ゲマン（Geman）ら（２００４）。この手法は、２遺伝子間の発現の最大の差を利用するために用いられ、ｑＰＣＲに基づく診断アッセイの開発を目的とした場合に有用であり得る。訓練セットからのＴＳＰは、ＲＡＳＧＲＰ１及びアプラタキシン（ＡＰＴＸ）とした。ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸは、応答患者においてそれぞれ過剰発現及び発現低下した。ロバストなＬＯＯＣＶにより、この最上位スコアペア（ＴＳＰ）によって試料の訓練セットにおいて８５．７％のＮＰＶ及び９１．７％のＰＰＶが得られ、全体誤差率はわずか８％であることが示された（図２Ａ）。予測される応答患者と非応答患者との間の全体生存期間の差は、３５７日であった（図２Ｂ）。これらのデータは、このモデル構築アルゴリズムはこれにともなう予測誤差率が低いことを示している。

再発性又は不応性ＡＭＬの独立セットにおけるＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ分類指標の検証
５４人の再発性／不応性ＡＭＬ患者からの試料からなる独立したマイクロアレイデータセットにおいて、ＴＳＰ分類指標の外部検証を行った。癌治療に対する応答が高確率であることを予測する診断アッセイは、できるかぎり多くの潜在的応答患者を拾うことが重要であることから、高い感度（及び陰性予測値）を有するものでなければならない。したがって、ＴＳＰ分類指標を試験するための適当なカットオフを定義するうえで、特異度を許容可能なレベルに維持しながら、応答患者を予測する高い感度を得る必要性を考慮した。訓練セットでは、実現可能な特異度のレベルは、感度が１００％～８０％に設定されている場合にそれぞれ約３０％～１００％の範囲であった。分類指標ができるだけ多くの応答患者を予測するようにするため、訓練セットにおいて約６０％の特異度を与えた控えめなカットオフを検定した。このカットオフを再発性／不応性ＡＭＬの独立した試験セットに適用したところ、ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ遺伝子分類指標により、応答患者は９２％ＮＰＶ及び２７．６％ＰＰＶで層別化された（１８．５％有病率に対し）（図３Ｃ）。応答患者であることにともなうオッズ比は４．３８であった。これは、ＲＡＳＧＲＰ１単独の予測精度と同様の値であるが、ＴＳＰ分類指標を適用することにより、より良好なＮＰＶが得られ、また、予測される応答患者と進行患者との全生存期間の差は９８日であり（図３Ａ）、ＲＡＳＧＲＰ１の場合のわずか５６日（図４）と比較して改善が示された。

ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ発現比のｑＰＣＲによる検証
２遺伝子発現比は、より臨床的に関連のあるｑＰＣＲ検出システムの使用を可能とするものである。３０人分の試料（２０人のＰＤ、６人のＣＲ、３人のＨＩ、及び１人のＰＲ）より、ｑＰＣＲを行ううえで充分な全ＲＮＡを得た。したがって、新たに診断されたＡＭＬの臨床試験からのこれら３０人分の試料（１０人の応答患者、２０人の進行疾患状態）においてＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲを使用して、ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ遺伝子発現比を、チピファルニブに対する応答の予測指標として評価した。これらの試料のうちの９個はマイクロアレイプラットフォーム上でアッセイを行ったが、２１個は低品質のＲＮＡのために発見セット（discovery set）において用いなかった。したがって、この試験セットの２／３は、完全に独立した試料からなるものであった。

９個の試料の評価により、２つのプラットフォーム間でＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ発現比の良好な相関（ｒ＝０．７４）があることが示された（図６）。カットポイント０を用いることにより、２遺伝子分類指標によって３０人の患者のうちの２０人において、ＰＰＶ及びＮＰＶがそれぞれ５０％及び８１％で治療成績が正しく予測された（図３Ｂ）。予測された抵抗性患者の全生存期間の中央値が８２日であったのに対して、応答患者として分類された患者では中央値は２９５日であった（図３Ｃ）。

ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ分類指標は、ＦＴＩ治療と独立した予後の有用性は有さない
２遺伝子発現比を、化学療法レジメンによる治療を受けた１１６人のＡＭＬ患者の独立したマイクロアレイデータセットにおいて検定した。ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ分類指標を、チピファルニブ治療群の場合と同様のカットオフを用いてこの患者群に適用したところ、全生存期間に有意な乖離は認められなかった（図５）。他の様々なカットオフを用いた場合にも、有意な生存期間の差は認められなかった（表４）。このことは、ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ分類指標がチピファルニブによる治療を受けた患者を特異的に層別化するものであり、非ＦＴＩとは関係がないことを示すものである。これに対して、この予後特性サインを本研究の再発性及び不応性ＡＭＬ患者の群に適用した場合、全生存期間に関して明確な層別化が見られた。

ＯＳ＝全生存期間

（実施例２）
本実施例では、２遺伝子アッセイをＦＴＩ併用療法に適用するのに適した改良されたＲＴ－ＰＣＲアッセイについて述べる。分析アッセイの開発に際して、ＲＡＳＧＲＰ１（ＲＡＳを活性化するグアニンヌクレオチド交換因子）、ＡＰＴＸ（ＤＮＡの除去修復に関与しているアプラタキシン）、及びＨＭＢＳ（内因性コントロールとして使用する）の３つのマーカーについてＴａｑｍａｎアッセイを設計した。ＨＭＢＳは一実施形態においてコントロールとして使用することができるか、又は他の実施形態では省略してもよい。Ｔａｑｍａｎプライマープローブセット及びそれらのアンプリコンの配列を上記の「課題を解決するための手段」の項、及び本開示の配列表に示す。すなわち、ＡＰＴＸについては配列番号３～４及び２、ＲＡＳＧＲＰ１プライマープローブセットについては配列番号５６及び１、及びＨＭＢＳについては配列番号７～９である。

定量的ＲＴ－ＰＣＲアッセイは、ＡＢＩ－７５００プラットフォームを使用して開発及び最適化することによって、ＦＡＭ標識ＲＡＳＧＲＰ１、Ｇｏｌｄ５４０－ＡＰＴＸ 及びＣｙ５－ＨＭＢＳにより１チューブ３重フォーマットで２遺伝子比性能を評価した。ＪＹ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡ及びＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ（ストラタジーン社（Stratagene））を外部正規化として使用した。
ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸ比＝２＾－（（Ａ－Ｂ）－（Ｃ－Ｄ））
式中、Ａ：試料のＲＡＳＧＲＰ１のＣｔ値
Ｂ：ＪＹ（又はＵｎｉｖｅｒｓａｌ）ＲＮＡ（＋）のＲａｓＧＲＰ１のＣｔ値
Ｃ：試料のＡＰＴＸのＣｔ値
Ｄ：ＪＹ（又はＵｎｉｖｅｒｓａｌ）ＲＮＡ（＋）ＡＰＴＸのＣｔ値

