CN113504324B - 胆汁淤积症预后生物标记物检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于胆汁淤积症指示预后的生物标记物、标记物检测方法及相应试剂盒。预后指示生物标记物选自甘氨酰化猪胆酸(Glyco‑hyoCA或GHCA)、牛磺酰化‑2β,3α,7α,12α‑四羟基胆酸(Tauro‑2β,3α,7α,12α‑Tetrahydroxy bileacid或Tauro‑2β,3α,7α,12α‑THBA)、牛磺酰化猪胆酸(Tauro‑hyoCA或THCA)、Tauro‑3α,6β,7α,12α‑THBA、Tauro‑3α,6α,7α,12α‑THBA、总Tauro‑THBAs中一种或多种。检测发现集中受试者血清/血浆样本中胆汁酸谱并筛选出差异性胆汁酸作为候选指示预后标记物同时制定相应截断值，对验证集应用上述截断值验证其指示预后效能。本发明首次提供了一种可用于胆汁淤积症预后判断的方法及试剂盒，检测效率高，结果准确，适合对胆汁淤积症患者进行早期的预后效果判断，为个体治疗及用药方案提供指导。

Description

胆汁淤积症预后生物标记物检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及胆汁淤积症的预后检测试剂盒及其在胆汁淤积症预后检测中的用途。

背景技术

Alagille综合征(缩写为ALGS)是具有表型特征的慢性胆汁淤积的最常见原因，是一种累及多系统的遗传性疾病，约94％的ALGS由JAG1基因突变引起。该综合征在1969年由Alagille等首次报道。Alagille综合征涉及的脏器包括肝脏、心脏、骨骼、眼睛和颜面等，发病率大约为1/30，000-70，000。其临床表型差异很大，严重者婴儿期就需要肝移植，也可无明显肝病表现生存至成人。此外也有部分患儿胆汁淤积在生命的前几年严重，后逐渐改善。

JAG1突变的类型和位置与疾病的严重性之间缺乏强相关性，甚至在同一家系受影响成员中表型明显不同。遗传给患儿的亲本临床表型亦可非常轻微。基因型-表型缺乏明显相关性限制了遗传数据应用于临床管理。由于依靠早期临床表现和基因信息难以区分预后较好和需要肝移植的患儿，因此寻找可判断预后的生物标志对病人临床管理具有积极意义。

胆汁酸是胆汁的主要组成成分，可作为内源性信号分子参与调节肝脏和周围组织中脂质和糖类的代谢和能量平衡。肝脏、胆囊和肠道协同参与维持人体内胆汁酸的稳态。肝脏或胆道疾病可引起胆汁酸的分布或代谢紊乱，导致血清胆汁酸的组成和含量发生显着变化。胆汁酸是两性分子，同时具有亲水性和疏水性基团。高浓度的胆汁酸蓄积因其细胞毒性作用，可导致严重的肝损伤。

