CN110305861B - 构建多点突变核酸序列的方法 - Google Patents

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CN110305861B CN201910648862.8A CN201910648862A CN110305861B CN 110305861 B CN110305861 B CN 110305861B CN 201910648862 A CN201910648862 A CN 201910648862A CN 110305861 B CN110305861 B CN 110305861B
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Abstract

本发明公开了一种构建多点突变核酸序列的方法，涉及基因工程技术领域。本发明公开的构建多点突变核酸序列的方法利用依赖于甲基化的限制性内切酶和5‑甲基dCTP等来达到快速构建基因多点突变。该方法可以快速、便捷地构建出具有多点突变核酸序列。

Description

构建多点突变核酸序列的方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及构建多点突变核酸序列的方法。
背景技术
基因工程构建重组质粒不仅步骤繁琐、耗时长及成本高额，而且针对单点突变或多点突变更是需要花费大量时间。例如：采用直接合成DNA其成本较高往往还需要针对不同的位点突变合成不同模板；另外当突变两个以上氨基酸位点时往往需要先利用常规PCR方法引入突变待测序正确再进行第二轮突变。本研究所采用方法能经过三轮PCR仅仅只需一次测序就能到达同时引入三个氨基酸突变，极大节约了时间及成本。
此外，以往单点突变通过重叠延伸PCR或DpnI来达到，但是仍然需要传统的酶切、连接。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供构建多点突变核酸序列的方法。该方法可以快速、便捷地构建出具有多点突变核酸序列。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种构建多点突变核酸序列的方法，其包括：
步骤a：利用具有第一突变位点的第一引物扩增目标核酸分子，得到第一产物；其中，所述目标核酸分子为双链环状结构且具有甲基化位点；
步骤b：利用依赖于甲基化的限制性核酸内切酶处理所述第一产物，得到不具有甲基化位点的第二产物；
步骤c：利用具有第二突变位点的第二引物扩增所述第二产物，得到第三产物；其中，在扩增时，所用的dCTP为5-甲基dCTP；
步骤d：消化所述第三产物中的仅具有第一突变但不具有甲基化位点的单链环状结构的核酸分子，得到第四产物。
得到的第四产物即为在步骤a中的目标核酸分子的基础上引入了两个突变的核酸分子，如果需要引入更多突变位点的话，则仅需重复步骤a-b(这种情况引入的奇数数量的突变)或a-d(这种情况引入的是偶然数量的突变)即可。本发明提供的构建多点突变核酸序列的方法操作简单，该方法操作中不需要传统的酶切和连接步骤，通过简单的扩增和消化步骤即可，既可以在目标核酸分子中引入需要的突变位点。
需要说明的是，得到的第一产物中主要含有具有第一突变位点的双链环状结构的目标核酸分子，包括两种类型双链环状结构，第一种类型是其中一条链不具有第一突变位点具有甲基化，另一条链具有第一突变位点不具有甲基化；第二种类型两条链均具有第一突变位点但不具有甲基化；
这样，在后续步骤b中，依赖于甲基化的限制性核酸内切酶可以消化上述第一种类型双链环状结构核酸分子的具有甲基化位点的单链，这样，得到的第二产物主要含有的单链环状结构和双链环状结构的核酸分子，这些核酸分子均具有第一突变位点但不具有甲基化位点；
这样，在后续步骤c中，以5-甲基dCTP作为底物，以第二产物作为模板进行的扩增，得到的第三产物主要含有两种类型的双链环状结构的核酸分子，i：一条链具有两个突变位点和甲基化位点，另一条链仅具有第一突变但不具有甲基化位点；ii：两条链具有两个突变和甲基化位点。
这样，在步骤步骤d中，通过消化第三产物其中的第i种类型的仅具有第一突变但不具有甲基化位点单链，得到主要含有具有两个突变和甲基化位点的双链和单链环状结构的核酸分子的第四产物，这样的第四产物既可以作为模板，即作为重复前述步骤a-b或a-d时的起始物质，继续引入其他突变，也可以作为终产物，供后续步骤使用。
其中，需要说明的是，具有第一突变位点的第一引物和具有第二突变位点的第二引物均是本领域技术人员根据在目标核酸分子上的目标突变位点的位置和类型容易设计出的，根据不同的目标突变位点可以设计相应的扩增引物。
在可选的实施方式中，步骤d中，利用对Dcm甲基转移酶甲基化敏感的限制性核酸内切酶和核酸外切酶处理所述第三产物以消化所述仅具有第一突变但不具有甲基化位点的单链环状结构的核酸分子，得到所述第四产物。
在可选的实施方式中，对所述Dcm甲基转移酶甲基化敏感的限制性核酸内切酶选自ApaI、Acc65I、AlwNI、EcoRII和EaeI。
在可选的实施方式中，所述核酸外切酶为核酸外切酶V。
在可选的实施方式中，在步骤c中，利用所述第二引物扩增所述第二产物之前，使用甲基转移酶对所述第二产物进行甲基化修饰；
