ES2813324T3

ES2813324T3 - Producción de ADN lineal cerrado

Info

Publication number: ES2813324T3
Application number: ES17757824T
Authority: ES
Inventors: Thomas Adie; Neil Porter; Paul Rothwell
Original assignee: Touchlight IP Ltd
Current assignee: Touchlight IP Ltd
Priority date: 2016-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2037-08-16
Also published as: WO2018033730A1; US11505821B2; CN116732145A; LT3500682T; US20190185924A1; CN109844134B; ES2813324T8; CN109844134A; EP3500682A1; US20230272461A1; EP3763823A1; DK3500682T3; EP3500682B1

Abstract

Un método libre de células para producir moléculas de ácido nucleico desoxirribosa (ADN) lineal cerrado que comprende: (a) poner en contacto un molde que comprende una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa y que comprende al menos un motivo de tallo lazo con una polimerasa de desplazamiento de hebra en condiciones que promueven la amplificación de dicho molde en presencia de al menos un cebador que es capaz de unirse específicamente a un sitio de unión del cebador dentro de dicho motivo de tallo lazo; (b) poner en contacto el ADN producido en (a) con al menos una protelomerasa en condiciones que promuevan la producción de ADN lineal cerrado.

Description

DESCRIPCIÓN

Producción de ADN lineal cerrado

Campo

La presente invención se refiere a los procesos mejorados para la producción de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, en particular la producción enzimática libre de células de moléculas de ADN lineal cerrado, preferentemente mediante el uso de un ADN lineal cerrado como molde para la síntesis de ADN. La invención se refiere además a una nueva especie de ADN lineal cerrado, adecuada para usar como molde en los procesos mejorados para la producción de ADN lineal cerrado. Además, la invención se refiere a los productos intermediarios de los procesos, ya que esto permite la producción de mayores cantidades de ADN lineal cerrado a partir del molde que con los métodos conocidos en la técnica.

Antecedentes

La producción libre de células de ADN lineal cerrado ha sido descrita previamente por el solicitante en los documentos WO2010/086626 y WO2012/017210. El método descrito en estas solicitudes se refiere a la producción de ADN lineal de doble hebra cerrado covalentemente en cada extremo (ADN lineal cerrado) mediante el uso de un molde de ADN, en donde el molde de ADN comprende al menos una secuencia de reconocimiento de protelomerasa, y donde el molde se amplifica mediante el uso de al menos una ADN polimerasa y se procesa mediante el uso de una enzima protelomerasa para rendir el ADN lineal cerrado. Los extremos cerrados del ADN lineal cerrado incluyen cada uno una porción de una secuencia de reconocimiento de protelomerasa. El uso de un ADN lineal cerrado como molde se contempla en las solicitudes enumeradas, y el uso de tal molde es ventajoso, ya que significa que se desperdicia la mínima cantidad de reactivos durante la producción. La producción experimental a pequeña escala de ADN lineal cerrado funciona bien con un molde de ADN lineal cerrado mediante el uso de estos métodos. Sin embargo, el rendimiento es inferior al esperado y no es suficiente para la preparación de cantidades comercialmente viables de ADN lineal cerrado.

Cuando se usa un molde de ADN lineal cerrado en los métodos descritos anteriormente, la molécula de ADN lineal cerrado puede verse como una molécula circular monocatenaria como se representa en la Figura 5. Normalmente, el ADN lineal cerrado como se describió en la presente descripción es esencialmente completamente complementario en secuencia, aunque la estructura puede tolerar algunas variaciones menores u "oscilaciones". Por tanto, el ADN lineal cerrado puede ser al menos un 95 % complementario, o al menos un 96, 97, 98, 99 o 100 % complementario en secuencia. Cuando se desnaturaliza, es efectivamente una molécula circular que comprende hebras directas (sentido o positiva) e inversas (antisentido o negativa) adyacentes entre sí. Por el contrario, esto es con el ADN plasmídico donde las secuencias complementarias (negativa y positiva) se encuentran en cadenas circulares separadas (Figura 5, A en comparación con B).

La estructura única del ADN lineal cerrado significa que puede renaturalizarse más fácilmente que un plásmido y, por lo tanto, el cebado de oligonucleótidos para la amplificación del ADN mediante la ADN polimerasa puede presentar un desafío mayor. Este es particularmente el caso donde se usan cebadores únicos que se unen a las secuencias palindrómicas que comprenden la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa dentro de la horquilla. El molde de ADN lineal cerrado puede amplificarse mediante el uso de una polimerasa de desplazamiento de hebra que inicialmente produce concatémeros que comprenden cadenas simples de ADN, cada concatémero comprende múltiples unidades repetidas del molde de ADN, siendo cada unidad repetida complementaria en secuencia a la secuencia original del molde de ADN lineal cerrado. Sin embargo, dado que cada molde incluye tanto las hebras positivas como negativas, el ADN de hebra sencilla concatemérico producido incluye las secuencias alternas de las hebras positivas y negativas como una "unidad de repetición". Esto puede compararse con la amplificación de un plásmido, donde la hebra única que se produce a partir del molde circular (cualquiera de las hebras) comprende múltiples repeticiones de la misma secuencia en la orientación opuesta (es decir, una hebra con sentido se replica como un concatémero que comprende múltiples unidades de repetición de la hebra antisentido). Por tanto, existen distintas diferencias estructurales en el producto concatemérico producido como resultado de las replicaciones de desplazamiento de hebra de un molde de ADN plasmídico y un molde de ADN lineal cerrado. Son estas diferencias estructurales en el producto de la amplificación de un ADN lineal cerrado las que pueden resultar en una generación ineficaz de ADN lineal cerrado.

Dado que los concatémeros que se producen inicialmente a partir de la amplificación de un ADN lineal cerrado son una sola hebra de ADN, teóricamente están disponibles como molde para una mayor unión del cebador y, por lo tanto, una mayor replicación. Esta etapa genera un concatémero con dos hebras complementarias distintas, y luego cualquiera de los soportes puede desplazarse para replicar una nueva hebra adicional. El concatémero de "doble hebra" comprende así dos hebras complementarias distintas de ADN. Teóricamente, pueden tener lugar grandes cantidades de amplificación a partir de una pequeña cantidad de molde inicial, debido a la naturaleza de la polimerasa de desplazamiento de cadena usada. El concatémero de ADN de doble hebra es importante, ya que éste es en última instancia el sustrato de la enzima protelomerasa usada en el proceso de fabricación de ADN lineal cerrado, como se describió en las solicitudes anteriores, tales como WO2010/086626 y WO2012/017210.

Sin embargo, los inventores han establecido que cuando se usa ADN lineal cerrado como molde, una parte o la mayor parte del "producto" se forma como nanoflores de ADN, a pesar de la adición de una enzima protelomerasa para escindir las secuencias de reconocimiento completas de protelomerasa en los concatémeros bicatenarios y formar ADN lineal cerrado. Esto se muestra en la Figura 6. La hebra sencilla de ADN que comprende hebras "positivas" y "negativas" alternativas es efectivamente autocomplementaria y, por lo tanto, se pliega fácilmente internamente para formar estructuras compactas conocidas como nanoflores de a Dn . Se trata esencialmente de cadenas sencillas largas de ADN concatemérico que se han autohibridado y ya no están disponibles para cebar o procesar con la protelomerasa, ya que las cadenas están empaquetadas muy juntas. Esto está lejos del escenario ideal. Para los métodos estándar de producción de ADN lineal cerrado se requiere la producción de concatémeros lineales bicatenarios mediante el uso del ADN concatemérico de hebra sencilla inicial como molde, y este intermediario de doble hebra es procesable por una protelomerasa para formar las moléculas de ADN lineal cerrado (etapa K de la Figura 5). La secuencia de reconocimiento completa de la protelomerasa se forma a partir de dos hebras complementarias de ADN, en una formación dúplex.

La naturaleza adyacente positiva - negativa de la hebra sencilla inicial de ADN producida por una polimerasa de desplazamiento de hebra que actúa sobre un molde de ADN lineal cerrado da como resultado una extensa hibridación interna de los concatémeros para producir nanoflores de ADN (Figura 6, etapa F). Esta estructura de ADN plegada y compacta evita la unión de cebadores oligonucleotídicos eficientes (Figura 6, etapa G) necesaria para convertir las nanoflores de ADN en concatémeros lineales bicatenarios procesables por la protelomerasa como se usa en los métodos actuales en la técnica.

Por tanto, existe la necesidad de un proceso mejorado in vitro para amplificar eficientemente un molde de ADN lineal cerrado con altos rendimientos de ADN o, alternativamente, para disminuir la producción de nanoflores de ADN impenetrables durante la producción de ADN lineal cerrado y/o para aumentar la conversión de nanoflores de ADN ya formadas en ADN lineal cerrado.

Sumario

La presente invención se refiere a un proceso para la producción in vitro, libre de células de ADN lineal cerrado a partir de un molde de ADN lineal cerrado. El proceso puede permitir una producción mejorada de ADN lineal cerrado en comparación con las metodologías actuales. Esto aumenta significativamente la productividad al tiempo que reduce el costo de producir ADN lineal cerrado, particularmente a mayor escala.

En consecuencia, se proporciona un método libre de células para producir moléculas de ADN lineal cerrado que comprende:

(a) poner en contacto un molde que comprende una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa y que comprende al menos un motivo detallo lazo con una polimerasa de desplazamiento de hebra en condiciones que promueven la amplificación de dicho molde en presencia de al menos un cebador que es capaz de unirse específicamente a un sitio de unión del cebador dentro de dicho motivo de tallo lazo;

(b) poner en contacto el ADN producido en (a) con al menos una protelomerasa en condiciones que promuevan la producción de ADN lineal cerrado.

Opcionalmente, el molde puede comprender otras secuencias de reconocimiento de la protelomerasa, además de aquellas porciones de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa localizadas en los extremos cerrados o caperuzas del molde de ADN lineal cerrado. Si el molde comprende una o más secuencias de reconocimiento adicionales o extras de la protelomerasa, las secuencias de reconocimiento adicionales de la protelomerasa pueden colocarse en cualquier sitio en la sección bicatenaria del molde. Preferentemente, estas secuencias de reconocimiento adicionales o extras de la protelomerasa son distintas y separadas de al menos un motivo de tallo lazo. La secuencia o secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa pueden separarse de uno o ambos extremos cerrados del ADN lineal cerrado por al menos un motivo de tallo lazo.

Opcionalmente, cada una de las secuencias de reconocimiento de la protelomerasa o porciones de las mismas puede ser la misma secuencia o secuencias diferentes, cada una independientemente una de la otra. Diferentes enzimas protelomerasas actuarán sobre diferentes secuencias de reconocimiento y, por lo tanto, se requerirán las enzimas protelomerasas apropiadas para la producción de ADN lineal cerrado.

De acuerdo con un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, en donde la secuencia de dicha molécula de ADN de doble hebra lineal incluye al menos un motivo de tallo lazo.

De acuerdo con un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN concatemérico que comprende una hebra sencilla de ADN, dicha hebra sencilla que comprende dos o más unidades idénticas de secuencia de ADN unidas covalentemente entre sí en una serie, cada unidad que comprende al menos una hebra sencilla de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa y al menos una estructura o motivo de tallo lazo. Opcionalmente, el concatémero está in vitro y libre de células. Opcionalmente, la unidad comprende al menos otra secuencia de reconocimiento de la protelomerasa.

De acuerdo con el tercer aspecto, puede proporcionarse una molécula de ADN concatemérico que comprende una hebra sencilla de ADN, dicha hebra sencilla que comprende dos o más unidades idénticas de secuencia de ADN unidas covalentemente en una serie, cada unidad que comprende al menos una estructura o motivo de tallo lazo flanqueado a cada lado por al menos una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. Opcionalmente, dichas porciones son reconocidas por las mismas o diferentes enzimas protelomerasas.

De acuerdo con el tercer aspecto, la estructura de tallo lazo puede comprender toda o parte de la secuencia para un motivo de tallo lazo como se describió anteriormente.

Además, de acuerdo con el tercer aspecto, las unidades de secuencia de ADN son la secuencia de una molécula de ADN lineal, de doble hebra, como se definió en la presente descripción.

La hebra sencilla de ADN concatemérico como se describió puede formar pares de bases intracatenarias, con la excepción del lazo de la estructura de tallo lazo. Por lo tanto, la hebra única de ADN concatemérico puede formar una nanoflor de ADN con lazos abiertos de hebra sencilla. Por tanto, la invención se extiende al concatémero de hebra sencilla como se describió en la presente descripción, plegado en una nanoflor.

De acuerdo con un cuarto aspecto, se proporciona un kit, opcionalmente adecuado para realizar el método de cualquier aspecto de la invención, dicho kit que comprende:

(a) una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, en donde la secuencia de dicha molécula de ADN de doble hebra lineal incluye al menos un motivo detallo lazo;

(b) una protelomerasa; y opcionalmente;

(c) un oligonucleótido puente.

El kit puede comprender además una ADN polimerasa y opcionalmente un cebador. Adicionalmente, el kit puede incluir uno o más tampones apropiados, nucleótidos, pirofosfatasa y/o nucleasas.

De acuerdo con cualquier aspecto de la invención, el motivo de tallo lazo es una secuencia, que puede comprender dos secuencias que flanquean una sección central. El motivo de tallo lazo está diseñado para formar una estructura de tallo lazo en condiciones adecuadas para la formación de estructura secundaria, como cuando la secuencia está presente en una hebra sencilla de ADN, es decir, sin una segunda hebra complementaria unida distinta, pero de la segunda hebra. Las hebras distintas tienen sus propios extremos 3' y 5'. Opcionalmente, dichas condiciones son las condiciones de amplificación usadas en el método de la presente invención, y las condiciones ilustrativas se describen más abajo.

De acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la invención, la sección central del motivo está diseñada para ser un bucle como una hebra de ADN sencillo cuando las secuencias flanqueantes se juntan; ya sea mediante pares de bases autocomplementarios que forman un tallo o mediante el uso de un oligonucleótido puente.

De acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la invención, el motivo de tallo lazo o estructura de tallo lazo puede comprender un sitio de unión del cebador. Este sitio de unión del cebador está dentro de la sección central del motivo o estructura y, por tanto, dentro de la sección de hebra sencilla. Opcionalmente, el sitio de unión del cebador está rodeado por 1 o 2 secuencias de hebra sencilla adyacentes en la sección central.

De acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la invención, el motivo o estructura de tallo lazo puede comprender dos secuencias flanqueantes a la sección central, opcionalmente diseñadas para ser autocomplementarias o diseñadas para ser complementarias a un oligonucleótido puente.

De acuerdo con cualquier aspecto o modalidad de la invención, el motivo o estructura de tallo lazo puede ser adyacente o próximo a una porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, en donde dicha porción está dentro del extremo cerrado covalentemente de la molécula de ADN lineal. Opcionalmente, la secuencia para el motivo o estructura de tallo lazo está separada por hasta 100 bases desde el extremo de la porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa que forma el extremo cerrado de la molécula molde. Cuando estén presentes secuencias diana adicionales de la protelomerasa, estas pueden ser adyacentes a los motivos detallo lazo o separadas de ellos.

De acuerdo con cualquier aspecto de la invención, pueden incluirse dos o más motivos de tallo lazo en el molde de ADN y, por tanto, dos o más estructuras de tallo lazo en el concatémero como se definió previamente. Cada motivo de tallo lazo puede estar adyacente o cerca de un extremo cerrado de la molécula de ADN lineal cerrado.

De acuerdo con cualquier aspecto de la invención, pueden incluirse una o más secuencias de reconocimiento adicionales de la protelomerasa dentro de la sección de la doble hebra del molde. Dichas secuencias de reconocimiento adicionales de la protelomerasa son distintas de las presentes en los extremos cerrados del molde, y además son distintas de uno o más motivos de tallo lazo.

Otras modalidades se describen a más abajo y en las reivindicaciones. Otras ventajas se describen más abajo.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se describirá con más detalle más abajo con referencia a las modalidades ilustrativas y los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra la secuencia de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa para la protelomerasa TelN en un formato lineal, sin las estructuras de horquilla. Puede verse que la primera porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa (A) tiene una secuencia que es complementaria a la segunda porción de la secuencia de reconocimiento de protelomerasa (B). En el centro (en este ejemplo) de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa (D) está el sitio en el que la protelomerasa escindirá la secuencia, que está en el centro de la secuencia telO (E). La secuencia de reconocimiento de la protelomerasa completa (C) está compuesta de TelRL para la enzima TelN.

La Figura 2 muestra lo que sucede con la secuencia de la Figura 1 una vez que la protelomerasa TelN cataliza la reacción en la secuencia de reconocimiento. La secuencia se escinde en el punto indicado (D en la Figura 1) y cada uno de los extremos escindidos se vuelve a ligar con la hebra opuesta para formar dos estructuras de horquilla separadas;

La Figura 3 representa la misma secuencia que la Figura 1, pero demuestra que las porciones de la secuencia de reconocimiento de protelomerasa (A y B) pueden formar horquillas internas, en lugar de unirse a la otra porción de la secuencia de reconocimiento de protelomerasa, a pesar de estar completa (C);

La Figura 4 muestra las secuencias de reconocimiento nativas completas para una selección de enzimas protelomerasas, al mostrar las secuencias de ambas cadenas del ADN complementario. Se muestran las secuencias diana: la secuencia de SEQ ID NO: 15 (protelomerasa N15 TelN de Escherichia coli), la secuencia de SEQ ID NO: 16 (protelomerasa del fago Phi K02 de Klebsiella), la secuencia de SEQ ID NO: 17 (protelomerasa del fago PY54 de Yersinia), la secuencia de SEQ ID NO: 1 (fago PhiHAP-1 de Halomonas), la secuencia de SEQ ID NO: 18 (protelomerasa del fago VP882 de Vibrio), la secuencia de SEQ ID NO: 19 (protelomerasa de Borrelia burgdorferi), la secuencia de SEQ ID NO: 21 (protelomerasa del plásmido Vp58.5 de Vibrio parahaemolyticus) y la secuencia de SEQ ID NO: 20 (protelomerasa TelA de Agrobacterium tumefaciens). Cuando se conoce el requisito de longitud de secuencia mínima para la protelomerasa análoga, esto se ha indicado al sombrear la secuencia en gris, aunque la enzima puede aceptar alguna variación en la secuencia dentro de esta secuencia de reconocimiento del núcleo. Los nucleótidos representados en negrita y subrayados indican imperfecciones en la secuencia del palíndromo. La línea vertical que atraviesa las secuencias representa el centro de la secuencia invertida perfecta y el punto en el que la protelomerasa se escinde y se une a su secuencia de reconocimiento específica;

La figura 5 muestra el proceso específico ideal para la fabricación in vitro de ADN lineal cerrado mediante el uso de un cebador palindrómico específico sencillo, un molde de ADN lineal cerrado y una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra en combinación con la protelomerasa TelN. A. Molde de ADN lineal cerrado. R y L representan las secuencias de ADN de los brazos derecho e izquierdo de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa TelN. B. Molde de ADN plasmídico. C. Desnaturalización del molde de partida para formar el ADN circular de hebra sencilla. Dado que el molde de ADN plasmídico está compuesto por anillos encadenados de ADN de hebra sencilla, se debe entender que los círculos de hebra sencilla no pueden separarse. Estos "encadenados" o círculos topológicamente entrelazados no están unidos covalentemente, pero no pueden separarse porque están entrelazados y cada uno está cerrado covalentemente. D. Unión de un cebador específico sencillo. E-H. Amplificación a partir de un molde de ADN de hebra sencilla mediante una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra. I-J. Formación de ADN de doble hebra concatemérico largo que comprende las unidades sencillas de molde amplificado separadas por las secuencias de unión a la protelomerasa (Rl ). K. Ponerse en contacto con la protelomerasa TelN específica de la secuencia RL. La protelomerasa escinde el ADN concatemérico en el sitio RL y liga las cadenas complementarias para producir copias amplificadas del molde de ADN lineal cerrado covalentemente;

La Figura 6 muestra el mismo proceso que la Figura 5, solo que en lugar de formar ADN de doble hebra concatemérico largo, la hebra sencilla concatamérica de ADN se pliega en nanoflores de ADN; A. Molde de ADN lineal cerrado; B-C. Unión de cebadores específicos y amplificación a partir de un molde de ADN de hebra sencilla mediante una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra y formación de hebras sencillas concateméricas largas de ADN, aunque en esta modalidad se muestran dos especies de cebadores que son idénticos, pero el método podría realizarse con dos o más especies de cebadores diferentes. D-E. El cebador específico se une a la hebra sencilla concatamérica de ADN y la replicación de la misma, lo que conduce a formaciones en horquilla en las porciones de las secuencias de reconocimiento de la protelomerasa. F - G. la formación de nanoflores de ADN a partir de una hebra sencilla concatamérica de ADN, a las que los cebadores no pueden unirse;

La Figura 7 muestra el mismo proceso general que las Figuras 5 y 6, con la excepción de que el molde de ADN lineal cerrado incluye un motivo detallo lazo de acuerdo con la presente invención. Este motivo detallo lazo incluye un sitio de unión del cebador, y está diseñado particularmente para que la estructura de tallo lazo se forme cuando la secuencia del motivo es de hebra sencilla; formándose así en las hebras sencillas de ADN concatemérico. Esto permite que las nanoflores tengan una estructura de "lazo abierto", en la que se encuentra un sitio de unión del cebador. Esto permite que el cebador se hibride y la polimerasa de desplazamiento de hebra forzar la apertura y convertir las nanoflores en ADN concatemérico de doble hebra lineal para su procesamiento en ADN lineal cerrado. A representa la introducción de cebadores al molde, B representa la unión de los cebadores y la amplificación que se produce, C muestra el crecimiento del ADN concatemérico de hebra sencilla, D y E muestran la replicación de un concatémero de ADN de hebra sencilla, F muestra la formación de las nanoflores de ADN, excepto los motivos de tallo lazo que fuerzan la formación de regiones de hebra sencilla en la nanoflor, lo que permite una mayor unión del cebador (G). Se debe señalar que la modalidad mostrada implica el uso de dos especies de cebadores, pero este método puede realizarse igualmente con un cebador específico;

La Figura 8 representa el uso de un oligonucleótido puente para mantener el motivo de tallo lazo en una estructura de lazo abierto. Este es un arreglo alternativo para el motivo de tallo lazo. El oligonucleótido puente se une específicamente a las secuencias flanqueantes del motivo de tallo lazo y fuerza la sección central hacia un lazo de ADN de hebra sencilla. Cuando se introduce una estructura de este tipo durante el proceso de la invención, permite que la sección central del motivo de tallo lazo sea de hebra sencilla, lo que presenta así el sitio de unión del cebador para que el cebador se hibride específicamente. A. Proceso de usar un oligonucleótido puente para crear un lazo dentro del motivo de tallo lazo. B. Unión de un cebador al sitio de unión del cebador dentro de la estructura del lazo. C. Cebado del lazo del motivo de tallo lazo mediante el uso de un oligonucleótido puente.

La Figura 9 (A a D) representa varias estructuras discutidas en esta solicitud representadas esquemáticamente. La Figura 9A es una molécula de ADN lineal cerrado con los extremos de la molécula formados por una porción de una secuencia diana de protelomerasa. La Figura 9B es un ADN lineal cerrado con un motivo de tallo-lazo como se describió en la presente solicitud. Los tallos lazos están emparejados debido a la naturaleza complementaria de las secuencias presentes en las secciones opuestas del ADN. La Figura 9C muestra una nanoflor de ADN, hecha de una hebra sencilla de ADN que ha formado pares de bases intracatenarias entre secuencias complementarias. La Figura 9D muestra la misma estructura que la 9c , con la adición de un motivo de tallo lazo a la secuencia. Esto da como resultado que se formen pares de tallo lazo dentro de la nanoflor de ADN, lo que permite el apareamiento del cebador y el inicio de la síntesis de ADN en la dirección que se muestra.

La Figura 10A muestra la secuencia lineal del tallo lazo introducido usado en el Ejemplo 1. Esto también muestra los cebadores usados en el Ejemplo 1 y se muestra la posición de unión en el lazo. La Figura 10B es una fotografía de un gel de agarosa al 0,8 % de la digestión de TelN de los productos amplificados producidos a partir de diferentes estrategias de cebado;

La Figura 11 representa un mapa de los plásmidos para los vectores usados en el Ejemplo 1. Se representan varios componentes.

La Figura 12 representa una estructura ilustrativa de un molde de ADN lineal cerrado que comprende las secuencias de reconocimiento de dos protelomerasas diferentes separadas por un motivo de tallo lazo (S1 indica el par de tallo lazo complementario que se crea en una posición debido al motivo de tallo lazo, y S2 indica una segundo par de tallo lazo creado en una posición diferente debido a un motivo de tallo lazo adicional que puede ser el mismo o diferente) que incorpora una secuencia de unión de cebador. El cebador puede diseñarse para unirse a cualquiera de los dos pares. Los extremos cerrados del ADN lineal están formados por dos porciones de la misma secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, en este ejemplo, la protelomerasa A. Un par adicional de secuencias de reconocimiento de protelomerasa B está presente dentro de la sección de doble hebra como un sitio completo capaz de escindirse y ligarse por la protelomerasa B. Se debe entender que las secuencias 1, 2, 3 y 4 podrían ser secuencias de reconocimiento de la protelomerasa para las mismas o una mezcla de diferentes enzimas protelomerasas.

La Figura 13 muestra la estructura de un motivo de tallo lazo 15-0-15-10 ilustrativo, con el sitio de cebado mantenido en la configuración abierta. El esquema de los nombres se refiere a la longitud del tallo (ST) (15), la longitud del primer espaciador (SP) (0), la longitud del sitio de cebado (P) (15), la longitud del segundo espaciador (SP) (10). El cebador puede unirse a la hebra superior. Un lazo etiquetado como "inverso" es la misma secuencia en la hebra opuesta, con el cebador unido a la hebra inferior. El esquema podría usar cualquier longitud de secuencia adecuada para cualquiera de los elementos representados.

La figura 14 representa un proceso de acuerdo con un aspecto de la presente invención cuando se usa el molde de la figura 12. La molécula central de la figura muestra una sección de producto concatemérico de doble hebra producido por amplificación por círculo rodante del molde representado en la Figura 12. En este caso, la hebra sencilla que sale del molde representada en la Figura 12 se ha convertido en un concatémero de doble hebra a través de la síntesis de una hebra complementaria, que se ha habilitado gracias al uso de motivos de tallo lazo. Esta figura representa los motivos de tallo lazo como secuencias de tallo complementarias que soportan secciones abiertas de una hebra sencilla que están disponibles para la unión del cebador y la amplificación adicional mediante una ADN polimerasa que desplaza la hebra. En este caso, las secuencias de reconocimiento de la protelomerasa 1 y 2 son ambas secuencias de la Protelomerasa A, y las secuencias de reconocimiento de protelomerasa 3 y 4 son ambas secuencias de la Protelomerasa B. Ambas secuencias de reconocimiento de la protelomerasa A y B pueden ser escindidas y ligadas por sus respectivas protelomerasas. La escisión con la protelomerasa A (parte superior de la figura) produce un ADN lineal cerrado idéntico al molde como se representa en la Figura 12. La escisión y ligación con la protelomerasa B (parte inferior de la figura) produce un ADN lineal cerrado cubierto por secuencias de reconocimiento de la protelomerasa B y libre de secuencias de reconocimiento de la protelomerasa A y motivos de tallo lazo. Adicionalmente, se produce un ADN lineal cerrado de desecho muy corto (Z1) también cubierto por secuencias de reconocimiento de la protelomerasa B y que incorpora los motivos de tallo lazo y una única secuencia de reconocimiento de la protelomerasa A. Por lo tanto, el experto puede seleccionar qué producto se produce al variar la protelomerasa agregada al proceso. S1 indica el par de tallo lazo complementario que se crea en una posición debido al motivo de tallo lazo, y S2 indica un segundo par de tallo lazo creado en una posición diferente debido a un motivo detallo lazo adicional que puede ser el mismo o diferente.

