CN114196714A - 利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法及其应用。将引发链单链DNA、TdT反应缓冲液和醋酸镁溶液混合,为混合液1;混合液1中加入天然的脱氧核糖核苷酸、dTPT3TP、dTPT3TP衍生物或者dNaMTP中的一种,为混合液2;混合溶液2中加入TdT,为混合液3;混合液3孵育,热处理,使TdT失活,为混合液4;混合液4中加入上样缓冲液,加热处理,使寡核苷酸链完全变性,通过变性胶,分析TdT将非天然碱基添加到寡核苷酸链3’末端的效果。该方法偶联效率高,成本低,操作方便,副产物少,不产生污染性废物。所述寡核苷酸链在DNA末端标记、六碱基信息存储中具有潜在应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法及其应用。
背景技术
寡核苷酸链的合成是分子生物学的重要基础技术之一,对现代生物学研究至关重要,在基因工程、临床诊断和治疗等领域有十分重要的应用,如聚合酶链式扩增(PCR)、基因组合成、测序、适配体经指数富集的配体系统进化技术(SELEX)核酸适配体文库的构建提供DNA片段等,并有望实现新的“数字生物学”应用,如基于DNA的数据存储和计算。
目前寡核苷酸链的合成主要是用固相亚磷酰胺法,虽然是现行最常用的方法,但是这种方法有很多的缺点,如偶联效率较低、合成序列较短、错误率较高、产生有毒易燃的废弃物等。近年来,基于末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT酶)的酶促合成寡核苷酸链技术受到大量关注。该技术有诸多的优点,例如:合成更长的寡核苷酸链、错误率低、周期短以及生产成本低,因此基于TdT酶法的寡核苷酸链的合成有望替代寡核苷酸链固相合成的技术
为了拓展遗传字母的种类,丰富DNA与RNA的序列和功能多样性,多种非天然碱基对(UBPs)已经被开发出来并加以应用,其中最有代表性的例如dNaM-dTPT3。dNaM、dTPT3主要依赖于疏水相互作用配对,形成类似于基于沃森-克里克配对的天然碱基对的结构。之前的研究表明,该非天然碱基对能被依赖于模板的DNA聚合酶和RNA聚合酶很好地识别,并且能被高效、高保真地扩增。在近期的研究工作中,dNaMTP、dTPT3TP已经被研究者成功整合到大肠杆菌细胞内的DNA中,并且能在细胞内被高效复制、转录和表达,从而实现了在活体细胞中的遗传密码拓展。同时,非天然碱基的体外应用也非常的广泛,比如用于核酸分子的定点标记或者小分子偶联、开发新型的核酸适配体及核酸适配体偶联药物等。关于上述体内体外的所有应用,都需要先合成含非天然碱基的寡核苷酸链,目前含非天然碱基的寡核苷酸链的合成面临着和天然寡核苷酸链合成一样的难题,但是能否用TdT酶酶法合成含非天然碱基的寡核苷酸链还未被研究。因此,非天然寡核苷酸链的合成依然采用传统的固相合成的方法,成本高,合成复杂,所用的有机试剂对环境污染很大等,然而酶法合成则可以解决面临的各种问题,比如降低成本,不完全依赖于昂贵的设备,水相的反应体系更为环保。文献报道的利用酶TdT合成寡核苷酸链做信息存储只包含ATGC四种碱基,合成的是天然的寡核苷酸链(DOI:10.1038/s41467-019-10258-1)。而通过我们的方法制备含有5碱基的寡核苷酸链,也是首次利用酶TdT合成含有dTPT3TP和dNaMTP的寡核苷酸链,可以直接用于标记,也具备更大容量信息存储的潜在应用。
DNA分子由四种脱氧核糖核苷酸(分别含有ATGC四种碱基)连接成具有各种序列的长链。根据需要设计具有任意序列的DNA链并进行人工合成,而这些序列可以被复制、扩增,并最终利用DNA测序技术读取,因此DNA可以用于以四进制的方式存储信息。由于DNA具有信息密度大(信息存储容量大)、结构稳定性好、用于存储数据时能耗低等特点,因而是一种优良的信息存储介质。
在现有DNA数据储存的基础上,为了进一步拓展信息存储的容量,通过合成含非天然的寡核苷酸链将非天然碱基dTPT3和dNaM应用到DNA数据存储技术中,可把四进制的信息存储系统直接拓展到六进制的信息存储系统,极大地扩大“DNA”的存储容量,此技术具有非常大的开发潜力。
发明内容
(1)本发明的目的在于克服固相合成含有非天然碱基寡核苷酸链的缺点与不足,提供一种基于酶TdT催化非天然碱基添加到单链DNA 3’末端,在此基础上酶法合成含非天然碱基的寡核苷酸链的方法。
(2)本发明的目的在于利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链在核酸标记和DNA数据存储中的应用。