在步骤d中，往所述第三产物中加入对所述甲基转移酶甲基化不敏感的限制性核酸内切酶，以消化所述仅具有第一突变但不具有甲基化位点的单链环状结构的核酸分子，得到所述第四产物。
在可选的实施方式中，所述甲基转移酶为Dam甲基转移酶。
在可选的实施方式中，对所述Dam甲基转移酶甲基化不敏感的限制性核酸内切酶选自DpnI、BamHI、Sau3AI、BglII和PvuI。
在可选的实施方式中，步骤b中，所述依赖于甲基化的限制性核酸内切酶选自FspEI、MspJI和LpnPI。
在可选的实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括：将线性化的目标核酸分子克隆至质粒载体中，将所述质粒载体转入Dcm+菌株扩增，提取所述质粒载体，即为具有环状结构且具有甲基化位点的所述目标核酸分子。
优选地，Dcm+菌株选自BL21(DE3)、C600、HB101和JM109。
在可选的实施方式中，所述线性化的目标核酸分子为DNA序列；
优选地，所述DNA序列为基因序列或启动子序列。
当然，需要说明的是，在其他的一些实施方式中，目标核酸分子可以是本领域技术人员任意感兴趣的DNA序列，并不限于基因序列或启动子序列。
优选地，步骤a和步骤c中，扩增时所用的DNA聚合酶均为高保真DNA聚合酶；
优选地，所述高保真DNA聚合酶选自AccuPrime DNA聚合酶、permeSTAR DNA聚合酶、pyrobest DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶，Blend Taq DNA聚合酶、Phi9DNA聚合酶、Klenow酶、Q5超保真DNA聚合酶、KODTM DNA聚合酶和HS DNA聚合酶中的任意一种。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中的第一个点突变测序峰图；箭头所示位置为突变位置；
图2为实施例1中的第二个点突变测序峰图；箭头所示位置为突变位置；
图3为实施例1中的第三个点突变测序峰图；箭头所示位置为突变位置；
图4为实施例1中的突变前后氨基酸序列比对；箭头所示位置为突变位置。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
以SEQ ID NO.1作为出发序列，利用本实施例构建多点突变核酸序列的方对其进行突变，以构建出具有3个突变位点的突变序列；
3个突变分别是：
突变1：C149A；
突变2：A244G、A245C；
突变3：A654G、A655C。
SEQ ID NO.1所示序列命名为hIgG1Fc 1.4；其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。突变后的序列命名为hIgG1Fc 1.5，其核酸序列如SEQ ID NO.3所示；其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。
具有步骤如下：
1.利用质粒提取试剂盒(生工B110091-0050)提取需要突变的含目的基因(SEQ IDNO.1)的具有甲基化的双链环状结构的原始质粒，该原始质粒来源于Dcm+菌株。
2.设计针对目的基因单点突变即突变1的反向PCR引物1F/1R。其中：
1F:TGGTGGaCGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAG；
1R:CACGtCCACCACCACGCAGGTCACCTCGGGGGTG。
引物1F/1R用于引入突变1，下划线处小写字母为突变位点。
3.利用Q5高保真DNA聚合酶(NEB#M0491L)进行扩增，具体扩增体系及程序如下：
5×Q5PCR buffer 10ul
5×Q5High GC Enhancer 10ul
dNTP 4ul
引物 1.5ul/1.5ul
模板 0.5ul
H<sub>2</sub>O 22ul
Q5高保真DNA聚合酶 0.5ul
扩增程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃210s、循环30次；72℃5min；4℃保温。
4.向50ul PCR扩增体系中加入甲基化依赖限制性内切酶HPaII 1ul消化未突变原始质粒。
5.DNA回收试剂盒(天根DP209-02)回收突变后产物。
6.利用针对目的基因突变2的反向PCR引物2F/2R，相应扩增程序及体系如下：
5×Q5PCR buffer 10ul
5×Q5High GC Enhancer 10ul
dATP/dTTP/dGTP/5’甲基-dCTP(10mM each) 1ul/1ul/1ul/1ul/1ul
引物 1.5ul/1.5ul
模板 0.5ul
H<sub>2</sub>O 22ul
Q5高保真DNA聚合酶 0.5ul
扩增程序：94℃3min；94℃30s、55℃30s、72℃210s、循环30次；72℃5min；4℃保温。
其中，引物2F的序列如下：
AGTACgcCAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTG；
引物2R的序列如下：
GTGCTggcGTACTGCTCCTCGCGGGGCTTGGTC。
引物2F/2R用于引入突变2，下划线处小写字母为突变位点。
7.向50ul PCR扩增体系中加入甲基敏感性内切酶Apa I 1ul消化未甲基化产物。