アッセイのパラメータ、特に閾値が、外部正規化に用いられる特定の細胞ＲＮＡについて再計算されるのであれば、他の細胞ＲＮＡの供給源で代用することもできる。外部正規化に使用される参照ＲＮＡは、好ましくは規定の条件下で増殖させた、ＦＴＩに対して比較的応答性のない細胞系統に由来するものであることが好ましい。理論によって束縛されずに言えば、適当な参照ＲＮＡは、ＦＴＩに対するその応答性において中性である細胞系に由来するものでよい。このような参照細胞系統は、２遺伝子アッセイに基づいて閾値領域で治験を行っているが、実際にはＦＴＩ治療に対して応答しない患者から開発することができる。したがって、理論によって束縛されずに言えば、このような患者は、２遺伝子比検定用の改良された参照ＲＮＡを開発するための有望な供給源である。細胞系統を開発及び評価するための１つの可能な方法は、２遺伝子アッセイにおいて外因性コントロールとして使用された場合に閾値が高くなる傾向がある細胞系統を選択することであり得る。この基準は、このような細胞系統では測定される２遺伝子比の減衰（２遺伝子応答と測定される応答との可能な相関による）が最小であることから妥当なものである。また、外因性コントロールは、絶対的定量化を可能とするＡＰＴＸとＲＡＳＧＲＰ１ ＲＮＡとの所定の組み合わせを用いて、あるいは応答患者と非応答患者との識別力を最大とするＡＵＣを用いて選択することもできる。外因性コントロールの選択は、２遺伝子アッセイで用いられる閾値の変動性の唯一の原因ではない。

２つのＲＴ－ＰＣＲフォーマットを開発し、標準曲線分析を用いてそれらの性能を評価した。これらのフォーマットは、３つのマーカーの両方の生のＣ_ｔ値を用いることで高いピアソン相関を有する性能において同等なものであることが示され、これらから２遺伝子比の値を導出した（Ｒ２＝１－０．９３、Ｐ＜０．０００、表５）。

ＲＵＯフォーマットは、インビトロジェン社（INVITROGEN）（登録商標）によって流通される市販のＲＮＡ－ｔｏ－Ｃｔ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（カタログ番号４３９２９３８）を使用している。このフォーマットは、製造者の使用説明書によれば５０ｎｇの全ＲＮＡインプットを含む２０μＬの反応体積を有する。

ＧＭＰフォーマットは、ＶＥＲＩＤＥＸ（登録商標）ＢＬＮ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔの構成品（ＧｅｎｅＳｅａｒｃｈ（登録商標）Ｂｒｅａｓｔ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ（ＢＬＮ）Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ、ＩＶＤ、カタログ番号２９００００４）と、ＲＴ－ＰＣＲマスターミックスの調製に用いられるＧｅｎｅＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＢＬＮ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、ＩＶＤ、Ｐ／Ｎ７７０００４０及びＢＬＮ Ｂａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｐ／Ｎ７７０００３１に基づいたものである。ＧＭＰフォーマットは、以下に述べる最適化されたＲＴ工程を用いた５０ｎｇのＲＮＡインプットを含む２５μＬの反応液を有する。

ＧＭＰフォーマットでのＲＴ－ＰＣＲ多重化プロトコール
５０ｎｇの全ＲＮＡを３重ｑＲＴ－ＰＣＲにおいて標的インプットとして使用し、これを２５μＬの反応液中、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７５００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍで行った。ＲＮＡ試料（正規化コントロールＲＮＡを含む）を氷上で解凍し、１０ｎｇ／μＬにまで希釈した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＶＥＲＩＤＥＸ（登録商標）ＢＬＮ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＧｅｎｅＳｅａｒｃｈ（登録商標）Ｂｒｅａｓｔ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ（ＢＬＮ）Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ、ＩＶＤ、カタログ番号２９００００４）：ＧｅｎｅＳｅａｒｃｈ（登録商標）ＢＬＮ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ、ＩＶＤ、Ｐ／Ｎ ７７０００４０及びＢＬＮ Ｂａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｐ／Ｎ ７７０００３１からの試薬を使用して行った。

表６にまとめたように、４００ｎＭの配列番号１及び２のそれぞれ、及び２００ｎＭのＦＡＭ標識ＲａｓＧＲＰ１（配列番号１０）と、４００ｎＭの配列番号３及び４、及び２００ｎＭのＧｏｌｄ ５４０－ＡＰＴＸ（配列番号１１）と、４００ｎＭの配列番号８及び９、及び２００ｎＭのＣｙ５－ＨＭＢＳ（配列番号１２）とを含む２５Ｘプローブプライマーマスターミックスを調製した。

各反応液は、９μＬのＢＬＮ Ｂａｓｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、１０μＬの２．５Ｘ ＢＬＮ Ｅｎｚｙｍｅミックス及び１μＬの２５Ｘプライマー／プローブミックスからなるものであった。プライマー／プローブミックスは、最終濃度４００ｎＭの順方向及び逆方向プライマーと、２００ｎＭの各マーカーに対する蛍光プローブとを含んでいた。患者試料からの５μＬの全ＲＮＡ又は正規化コントロール（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ又はＪＹ ＲＮＡ）を、２０μＬのＲＴ－ＰＣマスターミックスに加えた。

外部正規化コントロールとして使用したＪＹ ｃｅｌｌｕｌａｒ ＲＮＡに基づいて、閾値／カットオフを５．２と決定した。

ｑＲＴ－ＰＣＲアッセイを以下のサイクルパラメータを用いて行った。すなわち、変性工程を９５℃で１分間、５８℃で３０分間（逆転写反応）、７０℃まで５％の昇温勾配及び２分間のインキュベーションの後、９５℃で１５秒間（変性）及び６０℃で１分間（アニーリング／伸長）を４０サイクル。１チューブ多重型装置でのＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲフォーマットのプローブ／プライマー濃度のこのような最適化によって、骨髄及び末梢血試料の両方から、０．６ｎｇのレベルでＣｔ値約３１（すなわち、Ｃｔの変動性が低く、再現性が高い範囲）でロバストかつ感度のＲＮＡターゲットの検出が実現された（図３）。この反応フォーマットは、Ｔｔｈ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（酵素ミックス）及びＢａｓｅマスターミックスなどのＦＤＡに承認されたＢＬＮキット用に配合及び製造されたＧＭＰグレードの試薬に基づいたものであり、この試験の商業化に適している。Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘに基づいたプロトコールの詳細の一部を表７に示す。

データ分析
１．組み入れ基準
ＡＢＩ７５００データアウトプットファイルから得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値をデータ分析に使用した。各マーカーについて「試験せず」のＣ_ｔカットオフを以下のように選択した。
ＨＭＢＳ（内因性コントロールマーカー）：Ｃｔは３０以下、
ＲＡＳＧＲＰ１ Ｃ_ｔ：３５以下、
ＡＰＴＸ Ｃ_ｔ：３５以下。

試料の２つのマーカー、ＲＡＳＧＲＰ１又はＡＰＴＸのいずれか一方がＣ_ｔカットオフレベルを上回った場合、その試料は「試験せず」（データ分析から除外される）とされる。表８に示される結果は、傾きの値及びＰＣＲ効率を比較した場合のＲＴ－ＰＣＲ装置の１重フォーマットと３重（１チューブ）フォーマットとの等価性を示している。表９は、逆転写反応工程を３０分間に延長することによる更なる改善を示している。

ＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲフォーマットを使用し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ（アジレント（AGILENT）（商標））及びＪＹ ＲＮＡコントロール（実験室内培養した細胞系統）を、第２相Ｔ＋Ｅ試験からの３７人の患者試料とともにＲＴ－ＰＣＲで用いた。この分析をこの後、４０人の患者試料で繰り返した。生のＣ_ｔを正規化するためにＪＹ又はＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡコントロールを用い、閾値を調整した場合にアッセイ性能が等価であることを示すため、ＲＯＣ曲線分析の結果に基づく両方の分析を表１０に示す。

外因性コントロールとしてＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡを使用することにより、外因性コントロールとしてＪＹ ＲＮＡを使用した場合の閾値５．２に対して閾値７．３を得た。これらの閾値を決定するうえで、計算においてＣＲを応答基準としてみなし、他のすべての応答の種類は非応答としてみなした。

２遺伝子アッセイにおける閾値は無次元量（ＲＡＳＧＲＰ１とＡＰＴＸとの比である）であるが、理論に束縛されずに言えば、閾値の値は基準条件及び使用される試薬によって決まり得る。したがって、ＲＯＣ曲線に基づく基準のような、性能に基づいた基準に対して閾値を設定することが好ましい。このため、外因性コントロールが変わってもＡＵＣ値が一定に保たれるといった、他の必要条件を満たすように閾値／カットオフを調整することができる。この場合、外因性コントロールとしてＪＹ ＲＮＡの代わりにＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡを使用すると、閾値／カットオフは７．３と高くなったが、ＡＵＣは変化しなかった。

（実施例３）
本実施例では、２遺伝子アッセイが新たに診断されたＡＭＬ患者において有効であることを示す。２遺伝子応答予測アッセイを、チピファルニブ及びエトポシドの第１相投与試験に組み込まれた８４人の新たに診断されたＡＭＬ患者のサブセットから得た白血病芽球で、Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１１：２５８９に述べられる技術的ＲＴ－ＰＣＲプロトコールを用いて最初に試験した。第１相試験の臨床計画は、Ｂｌｏｏｄ ２００９，１１３：４８４１に述べられている。

簡単に述べると、この試験で得られた５１人の未発表の評価可能な患者試料を、２遺伝子アッセイの性能の予備評価において分析した。表１１は、閾値５を用いた結果をまとめたものであり、ＲＲは応答患者がＣＲ又はＰＲを示す奏功率を意味し、ＰＰＶは陽性予測値を意味し、ＮＰＶは陰性予測値を意味する。５１人の患者のうち１３人が応答を示したため、ＲＲは約０．２５であった。２遺伝子アッセイの閾値が５を上回った患者のうち、半数（１８人中９人）が応答を示したため、ＰＰＶは約０．５であった。閾値を超えなかった患者３３人のうち２９人は応答を示さなかったため、ＮＰＶは０．０８８となった。

ＲＵＯとＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲフォーマットとの比較
ＲＵＯ及び最適化ＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲフォーマットを用い、臨床応答について評価可能な新たに診断されたＡＭＬ患者３３人からの骨髄試料から遺伝子発現プロファイルを分析した。ＲＵＯ ＲＴ－ＰＣＲデータセットからの１人の患者試料（ＨＩ）が分析組み入れ基準を満たさなかったため、両方のデータセットから除外した。最も良好な応答による患者の内訳を表１２に示す。

後の対応する期日において、これら３３人の患者を再び分析したところ、７人の完全寛解（ＣＲ）、４人のＨＩ、３人のＰＲ、７人のＰＤ及び１１人のＳＤの症例を有することが示された（表１３）。応答基準としてＣＲを用いた場合には、７人の患者が応答患者として、２５人が非応答患者として分類されたのに対して、ＣＲ／ＰＲ／ＨＩを応答基準として用いた場合では、１２人の患者が応答患者として、２０人が非応答患者として分類された。

応答患者をＣＲ、ＰＲ又はＨＩを示す患者として、「正常」（応答患者（Ｒ））な試験結果を「異常」（非応答患者（ＮＲ））な試験結果から分離するうえで可能なカットオフ値を評価するために、予備的統計分析を行った。両方のＲＴ－ＰＣＲフォーマットのＲＯＣ曲線分析によって、２遺伝子比のＡＵＣ値が７１％と同等の、ほぼ同等のアッセイ性能が示された（表１４）。ＪＹ ＲＮＡを正規化コントロールとして用いた場合、ＲＯＣ曲線分析アルゴリズムに基づいて、ＲＵＯプロトコールではカットオフとして４．７、ＧＭＰでは５．２が求められた。理論に束縛されずに言えば、使用されるフォーマットに基づく閾値及び他のパラメータの差は、ＲＴ－ＰＣＲ法の特異性又は効率及び統計的変動に一部よるものと考えられる。

表１２及び１３に示されるデータの場合、応答患者を完全寛解（ＣＲ）を示す患者のみとしてみなした後日の分析（ＰＲ及びＨＩの患者は非応答患者の群に含めた）によって表１５の結果が得られたが、これより、ＲＯＣ曲線分析アルゴリズムに基づいてＲＵＯプロトコールについては５．１の閾値、ＧＭＰフォーマットについては５．２が求められた。

ＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲデータセットについてカットオフ値として５．２を用いた場合、ＪＹ ＲＮＡを用いた全体の奏功率（ＣＲ又はＰＲ又はＨＩを示す患者における）は３８％（ＯＲＲ）～８６％（ＰＰＶ）へと高くなり、陰性予測値は７６％であった（表１６）。これは、２遺伝子アッセイによって応答患者として分類された患者の８６％が実際に応答を示したということであり、一定の改善である。この成績は、若年患者における誘導療法で期待される７０％の奏功率に匹敵する。これは、ＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲフォーマットアッセイにおいて５．２よりも大きい２遺伝子比の値を示した患者の８６％（７人の患者のうちの６人）が、チピファルニブとエトポシドとの組み合わせによる治療に応答を示したということである（８６％のＰＰＶに相当する）。これに対して、２遺伝子比の値が５．２以下であった患者の２４％（２５人の患者のうちの６人）が、チピファルニブとエトポシドとの組み合わせによる治療に応答を示したが、２遺伝子試験によっては検出されなかった。外因性コントロールが変わってもＡＵＣ値が一定に保たれるといった、他の必要条件を満たすように閾値／カットオフを調整することもできる点に注意されたい。この場合、外因性コントロールとしてＪＹ ＲＮＡの代わりにＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡを使用すると、閾値／カットオフは約８へと高くなった（約５から）。

応答患者を、完全回復を示す患者のみとしてみなした後日の分析では表１７の結果が得られ、同等の特異度で高いＮＰＶ及びより高い感度を示している。

ハザード比（ＨＲ）を２．３としたカプラン・マイヤー曲線分析により、高齢の新たに診断されたＡＭＬ患者におけるチピファルニブとエトポシドとの組み合わせに対する応答患者と非応答患者との間の応答を予測するうえでの２遺伝子比アッセイの実用性を支持する好ましい傾向が示された（図８及び１３－両者は応答患者の同定に用いた定義において異なる）。アッセイ性能特性の等価性に基づき、コンパニオン診断アッセイとしてＧＭＰフォーマットの更なる開発の可能性を追求した。

更なるＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲフォーマットの試験
更なる改良の後、ＧＭＰフォーマットの１チューブ多重型ＲＴ－ＰＣＲアッセイを、３３人分の骨髄試料の既存のセットに４人分の評価可能な全血試料を追加することにより、３７人の患者で試験した。骨髄及び全血試料では３つのマーカーについて同等の生のＣｔ値が得られたことから、これらを１つのデータセットに合わせて表１８にまとめる。受信者操作特性（ＲＯＣ）分析により、ＣＲ（９）／全患者（３７）として計算された、全体奏功率（２４％）に一致する応答基準として用いた完全寛解（ＣＲ）患者群における完全寛解率を予測するための２遺伝子比の差別値として８０％（ＡＵＣ＝０．８０）が示された。これを図９及び１４に示す。２遺伝子比カットオフ５．２で、アッセイの感度は６７％、特異度は９３％であった。

表１８に示される応答患者の定義を用い、表１８において用いられた拡張された患者セットについて、アッセイの全体的な性能を表１９に示す。

（実施例４）
本実施例では、上記の実施例と一致して、２遺伝子アッセイがＦＴＩを含む治療に対して特異的であることを示す。別の相乗的な薬剤が存在することで、２遺伝子アッセイが有効性を示すためにＦＴＩに求められる条件が大きく低減されることはない。

２遺伝子アッセイによって同定される、ＡＭＬを罹患した患者の同定可能なサブセットにおいて、ザルネストラのようなＦＴＩを含む併用療法によってこうした患者を効果的に治療することが可能であることは明白であるが、併用療法にＦＩＴが含まれない場合には２遺伝子アッセイは有用でないものと予想された。

２遺伝子アッセイの特異性を実験的に評価するため、ＦＴＩであるザルネストラによる治療を受けていないＡＭＬ患者からの４１人分の試料で２遺伝子アッセイを試験して、応答が２遺伝子アッセイの結果と相関しているか否かを調べた。これらのＡＭＬ患者は、ａｒａ－Ｃ、アントラサイクリン、及びＶＰ１６（ＡｃＤＶＰ１６、ｎ＝２３）及びＦＬＡＭ（ｎ＝１８）からなる従来の化学療法レジメンによる治療を受けていた。図１０は、２遺伝子比と臨床応答又は全生存期間との間に有意な相関が認められなかったことを示している。したがって、これらの結果により、２遺伝子比アッセイが、ＦＴＩによる治療以外の治療を受けるＡＭＬ患者において治療に対する応答を予測しないことが更に確認された。ＲＯＣのＡＵＣは０．５と求められ、ＦＴＩを含まない化学療法レジメンに対する臨床応答を予測するうえで大きな有用性がないことを示している。

更に、患者を、２遺伝子比の中央値（０．９５９）、第１四分位値（０．５６１）、第３四分位値（１．２４８）に対して高い比を有するか低い比を有するかによって分類した場合、全生存期間に利点は認められなかった。以下の生存分析を行った。すなわち、１）全患者、２）ＶＰ１６単独、及び３）ＦＬＡＭ単独。結果（図１０及び１５、全患者）は、中央値の比によって層別化された２群間で、また、治療レジメンによって層別化された２個のサブグループ間で全生存期間（日）に有意差が見られなかったことを示している。これは、第１四分位値及び第３四分位値のカットポイントを用いた場合にも同様であることが示されている（データは示さない）。

（実施例５）
本実施例では、すべての試料採取法が同等ではないことを示す。過剰なＲＮＡ分解、及び試料の採取プロトコールに依存した他の変動要因によって、２遺伝子アッセイは影響され得る。

試料採取プロトコールでは、通常、事前に２遺伝子アッセイを実施する際に骨髄試料を使用する必要がある。これは侵襲性が極めて高いばかりでなく、ＡＭＬの患者にとって苦痛でもある。新たなプロトコールでは、本実施例において述べるように全血の使用が可能である。

アッセイに好ましい試料採取プロトコール（試料タイプ）を同定するため、３つの採取プロトコール（Ｐａｘｇｅｎｅシステムと、ヘパリン及びＥＤＴＡチューブ内に採取する標準的採取プロセスの後にＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ遠心法を行うもの）をそれぞれ用いて２つの試料タイプ（骨髄と全血）間で等価性検定試験を行った。ジョンズホプキンス大学のシドニー・キンメル総合がんセンターより提供を受けた１１人のＡＭＬ患者で試験を行った。

図１１に示されるワークフローに従って、２つの試料タイプのそれぞれに３つの採取法を用いて各患者から約１１ｍＬの血液を採血し、更に８～１０ｍＬの骨髄を吸引した。図１１に示されるような本研究の設計に従って、以下の６つのプロトコールを試験した。

プロトコール１：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｙｓｔｅｍ カタログ番号７６４１１４（プリアナリティクス社（PreAnalytix）（キアゲン社（QIAGEN）とビーディー社（BD）の合弁会社）。体積２ｍＬの骨髄をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗチューブに採取し、冷凍した低温パック上で室温で２４時間以内にＶＲＸ社に発送した。試料の受領後、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｏｗ ＲＮＡ ｋｉｔ（カタログ番号７６４１３３）を使用して直ちにＲＮＡを単離した。

プロトコール２：ナトリウムへパリンチューブ（２ｍＬ試料容量）中に骨髄を採取し、冷凍した低温パック上で室温で２４時間以内にＶＲＸ社に発送した。Ｖｅｒｉｄｅｘにおいて、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅによる密度勾配遠心分離工程後、細胞ペレットを－８０℃で直接凍結し、Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔによるＲＮＡ抽出を行った。

プロトコール３：ＥＤＴＡチューブ（２ｍＬ試料容量）中に骨髄を採取し、冷凍した低温パック上で室温で２４時間以内にＶＲＸ社に発送した。Ｖｅｒｉｄｅｘ（登録商標）において、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｈｙｐａｑｕｅによる密度勾配遠心分離工程後、細胞ペレットを－８０℃で直接凍結し、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔによるＲＮＡ抽出を行った。

プロトコール４：ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２．５ｍＬの血液をＰＡＸｇｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄチューブ（カタログ番号７６２１６５、プリアナリティクス社（PreAnalytix）（キアゲン社（QIAGEN）とビーディー社（BD）の合弁会社）に採取し、冷凍した低温パック上で室温で２４時間以内にＶＲＸ社に発送した。試料の受領後、Ｖｅｒｉｄｅｘ社においてＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ ｋｉｔ（カタログ番号７６２１６４）を使用して直ちにＲＮＡを単離した。

プロトコール５：ナトリウムヘパリンチューブに採取した全血（４ｍＬの血液）を、冷凍した低温パック上で室温で２４時間以内にＶＲＸ社に発送した。Ｖｅｒｉｄｅｘ社において３ｍＬの血液を４ｍＬのＣＰＴチューブに移した後、単核細胞をＦｉｃｏｌｌにより分離し、－８０℃で細胞ペレットの直接凍結を行った。Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔによりＲＮＡ抽出を行った。