胆汁酸的细胞毒性与其结构相关，疏水性强的胆汁酸具有脂解性，高浓度时具有细胞毒性，共轭(甘氨酰化、牛磺酰化、硫酸化及葡萄糖醛酸化)和羟基化均可通过增加胆汁酸的溶解性来降低胆汁酸的毒性。血和尿中胆汁酸代谢谱是体内肝脏胆固醇代谢和胆汁酸肠肝循环等的综合反映。早在2001年，Wang等在Bsep^-/-(Abcb11^-/-或Spgp^-/-)小鼠胆酸池中检测出高水平的四羟基胆汁酸(Tetrahydroxy bile acid，THBA)并据此推断THBA引起的胆酸池亲水性增高可能是导致小鼠与胆盐外运泵(Bile salt export pump，BSEP)缺陷患儿临床表型差异的原因。后经鉴定，这种THBA为3α,6β,7β,12α-THBA。2017年台湾学者在婴儿胆汁淤积症患儿尿液胆酸谱检测后发现，尿THBA比例>7.23％时指示患儿预后良好，且THBA比例≤7.23％是导致无移植存活率降低的独立因素。后Wang等发现在Bsep和Mdr2双敲除小鼠体内亦具有增加的亲水性胆酸THBA及鼠胆酸(Muricholic acid，MCA)等，这种变化可预防Mdr2^-/-小鼠的肝损伤而起保护作用。发明人通过前期对钠离子-牛磺胆酸钠共转运多肽(Sodium taurocholate co-transporting polypeptide，NTCP)缺陷患儿和小鼠体内胆汁酸的检测还发现，硫酸化的胆酸增加亦可能是引起较轻临床表型的原因。尿液中硫酸化的胆汁酸亦可区分不同严重程度妊娠期胆汁淤积症。据此推断，特定的胆汁酸可以作为胆汁淤积症的预后指标，对于胆汁淤积症的预后指示具有重要临床意义。且目前国际上无相关ALGS患儿胆汁酸谱研究，ALGS患儿胆汁酸谱分析具有十分重要临床意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供了一种用于胆汁淤积症预后检测、判断的生物标记物，检测受试者血液中生物标记物水平的方法，及用于该检测方法的试剂盒。本发明还涉及根据检测到的受试者血液中标记物的浓度水平判断预后状况的方法。将对于预后的判断结论告知预测或治疗对象，指导临床治疗或用药。

本发明的第一方面，提供了胆汁淤积症指示预后标记物及其检测试剂在制备用于胆汁淤积症预后检测试剂盒的应用。

其中，所述胆汁淤积症或胆汁淤积性肝病包括原发性胆汁性胆管炎(Primarybiliary cholangitis，PBC)、原发性硬化性胆管炎(Primary sclerosing cholangitis，PSC)和各种基因缺陷引起的胆汁淤积症。基因缺陷引起的胆汁淤积症包括SLC25A13基因缺陷引起的希特林蛋白缺乏症(Neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrindeficiency，NICCD)、先天性胆汁酸合成障碍(Congenital bile acid synthesis defect，CABS)[例如，CBAS1型，HSD3B7基因缺陷；CBAS2型，AKR1D1基因缺陷及CYP27A1基因缺陷引起的脑腱黄瘤病(Cerebrotendinous xanthomatosis，CTX)]及家族性肝内胆汁淤积症(Progressive familial intrahepatic cholestasis，PFIC)1～6型(进一步的，分别为PFIC1型，ATP8B1(编码FIC1蛋白)基因缺陷；PFIC2型，ABCB11(编码BSEP蛋白)基因缺陷；PFIC3型，ABCB4(编码MDR3蛋白)基因缺陷；PFIC4型，TJP2(编码TJP2蛋白)基因缺陷；PFIC5型，NR1H4(编码FXR蛋白)基因缺陷及PFIC6型，MYO5B(编码MYO5B蛋白)基因缺陷)、由JAG1或NOTCH2基因缺陷引起的Alagille综合征等；

其中，所述标记物选自GHCA、Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA、THCA、Tauro-3α,6β,7α,12α-THBA、Tauro-3α,6α,7α,12α-THBA、总Tauro-THBAs中一种或多种。

本发明第二方面，提供了一种用于胆汁淤积症预后标记物检测的试剂盒，试剂盒中包括用于预后标记物检测的试剂，所述试剂包括预后标记物标准品或稳定同位素标记的与待测预后标记物相同的化合物，其中标准品或稳定同位素标记的化合物用于定量和校正待诊断标记物。

用于胆汁淤积症预后的生物标记物可选自GHCA、Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA、THCA、Tauro-3α,6β,7α,12α-THBA、Tauro-3α,6α,7α,12α-THBA、总Tauro-THBAs中一种或多种。