本发明的目的通过下述步骤实现:
(1)将引发链单链DNA,10×TdT反应缓冲液,醋酸镁溶液混合均匀,得到混合液1;
(2)向步骤(1)所述混合液1中加入一种天然的脱氧核糖核苷酸、dTPT3TP、dTPT3TP衍生物或者dNaMTP中的任意一种,得到混合液2;
(3)向步骤(2)所述混合溶液2中加入酶TdT,37℃孵育1h得到混合液3;
(4)将步骤(3)所述混合液3进行热处理,使TdT失活,得到含非天然碱基寡核苷酸链的混合液4;
(5)在步骤(4)所述混合液4中加入上样缓冲液,加热处理,使含非天然碱基寡核苷酸链完全变性;通过变性胶,分析TdT将非天然碱基添加到寡核苷酸链3’末端的效果。
进一步地,步骤(1)所述TdT反应缓冲液包含50-150mM氯化钾,20-40mM Tris乙酸,0.04-0.06%(v/v)Triton X-100。
进一步地,步骤(1)所述10×TdT反应缓冲液包含50-150mM氯化钾,20-40mM Tris乙酸,0.04-0.06%(v/v)Triton X-100。
进一步地,步骤(1)所述TdT反应缓冲液的pH为7-8。
进一步地,步骤(1)所述10×TdT反应缓冲液的pH为7-8。
进一步地,步骤(1)所述醋酸镁溶液的终浓度为8-12mM;步骤(1)所述引发链单链DNA的终浓度为400-600nM;步骤(1)所述10×TdT反应缓冲液的终浓度为1×。
进一步地,步骤(2)所述天然的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP中的一种;步骤(2)所述dTPT3TP衍生物为dTPT3PATP、dTPT3BiotinTP。
步骤(2)所述一种天然的脱氧核糖核苷酸、dTPT3TP或者dNaMTP中的任意一种的终浓度为40-60μM;步骤(3)所述TdT的终浓度为0.5-1U/μL。
进一步的,所述dTPT3PATP的终浓度为40-60μM;所述dTPT3BiotinTP终浓度为1-10μM。
进一步地,步骤(3)所述TdT的终浓度为0.5-1U/μL。
进一步地,步骤(4)所述孵育的温度为37℃,孵育的时间为10-60min。
进一步地,步骤(4)所述热处理的温度为75-85℃,时间为10-20min。
进一步地,步骤(5)所述加热处理的温度为92-98℃;步骤(5)所述加热处理的时间为2-10min。
利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链在核酸标记和DNA数据存储中的应用。
基于以上TdT酶聚合一种天然的脱氧核糖核苷酸或者dTPT3TP或者dNaMTP到引发链3’末端的反应,开发了利用TdT酶无模板指导下的新型酶法合成含有非天然碱基的寡核苷酸链的方法。
基于以上TdT酶聚合一种天然的脱氧核糖核苷酸或者dTPT3TP或者dNaMTP到引发链3’末端的反应,开发了利用TdT酶无模板指导下的六碱基信息储存的新技术。
基于以上TdT酶聚合dTPT3TP或者其衍生物到引发链3’末端的反应,开发了利用TdT无模板指导下功能核酸3’末端标记的技术,并且dTPT3TP衍生物不会影响功能核酸的活性与功能。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明提供的方法利用末端转移酶催化非天然碱基添加到单链DNA 3’末端,可以生成含有非天然碱基的寡核苷酸链,该方法简单高效。
(2)用该方法合成含有非天然碱基的寡核苷酸链,不仅偶联效率高,成本低,操作方便,副产物少,不产生污染性废物。
(3)利用该方法制备得到的寡核苷酸链具有巨大的潜在应用价值,如DNA末端标记、六碱基信息存储等。
附图说明
图1分别是非天然碱基dNaM-dTPT3、dTPT3Biotin、dTPT3PAdTPT3FAM的化学结构式图。
图2是酶TdT促合成含有非天然碱基的寡核苷酸链的示意图。
图3为实例1-6中的酶TdT促合成含非天然碱基的DNA的电泳结果图。
图4为实施例7-10利用酶TdT分别在引发链FAM-T36-A3’末端、FAM-T36-T 3’末端、FAM-T36-G 3’末端、FAM-T36-C 3’末端加dTPT3BiotinTP的效果图。
图5为酶TdT不依赖模板将dTPT3PA添加在大肠杆菌aptamerE1 3’末端的电泳图。
图6为E1 aptamer通过dTPT3PA偶联FAM之后在蓝光下的效果图。
图7为E1 aptamer通过dTPT3PA偶联FAM之后电泳图。