プロトコール６：ＥＤＴＡチューブに採取した全血（４ｍＬの血液）を、冷凍した低温パック上で室温で２４時間以内にＶＲＸ社に発送した。Ｖｅｒｉｄｅｘ社において３ｍＬの血液を４ｍＬのＣＰＴチューブに移した後、単核細胞をＦｉｃｏｌｌにより分離し、－８０℃で細胞ペレットの直接凍結を行った。Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｄｉ ｋｉｔによりＲＮＡ抽出を行った。

Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ＱＣによる結果に基づくと、ＰＡＸＧｅｎｅシステムの使用により、１１人の患者すべてにおいて、臨床実験室の状況下で最も一般的に用いられているヘパリン及びＥＤＴＡのプロトコールと比較して、骨髄及び血液試料の両方で高品質のＲＮＡターゲットが得られた。

ＲＮＡの完全性を評価する直接的方法（ＲＮＡ ＱＣ）として、ＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒにかけてＲＩＮ値（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）を計算することがある。キアゲン社（Qiagen）により推奨されるように、ＰＡＸｇｅｎｅシステムを使用する場合、ＲＩＮが７以上（１０まで）のＲＮＡは、高品質なターゲットとみなされる。表１７に更なるデータとして、１１人の患者試料による試料安定性試験におけるＲＩＮ値を示したので、これを参照されたい。黄色でハイライトしたＲＩＮ値は、低品質のＲＮＡ試料を示す（ヘパリン及びＥＤＴＡチューブからのもの）。ＰＡＸｇｅｎｅシステムでは、他の２つのタイプの採取チューブと異なり、試料の収率による評価に基づき高品質のＲＮＡのみが得られた。表２０において、ＮＥは、「評価せず」（not evaluated）を意味し、ＮＡは（データなし）（not available）を意味しており、約２～５のＲＩＮ値は分解したＲＮＡを示し、約５～７のＲＩＮ値は最低限度のＲＮＡを示す。

ＮＥとして示された試料は、試料の調製工程後の試料の収率が不充分であったために分析を行わなかった。

図１２（パネルＡ及びＢ）は、骨髄試料番号３及び６が、ヘパリンチューブにおいて顕著なＲＮＡ分解を示し、この分解により２遺伝子比の値が高くなったことを示している。生のＣｔはＲＩＮ値と逆相関しており、ヘパリン及びＥＤＴＡプロトコールの場合では３つのチャンネルのすべてにおいて、ＲＩＮ値が低いほど高いＣｔが得られている。

図１２Ａ及び１２Ｂに見られるように、２遺伝子アッセイの閾値５を上回った試料はなかった。図１２Ｂに見られるように、採取プロトコールによる測定された２遺伝子比のばらつきには変動がある。患者３及び６は最もばらつきが大きいようであり、ヘパリン及びＰａｘｇｅｎｅ骨髄採取プロトコールは、これらの患者において２つの端となる境界値を規定している。表２０のデータを検討すると、全血採取プロトコールは互いに高い相関を有しているが、骨髄採取プロトコールについて同じことは言えないことが示されている。実際、表２０並びに図１２Ａ及び１２Ｂに基づくと、全血を使用して２遺伝子アッセイが好ましく行われるかは議論の余地がある。一貫性を保証するためには、ＰＡＸｇｅｎｅ ＰＢプロトコールが好ましい。議論によって束縛されずに言えば、ＲＮＡの分解は、全血よりも骨髄試料においてより急速に起こっているために、ＥＤＴＡ（ヘパリン）チューブとＰＡＸｇｅｎｅシステムとの間に示される相関はより低いレベルとなると考えられる。

更に、ヘパリンチューブへの骨髄試料の採取は他の方法と比較して信頼性がより低いと考えられ、改善すべき細かい点は、本明細書に開示される２遺伝子アッセイだけでなくそれ以外のアッセイについての一般的な試料採取の手順である。

骨髄（ＢＭ）及び血液試料（ＰＢ）についてのピアソン相関係数（Ｒ２）及びｐ値を、図１１の６つの採取／処理プロトコールとともに表２１に示す。血液試料の場合、ヘパリン、ＥＤＴＡ、及びＰＡＸＧｅｎｅチューブから得られたＲＮＡ試料の２遺伝子比の間には高い相関が認められる（赤でハイライトした値）。しかしながら、ＰＡＸＧｅｎｅによる骨髄試料と他の採取法との間の相関は低い。この観察結果は、骨髄試料が処理前に２４時間以内の時間、周囲条件下で保存（発送）される際のＲＮＡ鋳型の不安定性に結びつくヘパリンチューブの安定性の欠如と一致する。これらの観察結果は更に、こうした試料において観察されるＲＮＡの完全性及び２遺伝子比の値の信頼性を考慮して、本開示の好ましい採取／処理プロトコールの１つとしてＰＡＸＧｅｎｅ Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄシステムを支持するものである。

（実施例６）
本実施例は、実施例３の一部として上記に述べた患者の一部に基づいたものであり、ＦＴＩ併用療法を実施するうえで２遺伝子アッセイの助けにより毒性と患者の効果的治療とのバランスをとるために、チピファルニブの用量を調節することについて述べる。この後日の分析は、チピファルニブ及びエトポシドのより適当な投与計画を決定するうえで行われたものであり、ＣＲを応答患者としてみなし、残りを非応答患者としてみなすことにより、ＲＵＯ及びＧＭＰ ＲＴ－ＰＣＲに関する上記の分析をやはり改変するものである。この後日の分析の結果は、上記に述べた実施例に示した。

考察
治療応答を予測するための患者集団の層別化は、癌患者の臨床管理におけるその重要性が益々高まっている。例えば、質の高い治療を行ううえで、転移性乳癌におけるトラスツズマブ（ヘルセプチン、ジェネンテック社（Genentech））及び直腸結腸癌におけるセツキシマブ（エルビタックス、メルク社（Merck））などの標的療法の候補となる患者を層別化するためにコンパニオン診断が必要とされる。消化管間質腫瘍におけるイマチニブ（グリベック、ノバルティス社（Novartis））、並びに肺癌におけるエルロチニブ（タルセバ、オー・エス・アイ・ファーマシューティカルズ社（OSI Pharmaceuticals））及びゲフィニチブ（イレッサ、アストラ・ゼネカ社（Astra-Zeneca））では、予測用バイオマーカーが更に利用されている。現在のところ、ＦＴＩを含む併用療法に対する応答を予測する方法は存在していない。

ＲＡＳＧＲＰ１は、ＦＴＩのみによる治療について交差検定された訓練セットにおいて７７％の全体の予測精度を有する最もロバストな単一の予測遺伝子発現マーカーとして同定されている。ＲＡＳＧＲＰ１は、ＲＡＳを特異的に活性化するグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）である。ＲＡＳＧＲＰ１の発現は、脳、Ｔ細胞、単球系統の細胞、及び未分化造血前駆細胞において見出されている。

本開示は、ＦＴＩ併用療法に対する応答のロバストな予測指標としてのＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現の比を提供するものである。この２遺伝子分類指標は、新たに診断されたＡＭＬの発見セット（discovery set）において予測上の実用性を示した。