优选地，所述预后标记物为Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA、GHCA。

进一步优选地，所述预后标记物为Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA。

某些实施方式中，所述试剂盒包含所有测试预后标记物的混合标准品或所有需要测试的诊断标记物的单一标准品。

某些实施方式中，所述标准品为固体形式或是配制好的溶质干粉。

某些实施方式中，所述试剂盒中进一步包括用于标准品制备或者样本测试的溶剂。

某些实施方式中，所述的溶剂为乙腈和甲醇。

本发明第三方面，提供了一种检测、判断胆汁淤积症预后状况的方法，通过检测发现集中受试者血清/血浆样本中胆汁酸谱并筛选出差异性胆汁酸作为候选预后标记物同时制定相应截断值，进而对验证集应用上述截断值验证其指示预后效能。

其中，所述相应诊断标记物的截断值为将已知预后状况的发现集患者血液中有差异的生化指标或胆汁酸进行ROC分析获得。

本发明的第四方面，提供了本发明诊断标记物标准品在制备本发明第一方面所述的胆汁淤积症预后检测试剂盒或试剂中的应用。

其中，所述指示预后标记物选自GHCA、Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA、THCA、Tauro-3α,6β,7α,12α-THBA、Tauro-3α,6α,7α,12α-THBA、总Tauro-THBAs中一种或多种。优选为Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA、GHCA。进一步优选为，Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的可用于胆汁淤积症预后检测的标记物的筛选、验证方法。所述方法包括如下基本步骤：

(一)研究对象的确定、随访及分组

从标本库中查找并整理出所有患儿1岁龄前留取的血标本。根据标本收集时间设置发现集和验证集。对发现集和验证集的研究对象进行随访，根据预后情况的差异将发现集和验证集的对象分为预后好组和预后差组。

(二)研究对象标本处理及分析

从发现集的血浆/血清样本中提取纯化胆汁酸，从验证集的血浆/血清样本中提取纯化胆汁酸。胆汁酸谱分析采用反相超微高效液相色谱/多反应监测-质谱分析(Ultrahighperformance liquid chromatography/multiple-reaction monitoring-massspectrometry，UPLC/MRM-MS)方法。配制标准品溶液，绘制标准曲线。采用常用的统计学方法对检测结果进行统计分析。从发现集筛选能够指示预后的生物标记物并在验证集进行验证。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1:GHCA生存曲线。

有益效果

本发明通过实验证明：1，发现集血标本所有检测的胆汁酸中，预后好组GHCA、Tauro-2β，3α，7α，12α-THBA浓度均明显高于预后差组，差异有统计学意义。可见，GHCA、Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA浓度升高可指示预后好；2，通过比较不同预后组血液中胆汁酸的修饰过程，如羟基化、硫酸化、甘氨酸及牛磺氨酸缀合、氧化还原反应等，发现在预后好的ALGS患儿中，血液中胆汁酸羟基化过程明显增强；这提示了ALGS预后好的机制；3，为验证上述胆酸结果，进一步进行了验证集胆汁酸谱实验，上述羟基化胆酸指标在验证集中差异性分析结果同发现集。证明了本发明筛选获得的指标的可靠性；4，验证集中，GHCA及Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA曲线下面积分别为0.808和0.907，应用GHCA<607.69nM及Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA<79.88nM为截断值判断ALGS患儿预后，其预测正确率分别为72％和88％，Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA取得了较高的预测正确率(敏感度92.31％，特异性83.33％)；5，对上述羟基化胆酸指标进行单因素及多因素Cox生存分析发现，GHCA是唯一影响ALGS患儿生存时间的因素(P＝0.006)，风险比10.366(1.987，54.075)；6，本发明首次提供了一种可用于胆汁淤积症预后判断的方法及试剂盒，检测效率高，结果准确，适合对胆汁淤积症患者进行早期的预后效果判断，为个体治疗及用药方案提供指导。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

