CN112210605B - 用于评估组织免疫反应和诊断预后的dna甲基化检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于评估组织免疫反应和诊断预后的DNA甲基化检测试剂盒。发明人研究发现使用CpG位点cg02430840、cg06113913和cg12673499中的至少1个可以可靠地评估组织免疫反应和诊断预后，特别是CRC中CD8+ TILs水平及其预后。有望成为CD8+ TILs的研究工具，以及成为指导结直肠癌和其他癌症免疫治疗的潜在标志物。

Description

用于评估组织免疫反应和诊断预后的DNA甲基化检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医疗及生物领域，具体涉及可用于确定组织免疫反应，特别是肿瘤样本中CD8+ T细胞丰度的DMPs及其应用。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)与肿瘤免疫反应相关，可用于预测免疫治疗的反应和生存结果9-11，其中CD8+ TILs依靠细胞毒作用杀伤癌细胞，并影响CRC的预后、免疫治疗反应和生存结果12-14。包括来自国际TILs工作组的建议15和免疫评分16等多种基于形态学评估TILs水平的方法已经建立并被广泛验证。
目前对CD8+ TILs的评估依赖于组织病理学方法，其过程繁琐且可重复性欠佳，存在一定的局限性。一些基于CD8B等基因表达的标志物是评估CD8+ TILs的方法17-19。DNA甲基化在组织分化中起着重要作用，特别是低CpG密度区域内的CpG位点、部分甲基化结构域（PMDs）和solo-WCGW的甲基化，在发明人的研究过程中被鉴定为更为重要的甲基化区域。这些区域在人基因组中分布非常广泛，然而，目前对其功能研究尚未成熟，相关的报导较少。本发明涉及的CD8+ T细胞特异性甲基化位点（differentially methylated positions，DMPs)即位于此区域。
结直肠癌(CRC)是全球癌症相关死亡的主要原因之一1，2。免疫治疗在可手术切除和不可切除的CRC患者治疗中发挥着越来越重要的作用3。免疫检查点抑制剂可以促进T细胞攻击肿瘤细胞，延长病人的生存时间4-6。同时，CRC的免疫治疗仍具有挑战性，因为其免疫反应具有异质性7，8。
可靠地评估肿瘤或其他免疫相关疾病中CD8+ TILs水平及其预后，有利于指导肿瘤及其他免疫相关疾病，如结直肠癌和其他癌症的免疫治疗，提高病人的生存质量或疗效。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效评估肿瘤及其他免疫相关疾病中CD8+ T细胞丰度的CD8+ T细胞特异性甲基化位点（DMPs)组及其应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
可用于确定免疫相关疾病样本中CD8+ T细胞丰度的CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组，所述CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组至少含有cg02430840（chr22:26993176）、cg06113913(chr4: 84060418)和cg12673499(chr10: 104412063)中的一个，两个或三个CpG位点。
通过使用2个或3个CpG位点，可以获得更为准确的评价结果。
在一些实例中，所述免疫相关疾病选自肿瘤、克罗恩病、溃疡性结肠炎、COVID-19。
在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌。
在一些实例中，所述肺癌选自肺腺癌、肺鳞状细胞癌；所述乳腺癌为乳腺浸润性癌。
本发明的第二个方面，提供：
定量CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组甲基化程度的制剂在制备确定肿瘤预后或免疫相关疾病样本中CD8+ T细胞丰度检测试剂中的应用，所述CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组如本发明的第一个方面所述。
在一些实例中，定量CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组的制剂选自甲基化芯片、甲基化程度检测试剂。具体的包括DNA提取试剂盒、DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒、覆盖待测CpG位点的Taqman探针，每条Taqman探针的5’末端连接荧光基团，3’末端连接淬灭剂和MGB基团，且两条Taqman探针5’末端连接的荧光基团具有不同发射光波长；引物；dATP、dCTP、dGTP和dTTP；MgCl2；HotStar Taq酶；PCR缓冲液。
在一些实例中，所述样本包括新鲜组织、新鲜冰冻组织、福尔马林固定石蜡包埋组织、内镜活检组织、穿刺活检组织、液体活检组织。
在一些实例中，所述液体活检组织包括淋巴液、血液、腹腔积液、胸腔积液。
在一些实例中，所述免疫相关疾病选自肿瘤、克罗恩病、溃疡性结肠炎、COVID-19。
在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌。
在一些实例中，所述肺癌选自肺腺癌、肺鳞状细胞癌；所述乳腺癌为乳腺浸润性癌。
本发明的第三个方面，提供：
一种确定肿瘤预后或免疫相关疾病样本中CD8+ T细胞丰度的系统，包括：
定量装置：用于定量样本中CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组的量和/或甲基化程度，所述CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组如本发明的第一个方面所述；