8.DNA回收试剂盒(天根DP209-02)回收突变后产物。
9.重复步骤2-5，用引物3F/3R替换1F/1R。
其中引物3F的序列如下：
TGCACgcCCACTACACCCAGAAGAGCCTGAG；
引物3R的序列如下：
AGTGggcGTGCAGGGCCTCGTGCATCACGCTG。
引物3F/3R用于引入突变3，下划线处小写字母为突变位点。
10.将回收后的产物取10ul至50ul DH5a感受态混匀，冰上静置30min,42℃热激90s，冰上静置2min，加入无抗LB培养基500ul,37℃250rpm震荡培养1h,6000rpm离心3min，去掉上清剩余约50进行涂板，37℃倒置培养24h，次日挑选阳性克隆进行测序，得到的突变序列的测序结果显示与SEQ ID NO.3一致。
测序结果见图1-图3，突变前后的蛋白序列比对见图4，第50位氨基酸残基A突变为D，第82位氨基酸残基N突变为A，第219位氨基酸残基N突变为A。可见，采用本实施例的方法，可以在SEQ ID NO.1中准确地引入了上目标突变(突变1：C149A；突变2：A244G、A245C；突变3：A654G、A655C。)：从上述的构建过程可以看出，本实施例的构建方法操作简单便捷，不需要重叠延伸PCR、酶切和连接等步骤，该方法也不需要在每次引入点突变后进行测序后再进行下一步的突变引入，而是所有突变引入后最后测序验证，引入的突变位点准确，突变序列未出现目标突变位点之外的其他突变。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司
<120> 构建多点突变核酸序列的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctggcc 60
ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 120
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggcc gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg cgaggagcag 240
tacaacagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 420
gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 600
cgctggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660
tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggcaagtaat gagaattc 708
<210> 2
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 3
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctggcc 60
ggcggcccca gcgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatcagccgc 120
acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggaccccga ggtgaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg cgaggagcag 240
tacgccagca cctaccgcgt ggtgagcgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgagcaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 360
atcagcaagg ccaagggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc ccccagccgc 420
gacgagctga ccaagaacca ggtgagcctg acctgcctgg tgaagggctt ctaccccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540
cccgtgctgg acagcgacgg cagcttcttc ctgtacagca agctgaccgt ggacaagagc 600
cgctggcagc agggcaacgt gttcagctgc agcgtgatgc acgaggccct gcacgcccac 660
tacacccaga agagcctgag cctgagcccc ggcaagtaat gagaattc 708
<210> 4
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
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Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