实施例1研究对象确定、随访及分组

1.1研究对象

复旦大学附属儿科医院及其医联体成员复旦大学附属金山医院门诊及病房经临床及基因诊断明确为JAG1突变致ALGS的患儿1岁龄前留取的血标本。2015/01/01-2017/12/30期间留取标本为发现集，2018/01/01-2020/10/31期间留取标本为验证集。ALGS诊断标准如下：无家族史者，经病理证实存在肝脏小叶间胆管缺乏，符合心脏杂音、眼部异常(角膜后胚胎环)、蝴蝶形椎骨、肾脏异常和特殊面容5项中3项或以上者可诊断；无家族史者，未进行肝脏病理检查，符合5项中4项或以上者可诊断；存在JAG1基因突变者符合上述5项中1项即可确诊。

1.2随访及分组

患儿的临床资料来自于就诊时的既往研究者资料记录、复旦大学附属儿科医院(及其医联体成员复旦大学附属金山医院)住院及门诊电子信息系统资料，以及随访中父母提供的信息。

分组方法：

预后差组(poor prognosis)：随访中出现下列情况之一者：1)死亡(肝脏原因)/肝移植/等待肝移植，2)1岁后仍持续严重黄疸(TB≥85μmol/L)。

预后好组(good prognosis)：同时符合以下条件者：1)自体肝生存，2)末次随访TB<85μmol/L。患儿随访工作持续至2021年1月10号。

排除末次随访时年龄不满1岁患儿标本。

实施例2研究对象标本处理及分析

2.1标本处理(一)发现集血清/血浆冻干标本处理：

取血清/血浆100μL，真空干燥，并贮存在-80℃冰箱，处理后采用UPLC/MRM-MS技术进行定量。

S1提取胆汁酸：取出100μl血清/血浆冻干标本，加入LC-MS级水(H₂O)100μl溶解，应用涡旋仪震荡后再放入超声震荡仪中15分钟，使血清/血浆溶质充分溶解；取出30μl置入新的EP管中，加入预先配制好的乙腈：甲醇体积比1：1混合溶液90μl(水：有机溶剂保持1：3比例)，涡旋10秒，冰水中超声震荡120秒，重复上述涡旋和超声震荡步骤三次使溶质充分溶解，然后高速低温离心，离心条件为15000rpm，在15℃下离心10分钟；取100μl加入EP管待用；S2纯化胆酸，去除杂质：采用反相固相提取(Reversed-phase solid-phaseextraction，RP-SPE)方法，每个Strata-X聚合反相萃取柱中加入1mL纯甲醇激活萃取柱，然后加压，应用氮气的压力使萃取柱内液体流出，后采用1mL水洗柱；然后采用预先配制好的样品溶液过柱(先加900μl水，再加100μl样品)；后1mL水清洗脱盐，再采用预先配制好的ACN：MeOH体积比1：1混合溶液1mL洗脱，收集洗脱下的液体入玻璃管氮吹仪吹干后放入-20℃冰箱暂时储存等待重融后上机检测。

(二)验证集血清/血浆标本处理

第一步：提取胆酸

1、取30μL血清/血浆，加入预先配制好的ACN：MeOH(1：1)混合溶液90μL，涡旋10秒；

2、高速低温离心：15000rpm，15℃，10分钟；

3、取90μL入Ep管；

第二步：纯化胆酸，去除杂质(RP-SPE)

1、每个萃取柱中加入1mL纯甲醇激活萃取柱，加压，应用氮气的压力使萃取柱内液体流出(注意不要流干)

2、1mL水洗柱

3、样品过柱(取80μL样品+900μL水)(先加水后加样品)