La Figura 15 muestra una sección de un producto concatemérico de hebra sencilla producido por amplificación en círculo rodante del molde de ADN lineal cerrado representado en la Figura 12. Esta figura muestra cómo los concatémeros de hebra sencilla pueden plegarse internamente para formar nanoflores si no se convierten inmediatamente en hebras dobles mediante la síntesis de una hebra de ADN complementaria. Las nanoflores de ADN formadas de esta manera a partir de un molde de ADN lineal cerrado con las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa pueden convertirse directamente en ADN lineal cerrado que incluye una secuencia diana mediante el tratamiento con la protelomerasa B. Tal producto de ADN lineal cerrado no contiene ninguna secuencia de tallo lazo o secuencias de reconocimiento de la protelomerasa A (secuencias 1 y 2). Se debe señalar que la segunda estructura de tallo-lazo no está representada en esta figura, ya que se cree que no se formarán en el extremo anidado, ya que los inventores suponen que las secuencias complementarias adyacentes hibridan antes que las separadas. Un pequeño porcentaje de extremos puede permitir la formación de tallo lazo, pero la estructura representada es más probable y energéticamente favorable. Esta figura muestra una modalidad donde se usa un cebador único. Si se usa un cebador alternativo (es decir, para un tallo lazo diferente), pueden formarse productos secundarios alternativos (Z2 en esta modalidad).

La Figura 16 representa un gel que muestra la escisión satisfactoria de las nanoflores formadas a partir de los concatémeros de hebra sencilla y la escisión de concatémeros de hebra doble. El carril 'B' es el producto de la amplificación del círculo rodante escindido con TelN, que muestra los productos de desecho de la escisión de concatémeros de hebra doble (~300 pb y Z1 en la Figura 14) y nanoflores (— 150 pb y Z2 en la Figura 15), así como también el producto de ADN lineal cerrado (— 1600 pb). El carril 'A' muestra la escisión de la misma reacción con VP58.5, lo que muestra el producto molde de longitud completa (— 1900 bp) y más ADN sin escindir en los pocillos. Los carriles BX y AX muestran los resultados de la incubación con una exonucleasa.

La Figura 17 representa un mapa del plásmido usado en el Ejemplo 2 (proTLx-K B5X4A4 eGFP 15-0-15-10) con los componentes clave representados. TelRL y VP58.5 representan las secuencias de reconocimiento para las protelomerasas TelN y VP58.5 respectivamente. La secuencia representada como 15-0-15-10-15 y ubicada entre telRL y VP58.5 representa el motivo de tallo lazo que contiene un sitio de unión del cebador abierto (véase la Figura 13).

Descripción detallada

La presente invención se refiere a procesos mejorados libres de células para sintetizar o amplificar ADN lineal cerrado a partir de un molde de ADN lineal cerrado.

El molde de ADN lineal cerrado

El molde de ADN para usar en el método de la invención tiene ciertas características que son pertinentes, y estas se describen más abajo. ADN lineal cerrado, es decir, moléculas de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente; comprenden típicamente una sección lineal de doble hebra de ADN con extremos cerrados covalentemente, es decir, extremos en horquilla. Las horquillas unen los extremos de las hebras dobles de ADN lineales, de manera que, si la molécula se desnaturalizara por completo, se produciría una molécula de ADN circular de hebra sencilla.

Para los propósitos de esta invención, los extremos u horquillas cerrados covalentemente contienen secuencias internamente complementarias, ya que comprenden una parte o una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. Es posible que las bases dentro del vértice (extremo o vuelta) de la horquilla no puedan formar pares de bases, debido al estrés conformacional que se ejerce sobre la hebra de ADN en este punto. La Figura 3 muestra que se cree que al menos los 2 pares de bases en el vértice de la porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa pueden no formar pares de bases, pero la conformación exacta aún no se conoce y es probable que esté sujeta a fluctuaciones en dependencia de las condiciones en las que se mantiene el ADN y las secuencias exactas alrededor de la horquilla. Por lo tanto, es posible que 2 o más bases no puedan formar pares dada la distorsión estructural involucrada, a pesar de su naturaleza complementaria. La Figura 2 muestra las horquillas creadas por la acción de la protelomerasa TelN en el sitio TelRL. Algunas "oscilaciones" de bases no complementarias dentro de la longitud de una horquilla pueden no afectar la estructura. Una oscilación puede ser una ruptura en el palíndromo, pero las secuencias pueden seguir siendo complementarias. Sin embargo, se prefiere que la secuencia de la horquilla sea completamente autocomplementaria. Cada enzima protelomerasa, que trabaja en su secuencia de reconocimiento de protelomerasa apropiada, generará dos horquillas diferentes en el extremo del ADN lineal cerrado si hay "oscilaciones" en el palíndromo. La Figura 2 ilustra este punto al generar tanto una horquilla "R" como una "L".

La complementariedad describe cómo las bases de cada polinucleótido en una secuencia (5' a 3') están en un par de enlaces de hidrógeno con una base complementaria, A a T (o U) y C a G en la hebra antiparalela (3' a 5'), que puede ser en la misma hebra (secuencias complementarias internas) o en una hebra diferente. Esta definición se aplica a cualquier aspecto o modalidad de la invención. Se prefiere que las secuencias en la horquilla sean 90 % complementarias, preferentemente 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarias.

Por tanto, el molde de ADN comprende un ADN de doble hebra lineal cerrado en cada extremo con una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. Cada extremo puede estar formado por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa para las mismas o diferentes enzimas protelomerasas. Estas porciones pueden denominarse como la primera y segunda secuencias de reconocimiento de la protelomerasa, y estas forman los extremos del molde de ADN lineal cerrado.

El molde de ADN puede comprender otras secuencias de reconocimiento de la protelomerasa, además de las de los extremos cerrados (la primera y segunda secuencias de reconocimiento de la protelomerasa). Estas secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa se colocan en la sección de doble hebra del ADN lineal cerrado. Puede haber una, dos o más secuencias de reconocimiento de la protelomerasa presentes dentro de la sección de doble hebra. Estas secuencias pueden denominarse secuencias tercera, cuarta, quinta, sexta o "n-ésima" de reconocimiento de la protelomerasa. Cada una puede ser una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa para la misma enzima o una enzima diferente. Se prefiere que las secuencias adicionales o extras de reconocimiento de la protelomerasa sean diferentes de las usadas para tapar el extremo del molde de ADN lineal cerrado (la primera y la segunda secuencias de reconocimiento de la protelomerasa que son independientemente iguales o diferentes - mostradas como iguales y marcadas "A" en la Figura 12).

Las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa pueden colocarse en cualquier punto del segmento de ADN de doble hebra del molde de ADN lineal cerrado. Las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa son distintas del motivo de tallo lazo, no son la misma entidad, ya que las secuencias de reconocimiento de la protelomerasa no pueden plegarse para formar un tallo lazo como se definió en la presente descripción. Se prefiere que, si están presentes secuencias de adicionales de reconocimiento de la protelomerasa, que estén separadas de los extremos cerrados del molde por un motivo de tallo lazo. En esta modalidad, se prefiere que haya dos secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa, que sean iguales o diferentes, y que estén separadas de los extremos cerrados del ADN molde por un motivo de tallo lazo.

Por tanto, un molde ilustrativo comprende una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una primera y una segunda secuencia de reconocimiento de la protelomerasa; y que comprende al menos dos motivos de tallo lazo y al menos una tercera y una cuarta secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, en donde el primero de dichos motivos de tallo lazo está entre la primera y la tercera secuencias de reconocimiento de la protelomerasa y el segundo de dichos motivos de tallo lazo está entre la cuarta y la segunda secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. En otras palabras, cada motivo de tallo lazo se coloca entre el extremo protegido del ADN lineal cerrado y la secuencia adicional de reconocimiento de la protelomerasa. Esto se representa en la Figura 12.

Una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa es cualquier secuencia de ADN cuya presencia en una secuencia de ADN permite su conversión en un ADN lineal cerrado por la actividad enzimática de la protelomerasa. En otras palabras, la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa es necesaria para la escisión y la religación del ADN de doble hebra por la protelomerasa para formar ADN lineal cerrado covalentemente. Normalmente, una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa comprende una secuencia palindrómica, es decir, una secuencia de ADN de doble hebra que tiene una simetría rotacional doble, también descrita en la presente descripción como una repetición invertida. La longitud de la repetición invertida difiere en dependencia del organismo específico del que se deriva la protelomerasa. El palíndromo o la repetición invertida pueden ser perfectos o imperfectos. Una secuencia completa de reconocimiento de la protelomerasa comprende preferentemente una secuencia palindrómica de doble hebra (repetición invertida) de al menos 14 pares de bases de longitud.

Con más detalle, una secuencia completa de reconocimiento de la protelomerasa es reconocida y escindida por su protelomerasa análoga, y puede presentarse como un dúplex de una primera secuencia de ADN que comprende una porción directa (o sentido) de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa y una segunda secuencia de ADN complementaria que contiene la parte inversa (o antisentido) de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. Una vez que se ha escindido la secuencia de reconocimiento, lo que queda es una porción o parte de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. La porción o parte es preferentemente una hebra sencilla de la secuencia completa, que cuando se empareja con su secuencia complementaria, forma una secuencia completa de reconocimiento en un formato de doble hebra. Por tanto, la porción puede ser la parte directa (o sentido) de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa o la porción inversa (o antisentido).

La longitud de la primera o segunda porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa está determinada por la secuencia mínima reconocida por la protelomerasa análoga para unir, escindir y volver a unir los extremos libres. En la Figura 4 se representan varias secuencias completas de reconocimiento de la protelomerasa, y cada hebra representa una porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa análoga. La longitud de la porción de la secuencia de reconocimiento de protelomerasa para una protelomerasa análoga puede ser la misma o casi, ya que son capaces de aparearse para formar un dúplex. Cada porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa puede tener de 20 a 100 bases de longitud, más particularmente de 30 a 100 bases de longitud.

Como se muestra en la Figura 1, a pesar de que las dos porciones (A y B) de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa (C) forman un dúplex debido a la naturaleza complementaria de la secuencia de las porciones, debido a la naturaleza palindrómica de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, cada parte tiene la capacidad de plegarse en horquilla debido a secuencias internas autocomplementarias dentro de la parte de la secuencia de reconocimiento. Esto se muestra en la Figura 3.

El molde de ADN lineal cerrado de acuerdo con la presente invención comprende una secuencia para un motivo de tallo lazo dentro del ADN lineal de doble hebra. Como se usa en la presente descripción, un motivo de tallo lazo es una secuencia que permite la formación de una estructura de tallo lazo, bajo las condiciones apropiadas. La secuencia del motivo detallo lazo puede comprender una sección central flanqueada por dos secuencias adicionales.

La secuencia del motivo de tallo lazo puede incluir una sección central que forma la estructura de lazo del tallo lazo. Por tanto, esta sección central (lazo) está diseñada para ser de hebra sencilla y no complementaria a ninguna de las otras bases dentro del motivo. Esta sección central puede tener cualquier número apropiado de residuos de longitud, pero se prefiere que la sección central (y por lo tanto el lazo) tenga de 5 a 50 residuos, particularmente de 5 a 40 residuos, más particularmente de 5 a 30 residuos, incluso más particularmente de 10 hasta 25 residuos de longitud. La sección central, y por tanto el lazo, puede ser 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 residuos (bases) de longitud.

Preferentemente, la sección central del motivo o lazo incluye una secuencia para un sitio de unión del cebador. Un sitio de unión del cebador es una región de una secuencia de nucleótidos donde un cebador se une o se hibrida para iniciar la replicación. El cebador se hibrida específicamente con el sitio de unión del cebador debido a la naturaleza complementaria de sus secuencias. El sitio de unión del cebador puede diseñarse de manera que los cebadores se puedan hibridar ya que son complementarios a una parte o porción del sitio de unión del cebador, véase por ejemplo la Figura 10A. Alternativamente, el sitio de unión del cebador y el cebador pueden tener la misma longitud. El diseño del cebador y, por tanto, la secuencia del sitio de unión del cebador se discute con más detalle más abajo. El sitio de unión del cebador tiene al menos 5 residuos de longitud, pero puede tener de 5 a 50 residuos (bases) de longitud. Idealmente, el sitio de unión del cebador tiene de 5 a 30 o de 5 a 20 residuos de longitud, opcionalmente de 5 a 16 residuos de longitud. El sitio de unión del cebador puede ser al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 residuos de longitud. Se prefiere que el sitio de unión del cebador forme una parte o porción de la sección central, junto con al menos una secuencia que separa el sitio de unión del cebador de las secuencias flanqueantes. La secuencia contigua puede estar presente en el lado 3' o 5' del sitio de unión del cebador, o estar presente en ambos lados del sitio de unión del cebador. Las secuencias contiguas pueden ser de cualquier longitud adecuada y cada una de las secuencias contiguas es independiente, es decir, la presencia, longitud o naturaleza de la secuencia contigua puede ser diferente en cualquier lado del sitio de unión del cebador, si está presente. Cada secuencia contigua puede tener hasta 50 residuos de longitud, preferentemente hasta 40, hasta 30 o hasta 20, con la máxima preferencia, 15 residuos de longitud. Por tanto, las secuencias contiguas pueden ser al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 residuos (bases) en longitud.

La Figura 13 representa una estructura detallo lazo ilustrativa con el formato 15-0-15-10, con el sitio de cebado mantenido en la configuración abierta. El esquema de los nombres se refiere a la longitud del tallo (15), la longitud del primer espaciador (0), la longitud del sitio de cebado (15), la longitud del segundo espaciador (10). Se debe entender que este formato podría seguirse mediante el uso de elementos de diferentes longitudes a las representadas.

En una modalidad, puede producirse una estructura de tallo lazo debido al emparejamiento de bases intramoleculares dentro de una hebra sencilla de ADN. En este caso, el tallo lazo se produce cuando dos regiones de la misma hebra, normalmente complementarias en la secuencia de nucleótidos cuando se leen en direcciones opuestas, forman un par de bases para formar una sección de doble hebra que termina en un lazo no apareado. Alternativamente, en una segunda modalidad, el motivo de tallo lazo puede incluir secuencias sobre las que actúan moléculas de oligonucleótidos puente, que fuerzan una sección de ADN a formar un lazo de hebra sencilla.