数据分析装置：基于CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组的定量结果，确定肿瘤预后或样本中CD8+ T细胞丰度；
结果展示装置：展示数据分析装置得到的结果。
在一些实例中，通过机器学习QASM技术确定CpG位点cg02430840、cg06113913和cg12673499的甲基化比例。
在一些实例中，CD8+ MeTIL评分= cg02430840×0.28724 + cg06113913×0.40171 + cg12673499×0.45016。
在一些实例中，所述CD8+ MeTIL评分用于预测样本中CD8+ T细胞丰度及肿瘤预后；评分越低，表明CD8+ T细胞丰度越高，肿瘤预后越好；
评分越高，表明CD8+ T细胞丰度越低，肿瘤预后越差；
特别的，所述CD8+ MeTIL评分的阈值为68，高于68，丰度低，肿瘤预后差；低于68，丰度高，肿瘤预后好。
在一些实例中，所述定量装置选自QASM定量装置、焦磷酸测序或Illumina EPIC甲基化芯片。
在一些实例中，所述免疫相关疾病选自肿瘤、克罗恩病、溃疡性结肠炎、COVID-19。
在一些实例中，所述肿瘤选自结直肠癌、乳腺癌、肺癌、宫颈鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌。
在一些实例中，所述肺癌选自肺腺癌、肺鳞状细胞癌；所述乳腺癌为乳腺浸润性癌。
本发明的有益效果是：
本发明的一些实例，使用CpG位点cg02430840、cg06113913和cg12673499中的至少1个，2个或3个构建CD8+ MeTIL特征评分，该评分显示CD8+ T细胞和其他细胞具有显著区别。
本发明的一些实例，可以可靠地评估组织免疫反应和诊断预后，特别是CRC中CD8+TILs水平及其预后。有望成为CD8+ TILs的研究工具，以及成为指导结直肠癌和其他癌症免疫治疗的潜在标志物。
本发明的一些实例，可以有效评估结直肠癌和其他癌症中基于CD8+ TILs的免疫反应和预后。
附图说明
图1：本研究模型构建过程及研究队列流程图；
图2：使用CD8+ T细胞特异性DMPs生成CD8+ MeTIL评分；(A)基于73个候选差异甲基化位点(DMPs)的免疫细胞和正常以及结直肠癌细胞的无监督层次聚类分析。(B) 73个候选DMPs的基因组位置和功能域的分析。(C) 73个候选DMPs所定位基因的GO分析，包括分子功能(MF)、生物学过程(BP)和细胞组成(CC)三个方面。(D)对机器学习模型中最终选择的CpGs进行无监督层次聚类分析，检验其CD8+ T细胞特异性。每一列代表一个样本，红色或黄色表示高甲基化水平，蓝色表示低甲基化水平。(E)选取3个CpGs的甲基化值构建CD8+MeTIL评分，计算CD8+ T细胞、CRC细胞、正常结肠细胞、B细胞、CD4+ T细胞、粒细胞、单核细胞的CD8+ MeTIL评分。采用Student’s T检验(****p < 0.0001)评估CD8+ T细胞与其他细胞类型CD8+ MeTIL评分的差异。(F) 使用3个选定CpGs的值对SAH-SYSU队列的45个样本进行无监督层次聚类分析。热图上方显示每位患者的临床病理特征。
图3：基于qPCR的QASM法在单碱基分辨率下检测CD8+ MeTIL评分；(A)使用QASM法对每个的CpG位点进行甲基化水平检测。每个CpG位点甲基化水平仅在探针水平测定，其中FAM标记的MGB探针特异性结合到甲基化等位基因(CpG)序列上，而VIC标记的探针结合到未甲基化等位基因(TpG)序列上。在同一PCR反应中，用一对引物扩增出两个等位基因。(B～D)分别用QASM法、EIPC甲基化芯片法和焦磷酸测序法测定cg02430840、cg06113913和cg12673499所覆盖的CpG位点的甲基化水平。采用皮尔逊相关性检验，显示各检测方法的相关系数(R2)和p值。
图4：在细胞系和肿瘤组织中检测CD8+ MeTIL评分；使用QASM法检测CD8+ T细胞与其他免疫细胞、正常和结直肠癌细胞三个CpG位点甲基化水平及CD8+ MeTIL评分有显著差异。(B)SAH-SYSU队列的23例样本显示QASM法测定的CD8+ MeTIL评分与免疫组化法定量的CD8+ TILs计数之间的相关性。 (C)放大400倍和800倍时，使用免疫组化染色的病理切片显示CD8+ TILs计数从低到高(从左到右)相应的颜色越深表示CD8+ MeTIL评分数值越大。(D)SAH-SYSU队列的样本显示QASM法检测的CD8+ MeTIL评分与基于CD8B基因表达量测得的CD8+ ExTILs之间的相关性的散点图。 (ECCFR队列研究中不同分子表型的) CD8+ MeTIL评分情况 (***p < 0.001， *p < 0.05)。
图5：CD8+ MeTIL在CRC和多种癌症中的预后价值；根据最大选择秩统计量确定的临界值，将SAH-SYSU队列（A）和CCFR研究队列（C）中的CD8+MeTIL评分进行分组。用log-rank检验的p值显示各队列总生存率的Kaplan-Meier曲线。将MSI-H和MSI-L/MSS肿瘤患者按CD8+MeTIL评分进一步分层，用log-rank检验将SAH-SYSU队列（B）和CCFR研究队列（D）的总生存率Kaplan-Meier曲线分成四组进行比较。（E） DMPs筛选产生450K特异性CD8+MeTIL特征的工作流程，可应用于具有450K甲基化阵列数据的TCGA队列（F）森林图显示了用于24种TCGA癌症生存预测的单变量Cox分析中450K特异CD8+MeTIL特征的危险比和95%的置信区间。ACC，肾上腺皮质癌；BLCA，膀胱尿路上皮癌；BRCA，乳腺浸润癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和宫颈管内腺癌；COREAD，结肠和直肠腺癌；ESCA，食管癌；GBM，多形性胶质母细胞瘤；HNSC，头颈部鳞状细胞癌；KICH，肾嫌色细胞癌；KIRC，肾透明细胞癌；KIRP，肾乳头状细胞癌；LGG，脑低级胶质瘤；LIHC，肝细胞癌；LUAD，肺腺癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；间皮瘤；PAAD，胰腺癌；PCPG，嗜铬细胞瘤和副神经节瘤；SARC，肉瘤；STAD，胃腺癌；THCA，甲状腺癌；UCEC，子宫体子宫内膜癌；UCS，子宫癌肉瘤；UVM，葡萄膜黑色素瘤。