開示されるｑＰＣＲに基づいた簡単な診断アッセイは、現在のマイクロアレイ技術によってプロファイル分析することができない可能性がある低品質の臨床試料をアッセイすることが可能であるため、遺伝子発現マイクロアレイと比較して、診療機関において幅広い実用性を有するものである。更に本アッセイは、骨髄細胞を必要とする代わりに、全血試料中のシグナルを検出することが可能である。本アッセイの外因性コントロールを選択するための方法は、試料、外因性コントロール、並びにＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸのみに基づいた比の簡単な計算であり、患者、特に高齢の患者に、ＡＭＬを治療するうえでＦＩＴ併用療法が患者にとって効果的であるか否かを判定するための２遺伝子アッセイを提供することを可能とするものである。

現在行われているチピファルニブ＋エトポシドの治験との関連で採取された骨髄穿刺液の開示される遡及的分析は、２遺伝子シグネチャーを、チピファルニブに対する応答の再現可能な予測指標として実証するものである。本分析はまた、チピファルニブに対して応答する確率が高いＡＭＬ患者とそうでない患者とを予め区別することが可能であることを示唆している。ＲＡＳＧＲＰ１：ＡＰＴＸのｍＲＮＡ比と、２つの重点的に研究されている化学療法レジメン（それぞれａｒａ－Ｃ及びアントラサイクリンを第３の薬剤（フラボピリドール又はエトポシド）とともに含む）との間に予測される関係性が認められないことから、これらのデータは、２遺伝子シグネチャーがチピファルニブ（又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤）に対して比較的特異性を有するという考え方を裏付けるものである。チピファルニブ＋エトポシドの第２相試験に関して、試験の陽性予測値は７８％であったが、試験の陰性予測値（ＮＰＶ）は、チピファルニブ単独療法の試験において報告されたＮＰＶ（約９５％程度）よりもわずかに低かった（８７％）。単独療法と併用療法との間のこのようなＮＰＶの明らかな相違は、エトポシドに対する応答と関連している部分もあるかもしれない。

以上とりまとめると、本開示には、その教示又は趣旨から逸脱することなく多くの変形及び代替的な実施形態が可能である点は当業者であれば認識されるところであろう。例えば、２遺伝子比の代数的又は数学的な変形を用いて本方法を実施することが可能である。以下に添付する「特許請求の範囲」は多くのこうした改変を包含するものである。更に、本明細書において検討及び引用した各参照文献をその全容にわたってここに援用するものである。

配列表
ＲＡＳＧＲＰ１アンプリコン（配列番号１）
ｃｔｇｇａｃｇａｔｃｔｃａｔｔｇａｃａｇｃｔｇｃａｔｔｃａａｔｃｔｔｔｔｇａｔｇｃａｇａｔｇｇａａａｃｃｔｇｔｇｔｃｇａａｇｔａａｃｃａａｃｔｇｔｔｇｃａａｇ
ＡＰＴＸアンプリコン（配列番号２）
ｃｇｃｔｔｃｃｇａｔｔｇｇｇｃｔａｃｃａｃｇｃｃａｔｔｃｃｇａｇｔａｔｇａｇｃｃａｔｇｔａｃａｔｃｔｔｃａｔｔｇｔｇａｔｃａｇｃｃａｇｇａｔｔｔｔｇａｔｔｃｔ
ＡＰＴＸ上流プライマー（配列番号３）
ｃｇｃｔｔｃｃｇａｔｔｇｇｇｃｔａｃ
ＡＰＴＸ下流プライマー（配列番号４）
ａｇａａｔｃａａａａｔｃｃｔｇｇｃｔｇａｔｃ
ＲＡＳＧＲＰ１上流プライマー（配列番号５）
ｃｔｇｇａｃｇａｔｃｔｃａｔｔｇａｃａｇｃｔｇｃａｔｔｃａａｔｃｔｔｔｔｇａｔｇｃａｇａｔｇｇａａａｃｃｔｇｔｇｔｃｇａａｇｔａａｃｃａａｃｔｇｔｔｇｃａａｇ
ＲＡＳＧＲＰ１下流プライマー（配列番号６）
ｃｔｔｇｃａａｃａｇｔｔｇｇｔｔａｃｔｔｃｇ，
ＨＭＢＳアンプリコン（配列番号７）
ｃｃｔｔｇｃｃｃａｃｔｇｔｇｃｔｔｃｃｔｃｃｃｔｇｇｃｔｔｃａｃｃａｔｃｇｇａｇｃｃａｔｃｔｇｃａａｇｃｇｇｇａａａａｃｃｃｔｃａｔｇａｔ
ＨＭＢＳ上流プライマー（配列番号８）
ｃｃｔｇｃｃｃａｃｔｇｔｇｃｔｔｃｃｔ
ＨＭＢＳ下流プライマー（配列番号９）
ａｔｃａｔｇａｇｇｇｔｔｔｔｃｃｃｇｃｔ
ＲＡＳＧＲＰ１ ＴＡＱＭＡＮプローブ（配列番号１０）
ＦＡＭ－ｃａｔｔｃａａｔｃｔｔｔｔｇａｔｇｃａｇａｔｇｇａａａｃｃｔｇ－ＢＨＱ１
ＡＰＴＸ ＴＡＱＭＡＮプローブ（配列番号１１）
Ｇｏｌｄ ５４０－ｃａｃｇｃｃａｔｔｃｃｇａｇｔａｔｇａｇｃｃａｔｇｔａｃ－ＢＨＱ２
ＨＭＢＳ ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号１２）
Ｃｙ５－ｇｃｔｔｃａｃｃａｔｃｇｇａｇｃｃａｔｃｔｇｃａ－ＢＨＱ１，