La secuencia para el motivo de tallo lazo puede incluir dos regiones complementarias que flanquean la sección de lazo central no complementario. La complementariedad se definió previamente. Así, por ejemplo, una secuencia para un motivo de tallo lazo dice (5' a 3'): Secuencia de flanqueo 5', sección central, secuencia de flanqueo 3'. Las secuencias flanqueantes 5' y 3' son complementarias cuando la secuencia flanqueante 3' se lee 3' a 5'. Esto permite que las secuencias flanqueantes se emparejen entre sí y formen un dúplex, con la sección central formando un bucle como una hebra sencilla entre ellas. En esta modalidad, las secuencias flanqueantes son de la misma o muy similar longitud. Las secuencias flanqueantes tienen preferentemente al menos 5 residuos (bases) de longitud, o al menos 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de longitud. Las secuencias flanqueantes pueden tener hasta 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 residuos de longitud. Cuando las secuencias flanqueantes están diseñadas para ser autocomplementarias, se apreciará que la estabilidad de la sección de doble hebra está determinada por su longitud, el número de desapareamientos que contiene (un pequeño número es tolerable) y la composición de bases de la región emparejada. Los emparejamientos entre guanina y citosina tienen tres enlaces de hidrógeno y son más estables en comparación con los emparejamientos de adeninatimina, que solo tienen dos. Los expertos en la técnica apreciarán cómo diseñar una secuencia para un motivo de tallo lazo de manera que la estructura, cuando se forme, sea estable. El Integrated DNA Technologies Oligoanalyzer puede usarse para determinar la idoneidad de las estructuras de tallo lazo. La versión 3.1 está disponible en https://www.idtdna.com/calc/analyzer.

En una modalidad alternativa, las secuencias que flanquean la sección central se diseñan de manera que sean al menos parcialmente complementarias a un oligonucleótido puente. La complementariedad es como se definió anteriormente. En esta modalidad, las secuencias flanqueantes están diseñadas para unirse como una secuencia esencialmente contigua unida a un oligonucleótido puente, lo que obliga a la sección central a formar un lazo entre las secuencias flanqueantes. Por tanto, en esta modalidad, las secuencias flanqueantes están diseñadas para ser complementarias en secuencia a un oligonucleótido puente. Las secuencias flanqueantes tienen preferentemente al menos 5 residuos (bases) de longitud, o al menos 6, 7, 8, 9 o 10 residuos de longitud. Las secuencias flanqueantes pueden tener hasta 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 residuos de longitud. Por tanto, la secuencia para un motivo de tallo lazo puede permitir la formación de un tallo lazo en esa secuencia, y/o la secuencia complementaria de la misma, en condiciones apropiadas. Tales condiciones pueden incluir la presencia de la secuencia para el motivo de tallo lazo dentro de una hebra sencilla de ADN, tal como la hebra sencilla que se produce durante la replicación del molde. Las condiciones alternativas en las que se puede formar el tallo lazo son las condiciones de desnaturalización/renaturalización mediadas por cambios en el pH, la temperatura y los medios iónicos. Se prefiere que las condiciones para la formación del tallo lazo sean las usadas para la amplificación del molde de ADN, de manera que las estructuras de tallo lazo se formen inmediatamente o poco después de que se incorporen en la hebra sencilla de ADN sintetizada por la ADN polimerasa.

Los expertos en la técnica entenderán que la secuencia para el motivo tallo lazo, cuando está presente en el molde, estará presente tanto en las hebras directa (sentido) como inversa (antisentido) (como imágenes especulares/secuencias complementarias). En un molde de ADN lineal cerrado, las hebras directa e inversa están formadas por una hebra circular de ADN.

Cuando el molde se replica en el método de la invención, la secuencia sentido se replica para proporcionar una secuencia antisentido y la secuencia antisentido se replica para proporcionar la secuencia sentido. Por tanto, siempre hay una versión sentido y antisentido de la secuencia para el motivo del tallo lazo tanto en el molde como en el ADN replicado. El ADN replicado es un concatémero de hebra sencilla, que comprenderá tanto la secuencia sentido como la antisentido en la misma hebra de ADN.

Tanto las secuencias sentido como antisentido pueden ser capaces de formar una estructura de tallo lazo. En el molde de ADN lineal cerrado, esto puede resultar en una estructura de tallo lazo emparejado como se muestra en la Figura 9B, cada uno de los pares está en lados opuestos de la sección de doble hebra del a Dn lineal cerrado. En el ADN replicado, el concatémero de hebra sencilla, también pueden formarse estructuras de tallo lazo emparejadas, como se muestra en la Figura 9D. Estos tallos lazos emparejados sirven para mantener un sitio de cebado abierto dentro de la nanoflor de ADN que se forma debido a la naturaleza de la secuencia de ADN que se replica.

Puede diseñarse un cebador para que se una a la versión sentido o antisentido del "sitio de unión del cebador". El método de la presente invención requiere al menos un cebador. Opcionalmente, la secuencia del sitio de unión del cebador está en el formato correcto (dirección) en la versión/secuencia sentido del motivo detallo lazo. Por tanto, una opción es que el cebador se hibrida con el sitio de unión del cebador en la versión sentido de la secuencia del motivo de tallo lazo. Claramente, el sistema puede diseñarse a la inversa y el cebador puede diseñarse para poder unirse al sitio de unión del cebador en la versión antisentido de la secuencia del motivo de tallo lazo. Dado que ambos están presentes tanto en el molde como en el ADN replicado, cualquiera de las secuencias está disponible para apareamiento. Por tanto, cuando el método de la invención se realiza con una única especie de cebador, puede diseñarse para aparearse con la versión con sentido o antisentido del sitio de unión del cebador. Si el método de la invención se realiza con dos o más cebadores, cada cebador puede diseñarse individualmente para unirse a la versión sentido o antisentido de la secuencia para el motivo de tallo lazo.

La secuencia del motivo de tallo lazo incluye una secuencia para formar un lazo de hebra sencilla. Como tal, se debe señalar que el motivo detallo lazo no es una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, ya que no incluye secuencia para un lazo. Por tanto, el motivo de tallo lazo es distinto de dicha secuencia de reconocimiento de la protelomerasa o una parte de la misma y, por tanto, distinto de los extremos cerrados o tapados del ADN lineal cerrado.

El ADN lineal cerrado puede comprender una o más secuencias que comprenden un motivo de tallo lazo, por lo que puede comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de tales motivos. El motivo de tallo lazo puede incluirse en cualquier ubicación apropiada en la sección de ADN lineal cerrado. Opcionalmente, la secuencia del motivo de tallo lazo se incluye adyacente a la porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa que forma un extremo cerrado covalentemente. Adyacente en este contexto puede estar dentro de 1-100 residuos del extremo de la porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, opcionalmente dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 residuos del final de la porción de secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. Alternativamente, las dos entidades pueden estar cerca entre sí, es decir, hasta 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o hasta 100 residuos separados (se puede medir desde el extremo de la porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa hasta el comienzo del motivo de tallo lazo, o viceversa).

El molde de ADN lineal cerrado puede comprender además cualquier secuencia dentro de la secuencia de doble hebra, ya sea de origen natural o artificial. Puede comprender al menos una secuencia diana de la enzima de procesamiento, tal como uno, dos, tres, cuatro o más sitios diana de la enzima de procesamiento. Tal secuencia diana es para permitir que el ADN se procese opcionalmente después de la síntesis. Una enzima de procesamiento es una enzima que reconoce su sitio diana y procesa el ADN. La secuencia diana de la enzima de procesamiento puede ser una secuencia diana para una enzima de restricción. Una enzima de restricción, es decir, una endonucleasa de restricción, se une a una secuencia diana y escinde en un punto específico. La secuencia diana de la enzima de procesamiento puede ser una diana para una recombinasa. Una recombinasa cataliza direccionalmente las reacciones de intercambio de ADN entre secuencias cortas de sitios diana (30-40 nucleótidos) que son específicas de cada recombinasa. Los ejemplos de recombinasas incluyen la recombinasa Cre (con loxP como secuencia diana) y la recombinasa FLP (con sitios diana cortos de reconocimiento de flipasa (FRT)). La secuencia diana de la enzima de procesamiento puede ser una diana para una integrasa específica de sitio, tal como la integrasa phiC31.

La secuencia diana de la enzima de procesamiento puede ser una secuencia diana para una ARN polimerasa, de manera que el ADN se convierta en un molde para la síntesis de polipéptidos. En este caso, el sitio de direccionamiento de la enzima de procesamiento es un promotor, preferentemente un promotor eucariótico.

El molde de ADN lineal cerrado puede comprender una o más secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa, además de las presentes en los extremos cerrados del molde. Estas secuencias pueden ser cualquier secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, pero preferentemente son diferentes a la primera y segunda secuencias de reconocimiento de la protelomerasa usadas en los extremos lineales cerrados del molde. También pueden ser iguales o diferentes entre sí. Se prefiere que estén presentes al menos dos secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa, y se incluyan dentro de la sección de doble hebra del ADN lineal cerrado en un par. Este par de secuencias de reconocimiento de la protelomerasa (la tercera y cuarta secuencias) puede flanquear una secuencia deseada en el molde de ADN lineal cerrado. Se prefiere que esta secuencia deseada no incluya un motivo de tallo lazo como se definió en la presente descripción. La secuencia deseada puede incluir un casete de expresión o cualquier otra secuencia de interés. La secuencia deseada puede ser la secuencia para producir un ADN lineal cerrado mediante el uso de los métodos de la invención. En este caso, la tercera y cuarta secuencias de reconocimiento de protelomerasa son necesarias para la formación de los extremos cerrados del ADN lineal cerrado, con la secuencia deseada formando la sección de doble hebra. La tercera y cuarta secuencias pueden ubicarse adyacentes o cerca de los motivos de tallo lazo. En una modalidad, un motivo de tallo lazo separa una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa del extremo cerrado más cercano. En otra modalidad, hay un par de secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa, y cada una está separada de un extremo cerrado por un motivo de tallo lazo.

El molde de ADN lineal cerrado puede comprender un casete de expresión que comprende, consiste o consiste esencialmente en un promotor eucariótico operativamente unido a una secuencia que encierra una proteína de interés y, opcionalmente, una secuencia eucariótica de terminación de la transcripción. Un “promotor” es una secuencia de nucleótidos que inicia y regula la transcripción de un polinucleótido. “Unido operativamente” se refiere a un arreglo de elementos en donde los componentes descritos se configuran de modo que realizan su función usual. Por tanto, un promotor dado operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico es capaz de efectuar la expresión de esa secuencia cuando están presentes las enzimas adecuadas. El término "unido operativamente" pretende abarcar cualquier separación u orientación del elemento promotor y la secuencia de ADN de interés que permita el inicio de la transcripción de la secuencia de ADN de interés tras el reconocimiento del elemento promotor por un complejo de transcripción.

El molde de ADN puede tener cualquier longitud adecuada. Particularmente, el molde de ADN puede tener hasta 100 kilobases, o hasta 50 kilobases, o hasta 40 kilobases, o hasta 30 kilobases. Preferentemente, el molde de ADN puede tener de 100 bases a 100 kilobases, de 200 bases a 40 kilobases, con mayor preferencia de 200 bases a 30 kilobases, con la máxima preferencia de 1 kilobase a 15 kilobases.

El molde de ADN lineal cerrado usado en el método de la invención es único. Así, de acuerdo con un tercer aspecto, la invención se refiere a una molécula de ADN de doble hebra cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, en donde la secuencia de dicha molécula de ADN de doble hebra lineal incluye al menos un motivo de tallo lazo Todos estos elementos se han definido anteriormente. En condiciones apropiadas, el motivo de tallo lazo da como resultado la presencia de un par de estructuras de tallo lazo dentro de la sección de doble hebra del ADN lineal cerrado, tal como la molécula representada esquemáticamente en la Figura 9B. El molde de ADN lineal cerrado puede incluir las secuencias de reconocimiento adicionales de la protelomerasa, como se definió previamente.

El molde de ADN como se definió anteriormente puede proporcionarse en una cantidad suficiente para usar en el proceso de la invención mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, el molde puede producirse mediante PCR, extensión del molde o cualquier medio sintético para producir ADN.

Amplificación y procesamiento

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para producir ADN lineal cerrado a partir de un molde de ADN lineal cerrado. Dicho molde puede definirse como se describió previamente en la presente descripción.

De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro, libre de células para producir moléculas de ADN lineal cerrado que comprende:

(a) poner en contacto un molde que comprende una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una primera y una segunda secuencia de reconocimiento de la protelomerasa y que comprende al menos un motivo de tallo lazo con una polimerasa de desplazamiento de hebra en condiciones que promueven la amplificación de dicho molde en presencia de al menos un cebador que es capaz de unirse específicamente a una secuencia dentro de dicho motivo de tallo lazo;

El molde de ADN puede comprender opcionalmente otras secuencias de reconocimiento de protelomerasa, adicional a la primera y segunda secuencias. Preferentemente, estas secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa son distintas y están separadas del al menos un motivo de tallo lazo. Las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa pueden separarse de uno o ambos extremos cerrados del ADN lineal cerrado por el al menos un motivo de tallo lazo. Estas pueden identificarse como la tercera, cuarta, etc. secuencias de reconocimiento de la protelomerasa.

Opcionalmente, cada una de las secuencias de reconocimiento de la protelomerasa o porciones de las mismas puede ser la misma secuencia o secuencias diferentes, cada una independiente de la otra. Diferentes enzimas protelomerasas actuarán sobre diferentes secuencias de reconocimiento y, por lo tanto, se requerirán las enzimas protelomerasas apropiadas para la producción de ADN lineal cerrado.

El molde de ADN se pone en contacto con al menos una polimerasa de desplazamiento de hebra. Pueden usarse una, dos, tres, cuatro o cinco polimerasas de desplazamiento de hebra diferentes. La polimerasa de tipo desplazamiento de cadena puede ser cualquier polimerasa adecuada, de manera que sintetice polímeros de ADN.