图6：在结直肠癌微环境中，CD8+T细胞与其他细胞类型的D8+MeTIL评分存在差异；CD8+MeTIL评分是对来自ENCODE Consortium，GSE123003，GSE130029和GSE130030的不同细胞样本进行计算，这些样本代表典型的结直肠癌肿块中发现的不同细胞类型。以甲基化芯片为基础的CD8+MeTIL评分值绘制在y轴上，细胞类型组绘制在x轴上。显然，与其他细胞类型相比，CD8+MeTIL评分显示CD8+淋巴细胞的值最高，进一步显示了其在CD8+TIL评估中的特异性。用Student t检验评估CD8+T细胞和其他细胞类型之间CD8+MeTIL评分的差异（****p<0.0001）。
图7：应用最大选择秩统计方法确定生存分析中CD8+MeTIL评分的最佳临界值。CD8+ MeTIL得分的最佳截止值是68。
图8：CD8+MeTIL评分在TCGA-CRC队列中的分布；（A）应用DMPs筛选工作流程生成的450K特异性CD8+MeTIL特征，可应用于具有450K甲基化芯片数据的TCGA队列。（B）利用TCGA450K甲基化芯片和RNA序列数据，通过CD8A（顶部）和CD8B（底部）基因mRNA表达测定，显示450K特异性CD8+MeTIL和CD8+外显子之间的相关性。得到了Pearson相关系数和p值。（C）TCGA-CRC队列中450K特异性CD8+MeTIL的微卫星状态和肿瘤突变负荷（TMB）分布。采用Mann-Whitney检验（**p<0.01）。
图9：CD8+ MeTIL评分在TCGA-CRC队列中的预后价值；根据最大选择秩统计量确定的临界值，按TCGA-CRC队列（COAD&READ）中450k特异性CD8+MeTIL评分对患者进行分组。用log-rank检验的p值显示总生存率的Kaplan-Meier曲线（A）。MSI和MSS肿瘤患者按450k特异性CD8+MeTIL评分进一步分层，并用对数秩检验对TCGA-CRC队列总生存率的Kaplan-Meier曲线进行比较（B）。
图10：非小细胞肺癌中CD8+ MeTIL评分与PD -1单抗治疗的反应相关；发明人使用PD-1单抗治疗非小细胞肺癌患者的EPIC甲基化芯片数据，对来自治疗应答和治疗无应答的患者的样本计算了CD8+ MeTIL得分。绘制了基于甲基化序列的CD8+ MeTIL评分值。y轴是CD8+ MeTIL得分，x轴是治疗反应组。与无应答者相比，有应答者CD8+ MeTIL评分显著降低(CD8+ TILs更丰富)(p = 0.004)。采用Mann-Whitney检验评价患者组间差异(**p <0.01)。
具体实施方式
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
本研究旨在发现基于DNA甲基化的生物标志物，以评估CRC中CD8+ TILs水平。首先，通过甲基化芯片数据集，从CD8+ T细胞、其他免疫细胞、结直肠癌和正常结直肠上皮细胞中识别出CD8+ T细胞特异性DMPs。然后选取DMPs，利用机器学习算法构建CD8+ MeTIL特征评分模型。然后发明人进一步开发了QASM方法（参见Yu H, Bai L, Tang G, et al.Novel assay for quantitative analysis of DNA methylation at single-baseresolution[J]. Clinical chemistry, 2019, 65(5): 664-673.、CN109385465A及CN109385464A），用以基于qPCR技术在单碱基分辨率下检测选定的DMPs。最后，发明人用QASM方法对所选DMPs在多个队列中进行验证测试，并与CD8B基因表达和基于免疫组化的CD8+ TILs计数进行比较，研究其在CRC等癌症中的预后价值。
患者队列和肿瘤样本：本研究采用了结肠癌家族登记(CCFR)研究和中山大学附属第六医院(SAH-SYSU)肿瘤库的两组CRC肿瘤样本。之前发表的文章已经对CCFR研究27，28和SAH-SYSU样本29中的人群进行描述。简而言之， CCFR研究队列包括西雅图、安大略和梅奥诊所中335名经病理确诊的CRC患者，而SAH-SYSU队列包括282名经病理确诊的CRC患者。所有病例均行原发性肿瘤根治性切除术。既往有过抗癌治疗、CRC以外的其他癌症、慢性炎症性肠病、家族性腺瘤性息肉病以及DNA样本降解或无法获得的患者被排除在外。这些队列的基线特征见补充表。本研究中使用的所有样本都经过病理学家的复查，以确认诊断，确保肿瘤样本的肿瘤含量在60%以上。为了验证在其他癌症中的发现，发明人使用了24个TCGA队列及其Infinium Human甲基化450K BeadChip (450K甲基化芯片)数据。研究设计流程如图1所示。
结肠上皮细胞和免疫细胞：所有癌和正常结肠细胞株(RKO， SW48， HCT8， HCT15，NCM460)均来自美国生物标准品资源库(ATCC)。采用磁激活细胞分选法富集人源性免疫细胞，包括CD4+、CD8+、单核细胞、NK细胞和B细胞(1505、1508-1510、1513，广州市雷德生物科技有限公司，http://www.leidebio.com/)。
