CN103088015A - 一种dna多位点定向突变方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种DNA多位点定向突变方法，根据DNA突变位点设计包含Class IIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，经分段PCR扩增、酶切、连接反应得到连接产物，并以该连接产物直接进行PCR扩增，实现DNA多位点突变。本发明能快速高效地同时实现DNA多位点定向突变。

Description

一种DNA多位点定向突变方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种基因定点突变方法，具体涉及一种DNA多位点定向突变的方法。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，生物工作者越来越多地把研究重点转移到基因功能上。基因定点突变技术正适应了这一要求，通过有目的地将蛋白链上某一个或几个氨基酸突变为其它氨基酸，以确定蛋白的结构和功能中心。通过将启动子上顺式反应元件的一个或几个碱基突变，以探索该元件的功能中心。另外，定点突变技术也为基因工程改造、优化、提高酶的活性提供了一个途径。

PCR介导的定点突变技术因具有高效、便捷、经济等优点而倍受瞩目。基于PCR技术的发展，许多定点突变的方法得到进一步改进，例如，重叠PCR技术(Gene Splicing by OverlapExtension PCR，OE-PCR)，基于Class IIS限制性内切酶的DNA直接连接(Splicing by DirectedLigation，SDL)技术以及反向PCR技术等。这些技术的共同之处都是采用PCR技术通过特定的引物设计引入突变位点，不同之处在于获得带有全部突变位点的全长DNA片段的方法不同。OE-PCR技术利用首轮PCR引入的相同序列的互补进行后续的延伸或PCR获得全长片段；SDL技术利用酶切产生的粘性末端序列互补连接得到中间拼接产物，再将中间拼接片段连接到克隆载体，进行克隆子转化、筛选，得到带有突变的基因片段。

现有技术的上述方法，在多位点定向突变的实践工作中均存有一些不足，例如，OE-PCR技术原理简单明了，但在实际操作中，当需要连接的中间片段数量多于三个时，准确拼接效率就会降低。改进的OE-PCR方法中“两两混合法”(double-mixing)、“步步拼接法”(Step-by-stepassembling)、“顺序连接法”(Sequentially connecting)等，虽提高了片段的正确拼接效率，但是多步的延伸、PCR反应都需要优化才能得到最适条件，因而费时费力。而SDL方法，虽在多个中间片段连接中具有优势，但通常都需要将拼接产物连接到克隆载体、通过转化、菌落筛选才能得到需要的DNA片段，耗时较多，增加工作量，因而应用并不广泛。

发明内容

本发明采用了SDL技术的基于Class IIS内切酶和T4连接酶的中间片段连接策略及OE-PCR技术获取全长片段PCR扩增策略，克服了现有技术的上述缺陷，其目的是提供一种相对快速、操作简单、成本较低的DNA拼接及基因多位点定向突变的方法，利用含有Class IIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，通过PCR扩增、Class IIS限制性内切酶酶切、T4DNA连接酶连接、连接产物直接PCR扩增的方法，来实现对DNA片段进行拼接及对多个位点同时突变的目的。

本发明公开了一种DNA多位点定向突变方法，根据DNA突变位点，设计包含Class IIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，经分段PCR扩增、酶切、连接反应得到连接产物，并以该连接产物直接进行PCR扩增，实现DNA多位点突变。

本发明DNA多位点定向突变方法，包括以下步骤：

步骤a)构建引物；所述引物包括外部引物和内部引物；

其中，所述外部引物有两条：5’端的正向外部引物和3’端反向外部引物，所述外部引物的长度通常为18-30个碱基。正向外部引物序列与目标基因5’端序列相同；反向外部引物序列为目标基因3’端序列的反向互补序列。优选地，根据实验需要，也可以在外部引物的外侧引入限制性内切酶位点。

其中，所述内部引物包含正向内部引物和反向内部引物。优选地，根据突变实验的具体要求的不同，内部引物可设计为多条。所述内部引物的一般序列组成自5’端到3’端依次为：保护碱基、Class IIS限制性内切酶识别位点、Class IIS限制性内切酶切割位点、以及目标基因区域。进一步优选地，内部引物设计序列由5’端到3’端依次为：2-3个保护碱基、Class IIS限制性内切酶识别位点、Class IIS限制性内切酶切割位点(即拟突变碱基区域)、目标基因区域。