4、1mL水洗柱

5、1mL预先配制好的ACN：MeOH(1：1)洗柱，收集洗脱下的液体入玻璃管

6、氮吹仪干燥

2.2胆汁酸谱绘制及分析

胆汁酸谱分析采用反相超微高效液相色谱/多反应监测-质谱分析(UPLC/MRM-MS)方法：

(一)主要仪器、试剂与耗材：

胆汁酸谱分析采用的主要仪器、试剂与耗材列于表1：

表1

自制试剂配制：

50％v/v甲醇-水溶液：等体积纯甲醇和等体积水混合(具体量根据总量计算)；

50％v/v乙腈-甲醇溶液：等体积纯乙腈和等体积纯甲醇混合(具体量根据总量计算)；

IS溶液：2等分装有14种氚同位素标记胆酸标准液的胆酸类似物溶解在20ml 50％v/v甲醇-水溶液中；

(二)UPLC-MRM-MS色谱条件和质谱条件

质谱采用MLtimate 3000RSLC系统和4000QTRAP质谱仪(发现集)及6000QTRAP质谱仪(验证集)通过电喷雾电离源(Electrospray ionization，ESI)在负离子模式下采集；色谱柱：BEH C₁₈(2.1mm×150mm，1.7μm)UPLC柱；流动相：0.01％v/v甲酸铵-水(A液)和0.01％v/v甲酸-乙腈(B液)；83种胆酸的最佳MRM操作参数见表S1；三个常见的Q1(母离子)到Q3(子离子)包含了每种非结合胆汁酸，甘氨酸(Glycine)和牛磺酸(Taurine)结合胆酸；每一个结合胆酸组的检测20ms的保留时间(Retention time，RT)，对于非结合的THBAs和Tauro-THBA检测60ms。每一个特定的MRM的碰撞能量(Collision energy，CE)选用其各组同分异构体胆酸的中位数。详细步骤以及部分数据见已发表论文(Han J,Liu Y,Wang R,et al.AnalChem[J].2015；87(2):1127-1136)。

表S1 83种胆汁酸和14种同位素标记胆汁酸内参的相关参数

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(三)标准品溶液配制及标准曲线绘制

配制S1：每1kit(1nmol/L)胆酸标准品溶解在100μl IS溶液中，即得到浓度为10nmol/mL(10000nmol/L，nM)的标准溶液S1；

配制S2-S10：从上述配制好的S1中取25ul溶解在75μl IS溶液中，即得到稀释1/4的S2(S2浓度为1/4的S1)，依次按照相同的方法配制得S3～S10，S3的浓度为1/4的S2，依次类推，……，S10的浓度为1/4的S9。

标准溶液S1-S10和从标本中获得的胆酸同时上机检测。上样方法如下：

发现集：上述经吹干仅保留溶质的玻璃管(由实施例2中2.1的(一)和(二)获得)中分别加入配制好的IS溶液90μl，进样量为20μl；若应用analyst3.0软件得到峰谱图后峰值>1.0*10⁶，则样本需要稀释10倍后再次上样，稀释方法为从配制好的原溶液中取出10μl后再加入90μl IS溶液充分混匀后再次上样20μl；

验证集：上述经干燥后仅保留溶质的玻璃管(由实施例2中2.1的(三)获得)中分别加入配制好的IS溶液50μl，取5μl上样；

若应用analyst3.0软件得到峰谱图后峰值>1.0*10^6，则样本需要1：10稀释后再次上样，稀释方法为从原溶液中取出5μl+45μl IS溶液充分混匀后再次上样5μl。若需要1：100稀释，则分两次1:10稀释。

绘制标准曲线：检测结果为峰面积，峰面积/IS面积＝面积比值，根据S1-S10的面积比值和相对应已知浓度应用二元一次方程或二元二次方程可绘制相应的标准曲线，根据标准曲线求得到所检测标本中相应的浓度值，再根据上述不同的处理方式换算原标本溶液中的浓度值及调整单位(统一单位为nmol/L简写为nM)。

(四)统计分析方法：

应用IBM SPSS statistics 22.0软件统计分析；应用GraphPad Prism 8.0软件作图。数据符合正态分布时，采用t检验；当数据不符合正态分布时，采用非参数Mann-WhitneyU检验。数据用平均值(Mean)±标准差(Standard deviation，SD)或中位数(四分位数，interquartile range，IQR)表示。应用受试者工作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve，简称ROC曲线)分析计算曲线下面积(Area under the cure，AUC)。应用Cox比例风险模型进行单因素和多因素回归生存分析，Kaplan-Meier曲线确定患儿无肝移植存活的概率。双侧P<0.05为差异具有统计学意义。