Una polimerasa puede ser muy estable, de manera que su actividad no se reduce sustancialmente por una incubación prolongada en las condiciones del proceso. Por lo tanto, la enzima tiene preferentemente una vida media larga en una variedad de condiciones de proceso que incluyen, pero que no se limitan a, temperatura y pH. También se prefiere que la polimerasa tenga una o más características adecuadas para un proceso de fabricación. La polimerasa tiene preferentemente una alta fidelidad, por ejemplo, al tener actividad de corrección. Además, se prefiere que la polimerasa muestre alta procesividad, alta actividad de desplazamiento de hebra y una Km baja para dNTP y ADN. Se prefiere que la polimerasa no muestre actividad exonucleasa de ADN que no esté relacionada con su actividad de corrección.

El experto puede determinar si una polimerasa dada presenta o no las características definidas anteriormente por comparación con las propiedades mostradas por las polimerasas disponibles comercialmente, por ejemplo, Phi29 (New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, EE.UU.), Deep Vent® (New England Biolabs, Inc.) y ADN polimerasa I de Bacillus stearothermophilus (Bst) (New England Biolabs, Inc.). Cuando se hace referencia a una alta procesividad, esto típicamente denota el número promedio de nucleótidos agregados por una enzima polimerasa por asociación/disociación con el molde, es decir, la longitud de la extensión del cebador obtenida de un único evento de asociación.

Las polimerasas preferidas de tipo desplazamiento de hebra son Phi 29, Deep Vent y ADN Bst polimerasa I o las variantes de cualquiera de las mismas. "Desplazamiento de hebra" describe la capacidad de una polimerasa para desplazar hebras complementarias al encontrar una región de ADN de doble hebra durante la síntesis. Por tanto, el molde se amplifica al desplazar las hebras complementarias y sintetizar una nueva hebra complementaria. Por lo tanto, durante la replicación por desplazamiento de hebra, una hebra recién replicada se desplazará para dejar paso a la polimerasa para replicar una hebra complementaria adicional. La reacción de amplificación se inicia cuando un cebador o el extremo libre 3' de un molde de hebra sencilla se hibrida con una secuencia complementaria en un molde (ambos son eventos de cebado). Cuando prosigue la síntesis de ADN y si encuentra un cebador adicional u otra hebra hibridada con el molde, la polimerasa lo desplaza y continúa su elongación de la hebra. El desplazamiento de la hebra genera hebras sencillas de ADN recién sintetizadas que pueden actuar como molde para más eventos de cebado. El cebado del ADN recién sintetizado conduce a una hiperramificación y un alto rendimiento de productos. Debe entenderse que los métodos de amplificación por desplazamiento de hebra difieren de los métodos basados en PCR en que los ciclos de desnaturalización no son esenciales para una amplificación eficaz del ADN, ya que el ADN de doble hebra no es un obstáculo para la síntesis continua de nuevas hebras de ADN. Es posible que la amplificación por desplazamiento de hebra solo requiera una ronda inicial de calentamiento, para desnaturalizar el molde inicial si es de doble hebra, para permitir que el cebador se hibride con el sitio de unión del cebador si se usa. A continuación, la amplificación puede describirse como isotérmica, ya que no se requiere más calentamiento o enfriamiento. En contraste, los métodos de PCR requieren ciclos de desnaturalización (es decir, elevar la temperatura a 94 grados centígrados o más) durante el proceso de amplificación para fundir el ADN de doble hebra y proporcionar nuevos moldes de hebra sencilla. Durante el desplazamiento de hebra, la polimerasa desplazará hebras de ADN ya sintetizado. Además, usará ADN recién sintetizado como molde, lo que asegura una rápida amplificación del ADN.

Una polimerasa de desplazamiento de hebra usada en el proceso de la invención tiene preferentemente una procesividad de al menos 20 kb, con mayor preferencia, al menos 30 kb, al menos 50 kb, o al menos 70 kb o más. En una modalidad, la ADN polimerasa de desplazamiento de hebra tiene una procesividad que es comparable o mayor que la ADN polimerasa phi29.

La replicación por desplazamiento de la hebra ocurre durante el proceso de la invención. Durante la replicación por desplazamiento de hebra, el molde se amplifica al desplazar hebras ya replicadas, que han sido sintetizadas por la acción de la polimerasa, lo que desplaza a su vez otra hebra, que puede ser la hebra complementaria original de un molde de doble hebra, o una hebra complementaria recién sintetizada, esta última sintetizada por la acción de una polimerasa sobre un cebador anterior hibridado con el molde. Por tanto, la amplificación del molde puede producirse mediante el desplazamiento de hebras replicadas a través de la replicación por desplazamiento de hebra de otra hebra. Este proceso puede describirse como amplificación por desplazamiento de hebra o replicación por desplazamiento de hebra.

Un proceso de replicación por desplazamiento de hebra preferido es la amplificación/replicación de círculo rodante (RCA). El término RCA describe la capacidad de las polimerasas de tipo RCA para progresar continuamente alrededor de una hebra de ADN molde circular mientras se extiende un cebador hibridado. Un molde de ADN lineal cerrado puede desnaturalizarse para formar un ADN circular de hebra sencilla. La amplificación a partir de tal círculo conduce a la formación de productos lineales que son hebras simples de ADN con múltiples repeticiones de ADN amplificado enlazadas en serie. Una mayor replicación de estas hebras directamente puede resultar en hiperramificación. La secuencia del molde de ADN (una sola unidad) se repite multiplicando dentro de un producto lineal. Cada una de estas múltiples unidades repetidas son idénticas y están vinculadas en una serie. El producto inicial de la amplificación por desplazamiento de hebra a partir de un ADN lineal cerrado es una hebra sencilla de ADN concatamérica, que se considera que tiene la polaridad opuesta a la polaridad original del molde de ADN lineal cerrado. Sin embargo, dado que cada molde lineal cerrado incluye las hebras positivas y negativas una al lado de la otra, la hebra sencilla concatémera de ADN producida mediante amplificación incluye secuencias alternas de hebra positiva y negativa en cada unidad individual. Estas hebras simples lineales de ADN producidas pueden servir como base para eventos de hibridación múltiple, extensión de cebadores y desplazamiento de hebras, lo que da como resultado la formación de productos de ADN concatemérico de doble hebra (2 hebras complementarias separadas), que nuevamente comprenden múltiples repeticiones de las unidades individuales (moldes) amplificados por la polimerasa. Por tanto, hay múltiples copias de cada ADN de "unidad única" amplificado en los productos de ADN concatemérico de doble hebra. Se prefieren particularmente las polimerasas RCA para usar en el proceso de la presente invención. Los productos de los procesos de replicación por desplazamiento de hebra de tipo RCA pueden requerir procesamiento para liberar ADN de una sola unidad. Esto es conveniente si se requieren unidades individuales de a Dn .

Para permitir la amplificación, el molde de ADN también se pone en contacto con uno o más cebadores. Los cebadores son específicos para una o más secuencias comprendidas dentro del molde de ADN, en particular el sitio de unión del cebador situado en la sección central (o lazo) del motivo de tallo lazo. Por tanto, los cebadores son específicos, lo que significa que tienen una secuencia que es complementaria al sitio de unión del cebador. La complementariedad es como se definió anteriormente. Puede usarse un cebador específico único en el método de la invención debido a la naturaleza complementaria del molde de ADN lineal cerrado. Esto significa que cada molde comprende una secuencia directa (sentido) e inversa (antisentido) para el motivo de tallo lazo, lo que garantiza que el producto de ADN producido también tendrá una versión inversa (antisentido) y una versión directa (sentido) del motivo de tallo lazo. Como se mencionó anteriormente, la orientación correcta podría ser en la versión sentido o antisentido de la secuencia del motivo de tallo lazo.

Los cebadores pueden no estar marcados o pueden comprender uno o más marcadores, por ejemplo, radionúclidos o tintes fluorescentes. Los cebadores también pueden comprender modificaciones químicas, típicamente de manera que el cebador tenga una resistencia mejorada a la hidrólisis. Por ejemplo, el cebador puede comprender preferentemente uno o más enlaces fosforotioato. El cebador puede ser cualquier oligonucleótido adecuado, incluido un cebador de ADN, un cebador de ácido ribonucleico (ARN) o un cebador de ácido nucleico bloqueado (LNA), o cualquier híbrido adecuado de los mismos. Las longitudes/secuencias de los cebadores pueden seleccionarse típicamente con base en las consideraciones de temperatura, es decir, para que puedan unirse al molde a la temperatura usada en la etapa de amplificación. De manera análoga, el sitio de unión del cebador se diseña teniendo en cuenta estas consideraciones.

Adicionalmente el cebador puede sintetizarse in situ mediante el uso de una enzima primasa. En esta versión, puede suministrarse una enzima primasa para construir un cebador en la sección central abierta del motivo de tallo lazo. Por tanto, también es posible suministrar indirectamente un cebador al molde y la polimerasa.

El contacto del molde de ADN con la polimerasa y uno o más cebadores puede tener lugar en condiciones que promuevan el apareamiento de los cebadores con el molde de ADN. Las condiciones incluyen la presencia de ADN de hebra sencilla lo que permite la hibridación de los cebadores. Las condiciones también incluyen una temperatura y un tampón que permiten el apareamiento del cebador con el molde. Pueden seleccionarse condiciones de apareamiento/hibridación apropiadas en dependencia de la naturaleza del cebador. Un ejemplo de condiciones de apareamiento preferidas usadas en la presente invención incluye un tampón, Tris-HCl 30 mM pH 7,5, KCl 20 mM, MgCl 8 mM2. El apareamiento puede llevarse a cabo después de la desnaturalización mediante el uso de calor mediante enfriamiento gradual hasta la temperatura de reacción deseada. Los eventos de desnaturalización alternativos incluyen el uso de concentraciones específicas de iones.

Típicamente, un cebador de la invención se une o se une específicamente solo al sitio de unión del cebador dentro del molde de ADN lineal cerrado. Las longitudes de los cebadores pueden variar, por ejemplo, de 12, 15, 18, 20 o 30 residuos de longitud. Un cebador puede tener de 6 a 30, 12 a 30, 18 a 30 o 25 a 30 residuos de longitud.

Pueden aplicarse métodos de rutina de diseño y fabricación de cebadores para la producción de un cebador capaz de unirse específicamente a cualquier sitio incluido de unión de cebador. Las longitudes/secuencias de los cebadores pueden seleccionarse típicamente con base en consideraciones de temperatura, tales como ser capaz de unirse al molde a la temperatura usada en la etapa de amplificación.

De manera óptima, un cebador de la invención se une eficientemente al molde de ADN después de su desnaturalización para separar las secuencias complementarias. La desnaturalización en los métodos de amplificación estándar implica típicamente una etapa de "fusión" a alta temperatura. Por tanto, un cebador puede definirse por su temperatura de fusión, o Tm, que es la temperatura a la que un nucleótido de doble hebra se separa en hebras simples. Sin embargo, pueden usarse métodos alternativos de desnaturalización, y estos son los que se describen más abajo.

Una vez que el cebador se hibrida o se une al sitio de unión del cebador, está disponible para iniciar la amplificación del molde de ADN. El cebador hibridado con el molde se incuba en condiciones que promueven la amplificación de dicho molde mediante el desplazamiento de hebras replicadas mediante la replicación por desplazamiento de hebra de la otra hebra. Las condiciones comprenden el uso de cualquier temperatura que permita la amplificación del ADN, comúnmente en el intervalo de 20 a 90 grados centígrados. Un intervalo de temperatura preferido puede ser de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 o de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 grados centígrados.

Típicamente, se selecciona una temperatura adecuada en función de la temperatura a la que una polimerasa específica tiene una actividad óptima. Esta información está comúnmente disponible y forma parte del conocimiento general del experto. Por ejemplo, cuando se usa la ADN polimerasa phi29, un intervalo de temperatura adecuado sería de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 grados centígrados, preferentemente aproximadamente 30 grados centígrados. El experto podrá identificar de forma rutinaria una temperatura adecuada para una amplificación eficaz de acuerdo con el proceso de la invención. Por ejemplo, el proceso podría llevarse a cabo en un intervalo de temperaturas y los rendimientos de ADN amplificado podrían monitorearse para identificar un intervalo de temperatura óptimo para una polimerasa dada. La amplificación puede llevarse a cabo a temperatura constante y se prefiere que el proceso sea isotérmico. Dado que se prefiere la amplificación por desplazamiento de hebra, no es necesario alterar la temperatura para separar las hebras de ADN. Por tanto, el proceso puede ser un proceso isotérmico.

Típicamente, para sintetizar el ADN, la polimerasa requiere un suministro de nucleótidos. Un nucleótido es un monómero, o una sola unidad, de ácidos nucleicos, y los nucleótidos están compuestos por una base nitrogenada, un azúcar de cinco carbonos (ribosa o desoxirribosa) y al menos un grupo fosfato. Puede usarse cualquier nucleótido adecuado. La base nitrogenada puede ser adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U). La base nitrogenada también puede ser bases modificadas, tales como 5-metilcitosina (m5C), pseudouridina (V), dihidrouridina (D), inosina (I) y 7-metilguanosina (m7G).

Se prefiere que el azúcar de cinco carbonos sea una desoxirribosa, de manera que el nucleótido sea un desoxinucleótido. El nucleótido puede estar en forma de desoxinucleósido trifosfato, denominado dNTP. Esto es una modalidad preferida de la presente invención. Los dNTP adecuados pueden incluir dATP (trifosfato de desoxiadenosina), dGTP (trifosfato de desoxiguanosina), dTTP (trifosfato de desoxitimidina), dUTP (trifosfato de desoxiuridina), dCTP (trifosfato de desoxicitidina), dITP (trifosfato de desoxicitidina), trifosfato modificado de dITP (desoxiinosina), y versiones modificadas y derivadas de los mismos. Se prefiere que los dNTP comprendan uno o más de dATP, dGTP, dTTP o dCTP, o versiones modificadas o derivados de los mismos. Se prefiere usar una mezcla de dATP, dGTP, dTTP y dCTP o una versión modificada de los mismos.