本发明中，根据拟突变碱基所处序列的位点及突变方式，分别设计所述内部引物的ClassIIS限制性内切酶切割位点序列组成。具体地，当拟突变位点为单个碱基突变，包括插入、缺失和置换突变，该突变碱基可以直接在Class IIS限制性内切酶切割位点体现；当拟突变位点为多个连续碱基的缺失突变时，Class IIS限制性内切酶切割位点应该设计为目标基因序列。

本发明中，目标基因区域是指要进行研究的特定基因的序列。例如，实施例1中的AnSh基因序列即为该实施例中引物设计所指的目标基因区域。优选地，内部引物设计时，目标基因区域的碱基数为17-30bp。进一步优选地，目标基因区域的碱基数为18-25bp。

本发明中，由于相邻两个片段的拼接是通过以酶切产生的粘性末端互补进行，因此，将要连接的DNA片段对应的引物切割位点的碱基应该是互补序列。如，实施例1中R1与F2，R2与F3，R3与F4，R4与F5，R5与F6中的切割位点序列都是互补的。

步骤b)分段PCR扩增：

利用步骤a中构建的所述内部引物和外部引物，以目标基因为模板，将目标基因对应的引物两两组合，通过分段高保真PCR扩增，分别扩增出各段序列，然后，将各扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，并分别回收各个目的片段。本发明中，目的片段指实验设计分段PCR扩增想要获得的目标基因分段的DNA片段，如实施例中以目标基因为模板，分别以F1和R1、F2和R2、F3和R4、F5和R6为引物，扩增得到的F1R1片段、F2R2片段、F3R4片段、F5R6片段等目的片段。

步骤c)酶切并纯化：

将步骤b)中回收获得的各个目的片段分别用Class IIS限制性内切酶进行酶切，将酶切产物进行纯化，得到酶切纯化片段。

步骤d)连接反应：

利用T4DNA连接酶，将步骤c获得的各个酶切纯化片段进行连接反应，获得连接产物。

步骤e)全长PCR扩增反应

利用步骤a)构建得到的外部引物，以步骤d)获得的连接产物作为模板，用高保真酶进行PCR扩增全长，得到带有突变的全长目标基因。

本发明中，所述突变可以同时用于多位点的缺失突变、插入突变、置换突变。本发明中的缺失突变，是指在目标基因中进行碱基缺失的突变，包括单个碱基缺失和多个碱基连续缺失。本发明中的插入突变，是指在目标基因中插入单个碱基或多个连续碱基的突变。本发明的置换突变，是指在目标基因中进行碱基置换的突变，包括单个碱基置换和多个碱基置换。上述三种突变方式都可以通过内部引物设计来完成。

本发明中，所述Class IIS限制性内切酶是一类DNA限制性内切酶，其特点是识别位点与切割位点不是同一个序列，切割位点在识别位点之外。所述Class IIS限制性内切酶的识别位点与其切割位点分别位于双链DNA的不同区域，且该切割位点碱基序列组成与该内切酶是否能发挥内切酶功能相互之间没有关联。优选地，所述Class IIS限制性内切酶包括Eco31I、BbvI、BsaI、Esp3I、SapI等。

本发明中，所述步骤b的分段高保真PCR反应、步骤d中的PCR扩增全长反应均是使用高保真DNA聚合酶进行PCR反应。

本发明中，所述步骤b、步骤d中的PCR反应的反应体系如下：

本发明中，所述步骤b、步骤d中的PCR反应的反应条件为：

94～98℃下变性0～5分钟；

94～98℃下变性5～30秒，55～65℃下退火0～30秒，68～72℃下延伸0.5～5分钟，并进行28～32个循环。

优选地，所述步骤b、d中PCR反应条件包括：94～98℃下变性10秒～5分钟；94～98℃下变性10～30秒，45～65℃下退火0～30秒，68～72℃下延伸0.5～5分钟，并进行28～32个循环；72℃延伸2～10分钟。

本发明中，所述步骤b中回收目的片段采用的是DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒。

本发明中，所述步骤c中酶切反应体系如下：

本发明中，所述步骤c中的酶切反应条件为：根据所使用限制性内切酶的不同，先在37℃～65℃条件下反应5～30分钟进行酶切，再在65℃～80℃下反应5-30分钟，使酶失活。