中CD8+ T细胞特异性DMPs的筛选：由CD8+ T细胞、非CD8+免疫细胞、结直肠癌和正常结直肠上皮细胞系和Illumina Infinium MethylationEPICBeadchip (EPICmethylation array)甲基化芯片数据组成发现集(n = 167)，这些样本的详细信息详见补充表格中。每个CpG位点的甲基化评分以甲基化值表示， 0表示完全未甲基化状态，1表示完全甲基化状态。“minfi”R包和Combat tool用于原始数据处理、批次效应校正和DMP分析，如前所述34，35。为了识别CD8+ T细胞特异性的DMPs来区分CD8+ T细胞和非CD8+免疫细胞以及癌性和正常的结直肠上皮细胞，发明人使用它们的甲基化数据进行DMP分析，并选择了排名最高的候选DMP，其中△β> 0.4，q值< 0.001。发明人使用了无监督的层次聚类分析来分类细胞的甲基化表型。利用“GOfuncR”软件包对所选基因进行 gene ontology（GO）富集分析。采用机器学习选择DMPs并构建CD8+ MeTIL评分模型。
分离和亚硫酸氢盐转化：使用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen， 51306)提取20mg新鲜冰冻组织的基因组DNA，使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo， D5002)进行亚硫酸氢盐处理。
甲基化芯片和焦磷酸测序：根据制造商的说明用EPIC甲基化芯片对SAH-SYSU队列中45个新鲜冰冻组织肿瘤样本进行全基因组DNA甲基化分析。使用筛选CD8+ T细胞特异性DMPs过程中描述的方法对原始数据进行处理。发明人还通过焦磷酸测序检测了本队列中选定的CpG位点的甲基化情况，如补充材料所述。
基于qPCR的单碱基甲基化定量分析：每个候选CpG位点的甲基化百分比在多个队列中通过36的QASM方法确定，该分析已经在发明人之前的工作中开发并验证过26。简而言之，发明人对亚硫酸氢盐转化的DNA进行了扩增，在扩增过程中，利用了位点特异性的PCR引物，其位于一对分别用荧光染料FAM和VIC标记的甲基化和未甲基化探针的两侧(图3A)。用甲基化/(甲基化+非甲基化)×100%的公式来计算甲基化百分比。使用Applied BiosystemsQuantStudio 7 Flex 实时 PCR系统(Thermo)在以下条件下进行QASM:激活95℃15 min，变性98℃30 s，退火58℃1 min，延长72℃1 min，执行50个循环。在每个PCR板中加载双硫代转换的CpGenome universal methylated DNA (Millipore， S7821)，以校正潜在的批次效应。CD8+ MeTIL标记QASM检测的详细程序如下:
QASM检测CD8+ MeTIL标记
1.DNA提取和亚硫酸氢盐转换
按照制造商规定的InstaGene基质(Bio-Rad 732-6030)进行DNA提取。
按照EZ DNA甲基化试剂盒协议(Zymo Research D5002)对亚硫酸氢盐的DNA转化。
寡核苷酸的合成
Figure DEST_PATH_IMAGE002
引物或探针序列的SEQ ID NO.编号由上到下依次为1～12。
样品板设置
3.1反应体系制备
针对每个反应的CpG位点，准备如下混合料，并加冰：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
标注：a.建议使用0.5～50ng(最佳为5ng)亚硫酸氢盐处理前使用Nanodrop，Thermo Scientific 对DNA进行定量，得到高效的PCR扩增和可重复的结果。
b.发明人使用CpGenome Universal Methylated DNA (Millipore S7821)作为对照样本，在PCR板之间进行数据校正，以消除潜在的批次效应。
条件
根据设计引物的Tm和HotStarTaq、Qiagen的手册设置PCR仪。
Figure DEST_PATH_IMAGE006
标注：由于缓冲液的pH和离子浓度也会影响Tm，不是每个Tm计算器都能准确计算出引物和MGB探针的真实Tm。因此，发明人进行了初步试验，以寻求最佳的PCR条件，并通过在多个Tm计算器中验证Tm，选择最合适的寡核苷酸。
甲基化比例计算
甲基化 DNA：甲基化CT值=FAM探针CT值
非甲基化DNA：非甲基化CT值=VIC探针CT值
△CT=甲基化CT值 –非甲基化CT值
甲基化百分比=甲基化/(甲基化+非甲基化)×100%= 1/(1+1/(2-△CT))×100%
DNA甲基化芯片分析
EPIC芯片用于测定880，578个CpG位点的DNA甲基化状态。EPIC芯片已经被描述和验证为技术上的可靠37。发明人使用“minfi”R包进行探针数据过滤、归一化、差异分析和筛选，如前所述34，35。发明人用Combat tool校正批次效应。0(未甲基化)到1(完全甲基化)的甲基化值，表示每个CpG位点的甲基化状态。Δβ定义如下:Δβ=( CD8 +细胞的β值均数)-(非CD8 +细胞的β值均数)。然后，发明人对CD8+ T细胞与其他细胞(包括非CD8+免疫细胞和结直肠癌以及正常的结直肠上皮细胞)标准化后的每一个探针进行了分析。将△β> 0.4，q值<0.001的候选差异甲基化位(DMPs)进行筛选。最后，使用“minfi”R包进行DMP分析，与之前的研究一样34。发明人进一步进行焦磷酸测序分析，以验证从EPIC芯片中筛选出的CpG位点的甲基化值(图7)34。基于EPIC芯片数据，使用递归分割混合模型(RPMM)识别结直肠癌亚群34，38，39。使用机器学习选择DMPs构建CD8+ MeTIL评分模型。Cox比例风险回归分析是分析影响生存时间的协变量的常用方法，但是，当样本量与变量的比值太小(如小于10:1)时，不适用于高维数组数据。通过分析TCGA的数据，发明人进一步评估了450k芯片中所选CpG位点在结直肠癌中的预后价值(图8)，因为与TCGA项目中使用的HM450芯片相比，EPIC芯片覆盖了413745个新CpG探针。
焦磷酸测序分析