实施例3结果分析讨论

3.1人口学特征

共21例JAG1基因突变且临床确诊ALGS患儿纳入血液标本发现集研究(表2)，其中预后差组(Poor prognosis)10例，男5例；预后好组(Good prognosis)11例，男6例，两组性别无统计学差异(P＝0.771)。10例预后差患儿中2例一岁时因肝衰竭死亡，4例一岁左右接受肝移植手术，余4例患儿随访至2岁2月～3岁10月龄仍持续中重度黄疸。11例预后好患儿5例轻度黄疸，6例患儿黄疸均消退。预后好患儿随访时间2.83(1.83，4.00)年长于预后差患儿1.80(1.00，2.44)年(P＝0.003)，可能因预后差组6例患儿较早接受肝移植手术或死亡后终止随访。两组患儿选取标本均为1岁前黄疸未完全消退时标本，留取标本时两组患儿年龄无统计学差异。

3.2不同预后ALGS患儿胆汁酸谱分析

发现集：

发现集血标本所有检测的胆汁酸中，预后好组GHCA，Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA明显多于预后差组，差异有统计学意义(P＝0.036及0.013)，THCA(P＝0.099)，Tauro-3α,6α,7α,12α-THBA(P＝0.061)及Tauro-3α,6β,7α,12α-THBA(P＝0.099)亦有高于预后差组的趋势，但差异无统计学意义。GHCA、THCA及Tauro-THBAs均为羟基化后亲水性很强的胆汁酸。3-oxo-CA虽在预后差组多于预后好组(P＝0.008)，但其浓度均非常小(预后差组患儿平均浓度19.34μmol/L，预后好组平均浓度5.52μmol/L)，其临床意义可能不大。具体检测结果见下表4。

表4-不同预后患儿发现集血液中初级及次级胆汁酸浓度及差异

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注：CA：Cholic acid，胆酸；CDCA：Chenodeoxycholic acid，鹅去氧胆酸；DCA：Deoxycholic acid，脱氧胆酸；LCA：lithocholic acid，石胆酸；UDCA：Ursodeoxycholicacid，熊去氧胆酸；HCA：hyoCA，猪胆酸；MCA：muricholic acid，鼠胆酸；THBA：Tetrahydroxylated bile acids，四羟基胆汁酸；AUC：Area under the curve；^&：Mann-Whitney U test

进一步的，将血液中胆汁酸按照不同种类分类并计算总和及其所占比例，比较两组差异发现，在预后好组患儿血液中，总Tauro-THBA浓度及比例均明显高于预后差组(P值分别为0.001及0.010)，但硫酸化胆酸、甘氨酸及牛磺氨酸缀合胆酸，甚至结合胆酸及未结合胆酸分类加权时均无统计学差异(表5)。

表5不同预后ALGS患儿血液中不同分类胆酸浓度及比例差异分析(发现集)

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除上述外，我们还比较了血液中胆汁酸的修饰过程，如羟基化、硫酸化，甘氨酸及牛磺氨酸缀合，氧化还原反应等。在预后好患儿中，血液中胆汁酸羟基化过程明显增强(GHCA/GCDCA及THCA/TCDCA)(P值分别为0.013和0.010)，余修饰过程两组患儿无统计学差异(表6)。

表6-不同预后ALGS患儿血液中修饰胆酸与未修饰胆酸摩尔比(发现集)

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注：A，Hydroxylation羟基化；B，Sulfation硫酸盐化；C，Taurine conjugation牛磺酸缀合；D，Glycine conjugation甘氨酸缀合；E，Glucoside葡萄糖苷化；F，23C bileacid：23C胆酸；G，Oxidoreduction氧化还原反应；&：Mann-Whitney U test