图8为通过dTPT3PA偶联FAM的aptamer E1成功荧光标记大肠杆菌的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。需指出的是,以下若有未特别详细说明之过程,均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,视为可以通过市售购买得到的常规产品。
以下实施例所使用的末端转移酶均购自哈尔滨新海基因检测有限公司,dNaMTP、dTPT3TP以及衍生物等非天然碱基购买自无锡药明康德。
图1分别是非天然碱基dNaM-dTPT3、dTPT3Biotin、dTPT3PA、dTPT3FAM的化学结构式图。
图2是酶TdT促合成含有非天然碱基的寡核苷酸链的示意图。
酶TdT催化dATP、dTTP、dGTP、dCTP、dNaMTP或dTPT3TP,添加到FAM标记的单链DNA3’末端。
实施例中使用的单链DNA序列如下表1所示:
表1
实施例1
制备非天然碱基为dATP的寡核苷酸链
(1)将500nM引发链单链FAM-T36-G,1×TdT反应缓冲液,TdT反应缓冲液的pH为7.4,10mM醋酸镁溶液混合均匀,得到混合液1;
(2)向步骤(1)所述混合液1中加入50μM dATP,得到混合液2;
(3)向步骤(2)所述混合溶液2中加入1U/μL酶TdT,得到混合液3;
(4)将步骤(3)所述混合液3在37℃孵育15分钟,然后在75℃下热处理20分钟,使酶TdT失活,得到混合液4;
(5)在步骤(4)所述混合液4中加入2×TBE-Urea上样缓冲液,在95℃下加热处理10分钟,使寡核苷酸链完全变性;通过变性胶,分析酶TdT将非天然碱基添加到寡核苷酸链3’末端的效果。
实施例2
制备非天然碱基为dTTP的寡核苷酸链,步骤同实施例1,其中步骤(2)加入的为dTTP,步骤(3)孵育时间为30分钟。
实施例3
制备非天然碱基为dGTP的寡核苷酸链,步骤同实施例1,其中步骤(2)加入的为dGTP。
实施例4
制备非天然碱基为dCTP的寡核苷酸链,步骤同实施例1,其中步骤(2)加入的为dCTP,步骤(3)孵育时间为30分钟。
实施例5
制备非天然碱基为dTPT3TP的寡核苷酸链,步骤同实施例1,其中步骤(2)加入的为dTPT3TP,步骤(3)孵育时间为60分钟。
实施例6
制备非天然碱基为dNaMTP的寡核苷酸链,步骤同实施例1,其中步骤(2)加入的为dNaMTP,步骤(3)孵育时间为60分钟。
空白对照组
(1)将500nM引发链单链FAM-T36-G,1×TdT反应缓冲液,TdT反应缓冲液的pH为7.4,10mM醋酸镁溶液混合均匀,得到混合液1;
(2)向步骤(1)所述混合溶液1中加入1U/μL酶TdT,得到混合液2;
(3)将步骤(2)所述混合液2在37℃孵育30分钟,然后在75℃下热处理20分钟,使酶TdT失活,得到混合液3;
(4)在步骤(3)所述混合液3中加入2×TBE-Urea上样缓冲液,在95℃下加热处理10分钟,使寡核苷酸链完全变性;通过变性胶,分析TdT将非天然碱基添加到寡核苷酸链3’末端的效果。
图3为实例1-6中的酶TdT促合成含非天然碱基的DNA的电泳结果图。泳道1:引发链FAM-T-36-G;泳道2是加dATP产物;泳道3是加dTTP产物;泳道4是加dGTP产物;泳道5是加dCTP产物,泳道6是加dNaMTP产物;泳道7是加dTPT3TP产物。根据条带的位置,我们可以发现,酶TdT催化加尾dATP和dGTP的碱基数最多,加尾dTTP和dCTP次之,对于dNaMTP、dTPT3TP,TdT都可以很好的识别,所有的单链DNA 3’末端都能添加上非天然碱基。
实施例7-10中使用的单链DNA序列如上表1所示。
实例7
酶TdT在A碱基结尾的单链DNA添加dTPT3BiotinTP
(1)将500nM引发链单链FAM-T36-A/T/G/C,1×TdT反应缓冲液,TdT反应缓冲液的pH为7.4,10mM醋酸镁溶液混合均匀,得到混合液1;
(2)向步骤(1)所述混合液1中加入5μM dTPT3BiotinTP,得到混合液2;
(3)向步骤(2)所述混合溶液2中加入1U/μL TdT酶,得到混合液3;
(4)将步骤(3)所述混合液3在37℃孵育60分钟,然后在75℃下热处理20分钟,使TdT失活,得到混合液4;
(5)在步骤(4)所述混合液4用超薄DNA纯化试剂盒纯化,纯化后的产物分别加入2μL水,或者加入2μL链霉亲和素蛋白(streptavidin),37℃孵育4h。
实施例8