Otras condiciones que promueven la amplificación del molde de ADN lineal cerrado comprenden la presencia de iones metálicos, agentes tamponantes/pH adecuados y otros factores que se requieren para el rendimiento o la estabilidad de la enzima. Las condiciones adecuadas incluyen cualquier condición usada para proporcionar la actividad de las enzimas polimerasas conocidas en la técnica.

Por ejemplo, el pH de la mezcla de reacción puede estar dentro del intervalo de 3 a 12, preferentemente de 5 a 9 o aproximadamente 7, tal como aproximadamente 7,9. El pH se puede mantener en este intervalo mediante el uso de uno o más agentes tamponadores. Tales tampones incluyen, pero que no se limitan a MES, Bis-Tris, ADA, ACES, PIPES, MOBS, MOPS, MOPSO, Bis-Tris Propano, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, Trizma, HEPPSO, POPSO, TEA, EPPS, Tricina, Gly-Gly, Bicina, HEPBS, TAPS, AMPD, TABS, AMPSO, CHES, CAPSO, AMP, CAPS, CABS, fosfato, ácido cítricohidrogenofosfato de sodio, ácido cítrico-citrato de sodio, acetato de sodio-ácido acético, imidazol y carbonato de sodiobicarbonato de sodio.

Si bien la aplicación de calor (exposición a 95 °C durante varios minutos) se usa para desnaturalizar el ADN de doble hebra, pueden usarse otros enfoques que son más adecuados para la síntesis de ADN. El ADN de doble hebra puede desnaturalizarse fácilmente mediante la exposición a un entorno de pH alto o bajo o cuando los cationes están ausentes o presentes en concentraciones muy bajas, tal como en agua desionizada. La polimerasa requiere la unión de una secuencia corta de oligonucleotídico cebador a una región de hebra sencilla del molde de ADN para iniciar su replicación. La estabilidad de esta interacción y, por lo tanto, la eficiencia de la amplificación del ADN puede estar particularmente influenciada por la concentración de cationes metálicos y particularmente cationes divalentes tal como los iones Mg2+ que pueden verse como parte integral del proceso.

Las condiciones de amplificación también pueden comprender iones metálicos. La mezcla de reacción también puede comprender sales de metales tales como, pero que no se limitan a, sales de iones metálicos divalentes: magnesio (Mg2+), manganeso (Mn2+), calcio (Ca2+), berilio (Be2+), zinc (Zn2+) y estroncio (Sr2+), o sales de iones metálicos monovalentes, que incluyen, pero que no se limitan a, litio (Li+), sodio (Na+) o potasio (K+). Las sales pueden incluir cloruros, acetatos y sulfatos. Otras sales que pueden incluirse son sales de amonio, en particular sulfato de amonio.

También pueden incluirse detergentes en las condiciones de amplificación. Los ejemplos de detergentes adecuados incluyen Tritón X-100, Tween 20 y derivados de cualquiera de los mismos. También pueden incluirse agentes estabilizantes en la mezcla de reacción. Puede usarse cualquier agente estabilizante adecuado, en particular, albúmina de suero bovino (BSA) y otras proteínas estabilizantes. Las condiciones de reacción también pueden mejorarse al añadir agentes que relajen el ADN y faciliten la desnaturalización del molde. Tales agentes incluyen, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), formamida, glicerol y betaína. También pueden incluirse agentes de condensación de ADN en la mezcla de reacción. Tales agentes incluyen, por ejemplo, polietilenglicol o lípidos catiónicos o polímeros catiónicos.

Debe entenderse que el experto puede modificar y optimizar las condiciones de amplificación e incubación del proceso de la invención mediante el uso de estos componentes y condiciones adicionales con base en sus conocimientos generales. Igualmente, las concentraciones específicas de agentes particulares pueden seleccionarse sobre la base de ejemplos previos en la técnica y optimizarse adicionalmente sobre la base del conocimiento general. Como ejemplo, puede optimizarse la cantidad de polimerasa presente en la mezcla de reacción. Esto puede implicar la adición de enzima polimerasa a la mezcla de reacción durante la síntesis de ADN. Como ejemplo adicional, puede optimizarse la cantidad de molde de ADN. Esto puede implicar la adición de molde de ADN a la mezcla de reacción durante la síntesis de ADN.

Como ejemplo, un tampón de reacción adecuado usado en los métodos con base en la técnica de amplificación por círculo rodante es Tris HCl 50 mM, pH 7,5, MgCh 10 mM, (N H ^S O 420 mM, Glicerol al 5 %, BSA 0,2 mM, dNTP 1 mM. Un tampón de reacción preferido usado en la amplificación RCAde la invención es Tris-HCl 30 mM pH 7,4, KCl 30 mM, MgCh 7,5 mM, (NH4)2SO4 10 mM, DTT 4 mM, dNTP 2 mM. Este tampón es particularmente adecuado para usar con la polimerasa de RCA Phi29.

Las condiciones de amplificación también pueden comprender el uso de una o más proteínas adicionales. El molde de ADN puede amplificarse en presencia de al menos una pirofosfatasa, tal como la pirofosfatasa inorgánica de levadura. Pueden usarse dos, tres, cuatro, cinco o más pirofosfatasas diferentes. Estas enzimas son capaces de degradar el pirofosfato generado por la polimerasa de los dNTP durante la replicación de la hebra. La acumulación de pirofosfato en la reacción puede provocar la inhibición de las ADN polimerasas y reducir la velocidad y la eficiencia de la amplificación del ADN. Las pirofosfatasas pueden descomponer el pirofosfato en fosfato no inhibitorio. Un ejemplo de pirofosfatasa adecuada para usar en el proceso de la presente invención es la pirofosfatasa de Saccharomyces cerevisiae, disponible comercialmente de New England Biolabs, Inc.

Puede usarse cualquier proteína de unión a hebra sencilla (SSBP) en el proceso de la invención para estabilizar el ADN de hebra sencilla. Las SSBP son componentes esenciales de las células vivas y participan en todos los procesos que involucran al ADNss, tales como la replicación, reparación y recombinación del ADN. En estos procesos, las SSBP se unen al ADNss formado transitoriamente y pueden ayudar a estabilizar la estructura del ADNss. Un ejemplo de SSBP adecuada para usar en el proceso de la presente invención es la proteína T4 del gen 32, disponible comercialmente de New England Biolabs, Inc.

Al actuar sobre el cebador unido al molde, la polimerasa actúa para producir múltiples unidades repetidas e idénticas de dicho molde de ADN unidas en serie, descritas de cualquier otra manera como una hebra sencilla concatamérica de ADN. Este concatémero comprende múltiples repeticiones idénticas del molde enlazadas en serie. La hebra puede extenderse hasta 100 kb. Este concatémero es una hebra sencilla, pero se apreciará que el concatémero bien puede formar estructuras secundarias a través del emparejamiento de bases entre la hebra, al formar secciones de secuencia duplicada. Dado que el molde preferido (ADN lineal cerrado) incluye secuencias complementarias una al lado de la otra, es probable la formación de pares de bases dentro de la hebra. Estas secuencias complementarias dentro de la misma hebra pueden aparearse entre sí, formando dúplex de secuencia. Sin embargo, el motivo de tallo lazo evita el emparejamiento de la base interna del lazo o la sección central. Es en las condiciones usadas para la amplificación como se definió en la presente descripción que se prefiere que la secuencia del motivo de tallo lazo forme la estructura secundaria que permite al lazo salir fuera de la sección central como ADN de hebra sencilla, lo que evita que esta secuencia se empareje con secuencias complementarias internas. Este concatémero con estructuras detallo lazo permite la replicación adicional del molde, ya que permite que uno o más cebadores se hibriden con el producto inicial de amplificación y permite sintetizar una hebra complementaria de ADN. La hebra sencilla de ADN concatemérico todavía puede formar una nanoflor de ADN, pero retiene secuencias de hebra sencilla dentro de los lazos. Por tanto, estos lazos proporcionan una estructura o sitio adecuado dentro del cual colocar un sitio de unión del cebador, lo que permite que la ADN polimerasa use la hebra sencilla de ADN concatemérico como molde. Es fundamental para el método de la invención que se produzcan concatémeros que se componen de dos hebras complementarias distintas de ADN, ya que este es el producto intermediario final antes de que se produzca el ADN lineal cerrado.

La hebra sencilla concatamérica de ADN con estructuras de tallo lazo constituye un tercer aspecto de la invención. Por tanto, la invención también proporciona una hebra sencilla concatamérica de ADN que comprende dos o más unidades idénticas de secuencia de ADN unidas covalentemente en una serie, cada unidad que comprende al menos una hebra sencilla de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa y al menos una estructura de tallo lazo.

La hebra sencilla concatamérica de ADN como se describió en la presente descripción puede comprender múltiples unidades repetidas, siendo cada unidad la secuencia de un ADN lineal de doble hebra como se definió en la presente descripción. Por tanto, cada unidad puede comprender dos porciones de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa (que puede ser la misma o diferentes secuencias) y al menos un motivo de tallo lazo para formar una estructura detallo lazo. Si están presentes las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa en el molde, estas también estarán presentes en la hebra sencilla concatamérica de ADN en cada unidad, como se establece en el molde. Se prefiere que el concatémero de hebra sencilla incluya un motivo de tallo lazo flanqueado a cada lado por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa. Se debe entender que cada secuencia de reconocimiento de la protelomerasa está presente como una porción ya que el concatémero es de hebra sencilla. En una modalidad, el motivo tallo lazo está flanqueado por porciones de secuencias de reconocimiento de la protelomerasa que son diferentes. Se debe entender que estas secuencias flanqueantes pueden de hecho estar separadas por secuencias espaciadoras de cualquier longitud apropiada.

Se prefiere que la estructura de tallo lazo formada esté dentro del motivo de tallo lazo del ADN lineal cerrado molde, como se definió previamente. Opcionalmente, la estructura de tallo lazo puede formarse mediante el apareamiento de secuencias flanqueantes complementarias para formar una estructura de tallo. La sección central luego forma un lazo entre los extremos del tallo como un ADN de hebra sencilla. Se prefiere que la estructura de tallo lazo incluya un sitio de unión del cebador, opcionalmente en la sección central. La estructura del lazo es crítica, ya que mantiene una porción de la secuencia en formato de hebra sencilla y evita que el sitio de unión del cebador forme pares de bases entre las hebras con su secuencia complementaria dentro de la cadena sencilla de ADN concatemérico. Por tanto, el sitio de unión del cebador dentro del lazo o sección central se mantiene abierto y libre para la unión del cebador.

La estructura de tallo lazo predomina como resultado de la amplificación de un motivo de tallo lazo que contiene un molde de ADN lineal cerrado, ya que se forma antes de que se sintetice su secuencia complementaria inversa. Esto puede mejorarse al seleccionar cuidadosamente la secuencia de los residuos en el tallo para asegurar que haya un fuerte emparejamiento de bases. Los expertos en la técnica conocen técnicas para asegurar la presencia de estructuras secundarias particulares en el ADN he hebra sencilla. El diseño de tales secuencias es como se discutió anteriormente para el propio molde.

La presencia del lazo de hebra sencilla dentro de la hebra sencilla concatamérica de ADN (cuya hebra es producida por la acción de la polimerasa en el molde) permite que uno o más cebadores se hibriden con el sitio de unión del cebador y permite la generación de una hebra de ADN complementaria a la hebra inicial y, por lo tanto, un concatémero de ADN con dos hebras complementarias distintas (ADN concatemérico de doble hebra). Cualquiera de las hebras podría usarse luego como un molde adicional o podría usarse ADN concatemérico de doble hebra como sustrato para una o más enzimas protelomerasas.

Se prefiere que la etapa de amplificación se realice en condiciones que promuevan la formación de una estructura detallo lazo dentro de la hebra sencilla concatamérica de ADN. Estas condiciones pueden ser simplemente las optimizadas para la amplificación, ya que tienden a favorecer el mantenimiento de la estructura de hebra sencilla. Bajo tales condiciones, las estructuras de tallo lazo que se derivan del motivo de tallo lazo, incluidas las regiones flanqueantes complementarias, se forman debido al emparejamiento de bases. Alternativamente, estas condiciones pueden incluir la adición de uno o más agentes que promueven la formación de estructuras de lazo dentro del concatémero de ADN de hebra sencilla. Esto incluye la adición de oligonucleótidos puente. Estos son oligonucleótidos cortos (1 a 100, preferentemente 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, 1 a 60, 1 a 50, 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20 o 1 a 10 residuos de longitud) que son complementarias en secuencia a las regiones flanqueantes dentro de la secuencia del motivo de tallo lazo. Idealmente, el oligonucleótido puente está formado por dos partes, la primera que es complementaria a la primera secuencia flanqueante y la segunda que es complementaria a la segunda secuencia flanqueante. Opcionalmente, no hay espacio entre estas dos partes, pero en una modalidad alternativa, están separadas por 1 a 50 residuos, o alternativamente 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10 o 1 a 5 residuos. Por lo tanto, el oligonucleótido puente puede unir o casi unir las dos secuencias flanqueantes del motivo de tallo lazo, y forzar la sección central hacia fuera en un lazo de hebra sencilla. La complementariedad es como se definió anteriormente.

El oligonucleótido puente puede ser cualquier ácido nucleico adecuado. Se prefiere que el oligonucleótido puente no sea extensible por la ADN polimerasa, por ejemplo, incluye residuos modificados que evitan la extensión. Opcionalmente, el oligonucleótido puente comprende un tipo de ácido nucleico que se hibrida más fuertemente con el a Dn que el propio ADN, por ejemplo, un ácido nucleico bloqueado (LNA) o un ARN.

Los expertos en la técnica son capaces de utilizar la complementariedad entre residuos para diseñar nucleótidos y oligonucleótidos apropiados para usar en la presente invención. Por tanto, será rutinario diseñar varios sitios de unión de cebadores y pares de cebadores, mediante el uso de ellos para diseñar una secuencia para un motivo de tallo lazo o estructura de tallo lazo. Pueden diseñarse apropiadamente oligonucleótidos puente y secuencias flanqueantes adicionales. Los expertos en la técnica conocerán libros de texto de rutina tales como Biology of the Gene, Séptima Edición, Watson y otros, 2014.