参考文献
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Ｒａｐｏｎｉ，Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｅ．Ｌａｎｃｅｔ，Ｈｏｎｇｔａｏ Ｆａｎ，Ｌｅｓｌｅｙ Ｄｏｓｓｅｙ，Ｇｒａｃｅ Ｌｅｅ，Ｉｖａｎａ Ｇｏｊｏ，Ｅｒｉｃ Ｊ．Ｆｅｌｄｍａｎ，Ｊａｓｏｎ Ｇｏｔｌｉｂ，Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｐｅｔｅｒ Ｌ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ｊｏｈｎ Ｊ．Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊｅａｎ－Ｌｕｃ Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ，Ｂｏｂ Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｍ．Ｓｔｏｎｅ，Ｐｅｔｅｒ Ｄｅ Ｐｏｒｒｅ，Ｙｉｘｉｎ Ｗａｎｇ，ａｎｄ Ｊｕｄｉｔｈ Ｅ．Ｋａｒｐ．Ａ ２－ｇｅｎｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｉｐｉｆａｒｎｉｂ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ ２００８，１１１：２５８９～２５９６。
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Ｒｅｕｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｒａｓ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ：ａ ｒａｔｉｏｎａｌ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ－ｂａｓｅｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ？Ｂｌｏｏｄ ９６：１６５５～１６６９
Ｒｅｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｌｅｕｋｅｍｉａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｒｈｏ ｇｕａｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ，ａ Ｄｂｌ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｕｎｄ ｍｕｔａｔｅｄ ｉｎ ｌｅｕｋｅｍｉａ，ｃａｕｓｅｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＲｈｏＡ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：２７１４５～２７１５１
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〔実施の態様〕
（１） 疾患と診断された患者にチピファルニブ（tipinifarb）及びエトポシドを投与するための方法であって、
それぞれのレベルがΔΔＣｔ法を用いて計算されたＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現の比が、試験集団のＲＯＣ分析における特定の感度又は特異度又は感度と特異度との最大の和に対応したΔΔＣｔ閾値を上回るか否かを判定することと、
前記比が前記ΔΔＣｔ閾値を上回る場合に、治療上の有効量のチピファルニブを投与することと、を含む、方法。
（２） 前記ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現の比が、
（ｉ）５’－ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ－３’、
（ｉｉｉ）５’－ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ－３’、及び
（ｉｖ）５’－ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧ－３’からなる群からの少なくとも１つのプライマーを用いて決定される、実施態様１に記載の方法。
（３） ＲＡＳＧＲＰ１の発現のレベルが、ＡＰＴＸ、βアクチン及びＨＭＢＳからなる群のうちの１つ又は２つ以上に対して推定される、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記ΔΔＣｔ閾値が約５．２である、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記ΔΔＣｔ閾値が、約７０％以上の曲線下面積に対応している、実施態様１に記載の方法。
（６） アッセイは、１個のチューブ内で多重フォーマットで行われる、実施態様１に記載の方法。
（７） 外因性コントロールを用いて、ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を決定することを更に含む、実施態様２に記載の方法。
（８） 前記外因性コントロールが、１つ又は２つ以上の参照細胞系統、ＪＹ ＲＮＡ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ、標準化された参照ＲＮＡ、及び参照患者試料からなる群から選択される、実施態様７に記載の方法。
（９） 試料が、
（ｉ）骨髄試料、及び
（ｉｉ）血液試料、の少なくとも一方を含む、実施態様１に記載の方法。
（１０） 前記患者が、チピファルニブ及びチピファルニブと相乗作用を示す別の薬剤により治療され、前記チピファルニブと相乗作用を示す別の薬剤が、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される要素の１つ又はその誘導体である、実施態様１に記載の方法。

（１１） 前記疾患がＡＭＬである、実施態様１に記載の方法。
（１２） 疾患と診断された患者にチピファルニブを処方するための方法であって、
（ｉ）５’－ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ－３’、
（ｉｉｉ）５’－ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ－３’、及び
（ｉｖ）５’－ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧ－３’からなる群からの少なくとも１つのプライマーを用いた標的リボ核酸からのシグナルの増幅においてＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現を評価することを含む、方法。
（１３） ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子の発現の比が、ＡＰＴＸの発現レベルに対して推定される、実施態様１２に記載の方法。
（１４） 前記アッセイが、１個のチューブ内で多重フォーマットで行われる、実施態様１２に記載の方法。
（１５） 外因性コントロールを使用して、ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を決定することを更に含む、実施態様１３に記載の方法。
（１６） 前記ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を、約５．２のΔΔＣｔ閾値と比較する、実施態様１５に記載の方法。
（１７） 前記ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を、約４．７のΔΔＣｔ閾値と比較する、実施態様１５に記載の方法。
（１８） 前記ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を、特定の感度若しくは特異度又はＲＯＣ分析における感度と特異度との最大の和に対応した閾値と比較する、実施態様１５に記載の方法。
（１９） 曲線下面積が約７０％以上である、実施態様１８に記載の方法。
（２０） 前記外因性コントロールが、１つ又は２つ以上の参照細胞系統、ＪＹ ＲＮＡ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ、標準化された参照ＲＮＡ、及び参照患者試料からなる群から選択される、実施態様１５に記載の方法。

（２１） 試料が、
（ｉ）骨髄試料、及び
（ｉｉ）血液試料、の少なくとも一方を含む、実施態様１２に記載の方法。
（２２） 患者における前記ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比が閾値よりも大きい場合に、前記患者にチピファルニブを処方する、実施態様１５に記載の方法。
（２３） チピファルニブが、チピファルニブと相乗作用を示す別の薬剤とともに処方され、前記チピファルニブと相乗作用を示す別の薬剤が、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される要素の１つ又はその誘導体である、実施態様１７に記載の方法。
（２４） ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と相乗作用を示す前記別の薬剤が、エトポシドである、実施態様１９に記載のアッセイ。
（２５） 骨髄性疾患と診断された患者に対する治療を同定するための方法であって、
少なくとも標的リボ核酸の増幅に基づいて、第１の治療成績を有する第１のアッセイを投与することと、
前記第１の治療成績及び所定の閾値に基づいて前記患者を、治療群のうちの１つ又は２つ以上による効果が得られる確率が低いものとしてフラグ付けすることであって、前記治療群のそれぞれが、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される相乗作用を有する薬剤との投与を必要とする、フラグ付けすることと、
前記患者がフラグ付けされない場合に、前記治療群から治療を選択することと、を含む、方法。
（２６） 前記所定の閾値が、前記治療群のうちの１つ又は２つ以上に対する応答について高い陰性予測値を有するように選択される、実施態様２５に記載の方法。
（２７） 前記所定の閾値が、前記治療群のうちの１つ又は２つ以上に対して高い陽性予測値を有するように選択される、実施態様２５に記載の方法。
（２８） 前記治療の相対陽性予測値に基づいて前記治療を選択することを更に含む、実施態様２５に記載の方法。
（２９） 前記骨髄性疾患が急性骨髄性白血病である、実施態様２５に記載の方法。
（３０） 過去の治療に対する応答の低下が検出されることに応じて、前記過去の治療から今後の治療に変えることを更に含む、実施態様２５に記載の方法。

（３１） 前記第１のアッセイの陽性予測値が、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤による治療に対して陽性応答を示すことが予想される患者の割合に基づいて決定され、前記陽性応答が完全寛解を含む、実施態様２５に記載の方法。
（３２） 完全寛解が、５％未満の骨髄芽球が存在し、いずれの細胞系統も正常に成熟していること、ＡＮＣが少なくとも１０００／μＬであり、血小板数が少なくとも１００，０００／μＬであること、末梢血中に芽球が存在しないこと、骨髄中に同定可能な白血病細胞が存在しないこと、疾患に関連した細胞遺伝学的異常が認められないこと、及び以前に存在していたあらゆる髄外疾患が認められないことによって定義される、実施態様３１に記載の方法。
（３３） 前記陽性応答が、部分寛解及び血液学的改善の１つ又は２つ以上を更に含む、実施態様３２に記載の方法。
（３４） 部分寛解が、ＡＮＣ及び血小板の、上記に述べたレベルまでの回復をともなうが、骨髄芽球は５～２５％である、前記骨髄中の三血球系造血の存在、及び骨髄芽球の比率のベースラインから少なくとも５０％の減少により定義され、血液学的改善が、骨髄芽球の少なくとも５０％の減少若しくは任意の測定可能な髄外疾患の減少、ＡＮＣの５００～１０００／μＬへの回復、血小板数の２０，０００～１００，０００／μＬへの回復、又は輸血の必要性における改善によって定義される、実施態様３３に記載の方法。
（３５） （ｉ）５’－ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ－３’、
（ｉｉｉ）５’－ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ－３’、及び
（ｉｖ）５’－ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧ－３’からなる群からの少なくとも１つのプライマーを用いた標的リボ核酸からのシグナルの増幅においてＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現を評価することによって、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の投与を含む治療に対して応答する確率が高い患者を同定するためのアッセイ。
（３６） ＲＡＳＧＲＰ１遺伝子の発現のレベルが、ＡＰＴＸ、βアクチン及びＨＭＢＳからなる群のうちの１つ又は２つ以上に対して推定される、実施態様３５に記載のアッセイ。
（３７） 前記アッセイが、１個のチューブ内で多重フォーマットで行われる、実施態様３５に記載のアッセイ。
（３８） 外因性コントロールを用いて、ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を決定することを更に含む、実施態様３５に記載のアッセイ。
（３９） 前記外因性コントロールが、１つ又は２つ以上の参照細胞系統、ＪＹ ＲＮＡ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ、標準化された参照ＲＮＡ、及び参照患者試料からなる群から選択される、実施態様３７に記載のアッセイ。
（４０） 試料が、
（ｉ）骨髄試料、及び
（ｉｉ）血液試料、の少なくとも一方を含む、実施態様３５に記載のアッセイ。