实施例4预后生物标记物筛选及验证

4.1标记物筛选及验证

为筛选能指示预后的生物标记物，对发现集血液中羟基化的胆汁酸进行ROC分析(表7)。验证集患儿血液标本中上述指标差异性分析结果基本同发现集(表8)。

表7不同预后患儿发现集血液中羟基化胆汁酸ROC分析

注：CA：Cholic acid，胆酸；GHCA：GlycohyoCA，甘氨酰化猪胆酸；THCA：TaurohyoCA，牛磺酰化猪胆酸；THBA：Tetrahydroxylated bile acids，四羟基胆汁酸；^&：Mann-Whitney U test

表8-羟基化胆酸在验证集患儿血液中浓度差异

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注：CA：Cholic acid，胆酸；GHCA：GlycohyoCA，甘氨酰化猪胆酸；THCA：TaurohyoCA，牛磺酰化猪胆酸；THBA：Tetrahydroxylated bile acids，四羟基胆汁酸；^&：Mann-Whitney U test

在上述羟基化胆酸中，选择AUC>0.7，P<0.05的胆酸，Youden指数最大时取cut-off值，最终血液中GHCA及Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA进入验证集进行验证，结果如下(表9)：应用Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA<79.88nM为截断值判断预后，在验证集取得了88％的预测正确率(敏感度92.31％，特异性83.33％)，阳性预测值5.54，阴性预测值0.09，为较好的指示预后指标；应用GHCA<607.69nM为截断值判断预后，在验证集取得了72％的预测正确率(敏感度46.15％，特异性100％)，阳性预测值0.00，阴性预测值0.54，其指示预后效能差于Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA。

表9-指示预后指标验证效能分析

注：^$：fisher’s exact test；+LR：positive likelihood ratio，阳性预测值；-LR：negative likelihood ratio；阴性预测值

4.2单因素及多因素Cox生存分析

将肝移植或死亡作为结局，对上述46例(发现集21例，验证集25例)血液胆汁酸谱检测的患儿应用上述羟基化指标进行单因素及多因素生存分析，结果如下(表10)：单因素分析显示血液中羟基化胆酸GHCA，THCA，Tauro-3α,6β,7α,12α-THBA，Tauro-2β,3α,7α,12α-THBA及总Tauro-THBAs减少与生存时间呈负相关，是不良预后因素；多因素分析发现，GHCA是唯一影响生存时间的因素(P＝0.006)，风险比10.366(1.987，54.075)。在GHCA<607.69nM的13例患儿中，7例死亡或肝移植，在GHCA>607.69nM的33例患儿中，仅2例患儿肝移植，差异有统计学意义。

表10-ALGS患儿单因素及多因素生存分析

*：log-rank test

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (6)

1.指示预后标记物检测试剂在制备用于JAG1突变致ALGS预后检测试剂盒的应用，其特征在于，所述标记物选自甘氨酰化猪胆酸（即Glyco-hyoCA或 GHCA）和/或牛磺酰化-2β, 3α, 7α, 12α-四羟基胆酸（即Tauro-2β, 3α, 7α, 12α-Tetrahydroxy bile acid或Tauro-2β, 3α, 7α, 12α-THBA）。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述指示预后标记物检测试剂包括诊断标记物标准品或稳定同位素标记的与待测诊断标记物相同的化合物，其中标准品或稳定同位素标记的化合物用于定量和校正待诊断标记物。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过检测发现集中受试者血清/血浆样本中胆汁酸谱并筛选出差异性胆汁酸作为候选预后标记物同时制定相应截断值，进而对验证集应用上述截断值验证其指示预后效能；所述预后标记物的截断值为发现集中已知预后状况的JAG1突变致ALGS患者血液中有差异的生化指标及胆汁酸进行ROC分析获得。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含所有测试预后胆汁酸标记物的混合标准品或所有需要测试的标记物的单一标准品。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述标准品为固体形式或是配制好的干粉溶质。

6.据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒还包括用于标准品制备或者样本测试的溶剂。

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