本发明中，所述步骤c中酶切产物纯化采用的是PCR产物纯化试剂盒。

本发明中，所述步骤d中连接反应体系如下：

本发明中，所述步骤d中连接反应条件为4℃过夜，或16℃或室温下反应15分钟～3小时。

本发明DNA多位点定向突变方法的有益效果在于：本发明巧妙地构建了包含Class IIS限制性内切酶的识别位点和切割位点的引物，利用引物进行分段PCR扩增、并将连接产物直接作为模板用于下一轮的PCR扩增，通过分段PCR、酶切、纯化、T4DNA连接酶连接、连接产物直接PCR反应，从而实现快速拼接DNA以及同时对DNA进行多位点的定向突变。

本发明方法对DNA模板没有限制，对需要突变的目标基因DNA可以是线性DNA，也可以是质粒，并且对质粒大小也没有严格要求，适用范围广。通过分段PCR扩增，多个DNA片段拼接及多位点定向突变(缺失、插入、置换)可以同时进行。将连接产物直接进行PCR扩增全长，富集了突变后的全长DNA片段，为直接测序进行突变验证提供了可能，可以通过对全长扩增产物的直接测序来判断突变是否成功，也为后续操作提供了方便。且整个过程不需要构建克隆载体及克隆子筛选，避免了耗时的克隆子筛选过程，节省时间，提高效率。此外，本发明方法操作简单，仅需要借助PCR、酶切、连接等常规分子生物学技术，且实验条件可参照有关试剂盒说明进行，不需要耗时进行反应条件优化，重复性好，提高了DNA拼接及多位点定向突变研究的工作效率。在需要突变位点较多时，即分段PCR产生较多的中间片段需要连接时，本发明的优点尤为明显。

附图说明

图1为以Class IIS限制性酶中Eco31I限制性内切酶为例说明本发明中的酶切、连接过程示意图。

图2为本发明的技术路线示意图。

图3为本发明实施例1实施过程示意图。

图4a为实施例1中分段PCR电泳结果图。

图4b为实施例1中连接产物直接PCR电泳结果图。

图5为本发明实施例2中一个AnSh基因四碱基缺失突变序列对比图。

图6a为实施例2中分段PCR电泳结果图。

图6b为实施例2中连接产物直接PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不因此限定本发明。本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

本发明DNA多位点定向突变方法，其反应路线如图2所示。图2中，长方框表示外显子，线条表示内含子。长方框上方和下方的短线表示PCR扩增所用引物。上方的短线表示为正向引物，例如，F1、F2、F3、F4、F5、F6。下方的短线表示为反向引物，例如，R1、R2、R3、R4、R5、R6。外部引物是位于两个端点位置上，例如，F1、R6。内部引物是位于外显子和内含子的连接处，例如，F2、F3、F4、F5、F6、R1、R2、R3、R4、R5。长方框两侧小方块表示分段PCR扩增后引入的限制性内切酶位点，其中，深色方块表示Class IIS限制性内切酶识别位点，浅色方块表示通常的一般限制性内切酶位点。

以Class IIS限制性酶中Eco31I限制性内切酶为例说明本发明DNA多位点定向突变方法中的酶切过程、连接过程等，如图1所示。图1中，标有X、Y的灰色长方框分别表示目标基因的上下游区域；Eco31I下划线表示的Eco31I内切酶的识别位点；带有折线的“1234”表示Eco31I内切酶的切割位点，表示内切酶切割后产生的粘性末端为“1234”碱基；“1、2、3、4、N”表示此处的碱基可以是A、T、C、G四种碱基中的任意一种。

实施例1黑曲霉水杨酸羟化酶Aspergillus niger salicylate hydroxylase(AnSh，Genbanknumber：NT_166526)基因内含子的去除

黑曲霉水杨酸羟化酶Aspergillus niger salicylate hydroxylase(AnSh，Genbank number：NT_166526)基因全长1718bp，包括5段内含子和6段外显子，如图3所示。图3中，长方框表示外显子，线条表示内含子。长方框上方和下方的短线表示PCR扩增所用引物，其中，上方的短线表示为正向引物，例如，F1、F2、F3、F4、F5、F6。下方的短线表示为反向引物，例如，R1、R2、R3、R4、R5、R6。其中，外部引物是F1、R6。内部引物是F2、F3、F4、F5、F6、R1、R2、R3、R4、R5。

图3中，长方框两侧小方块表示分段PCR扩增后引入的限制性内切酶位点，其中，深色方块表示Class IIS限制性内切酶识别位点；该Class IIS限制性内切酶可以是Eco31I、BbvI、BsaI、Esp3I、或SapI等DNA内切酶之任意一种。浅色方块表示一般限制性内切酶位点，该一般限制性内切酶指识别位点与切割位点一致的限制性内切酶，例如，EcoRI、HindIII、BamHI、XbaI等。