在PCR体系(Applied Biosystems， Verity 96well)上，使用50ul的反应体系物进行PCR扩增。反应体系包含0.5um正向和反向引物，1单位Taq聚合酶，2.0 mM MgCl2， dNTP各200μM， 10 ng经过硫酸氢盐处理的模板DNA。然后发明人将10μLPCR产物与3μLSepharosebeads (streptavidin Sepharose HP，GE healthcare)和37μLbinding buffer混合，进行焦磷酸测序反应。最后的混合物以1400转/分离心10分钟。混匀后，发明人收集并保留生物素化DNA覆盖的珠子，并真空保存在过滤探针上。将过滤探针依次浸入70%乙醇、PyroMark变性液和PyroMark wash buffer 1×中，分别浸泡5s、5s和10 s。然后关闭真空，将固定DNA链的珠子释放到96孔板中，每孔板含有25μL的退火缓冲液和0.3μM的测序引物。测序板在80℃和室温下分别保存2 min和5 min。使用PyroMark Q96 ID (Qiagen)进行焦磷酸测序反应，使用PyroMark CpG软件1.0.11对CpG位点进行定量。最后，发明人采用了与非CG二核苷酸胞嘧啶(不受甲基化影响)在分配序列中的位置相对应的内转换控制，以确保未甲基化的胞嘧啶被成功转化。甲基化百分比计算如下:C/ G峰高度/(C/ G峰高度+ T/A峰高度)×100。
的免疫组化评估
将FFPE肿瘤块切成4微米厚的切片。脱蜡切片与单克隆抗CD8抗体(克隆C8/144B，DAKO， Kyoto， Japan， SK201)在4℃下以1:100稀释浓度孵育16小时。随后，使用辣根过氧化物酶偶联的二抗(Envision+ Dual Link Kit， DAKO， K5007)。按照Fortis等的方法对CD8+ TILs (CD8+ PaTIL)进行免疫组化评估40。简单地说，由两名独立的病理学家对5个有代表性的视野(每视野0.1255 mm2)进行目视计数，记录CD8+ TILs的平均计数。
根据CD8B基因表达量评估CD8+ TILs (CD8+ ExTIL)
根据制造商的说明从新鲜冷冻肿瘤中提取的RNA由ReverTra Ace qPCR RTMaster Mix (TOYOBO， FSQ-201)进行逆转录。然后qPCR检测CD8B mRNA表达。
分子表型
肿瘤的微卫星状态、KRAS密码子12和13的体细胞突变、BRAF p.V600E突变和CpG岛甲基化表型(CIMP)的测定方法与已发表文献使用的方法一致27，29，41，42。
统计学分析
采用t检验、Mann Whitney检验或卡方检验评估组间差异。结果之间的一致性采用Pearson相关性分析。在生存分析中，应用最大选择的秩统计来确定变量的最佳截取点。采用Cox回归分析和Kaplan-Meier生存曲线log-rank检验比较总生存(OS)。所有统计分析都使用R语言3.6.1版本进行。所有P值均采用双尾检验，认为P < 0.05时显著。
结果
结直肠肿瘤中CD8+ TILs的DNA甲基化特征
研究设计如图1所示，为了构建CD8 + MeTIL特征，发明人首先使用CD8 + T细胞与癌细胞和正常结直肠上皮细胞和其他来自人体(样本量为167)的免疫细胞，包括CD4 + T细胞、B细胞、粒细胞，单核细胞的基因组甲基化数据，来比较他们的甲基化特征 (见补充材料)。在这个发现步骤中，发明人选出了CD8+ T细胞特异性的DMPs，这些DMPs在CD8+ T细胞和其他细胞之间甲基化水平有很大差异(图2A)。
为了证实这些结果，发明人分析了这些CD8+ T细胞特异性DMPs的生物学特征。这些CpGs大部分位于基因内，包括CD8A、CD8B、CD96等CD8+ T细胞功能相关的基因，少数位于基因间区。发明人进一步进行GO分析，图2C中展示了多个排名最高的GO功能注释。这一结果证实了选出的这些CpGs与CD8+ T细胞的紧密联系。发明人进一步分析了它们所在的基因组位置信息，大部分位点位于低CpG密度区域(60.3%，44个)和中CpG密度区域(34.2%，25个)，少数位于高CpG密度区域(5.5%，4个) (CpG岛)(图2B)。值得注意的是，根据之前的基因组注释，6个CpGs为solo-WCGW CpGs， 10个CpGs位于PMD中24。
为了减少最终组合中包含的CpGs数量从而便于操作，发明人应用机器学习方法来选择能够最好地代表CD8+ T细胞特异性的CpGs(图6)。最终特征命名为CD8+ MeTIL评分，包含3个CpGs (cg02430840、cg06113913、cg12673499)，均位于低CpG密度区域。发明人构建了CD8+ MeTIL评分包括3个CpGs的β值及其在机器学习回归方程中相应系数:cg02430840×0.28724 + cg06113913×0.40171 + cg12673499×0.45016。这个评分理论上可以得到0.00到1.14之间的值，而发明人在发现队列中得出的CD8+ MeTIL评分在0.71到1.00之间。
为了验证CD8+ MeTIL评分的区分能力，发明人使用3个CpGs通过无监督的层次聚类分析对细胞进行分组。通过评估这3个CpGs，发明人发现CD8+ T细胞可以很好地与其他细胞类型区分(图2D)。值得注意的是，CD8+ T细胞的CD8+ MeTIL评分显著低于任何结直肠癌和正常的结直肠上皮细胞、CD4+ T细胞、B细胞、粒细胞和单核细胞(所有△β> 0.4，所有β值的差异倍数>3，所有p < 0.001，图2E)。CD8+ MeTIL评分在CD8+ T细胞中的高特异性是其判断肿瘤组织中CD8+ T细胞丰度的基础。值得注意的是，CD8+ MeTIL评分系统中的三个位点，各自都能独立地将CD8+ T细胞从结直肠癌和正常的结直肠上皮细胞、CD4+ T细胞、B细胞、粒细胞和单核细胞区分出。说明 cg02430840、cg06113913、cg12673499既可以作为独立标志物使用，也可以2个或3个组合使用评估免疫细胞浸润，以更好地确定CD8+ T细胞丰度。
接下来，发明人利用EPIC芯片数据，研究了SAH-SYSU队列中45例CRC的CD8+MeTIL评分和3个已选CpGs的甲基化水平，及其与临床病理特征之间的关系(图2F)。发明人发现，3个CpGs中CD8+ MeTIL评分较低且甲基化程度较低的CRCs与MSI-H、肿瘤位于右半结肠和高分化相关。这些结果与之前基于免疫组化技术的CD8+ TILs相关研究结果一致。EPIC芯片测定的3个CpGs的甲基化水平与焦磷酸测序测定的甲基化水平显著相关(图3D；R2 = 0.5413- -0.8145；p < 0.01)。