Además de la etapa de amplificación, un proceso de la invención para la amplificación de ADN lineal cerrado comprende además una etapa de procesamiento para la producción de ADN lineal cerrado. El ADN amplificado se pone en contacto con al menos una protelomerasa en condiciones que promueven la producción de ADN lineal cerrado. Esta simple etapa de procesamiento basada en la protelomerasa es ventajosa sobre otros métodos usados para la producción de moléculas de ADN lineal cerrado. Las etapas de amplificación y procesamiento pueden llevarse a cabo de forma simultánea o simultáneamente. Sin embargo, preferentemente, las etapas de amplificación y procesamiento se llevan a cabo de forma secuencial y la etapa de procesamiento se lleva a cabo después de la etapa de amplificación (es decir, en ADN amplificado).

Una protelomerasa es cualquier polipéptido capaz de escindir y volver a unir un molde que comprende una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa para producir una molécula de ADN lineal cerrado covalentemente. Por tanto, la protelomerasa tiene funciones de escisión y ligación del ADN. Las enzimas que tienen actividad de tipo protelomerasa también se han descrito como resolvasas de telómeros (por ejemplo, en Borrelia burgdorferi). Un sustrato típico de la protelomerasa es el ADN circular de doble hebra. Si este ADN contiene una secuencia completa de reconocimiento de la protelomerasa, la enzima puede cortar el ADN en esta secuencia y ligar los extremos para crear una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente. Los requisitos para las secuencias de reconocimiento de la protelomerasa se discutieron anteriormente. Como también se indicó anteriormente, la capacidad de un polipéptido dado para catalizar la producción de ADN lineal cerrado a partir de un molde que comprende una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa puede determinarse mediante el uso de cualquier ensayo adecuado descrito en la técnica.

La producción de ADN lineal cerrado puede requerir el uso de al menos una protelomerasa. El proceso de la invención puede comprender el uso de más de una protelomerasa, tal como dos protelomerasas diferentes, una para cada extremo de la molécula de ADN lineal cerrado. Si se usan secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa dentro del molde de ADN, entonces se requerirán más enzimas protelomerasas para el procesamiento, y el experto puede hacer una selección apropiada, en dependencia del resultado requerido. Las variaciones del proceso y varios productos potenciales se muestran en las Figuras 14 y 15. El procesamiento puede tener lugar a partir de dúplex de doble hebra o concatémeros he hebra sencilla plegados en nanoflores.

Los ejemplos de protelomerasas adecuadas incluyen las de bacteriófagos tales como phiHAP-1 de Halomonas aquamarina (SEQ ID NO: 1 y 2), PY54 de Yersinia enterocolytica (SEQ ID NO: 3 y 4), phiK02 de Klebsiella oxytoca (SEQ ID NO: 5 y 6), VP882 de Vibrio sp. (SEQ ID NO: 7 y 8), Vp58.5 de Vibrio parahaemolyticus (SEQ ID NO: 13 y 14) y N15 de Escherichia coli (SEQ ID NO: 9 y 10), o variantes de cualquiera de las mismas. Se prefiere particularmente el uso de la protelomerasa del bacteriófago N15 o una variante de la misma. Esta enzima también se conoce como TelN. Estas enzimas se describen con más detalle en el documento WO2012/017210.

Los procesos de la presente invención pueden realizarse con un molde de ADN lineal cerrado que comprende porciones de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa solo en los extremos cerrados del molde. En este caso, se requerirá una protelomerasa análoga para cada extremo para convertir el ADN concatemérico de doble hebra producido mediante el uso de los métodos de la invención en productos de ADN lineal cerrado. En algunos casos, la misma protelomerasa será suficiente para esta tarea, ya que cada extremo es una porción de la misma secuencia de reconocimiento de la protelomerasa.

En una modalidad alternativa, el proceso de la invención puede realizarse con un molde de ADN lineal cerrado que no solo tiene porciones de secuencias de reconocimiento de la protelomerasa que cubren los extremos del molde (primera y segunda secuencias), sino que también tiene secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa. (tal como la tercera y cuarta secuencias). Como se discutió anteriormente, se prefiere que se incluyan al menos dos secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa en el molde de a Dn . Estos se separan preferentemente en el molde de ADN lineal cerrado de los extremos cubiertos del molde por al menos un motivo de tallo lazo. Por lo tanto, un molde de ADN lineal cerrado ilustrativo puede tener la secuencia (véase también la Figura 12):

CAP1 - TALLO LAZO1 - PTS 3- SECUENCIA - PTS4 - TALLO LAZO2 - CAP2

En donde el CAP1 es una porción de una primera secuencia de la protelomerasa;

Los motivos de tallo lazo primero y segundo son iguales o diferentes;

PTS3 y PTS4 son la tercera y cuarta secuencias de reconocimiento de la protelomerasa que son iguales o diferentes; CAP2 es una porción de una segunda secuencia de la protelomerasa; y

SECUENCIA es la secuencia diana para su inclusión en un producto de ADN lineal cerrado.

Las secuencias 1 y 2 de reconocimiento de la protelomerasa pueden ser iguales o diferentes, pero preferentemente son diferentes de las secuencias 3 y 4 de reconocimiento de la protelomerasa.

Estas secuencias pueden ser adyacentes entre sí, cercanas entre sí o separadas por secuencias intermediarias.

El concatémero de ADN de hebra sencilla que resulta de la amplificación de un molde de ADN lineal cerrado con las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa también puede formar nanoflores de ADN. Esto se muestra en la Figura 15, junto con el método para procesar estas nanoflores.

Por tanto, las nanoflores de ADN producidas por amplificación de un molde con las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa también contendrán estas secuencias. Los presentes inventores han ideado un método que permite la liberación directa de productos de ADN lineal cerrado a partir del concatémero de ADN de hebra sencilla, que preferentemente ha formado pares de bases y dúplex entre las hebras, y plegado en una nanoflor. Este método no se basa en la formación de una hebra complementaria separada de ADN para formar un dúplex de ADN antes del procesamiento y, por lo tanto, no es necesario intentar volver a cebar una hebra sencilla de ADN plegada. Por tanto, si se incluyen las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa en el molde, estas se replican en el concatémero de hebra sencilla plegado y una secuencia dúplex de reconocimiento de la protelomerasa completa está presente como diana para una protelomerasa. En este caso, es posible poner en contacto el ADN amplificado con una protelomerasa análoga para las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa y liberar un ADN lineal cerrado. El subproducto de tal proceso es un ADN lineal cerrado mini con un motivo de tallo lazo contenido en la sección de ADN lineal (véase la Figura 15).

Un método de este tipo para liberar ADN lineal cerrado de las nanoflores de ADN es atractivo, porque permite una "limpieza" de las nanoflores que quedan al final de la reacción, en caso de que se hayan agotado componentes de la reacción tales como cebadores, polimerasa o nucleótidos. También permite la producción de una molécula de ADN lineal cerrado con solo la secuencia diana presente, con la eliminación del motivo de tallo lazo que puede ser indeseable para ciertas indicaciones. Además, las secuencias adicionales de la protelomerasa pueden usarse para procesar concatémeros de doble hebra como se muestra en la Figura 14, al liberar el mismo producto, pero con diferentes subproductos.

Los inventores prevén que el método de la invención puede realizarse de manera que se produzca ADN lineal cerrado a partir de concatémeros de ADN de doble hebra y concatémeros de ADN de hebra sencilla, ambos amplificados a partir de un molde de ADN lineal cerrado y, por lo tanto, una combinación de las figuras 14 y 15 funcionarán en la práctica, en dependencia del molde y la selección de la enzima. Esto permite una selección del producto deseado al variar qué enzima protelomerasa se agrega al ADN amplificado y, por lo tanto, altera qué producto se obtiene. El experto apreciará que se puede hacer una selección simplemente para agregar la o las enzimas protelomerasas para la primera y segunda secuencias de reconocimiento de la protelomerasa que forman las caperuzas del molde, y/o para agregar la o las enzimas protelomerasas para las secuencias de reconocimiento adicionales (por ejemplo, tercera y cuarta) de la protelomerasa que forman parte de la sección dúplex del ADN lineal cerrado.

Por tanto, el ADN amplificado a partir del molde de ADN se incuba preferentemente con al menos una protelomerasa en condiciones que promueven la producción de ADN lineal cerrado. En otras palabras, las condiciones promueven la escisión y religación de un ADN dúplex que comprende una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa para formar un ADN lineal cerrado covalentemente con extremos en horquilla. Las condiciones que promueven la producción de ADN lineal cerrado comprenden el uso de cualquier temperatura que permita la producción de ADN lineal cerrado, comúnmente en el intervalo de 20 a 90 grados centígrados. La temperatura puede estar preferentemente en un intervalo de 25 a 40 grados centígrados, tal como de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 grados centígrados, o aproximadamente 30 grados centígrados. Pueden seleccionarse temperaturas apropiadas para una protelomerasa específica de acuerdo con los principios descritos anteriormente en relación con las condiciones de temperatura para las ADN polimerasas. Una temperatura adecuada para usar con el protelomerasa del bacteriófago TelN de E. coli de SEQ ID NO: 15 es de aproximadamente 25 a aproximadamente 35 grados centígrados, tal como de aproximadamente 30 grados centígrados. Las condiciones que promueven la producción de ADN lineal cerrado también incluyen la presencia de concatémeros de ADN de doble hebra, con ambas porciones de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa que forma un sitio completo sobre el que puede actuar la protelomerasa.

Las condiciones que promueven la producción de ADN lineal cerrado también comprenden la presencia de una protelomerasa y agentes tamponantes/pH adecuados y otros factores que se requieren para el rendimiento o la estabilidad de la enzima. Las condiciones adecuadas incluyen cualquier condición usada para proporcionar la actividad de las enzimas protelomerasas conocidas en la técnica. Por ejemplo, cuando se usa la protelomerasa del bacteriófago TelN de E. coli, un tampón adecuado puede ser Tris HCl 20 mM, pH 7,6; CaCh 5 mM; glutamato de potasio 50 mM; EDTA 0,1 mM; ditiotreitol (DTT) 1 mM. Los agentes y las condiciones para mantener una actividad y estabilidad óptimas también pueden seleccionarse de los enumerados para las ADN polimerasas.

En algunas modalidades, puede ser posible usar las mismas condiciones para la actividad de la protelomerasa que se usan para la amplificación del ADN y/o la formación de la estructura del tallo lazo. En particular, se describe el uso de las mismas condiciones donde la amplificación del ADN y el procesamiento por la protelomerasa se llevan a cabo de forma simultánea o simultáneamente. En otras modalidades, puede ser necesario cambiar las condiciones de reacción donde las condiciones usadas para proporcionar una actividad óptima de la ADN polimerasa conducen a una actividad subóptima de la protelomerasa. La eliminación de agentes específicos y el cambio en las condiciones de reacción pueden lograrse mediante filtración, diálisis y otros métodos conocidos en la técnica. El experto podrá identificar fácilmente las condiciones que permitan una actividad óptima de la ADN polimerasa y/o protelomerasa.

En una modalidad particularmente preferida, para usar en la amplificación de ADN mediante una polimerasa de desplazamiento de hebra, preferentemente phi29, la amplificación de ADN se lleva a cabo en condiciones de tampón sustancialmente idénticas o que consisten esencialmente en Tris-HCl 35 mM, KCl 50 mM, MgCh 14 mM, (N H ^ S 04 10 mM, DTT 4 mM, dNTP 1 mM a una temperatura de 25 a 35 grados centígrados, tal como de aproximadamente 30 grados centígrados. La etapa de procesamiento con la protelomerasa puede llevarse a cabo entonces preferentemente con la TelN, y/o preferentemente en condiciones de tampón sustancialmente idénticas o que consisten esencialmente en Tris HCl 20 mM, pH 7,6; CaCl25 mM; glutamato de potasio 50 mM; EDTA 0,1 mM; ditiotreitol (DTT) 1 mM a una temperatura de 25 a 35 grados centígrados, tal como de aproximadamente 30 grados centígrados.

Tras la producción de ADN lineal cerrado por la acción de la protelomerasa, el proceso de la invención para la amplificación de ADN lineal cerrado puede comprender además una etapa de purificación del producto de ADN lineal cerrado covalentemente. De manera similar, el ADN amplificado de acuerdo con otros procesos de la invención también puede purificarse. La purificación mencionada anteriormente se realizará típicamente para eliminar cualquier producto no deseado. La purificación puede llevarse a cabo mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, el procesamiento de ADN amplificado o ADN lineal cerrado covalentemente puede comprender la purificación de ácido nucleico con fenol/cloroformo o el uso de una columna que se una de forma selectiva a un ácido nucleico, tal como las disponibles comercialmente de Qiagen. El experto puede identificar de forma rutinaria técnicas de purificación adecuadas para usar en el aislamiento del ADN amplificado.

La invención se refiere además a un kit adecuado para realizar el método de cualquier aspecto o modalidad, dicho kit que comprende:

(b) una o más enzimas protelomerasas; y opcionalmente;

(c) un oligonucleótido puente.

El kit puede contener un molde de ADN lineal cerrado como se describió anteriormente, que incluye aquellos con secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa.

El kit puede comprender además uno o más de los siguientes componentes: una ADN polimerasa, un cebador, tampones apropiados, nucleótidos, cationes metálicos, pirofosfatasa y/o nucleasas. La molécula de ADN de doble hebra lineal puede ser cualquier molécula como se describió en la presente descripción.