本实施例具体包括：

1.引物设计

在外显子和内含子的连接处，构建设计引入Class IIS限制性内切酶识别位点的内部引物，Class IIS限制性内切酶采用Eco31I，如图3所示。本发明中，还可以分别选用BbvI、BsaI、Esp3I或SapI等之任意一种Class IIS限制性内切酶作为本方法所采用的DNA内切酶，获得的实验效果均与本实施例1或2相同。

本实施例中构建的引物序列如下：

注：斜体大写字母是Eco31I限制酶的识别位点，斜体小写字母分别是HindIII和EcoRI酶切位点。方框中字母为连接互补碱基，即，此处碱基在引物R1与F2、R2与F3、R4与F5、R5与F6中分别互补。

2.分段PCR扩增

提取黑曲霉基因组DNA(包含有AnSh(Genbank number：NT_166526)基因在内的全基因组DNA)，以此基因组DNA为模板，利用外部引物和内部引物的两两组合(F1与R1，F2与R2，F3与R4，F5与R6)，进行分段PCR扩增反应。以F1和R1为引物进行PCR扩增得片段exon1，即F1R1片段；以F2和R2为引物进行PCR扩增片段得exon2，即F2R2片段；以F3和R4为引物进行PCR扩增片段exon3至exon4，即F3R4片段；以F5和R6为引物进行PCR扩增片段exon5至exon6，即F5R6片段。上述分段PCR扩增反应可以在各自反应体系下同时进行。

上述分段PCR扩增反应中，使用TaKaRa高保真酶PrimerSTAR HS DNA Polymerase，反应体系和反应条件如下：

PCR反应条件：98℃，10秒；68℃，30秒；循环30次。

3.回收目的片段

将上述分段PCR扩增反应获得的各个扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图4a所示，图4a表示分段PCR电泳结果图，其中，M：DNA分子量标准；1、2、3、4：分段PCR扩增产物，依次表示exon1、exon2、exon3-4、exon5-6片段，即分别为F1R1片段、F2R2片段、F3R4片段、F5R6片段。使用胶回收试剂盒(上海捷瑞生物有限公司)回收目的片段。

4.酶切并纯化

酶切：使用限制性内切酶FastDigestEco31I(Fermentas)对回收目的片段(胶回收产物)进行酶切，酶切反应体系如下：

酶切反应条件：37℃水浴15分钟，65℃水浴5分钟使酶失活。

纯化：酶切产物用PCR产物纯化试剂盒(上海捷瑞生物有限公司)进行纯化。优选地，通过纯化可以减少碎片序列的影响，从而提高正确连接效率。

5.连接。

使用T4DNA连接酶(Promega)将等摩尔数的各个酶切纯化片段进行连接。连接反应体系如下：

连接反应条件为：室温放置5-15分钟。

6.第二次分段PCR、第二次Eco31I酶切、第二次T4DNA连接酶连接

优选地，本发明DNA多位点定向突变方法可以采用多次分段PCR、多次Eco31I酶切、多次T4DNA连接酶连接反应。本实施例中，考虑到exon3和exon5片段较短可能会和引物二聚体混淆，采用两次分段PCR、酶切及T4DNA酶连接。

以本实施例步骤5中获得的连接产物为模板，分别以F1和R3、F4和R5、F6和R6为引物进行第二次分段PCR扩增反应、以及第二次Eco31I酶切、第二次T4DNAligase连接。以进一步去除exon3和exon4间的内含子、exon5和exon6间的内含子。第二次的反应条件均分别与前述相应步骤相同。

7.连接产物直接进行全长PCR扩增反应

使用TaKaRa高保真酶PrimerSTAR HS DNA Polymerase，以外部引物F1和R6为引物，以本实施例步骤6中获得的连接产物为模板，直接进行全长PCR扩增。反应体系如下：

反应条件：98℃，10秒；68℃，90秒；循环30次。

8.产物(突变结果)

将以上获得的全长PCR扩增反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，如图4b所示。图4b为连接产物直接PCR电泳结果图，其中，M：DNA分子量标准；AnSh：全部内含子已去除的全长AnSh基因PCR扩增产物。电泳结果表明，所获得的扩增产物大小与预期大小一致。将PCR产物直接进行测序，并将其与原AnSh基因序列进行对比分析，结果表明：基于连接产物直接PCR扩增所得到的全长DNA片段序列为AnSh基因内含子全部去除的基因序列，实验结果与预期结果一致。