三个位点的具体信息如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
表中［CG］即甲基化探针对应的检测位点，［CG］两侧为其周边的序列信息。
核苷酸序列的SEQ ID NO.编号由上到下依次为13～15。
cg02430840、cg06113913和cg12673499为Illumina公司EPIC甲基化芯片的探针编号，可以根据厂商提供的芯片注释文件查询到各个探针的详细信息。
基于qPCR技术在单碱基分辨率下检测CD8+ MeTIL评分的方法
为了轻松获得基于芯片分析得到的CD8+ MeTIL评分，发明人开发了基于qPCR的方法(QASM)在单碱基分辨率下来确定位于低CpG密度区域的3个CpGs的甲基化水平。如图3A所示，在探针水平上对每个CpG的甲基化和未甲基化等位基因进行量化，其中甲基化的百分比可以通过两个探针的信号比来确定。
为了验证基于qPCR技术得到的的CD8+ MeTIL评分，发明人接下来比较了SAH-SYSU队列中45例CRC的QASM检测结果与EPIC芯片和焦磷酸测序的结果。各CpG的检测中，基于qPCR的甲基化百分比和基于EPIC芯片的甲基化百分比呈良好的线性相关；R2 = 0.2730 -0.5292；p均< 0.001)。此外，QASM法测定的甲基化百分比与焦磷酸测序测定的甲基化百分比呈线性相关(图3B～D)；R2 = 0.5141 -0.8857；p < 0.01)。QASM检测产生的CD8+ MeTIL评分与EPIC芯片和焦磷酸测序得到的的CD8+ MeTIL评分呈线性相关(图3；R2 = 0.5751和0.7995；所有p < 0.0001)。因此，QASM法是检测CD8+ MeTIL评分的可靠工具。
为了用CD8+ MeTIL评分判断CD8+ TIL的分布，发明人首先用QASM确定3个CpGs在不同的组织和细胞中的甲基化比例，包括CRC组织(n = 45)和癌旁正常组织(n = 44)，正常(NCM460)和结直肠癌癌(RKO， SW48， HCT8，和HCT15)细胞和多种免疫细胞系(CD4 + T细胞、单核细胞和B细胞)，这些细胞代表了结直肠癌组织的主要组成部分。使用QASM方法，其他细胞相比，CD8+ T细胞的CD8+ MeTIL评分及三个位点的甲基化水平都显著低于其它细胞(所有△评分> 2.3，p < 0.001，图4)，与EPIC芯片结果一致，并进一步支持基于qPCR技术的CD8 + MeTIL评分可以精确衡量的CD8 + T细胞在肿瘤样本中的水平。
评分判断CRC中CD8+ TIL分布
发明人使用基于qPCR的CD8+ MeTIL评分评估肿瘤组织中的CD8+ TILs，并将其与SAH-SYSU队列中基于免疫组化(IHC)染色(CD8+ PaTIL)检测的CD8+ TILs进行比较(图4B～C)。CD8+ PaTIL与CD8+ MeTIL评分呈显著负相关(R2 = 0.291， p = 0.011)。值得注意的是，CD8+ MeTIL低组中基于IHC染色的CD8+ TILs计数明显多于CD8+ MeTIL高组(p =0.005，图4C)。
发明人进一步比较了CD8+ MeTIL评分和CD8分子相关基因表达水平 (CD8+ExTIL)，即CD8B基因表达的分子标记，用以评估CD8+ MeTIL，在之前研究中用于评估CD8+TILs19。发明人测定了SAH-SYSU队列中编码部分CD8抗原的CD8B基因的mRNA表达。CD8+MeTIL评分与CD8B基因表达特征显著负相关(R2 = 0.1664， p = 0.008，图4D)。综上所述，QASM检测的低CD8+ MeTIL评分与CRC组织中CD8+ T细胞(CD8+ PaTILs)的平均密度较高和CD8B基因(CD8+ ExTIL)的表达增加有关。
接下来，发明人根据CCFR队列CRC病例的分子特征评估QASM测定的CD8+ MeTIL评分的分布。MSI-H组的CD8+ MeTIL评分明显低于MSI-L/MSS组(p < 0.001，图4E)，这与之前MSI-H肿瘤比MSI-L/MSS肿瘤具有更多的CD8+ TILs的研究结果一致43。CIMP阳性(p =0.048)和右半结肠(p < 0.001)肿瘤患者CD8+ MeTIL评分明显低于CIMP阴性和左半结肠肿瘤患者(图4E)。
在CRC和多种癌症中的预后价值
考虑到CD8+ T细胞浸润在肿瘤免疫应答中的作用，发明人试图检验CD8+ MeTIL评分在CRC预后预测中的作用。发明人使用QASM分析来确定SAH-SYSU(237)和CCFR(335)队列中CRCs的CD8+ MeTIL评分，并根据最大选择秩统计确定的截取值对患者进行分组(图6)。这些患者的基线特征在补充表中显示。在SAH-SYSU队列(图5A， HR = 3.31[1.19−9.20]，p =0.015)和CCFR队列(图5C， HR = 3.17[1.26−7.99]，p = 0.009)中，低CD8+ MeTIL评分患者的OS明显优于高CD8+ MeTIL评分的患者。这一结果在多变量Cox分析中经临床危险因素校正后得到进一步证实(图9)。
接下来，发明人探讨了CD8+ MeTIL评分是否可以将MSI-H/MSI-L/MSS患者进一步分层。生存分析中，SAH-SYSU队列和CCFR队列根据MS状态和CD8+ MeTIL评分对患者进行分组。正如预期，每个MMR亚组的CD8 + MeTIL评分可以进一步将死亡风险分层(图5 B&D)。值得注意的是，MSI-H和高CD8+ TILs(低CD8+ MeTIL评分)水平的患者在两组中都有最好的总生存率（OS），而MSI-L/MSS和低CD8+ TILs(高CD8+ MeTIL评分)水平的患者在两组中有较差的OS。
考虑到CD8+ MeTIL特征是使用EPIC甲基化芯片数据在CRC中开发的，发明人使用TCGA中可用的450K甲基化芯片数据对其他癌症类型进行生存分析。发明人首先筛掉了CD8+MeTIL特征中450K甲基化芯片未涵盖的CpGs，并开发了一个可应用于TCGA队列的450K芯片特异性CD8+ MeTIL特征(图8)。