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115 120 125
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130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ala His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230

Claims (15)

1.一种构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，其包括：
步骤a：利用具有第一突变位点的第一引物扩增目标核酸分子，得到第一产物；其中，所述目标核酸分子为双链环状结构且具有甲基化位点；
步骤b：利用依赖于甲基化的限制性核酸内切酶处理所述第一产物，得到不具有甲基化位点的第二产物；
步骤c：利用具有第二突变位点的第二引物扩增所述第二产物，得到第三产物；其中，在扩增时，所用的dCTP为5-甲基dCTP；
步骤d：消化所述第三产物中的仅具有第一突变但不具有甲基化位点的单链环状结构的核酸分子，得到第四产物。
2.根据权利要求1所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，步骤d中，利用对Dcm甲基转移酶甲基化敏感的限制性核酸内切酶和核酸外切酶处理所述第三产物以消化所述仅具有第一突变但不具有甲基化位点的单链环状结构的核酸分子，得到所述第四产物。
3.根据权利要求2所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，对所述Dcm甲基转移酶甲基化敏感的限制性核酸内切酶选自ApaI、Acc65I、AlwNI、EcoRII和EaeI中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，所述核酸外切酶为核酸外切酶V。
5.根据权利要求1所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，在步骤c中，利用所述第二引物扩增所述第二产物之前，使用甲基转移酶对所述第二产物进行甲基化修饰；
在步骤d中，往所述第三产物中加入对所述甲基转移酶甲基化不敏感的限制性核酸内切酶，以消化所述仅具有第一突变但不具有甲基化位点的单链环状结构的核酸分子，得到所述第四产物。
6.根据权利要求5所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，所述甲基转移酶为Dam甲基转移酶。
7.根据权利要求6所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，对所述Dam甲基转移酶甲基化不敏感的限制性核酸内切酶选自DpnI、BamHI、Sau3AI、BglII和PvuI中的至少一种。
8.根据权利要求1-7任一项所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，步骤b中，所述依赖于甲基化的限制性核酸内切酶选自FspEI、MspJI和LpnPI中的至少一种。
9.根据权利要求1-7任一项所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，在步骤a之前，所述方法还包括：将线性化的目标核酸分子克隆至质粒载体中，将所述质粒载体转入Dcm+菌株扩增，提取所述质粒载体，即为具有环状结构且具有甲基化位点的所述目标核酸分子。
10.根据权利要求9所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，Dcm+菌株选自BL21(DE3)、C600、HB101和JM109。
11.根据权利要求9所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，所述线性化的目标核酸分子为DNA序列。
12.根据权利要求11所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，所述DNA序列为基因序列。
13.根据权利要求11所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，所述DNA序列为启动子序列。
14.根据权利要求11所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，步骤a和步骤c中，扩增时所用的DNA聚合酶均为高保真DNA聚合酶。
15.根据权利要求14所述的构建多点突变核酸序列的方法，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶选自AccuPrime DNA聚合酶、permeSTAR DNA聚合酶、pyrobest DNA聚合酶、pfuDNA聚合酶，Blend Taq DNA聚合酶、Phi9DNA聚合酶、Klenow酶、Q5超保真DNA聚合酶、KODTMDNA聚合酶和HSDNA聚合酶中的任意一种。
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