实施例2黑曲霉水杨酸羟化酶碱基缺失突变体的修复

本实施例对黑曲霉水杨酸羟化酶碱基缺失突变体进行修复。一个黑曲霉水杨酸羟化酶突变体在888-890bp和894bp处出现4个碱基的缺失突变，如图5所示的AnSh基因四碱基缺失突变序列对比图。图5中，方框中表示突变发生的碱基位置。斜体并用下划线标出碱基为引物设计时参照的目标基因区域。其中，加黑字体的碱基CACC为拟连接处互补序列。

本实施例中，根据DNA突变位点设计的引物如下：

外部引物：与实施例1中的1F(正向引物)和R6(反向引物)相同。

内部引物：

P1R：5′ATATCACCCAGAGACGCCA 3′；

P2F：5′GGC

G

AACCATACCCATA 3′。

其中，斜体大写字母是Eco31I限制酶的识别位点，方框中大写字母为互补碱基。

本实施例中的分段PCR扩增、酶切、连接方法、连接产物全长PCR扩增等步骤参照实施例1，分段PCR所用引物组合为F1和P1-R，P2-F和R6。实验结果如图6所示的琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，M：DNA分子量标准；图6a中，1、2表示分段PCR扩增产物，1表示F1P1R片段、2表示P2FR6片段；AnSh：表示突变已完成的全长AnSh基因PCR扩增产物。

对本实施例的产物进行测序，并将测序结果进行比对，结果表明突变位点完全正确。

Claims (10)

1.一种DNA多位点定向突变方法，其特征在于，根据DNA突变位点设计包含Class IIS限制性内切酶识别位点和切割位点的引物，经分段PCR扩增、酶切、连接反应得到连接产物，并以该连接产物直接进行PCR扩增，实现DNA多位点突变。

2.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变方法，其特征在于，包括如下步骤：

a.构建引物：

所述引物包括外部引物和内部引物；

其中，所述外部引物包括5’端的正向外部引物和3’端反向外部引物；

其中，所述内部引物包含正向内部引物和反向内部引物；所述内部引物自5’端到3’端依次为：保护碱基、Class IIS限制性内切酶识别位点、Class IIS限制性内切酶切割位点、以及目标基因区域；

b.分段PCR扩增：

利用所述内部引物和所述外部引物，进行分段高保真PCR扩增反应，各扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，回收获得各目的片段；

c.酶切、纯化：

将回收的所述目的片段分别用Class IIS限制性内切酶进行酶切，经纯化，得到酶切纯化片段；

d.连接反应：

用T4DNA连接酶将步骤c中获得的所述酶切纯化片段连接，得到连接产物；

e.PCR扩增全长反应：

利用外部引物，以步骤d中的所述连接产物为模板，进行高保真PCR扩增全长。

3.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变方法，其特征在于，所述突变是可同时在多位点的缺失突变、插入突变、置换突变。

4.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述Class IIS限制性内切酶包括Eco31I、BbvI、BsaI、Esp3I、SapI。

5.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述高保真PCR反应是使用高保真DNA聚合酶进行PCR反应。

6.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应体系包括：10μl 5×Buffer(Mg²⁺plus)，4μl dNTP mixture(各2.5mM)，1μl正向引物(10μM)，1μl反向引物(10μM)，0.1～100ng模板，0.5μl DNA聚合酶(2.5U/μl)，加灭菌双蒸水至总体积50μl。

7.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述步骤b、d中PCR反应条件包括：94～98℃下变性10秒～5分钟；94～98℃下变性10～30秒，45～65℃下退火0～30秒，68～72℃下延伸0.5～5分钟，并进行28～32个循环；72℃延伸2～10分钟。

8.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述步骤c中酶切的反应体系包括：5μl10×Buffer，20～30μl所述回收目的片段，4μl Class IIS限制性内切酶，加灭菌双蒸水至总体积50μl；所述步骤c中酶切的反应条件包括：先在37～65℃条件下反应5～30分钟，再在65～80℃下反应5～30分钟。

9.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述步骤d中连接反应体系为：5μl10×Buffer，酶切纯化产物片段，1～5U T4DNA连接酶，加入灭菌双蒸水至总体积为50μl。

10.如权利要求1所述的DNA多位点定向突变的方法，其特征在于，所述步骤d中连接反应的条件为4℃过夜，或16℃或室温15分钟～3小时。

Images