酶TdT在T碱基结尾的单链DNA添加dTPT3BiotinTP
步骤同实施例7,其中步骤(1)加入FAM-T36-T。
实施例9
酶TdT在G碱基结尾的单链DNA添加dTPT3BiotinTP
步骤同实施例7,其中步骤(1)加入FAM-T36-G。
实施例10
酶TdT在C碱基结尾的单链DNA添加dTPT3BiotinTP
步骤同实施例7,其中步骤(1)加入FAM-T36-C。
用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析实施例7-10利用酶TdT在引发链FAM-T36-A3’末端、FAM-T36-T3’末端、FAM-T36-G3’末端、FAM-T36-C 3’末端加dTPT3BiotinTP的效果。如图4所示,不论引发链3’末端是A、T、C、G任何一种,都产生了引发链FAM-T36与链霉亲和素蛋白结合的复合物,说明酶TdT酶在无模板指导下聚合dTPT3BiotinTP到引发链3’末端时,无底物核苷酸种类限制;胶滞后条带至少有3条,说明TdT酶在无模板指导下聚合dTPT3BiotinTP到引发链3’末端时,不止可以聚合一个dTPT3BiotinTP;但是,对于3’末端不同的引发链,催化效率不同。对于3’末端为A和G的引发链,TdT催化dTPT3BiotinTP效率几乎达到100%。
实例11
利用酶TdT和非天然碱基标记功能核酸
实例11中使用的核酸适配体序列如表2所示:
表2
表3
按照表3的反应体系进行实验
(1)将500nM大肠杆菌aptamer E1,1×TdT反应缓冲液,TdT反应缓冲液的pH为......,10mM醋酸镁溶液混合均匀,得到混合液1;
(2)向步骤(1)所述混合液1中加入50μM dTPT3PATP,得到混合液2;
(3)向步骤(2)所述混合溶液2中加入1U/μL TdT酶,得到混合液3;
(4)将步骤(3)所述混合液3在37℃孵育60分钟,然后在75℃下热处理20分钟,使TdT失活,得到混合液4;
(5)在步骤(4)所述混合液4用Zymo ssDNA/RNA Clean&Concentrator Kit纯化反应产物,将纯化得到的3’末端标记dTPT3PA的大肠杆菌适配体E1与0.2M NaOH在室温下温和摇动,孵育4h后暴露出氨基,然后用稀盐酸调至中性。
(6)将步骤(5)产物再用Zymo ssDNA/RNA Clean&Concentrator Kit纯化,纯化产物与0.1mM NHS-FAM混合于1×PBS缓冲液,pH 8.5中温和摇动,反应12h,反应产物再用ZymossDNA/RNA Clean&Concentrator Kit纯化。
(7)在步骤(6)所述反应产物中加入2×TBE-Urea上样缓冲液,在95℃下加热处理10分钟,使寡核苷酸链完全变性;通过变性胶,分析酶TdT将非天然碱基添加到寡核苷酸链3’末端的效果
如图5所示,泳道1:大肠杆菌核酸适配体E1;泳道2:3’末端标记dTPT3PA的大肠杆菌核酸适配体E1,泳道2的条带明显比泳道1高,条带滞后迁移,说明酶TdT在无模板指导下可以将dTPT3PATP聚合到E1的3’末端。
图6是3’末端标记dTPT3PA的大肠杆菌核酸适配体E1的脱保护产物与NHS-FAM偶联纯化产物,在460nm波长附近,可见荧光标记的偶联产物。
如图7所示,泳道1:大肠杆菌核酸适配体E1;泳道2:3’末端标记dTPT3PA的大肠杆菌核酸适配体E1的脱保护产物与NHS-FAM偶联纯化产物;泳道3:染色后的大肠杆菌核酸适配体E1;泳道4:染色后的3’末端标记dTPT3PA的大肠杆菌核酸适配体E1的脱保护产物与NHS-FAM偶联纯化产物。从染色前和经Cyber gold染色后的胶图看,泳道1因没有染色,所以无条带,泳道2中的条带因3’端借助dTPT3PA间接标记了FAM而自发光,泳道3和4因染色后,整条链都发亮,并且其大小与泳道1中的3’末端标记dTPT3PA的大肠杆菌核酸适配体E1的脱保护产物接近,说明FAM基团借助dTPT3PA成功偶联到大肠杆菌核酸适配体E1 3’末端,也进一步证明3’末端标记dTPT3PA的大肠杆菌核酸适配体E1脱保护是成功的。
图8表明借助dTPT3PA3’末端间接标记上荧光基团的大肠杆菌核酸适配体E1仍然具有活性,并且FAM基团不会影响大肠杆菌核酸适配体E1的活性与功能。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacacaggaa acagctatga cgaattcagt gtggag 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacacaggaa acagctatga cgaattcagt gtggaa 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacacaggaa acagctatga cgaattcagt gtggat 36