Secuencias de la invención:

Secuencia de ácido nucleico de la protelomerasa del fago phiHAP-1 de Halomonas (SEQ ID NO: 1)

Secuencia de aminoácidos de la protelomerasa del fago phiHAP-1 de Halomonas (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de ácido nucleico de la protelomerasa del fago PY54 de Yersinia (SEQ ID NO: 3)

Secuencia de aminoácidos de la protelomerasa del fago PY54 de Yersinia (SEQ ID NO: 4)

Secuencia de ácido nucleico de la protelomerasa del fago phiKO2 de Klebsiella (SEQ ID NO: 5)

Secuencia de aminoácidos de la protelomerasa del fago phiKO2 de Klebsiella (SEQ ID NO: 6)

Secuencia de ácido nucleico de la protelomerasa del fago VP882 de Vibrio (SEQ ID NO: 7)

Secuencia de aminoácidos de la protelomerasa del fago VP882 de Vibrio (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de ácido nucleico de la telomerasa del bacteriófago N15 (telN) de Escherichia coli y del represor de inmunidad Secundario (cA) (SEQ ID NO: 9)

Secuencia de aminoácidos de la telomerasa bacteriófago N15 (telN) de Escherichia coli (SEQ ID NO: 10) Secuencia del gen nativo TelA (1329 pb) de la Cepa C58 de la Protelomerasa TelA de Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NO: 11)

Secuencia de la Proteína TelA (SEQ ID NO: 12)

Secuencia de nucleótidos de Gp40 VP58.5 (SEQ ID NO: 13)

Vibrio: aminoácidos de la proteína gp40 [Fago VP58.5 de Vibrio](SEQ ID NO 14)

Secuencia de reconocimiento de la protelomerasa del fago N15 de Escherichia coli (SEQ ID NO 15)

Secuencia de reconocimiento de la protelomerasa del fago phiK02 de Klebsiella (SEQ ID NO 16)

Secuencia de reconocimiento de la protelomerasa del fago PY54 de Yersinia enterolytica (SEQ ID NO 17) Secuencia de reconocimiento de la protelomerasa del fago VP882 de Vibrio sp. (SEQ ID NO 18)

Secuencia de reconocimiento de la protelomerasa de Borrelia burgdorferi (SEQ ID NO 19)

Secuencia de reconocimiento de la protelomerasa de la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NO 20) Secuencia de reconocimiento de g P40 VP58.5: (SEQ ID NO 21)

Secuencia de reconocimiento del núcleo de la protelomerasa de la cepa C58 de Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NO 22):

Secuencias de tallo-lazo: en el formato de longitud de nucleótidos de cada parte: tallo, espaciador, sitio de unión del cebador, espaciador, tallo (es decir, para la SEQ ID 25, el tallo tiene 25 pares de bases de longitud y no hay espaciador para las 15 bases que forman el sitio de unión del cebador):

SEQ ID 23:25-0-15-0-25

SEQ ID NO. 24: 25-5-15-5-25

SEQ ID NO. 25: 25-10-15-0-25

SEQ ID NO. 26:25-0-15-10-25

SEQ ID NO 27: 15-0-15-0-15

SEQ ID NO. 28:15-5-15-5-15

SEQ ID NO. 29:15-10-15-0-15

SEQ ID NO 30: 15-0-15-10-15

SEQ ID NO 31: Tallo lazo de la Figura 10a

SEQ ID NO:32: cebador 4 a 11 de la Figura 10a

SEQ ID NO:33: cebador 3 a 12 de la Figura 10a

SEQ ID NO:34: cebador 2 a 13 de la Figura 10a

SEQ ID NO:35: cebador 1 a 14 de la Figura 10a

SEQ ID NO:36: cebador 0 a 15 de la Figura 10a

SEQ ID NO: 37: Cebador N0-11/short1

La presente invención se describirá con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes:

EJEMPLOS

Materiales y Métodos

Fluorómetro Qubit™ - Usa tintes fluorescentes para detectar ADN de hebra sencilla (SS)/ADN de doble hebra (ds), ARN o proteína en una muestra. Usado en el modo de ensayo de ADNds de amplio intervalo, proporciona una cuantificación precisa del ADNds en una muestra sin interferencia de ADNss tal como de cebadores o dNTP. Polietilenglicol 8000 (PEG8000) - ThermoFisher Scientific, Agua - Sigma Aldrich, dNTP libre de nucleasas, desionizado y esterilizado (grado de biología molecular) (sal de litio) - Bioline, concentración de la solución madre 100 mM, Varios cebadores - Oligofactory, TelN - Enzymatics, ADN 029 - Enzymatics, Xbal - NEB, ApaLI- NEB, exonucleasa T5 - NEB, Exonucleasa III - Enzymatics, Pirofosfatasa - Enzymatics, Proteinasa K- Sigma Aldrich, Composición de tampón TLG 10*: Tris 300 mM (pH 7,9); KCI 300 mM; DTT 20 mM; (N H ^S O 450 mM; MgCh 75 mM - Sigma Aldrich.

Ejemplo 1

Producción de ADN lineal cerrado de tallo lazo a partir de un molde de plásmido.

La Tabla 1 más abajo muestra las condiciones bajo las cuales se amplificó el plásmido proTLx-K B5X4 eGFP 53SL (véase la Figura 11). Las reacciones de RCA se establecieron a temperatura ambiente y los reactivos se agregaron en el orden indicado. Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de polipropileno y se incubaron durante la noche a 30 °C.

Los productos concateméricos crudos de la amplificación del plásmido molde se incubaron con 3|jM de la protelomerasa TelN a 30 °C durante 10 minutos. A continuación, se agregaron 750 U/ml de Xbal (NEB) y el A d N se incubó a 37 °C durante 3 horas antes de la adición de 500 U/ml de exonucleasa III (Enzymatics) y se incubó durante 2 horas más a 37 °C. Luego, la reacción se diluyó 2 veces en tampón NaCl 500 mM/MgCl2100 mM y se agregó polietilenglicol 8000 (PEG8000) al 2,5 % (p/v). Esto se centrifugó a 4500 g durante 10 minutos y se recuperó el sobrenadante. Después de la adición de PEG8000 al 2,5 % (concentración final del 5 %) al sobrenadante y una etapa de centrifugación adicional, se desechó el sobrenadante resultante y se lavó el sedimento con 5 ml de etanol al 100 %. El ADN se volvió a sedimentar mediante centrifugación, se descartó el etanol y el ADN se resuspendió en agua. El tallo lazo que contiene el ADN lineal cerrado (db_eGFP 53SL) se almacenó a -20 °C y se usó para los experimentos que se describen más abajo

Amplificación de ADN lineal cerrado de tallo lazo

Los experimentos indican que para la amplificación de ADN lineal cerrado mediante el uso de un solo cebador que se une a la secuencia diana de la protelomerasa palindrómica TelN, no es posible un aumento del rendimiento con la suplementación con dNTP (véase la Tabla 2). Esto se debe a la formación de ADN concatemérico muy plegado (nanoflores) a medida que la hebra sencilla se desprende del molde de ADN. Esta estructura altamente plegada dificulta el cebado y la incorporación posterior de los dNTP, lo que evita la conversión de nanoflores de ADN en concatémeros de doble hebra.

Con el fin de determinar si el cebado del tallo lazo es beneficioso para la amplificación de ADN lineal cerrado, se realizaron reacciones en un molde de ADNdb con tallos lazos introducidos (db_eGFP 53SL) y cebadores específicos para esta región. La Tabla 3 muestra las condiciones en las que se realizó la amplificación de ADNdb de tallo lazo.

Las reacciones se establecieron a temperatura ambiente y los reactivos se agregaron en el orden indicado seguido de incubación a 30 °C durante la noche. Se probaron 5 cebadores específicos diferentes para el tallo lazo introducido (véase la Figura 10b) para determinar si el cebado (y la posterior amplificación del ADN) en los tallos lazos del concatémero era posible después del cebado del lazo inicial en el molde de ADN lineal cerrado. Las reacciones se complementaron con dNTP 2,5 mM a las 16 horas, 40 horas, 64 horas y las concentraciones de ADN se determinaron a las 15,5 horas, 39,5 horas, 63,5 horas y 87,5 horas mediante el uso de la cuantificación fluorométrica Qubit™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante (los valores para el ADN de doble cadena se tabulan en la Tabla 4). También se tomaron muestras de 8 pl de cada reacción para el análisis en gel el día 3 y se digirieron con 10 pM de la protelomerasa TelN. Para el análisis de gel, las muestras se calentaron a 75 °C durante 2 minutos antes de la separación en un gel de agarosa al 0,8 % mediante el uso de procedimientos estándar.

La Tabla 3 muestra el rendimiento de la reacción de ADNds de ADN lineal cerrado amplificado después de la alimentación de las reacciones con dNTP. Por el contrario, a amplificación de ADN lineal cerrado estándar (Tabla 2), puede verse que, para todos los cebadores probados, el rendimiento del producto de ADN de doble hebra aumenta con las adiciones de dNTP. Esto indica que el producto concatemérico producido por amplificación del molde de ADN lineal cerrado (db_eGFP 53SL) es cebado y se amplifica adicionalmente para producir más producto de ADNds. La Figura 10B muestra que el producto de ADNds se convierte en un ADN lineal cerrado (db_eGFP 53SL) mediante tratamiento con la protelomerasa TelN. Esto muestra que todos los cebadores son específicos y son capaces de producir el producto final de ADN lineal cerrado deseado (con motivo de tallo lazo incluido)

Ejemplo 2

Producción de un ADN lineal cerrado con las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa a partir de un molde de plásmido

La Tabla 4 más abajo muestra las condiciones bajo las cuales se amplificó el plásmido proTLx-K B5X4A4 eGFP 15-0-15 10 (véase la Figura 17). Las reacciones de RCA se establecieron a temperatura ambiente y los reactivos se agregaron en el orden indicado. Las reacciones se llevaron a cabo en tubos de polipropileno y se incubaron durante la noche a 30 °C.

Los productos concateméricos crudos de amplificación del molde del plásmido proTLx-K B5X4A4 eGFP 15-0-15-10-15 se incubaron con 4 pM de la protelomerasa Vp58.5 a 30 °C durante 10 minutos. Luego se agregaron 200 U/ml de ApaLI (NEB) y el ADN se incubó a 37 °C durante 3 horas antes de la adición de 200 U/ml de Exonucleasa III (Enzymatics) y 50 U/ml de exonucleasa T5 (NEB) y se incubó durante unas 3 horas adicionales a 37 °C. Se agregaron 2 pl/ ml de proteinasa K (Sigma) y la reacción se incubó a 37 °C durante la noche. Luego, la reacción se diluyó 2 veces en tampón NaCl 500 mM/MgCl2100 mM y se agregó polietilenglicol 8000 (PEG8000) al 2,5 % (p/v). Esto se centrifugó a 4500 g durante 10 minutos y se recuperó el sobrenadante. Después de la adición del PEG8000 al 2,5 % (concentración final del 5 %) al sobrenadante y una etapa de centrifugación adicional, se desechó el sobrenadante resultante y se lavó el sedimento con 5 ml de etanol al 100 %. El ADN se volvió a sedimentar mediante centrifugación, se descartó el etanol y el ADN se resuspendió en agua. El molde de ADN lineal cerrado se almacenó a -20 °C y se usó para los experimentos que se describen a más abajo

Ejemplo 3

Amplificación de un ADN lineal cerrado que incluye las secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método libre de células para producir moléculas de ácido nucleico desoxirribosa (ADN) lineal cerrado que comprende:

2. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1, en donde la secuencia de dicho motivo de tallo lazo comprende una sección central flanqueada por dos secuencias.

3. Un método como se reivindicó en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la secuencia de la sección central del motivo de tallo lazo comprende un sitio de unión del cebador, opcionalmente con secuencias adyacentes que forman parte de la sección central.

4. Un método como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde dicha secuencia que forma el motivo de tallo lazo es adyacente o cercana a la porción de la secuencia de reconocimiento de la protelomerasa dentro del extremo cerrado covalentemente del molde.

5. Un método como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde la secuencia de dicho motivo de tallo lazo es capaz de formar una estructura de tallo lazo en condiciones que promueven la formación de esta estructura secundaria.

6. Un método como se reivindicó en la reivindicación 5, en donde la secuencia del motivo de tallo lazo incluye las secuencias autocomplementarias dentro de las secuencias flanqueantes que permiten la formación de un tallo lazo.

7. Un método como se reivindicó en la reivindicación 5, en donde la secuencia del motivo de tallo lazo incluye las secuencias dentro de las secuencias flanqueantes que son complementarias a un oligonucleótido puente.

8. Un método como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde cada uno de dichos extremos cerrados covalentemente comprende una porción de una secuencia diferente de reconocimiento de la protelomerasa.

9. Un método como se reivindicó en cualquier reivindicación anterior, en donde dicho molde comprende una o más secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa.

10. Un método como se reivindicó en la reivindicación 9, en donde dicho molde comprende dos secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa, en donde opcionalmente cada secuencia adicional de reconocimiento de la protelomerasa está separada del extremo cerrado del molde por al menos un motivo de tallo lazo.

11. Una molécula de ADN lineal de doble hebra cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una secuencia de reconocimiento la de protelomerasa, en donde la secuencia de dicha molécula de ADN lineal de doble hebra incluye al menos un motivo de tallo lazo, preferentemente en donde dicho motivo de tallo lazo es como se describió en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7.

12. Una molécula de ADN de doble hebra lineal como se reivindicó en la reivindicación 11, en donde dicha molécula comprende una o más secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa.

13. Una molécula de ADN de doble hebra lineal como se reivindicó en la reivindicación 12, en donde dichas secuencias adicionales de reconocimiento de la protelomerasa están separadas de los extremos cerrados por al menos un motivo de tallo lazo.

14. Una hebra sencilla concatamérica de ADN que comprende dos o más unidades idénticas de secuencia de ADN unidas covalentemente en una serie, cada unidad que comprende al menos una hebra sencilla de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa y al menos una estructura de tallo lazo.

15. Una hebra sencilla concatamérica de ADN como se reivindicó en la reivindicación 14, en donde cada unidad de secuencia de ADN comprende la secuencia de una molécula de ADN de doble hebra lineal como se reivindicó en la reivindicación 11, preferentemente en donde dicha hebra sencilla concatamérica de ADN forma una nanoflor con estructuras de tallo lazo.

16. Un kit adecuado para realizar el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, dicho kit que comprende: (a) una molécula de ADN de doble hebra lineal cerrado covalentemente en cada extremo por una porción de una secuencia de reconocimiento de la protelomerasa, en donde la secuencia de dicha molécula de ADN de doble hebra lineal incluye al menos un motivo detallo lazo;

(b) una protelomerasa; y opcionalmente;

(c) un oligonucleótido puente.

17. Un kit como se reivindicó en la reivindicación 16, en donde dicho molde se definió en cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, y dicho kit preferentemente que comprende además una ADN polimerasa y opcionalmente un cebador.