测试癌症类型(肺腺癌(LUAD， p = 0.033)，肺鳞状细胞癌(LUSC， p = 0.038)，CRC (COREAD， p = 0.048)，宫颈鳞状细胞癌(CESC，p = 0.044)，乳腺浸润性癌(BRCA， p =0.011)和肾上腺皮质癌(ACC， p = 0.033)，低CD8 + MeTIL分数与更好的生存结果显著相关(图5 f)。
此外，低CD8 + MeTIL分数还预测膀胱移行细胞癌(BLCA， p = 0.075)，子宫内膜癌(UCEC， p = 0.070)，胃腺癌(STAD， p = 0.065)，甲状腺癌(THCA， p = 0.092)，和葡萄膜黑色素瘤(UVM， p = 0.054) 更好的生存结果，尽管未达统计学意义(图5)。
综上所述，这些数据表明CD8+ MeTIL评分可以预测多种癌症的生存结果。
在预测肿瘤免疫治疗效果中的价值
考虑到CD8+ TILs在预测癌症免疫治疗反应中的价值，发明人试图探索CD8+MeTIL评分与免疫治疗反应的关系。虽然该评分是在CRC中构建的，但发明人使用EPIC甲基化芯片数据(图10)发现CD8+ MeTIL评分较低与非小细胞肺癌对PD-1单抗治疗的反应显著相关（p = 0.004）。
讨论
在本研究中，发明人分析了全基因组DNA甲基化谱来发现CD8+ T细胞特异性DMPs，并构建了CD8+ MeTIL评分来评估CRC中的CD8+ TILs。通过CD8+ MeTIL特征与CD8+ PaTILs和CD8+ ExTIL特征的紧密关联性，发明人证明了CD8+ MeTIL特征在评估基于CD8+TILs的免疫应答中的可靠性。此外，发明人开发了一种基于qPCR技术的QASM甲基化检测方法，可以在单碱基分辨率下有效地确定CD8+ MeTIL的特征，从而使CD8+ TILs的低成本定量评估成为可能。最后，发明人进一步验证了这一特征在两个CRC组群中对MSI/MSS状态和预后进行分层的能力，并通过对TCGA肿瘤的泛癌分析确定了与几种癌症生存率提高的相关性，并初步验证了其作为标志物预测非小细胞肺癌免疫治疗敏感性的价值。
在CD8+ TILs评估中应用CD8+ MeTIL特征的可靠性来自发明人在多个分析中的交叉验证。首先,GO分析显示73 个CD8 + T特异性DMPs所定位的基因主要包括T细胞活化、增殖、淋巴细胞介导的免疫体,细胞毒作用,抗原抗体结合和细胞膜表面的主要组织相容性复合体,以及其他免疫相关细胞。这一结果表明CD8+ MeTIL特征与CD8+ T细胞功能显著相关。其次，临床及分子特征分析显示，低CD8+ MeTIL评分与右半结肠肿瘤、高分化、MSI-H状态及野生型TP53相关。这些临床病理特征之前已经被证明与基于非甲基化测量方法的CD8+TILs相关44-47。在发明人的CCFR队列中，MSI-H状态与低CD8+ MeTIL评分密切相关，这与之前的研究结果一致，即MSI-H肿瘤通常因为有更多的异种抗原的表达，有更多的CD8+ T细胞，47,48。最后，发明人将CD8+ PaTIL和CD8+ ExTIL结果与CD8+ MeTIL评分进行了比较，均显示出显著的负相关。这表明，特征评分可能是评估CRC中CD8+ TILs的另一种可靠方法。
目前基于qPCR的甲基化检测主要用于确定高/中CpG密度区域多个CpG的平均值36。但是，CD8+ MeTIL评分中包含的DMPs位于低CpG密度区域。尽管EPIC甲基化芯片和焦磷酸测序可以在单碱基分辨率下测定这些孤立的CpGs，但它们都比基于qPCR的甲基化测定（QASM）更昂贵和耗时。这可能解释了为什么在以往的研究中涉及低CpG密度区域的甲基化生物标志物时，往往局限于芯片技术，而无法扩展到进一步的研究和临床应用11,49。因此，发明人开发了一种新的基于qPCR的QASM检测方法，并证明该方法可以有效地测量CD8+ MeTIL评分中每个CpG的甲基化水平。与EPIC甲基化芯片和焦磷酸测序相比，QASM测定CD8+ MeTIL评分是可靠的。基于IHC的CD8+ TILs评估方法，如免疫评分法，由于其复杂的过程和主观的评估受到限制，而发明人基于qPCR的方法以一种客观、经济和简单的方式评估CD8+ TILs，因此不太容易受到不同队列差异性的影响。散点图中CD8+ PaTIL和CD8+ MeTIL对CD8+ TILs的评估结果的差异，部分原因是两种方法本身的特性不同。因此，发明人认为基于qPCR的CD8+MeTIL评分检测方法有潜力广泛应用于临床和CD8+ TILs相关的研究。
发明人研究了CD8+ MeTIL评分如何改善CCFR和SAH-SYSU队列中生存结果的风险分层能力。正如预期的那样，CD8+ MeTIL评分在这两个不同队列中显示了预测预后的价值。MSI-H肿瘤通常表达更多的异种抗原而引发强的局部免疫反应47,48。发明人通过CD8+ MeTIL评分对MSI-H/MSI-L/MSS患者进行进一步分层，有趣的是，MSI-H和富含CD8+ TILs(低CD8+MeTIL评分)的两组中均有最好的生存结果，而MSI-L/MSS和缺乏CD8+ TILs(高CD8+ MeTIL评分)的两组有较差的生存结果。这一结果提示了MSI-H肿瘤中局部免疫应答的抗癌作用。
已有文献证明，MSI-H是对PD-1/PD-L1抑制剂是否有效进行预测的生物标志物4,51。然而，约20%的MSI-H-CRC患者不能从PD-1/PD-L1抑制剂中获益，约10%的MSS-CRC患者也表现出对PD-1/PD-L1抑制剂治疗的应答4,52。重要的是，CD8+ TILs已被报道为免疫治疗的反应标志物6，发明人确实观察到MSS/MSI-L组中存在CD8+ TILs(低CD8+ MeTIL评分)丰富的亚群。基于上述证据和发明人的研究结果，发明人假设低CD8+ MeTIL评分具有识别MSI-L/MSS肿瘤应答者的潜力，我们在非小细胞肺癌患者中证实了这一假设，尽管这仍然还需要在接受免疫治疗患者的队列或临床试验中进行验证。