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacacaggaa acagctatga cgaattcagt gtggac 36
<210> 5
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caatggtacg gtacttccac ttaggtcgag gttagtttgt cttgctggcg catccactga 60
gcgcaaaagt gcacgctact ttgctaa 87
Claims (10)
1.利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,包含以下步骤:
(1)将引发寡核苷酸链,TdT反应缓冲液,醋酸镁溶液混合均匀,得到混合液1;
(2)向步骤(1)所述混合液1中加入一种天然的脱氧核糖核苷酸、dTPT3TP、dTPT3TP衍生物或者dNaMTP中的任意一种,得到混合液2;
(3)向步骤(2)所述混合溶液2中加入酶TdT,孵育得到混合液3;
(4)将步骤(3)所述混合液3进行热处理,使TdT失活,得到含非天然碱基寡核苷酸链的混合液4;
(5)在步骤(4)所述混合液4中加入上样缓冲液,加热处理,使含非天然碱基寡核苷酸链完全变性;通过变性胶,分析TdT将非天然碱基添加到寡核苷酸链3’末端的效果。
2.根据权利要求1所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,步骤(1)所述TdT反应缓冲液包含50-150mM氯化钾,20-40mMTris乙酸,0.04-0.06%(v/v)Triton X-100。
3.根据权利要求1所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,步骤(1)所述TdT反应缓冲液的pH为7-8。
4.根据权利要求1所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,步骤(1)所述醋酸镁溶液的终浓度为10mM;步骤(1)所述引发链单链DNA的终浓度为500nM;步骤(1)所述TdT反应缓冲液的终浓度为1×。
5.根据权利要求1所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,步骤(2)所述一种天然的脱氧核糖核苷酸为dATP、dTTP、dGTP、dCTP中的一种;步骤(2)所述dTPT3TP衍生物为dTPT3PATP、dTPT3BiotinTP中的一种。
6.根据权利要求1所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,步骤(2)所述一种天然的脱氧核糖核苷酸、dTPT3TP或者dNaMTP中的任意一种的终浓度为40-60μM;步骤(3)所述TdT的终浓度为0.5-1U/μL。
7.根据权利要求5所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,所述dTPT3PATP的终浓度为40-60μM;所述dTPT3BiotinTP终浓度为1-10μM。
8.根据权利要求1所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,步骤(3)所述孵育的温度为37℃,孵育的时间为60min。
9.根据权利要求1所述利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链的方法,其特征在于,步骤(4)所述热处理的温度为75-85℃,时间为10-20min;步骤(5)所述加热处理的温度为92-98℃;步骤(5)所述加热处理的时间为2-10min。
10.利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶无模板合成含非天然碱基寡核苷酸链在核酸标记和DNA数据存储中的应用。
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