（４１） 患者における前記比が所定の閾値よりも大きい場合に、前記患者が、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と、前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と相乗作用を示す別の薬剤との投与に対する高確率応答患者として分類され、前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と相乗作用を示す前記別の薬剤が、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される要素の１つ又はその誘導体である、実施態様３８に記載のアッセイ。
（４２） 前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がチピファルニブであり、前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と相乗作用を示す前記別の薬剤がエトポシドである、実施態様４１に記載のアッセイ。
（４３） ファルネシル阻害剤と、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択されるか又はこれらの群から選択される要素の誘導体である、別の薬剤との組み合わせによる治療に対する応答患者を同定するためのアッセイにおける閾値を選択する方法であって、
血液試料を処理してリボ核酸が濃縮された調製物を調製することと、
ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現レベルの比を得ることと、
データセットにおいて、前記治療の陽性予測値、応答患者を同定する陰性予測値、ＲＯＣ分析におけるＡＵＣ、感度及び特異度からなるセットからの測定値の１つ又は２つ以上を最大化することであって、前記ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現レベルの比が、前記閾値と比較される、最大化することと、を含む、方法。
（４４） 前記ＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルが、ＲＴ－ＰＣＲを用いて測定される、実施態様４３に記載の方法。
（４５） 前記ＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルが、特定の参照標準ＲＮＡと一致するように決定される前記閾値に対して評価される、実施態様４４に記載の方法。
（４６） 急性骨髄性白血病と診断された患者にチピファルニブ及びエトポシドを投与するための方法であって、
それぞれのレベルがΔΔＣｔ法を用いて計算されたＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現の比が、試験集団における感度若しくは特異度又はＲＯＣ分析における感度と特異度との最大の和に対応したΔΔＣｔ閾値を上回るか否かを判定することと、
前記比が前記ΔΔＣｔ閾値を上回る場合に、治療上の有効量のチピファルニブを投与することと、を含む、方法。
（４７） 前記ＲＡＳＧＲＰ１及びＡＰＴＸの発現の比が、
（ｉ）５’－ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’、
（ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ－３’、
（ｉｉｉ）５’－ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ－３’、及び
（ｉｖ）５’－ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧ－３’からなる群からの少なくとも１つのプライマーを用いて決定される、実施態様４６に記載の方法。
（４８） ＲＡＳＧＲＰ１の発現のレベルが、ＡＰＴＸ、βアクチン及びＨＭＢＳからなる群のうちの１つ又は２つ以上に対して推定される、実施態様４６に記載の方法。
（４９） 前記ΔΔＣｔ閾値が約５．２である、実施態様４６に記載の方法。
（５０） 前記ΔΔＣｔ閾値が、約７０％以上の曲線下面積に対応している、実施態様４６に記載の方法。

（５１） 前記アッセイが、１個のチューブ内で多重フォーマットで行われる、実施態様４６に記載の方法。
（５２） 外因性コントロールを用いて、ＡＰＴＸに対するＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を決定することを更に含む、実施態様４７に記載の方法。
（５３） 前記外因性コントロールが、１つ又は２つ以上の参照細胞系統、ＪＹ ＲＮＡ、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ、標準化された参照ＲＮＡ、及び参照患者試料からなる群から選択される、実施態様４２に記載の方法。
（５４） 試料が、
（ｉ）骨髄試料、及び
（ｉｉ）血液試料、の少なくとも一方を含む、実施態様４６に記載の方法。
（５５） 前記患者が、チピファルニブ及びチピファルニブと相乗作用を示す別の薬剤により治療され、前記チピファルニブと相乗作用を示す別の薬剤が、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される要素の１つ又はその誘導体である、実施態様４６に記載の方法。
（５６） 急性骨髄性白血病と診断された前記患者が、年齢５５才以上、好ましくは年齢６０才以上、更により好ましくは年齢６５才以上である、実施態様４６に記載の方法。

Claims (6)

1. 血液試料を含む試料において、
   （ｉ）５’－ＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＧＣＴＡＣ－３’、
   （ｉｉ）５’－ＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＣＴＧＧＣＴＧＡＴＣ－３’、
   （ｉｉｉ）５’－ＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＣ－３’、及び
   （ｉｖ）５’－ＣＴＴＧＣＡＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＴＣＧ－３’からなる群からの少なくとも１つのプライマーを用いた標的リボ核酸からのシグナルの増幅においてＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルとＡＰＴＸの発現レベルとの比を評価することによって、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の投与を含む治療に対して応答する確率が高い患者を同定するための指標を得るためのアッセイであって、
   前記ＡＰＴＸの発現レベルと前記ＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルとの前記比が、外部正規化コントロールを使用して推定される、アッセイ。
2. 前記アッセイが、１個のチューブ内で多重フォーマットで行われる、請求項１に記載のアッセイ。
3. 外因性コントロールを用いて、前記ＡＰＴＸの発現レベルに対する前記ＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルの比を決定することを含む、請求項１に記載のアッセイ。
4. 前記外因性コントロールが、１つ又は２つ以上の参照細胞系統、ＪＹ ＲＮＡ、Ｕｎｉ
   ｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ、標準化された参照ＲＮＡ、及び参照患者試料からなる群から選択
   される、請求項３に記載のアッセイ。
5. 患者における前記ＡＰＴＸの発現レベルと前記ＲＡＳＧＲＰ１の発現レベルとの前記比が所定の閾値よりも大きい場合に、前記患者が、前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と、前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と相乗作用を示す別の薬剤との投与に対する高確率応答患者として分類され、前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と相乗作用を示す前記別の薬剤が、エトポシド、テニポシド、タモキシフェン、ソラフェニブ、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、トラスツズマブ、及びシスプラチナムからなる群から選択される要素の１つ又はその誘導体である、請求項１に記載のアッセイ。
6. 前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤がチピファルニブであり、前記ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤と相乗作用を示す前記別の薬剤がエトポシドである、請求項５に記載のアッセイ。

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