考虑到肿瘤免疫应答与CRC中较好的预后相关性越来越被认可，发明人进一步检测了CD8+ MeTIL特征在多种癌症中的预测预后价值。有趣的是，CD8+ MeTIL特征也可以预测其他癌症的生存结果，包括LUAD、LUSC、CESC、BRCA、ACC，尽管该特征是基于450K甲基化芯片上可用的CpGs进行筛选的。发明人推测，如果通过QASM测定的CD8+ MeTIL标记能够在这些肿瘤中被评估的话，该特征可能能预测更多肿瘤的生存结局。值得注意的是，发明人证明了低CD8+ MeTIL评分可以预测非小细胞肺癌对免疫治疗的反应。这些结果表明，CD8+MeTIL特征也可以评估其他癌症的免疫反应，从而对患者的预后和对免疫治疗的潜在反应进行分层。此外，这表明CD8+ T细胞特异性DMPs也可能将CD8+ TILs与其他组织区分开来。
结论
在本研究中，发明人开发了一种基于DNA甲基化的CD8+ MeTIL标志物，它可以可靠地评估CRC中基于CD8+ TILs的免疫应答。此外，发明人开发了一种基于qPCR的QASM检测方法，以确定单碱基分辨率下的CD8+ MeTIL特征，这可以定量评估CD8+ TILs，并提高检测效率和成本效益。发明人进一步验证了该特征对两个CRC队列和TCGA队列与其他癌症的MSI/MSS状态和预后进行分层的能力。如果有进一步验证，CD8+ MeTIL有潜力成为一种有效的生物标志物，可以很容易地应用于临床诊断，为包括免疫治疗在内的多种治疗方法的选择提供信息。
补充表
表S1、本研究使用的探针和引物
Figure DEST_PATH_IMAGE010
引物或探针序列的SEQ ID NO.编号由上到下依次为16～46。
表S2、 SAH-SYSU和CCFR队列总生存率的单因素和多因素Cox回归分析
Figure DEST_PATH_IMAGE012
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Claims (10)

1.定量CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组甲基化程度的制剂在制备确定肿瘤预后或肿瘤样本中CD8+ T细胞丰度检测试剂中的应用，其特征在于：所述肿瘤为结直肠癌，所述CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组至少含有cg02430840、cg06113913和cg12673499中的一个，两个或三个CpG位点；或
所述肿瘤选自乳腺癌、肺癌、宫颈鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌，所述CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组含有cg02430840、cg06113913和cg12673499三个CpG位点。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：定量CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组的制剂选自甲基化芯片、甲基化程度检测试剂；
所述样本包括新鲜组织、新鲜冰冻组织、福尔马林固定石蜡包埋组织。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述新鲜组织选自内镜活检组织、穿刺活检组织、液体活检组织。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体活检组织包括淋巴液、血液、腹腔积液、胸腔积液。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肺癌选自肺腺癌、肺鳞状细胞癌；所述乳腺癌为乳腺浸润性癌。
6.一种确定肿瘤预后或肿瘤样本中CD8+ T细胞丰度的系统，包括：
定量装置：用于定量样本中CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组的甲基化程度，所述肿瘤为结直肠癌，所述CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组至少含有cg02430840、cg06113913和cg12673499中的一个，两个或三个CpG位点；或所述肿瘤选自乳腺癌、肺癌、宫颈鳞状细胞癌、肾上腺皮质癌，所述CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组含有cg02430840、cg06113913和cg12673499三个CpG位点；
数据分析装置：基于CD8+ T细胞特异性甲基化位点DMPs组的定量结果，确定肿瘤预后或样本中CD8+ T细胞丰度；
结果展示装置：展示数据分析装置得到的结果。
7.根据权利要求6所述的系统，其特征在于：通过QASM技术确定CpG位点cg02430840、cg06113913和cg12673499的甲基化比例，CD8+ MeTIL评分= cg02430840甲基化比例×0.28724 + cg06113913甲基化比例×0.40171 + cg12673499甲基化比例×0.45016。
8.根据权利要求7所述的系统，其特征在于：所述CD8+ MeTIL评分用于预测样本中CD8+T细胞丰度及肿瘤预后；
评分越低，表明CD8+ T细胞丰度越高，肿瘤预后越好；
评分越高，表明CD8+ T细胞丰度越低，肿瘤预后越差；
特别的，所述CD8+ MeTIL评分的阈值为68，高于68，丰度低，肿瘤预后差；低于68，丰度高，肿瘤预后好。
9.根据权利要求6～8任一项所述的系统，其特征在于：所述定量装置选自QASM定量装置、焦磷酸测序或Illumina EPIC甲基化芯片。
10.根据权利要求6～8任一项所述的系统，其特征在于：所述肺癌选自肺腺癌、肺鳞状细胞癌；所述乳腺癌为乳腺浸润性癌。
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