CN113372402A - 3’-o-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用 - Google Patents

3’-o-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶法核酸合成领域，具体而言，提供了一种3’‑O‑可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用。本发明提供的3’‑O‑封闭的核苷酸，其封闭基团为氰基乙烯基，氰基乙烯基的作用是实现核苷酸的3’‑OH的可逆封闭，氰基乙烯基体积较小，结构相对稳定，易于合成，成本低，同时可与TdT酶催化位点发生氢键相互作用，稳定结合构象，非常有利于TdT酶催化反应，提高酶促核酸合成的反应速率。

Description

3’-O-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的 应用
技术领域
本发明涉及酶法核酸合成领域，具体而言，涉及一种3’-O-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用。
背景技术
目前广泛使用的寡核苷酸合成方法是基于固相亚磷酰胺“脱保护、偶联、盖帽和氧化四步法”的化学合成技术。然而，由于受到合成化学技术的局限，其极限合成长度约为200nt，难以完全满足合成生物学和DNA存储技术等对高通量、高保真、长片段、低成本DNA合成的需求，需要进一步发展新的酶法DNA合成技术。
在DNA酶法合成中，TdT酶(DNA末端转移酶，Terminal deoxynucleotidyltransferase)是一种可在无模板条件下，催化脱氧核糖核酸(dNTP)结合到单链DNA分子3’-OH端的DNA聚合酶。相较于化学法，基于TdT酶的酶法DNA合成潜力巨大：(1)TdT酶催化效率高，其无模板合成DNA单链长度可达8000nt，可使DNA单链合成长度增加数个数量级，打破化学法合成长度的限制；(2)酶法合成过程，反应条件温和，减少了对DNA的损伤，有助于提高DNA合成产物的准确性；(3)反应过程均是在水相中进行，无需使用有毒化合物；(4)合成步骤少，循环速率更快，合成效率更高，可大幅降低合成DNA成本。此外，DNA酶法合成技术完全兼容天然DNA(3’-OH未保护的DNA)，从而实现对天然DNA进行人工修改。DNA酶法合成技术的发展将大幅提升合成生物学在设计和组装基因网络的能力，同时也为DNA数据存储、DNA纳米材料的设计和制造等领域带来重要变革。
然而天然的TdT酶只能在DNA链3’-末端随机添加dNTP，无法精确控制酶促延伸过程，不能满足人工DNA合成需求。因此，酶法DNA合成技术的关键点就是通过构建适当的反应体系，以实现控制TdT酶精确合成DNA链。
基于TdT酶的催化特定，一类重要的控制策略是利用可逆终止基团阻断dNTP 3’-OH成键位点，实现对酶促DNA延伸的控制。具体来说，当DNA延伸所需的3’-OH基团被可逆终止基团阻断时，TdT酶催化DNA链延伸将终止，从而达到精确控制酶促DNA合成的目的；随后，将可逆终止基团脱保护除去，将DNA链3’-OH释放出来，继续下一轮的酶促延伸反应，如此循环进行“停止-重启”，实现TdT酶催化无模板合成目标DNA链。
由于在核苷酸3’-OH上引入保护基将影响底物与酶的结合，降低TdT酶催化延伸速率，因此，选取合适的可逆终止基团用于控制TdT酶促延伸是无模板DNA合成的关键。甲基、2-硝基苄基、烯丙基、叠氮甲基、氨基及叔丁氧基乙氧基等均可作为可逆终止保护基团，但这些保护基存在催化延伸速率低、精确度不足、脱保护效率低、相应dNTP合成过程复杂、成本高等问题，目前，仍不能满足工业化合成DNA的要求，未见大规模应用于基因组的合成。因此，酶法DNA合成技术尚待进一步开发优化，迫切需要研发基于新的可逆终止基团的无模板TdT酶法DNA合成技术。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种3’-O-封闭的核苷酸。
本发明的第二目的在于提供上述3’-O-封闭的核苷酸在酶促核酸合成中的应用。
本发明的第三目的在于提供上述3’-O-封闭的核苷酸的制备方法。
本发明的第四目的在于提供上述3’-O-封闭的核苷酸的脱保护方法。
本发明的第五目的在于提供一种酶促核酸合成的方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种3’-O-封闭的核苷酸，封闭基团为氰基乙烯基。
进一步地，所述核苷酸选自脱氧腺苷酸及衍生物、脱氧鸟苷酸及衍生物、脱氧胞苷酸及衍生物、脱氧胸苷酸及衍生物、腺苷酸及衍生物、鸟苷酸及衍生物、胞苷酸及衍生物和尿苷酸及衍生物中的任一种。
上述3’-O-封闭的核苷酸在酶促核酸合成中的应用；
优选地，所述酶为TdT酶；
优选地，所述酶促核酸合成为可逆终止的无模板酶促核酸合成。
上述3’-O-封闭的核苷酸的制备方法，用3’-O-氰基乙烯基替代核苷酸的3’-OH，得到3’-O-封闭的核苷酸。
进一步地，核苷酸的3’-OH先与甲酸发生酯化反应生成甲酯，再与三苯基亚正膦基乙腈反应生成3’-O-氰基乙烯基，得到3’-O-封闭的核苷酸。
进一步地，以5’-OTBDMS保护核苷为原料，5’-OTBDMS保护核苷的3’-OH先与甲酸发生酯化反应生成甲酯，再与三苯基亚正膦基乙腈反应生成3’-O-氰基乙烯基，得到3’-O-氰基乙烯基后，依次经脱除5’-OTBDMS和磷酸化，得到3’-O-封闭的核苷酸。
上述3’-O-封闭的核苷酸的脱保护方法，采用裂解剂将3’-O-封闭的核苷酸中的封闭基团切割，得到3’-OH核苷酸。
进一步地，所述裂解剂为钯络合物，优选为二乙腈二氯化钯；
优选地，二乙腈二氯化钯浓度为0.04-0.06M，切割条件为55-65℃反应0.5-10min。
一种酶促核酸合成的方法，所述方法的原料包括上述的3’-O-封闭的核苷酸。
进一步地，所述酶促核酸合成为可逆终止的无模板酶促核酸合成；
优选地，所述酶为TdT酶；
优选地，利用上述脱保护方法实现核酸延伸终止的重启。
基于上述方法生成核酸的合成仪器。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种3’-O-封闭的核苷酸，其封闭基团为氰基乙烯基，氰基乙烯基的作用是实现核苷酸的3’-OH的可逆封闭，在酶促核酸合成的过程中，使用该3’-O-封闭的核苷酸，由于其3’-OH被封闭，所以可以实现酶促核酸合成的停止，同时，由于氰基乙烯基又可以被切割，使得3’-O-氰基乙烯基变为3’-OH，酶促核酸合成又可以重启，如此重复“停止-重启”的过程，就可以实现高效精准控制特定序列核酸的合成。
氰基乙烯基体积较小，结构相对稳定，易于合成，成本低。同时，3’-O-氰基乙烯基团(3’-O-Cyanovinyl)作为一种乙烯基醚，可以方便高效地由[Pd]催化裂解，实现正交脱保护。此外，例如针对TdT酶，3’-O-封闭的核苷酸与TdT酶具有独特的结合作用：3’-O-氰基乙烯基上的亲水性氰基体积小，电负性高，非常有利于TdT酶催化反应，提高酶促核酸合成的反应速率，例如，在同样条件下，以3’-O-氰基乙烯基-dTTP(3’-O-Cyanovinyl-dTTP，CTTP)为底物，引物可在1h完成延伸，而对照的3’-O-叠氮甲基-dTTP(3’-O-Azidomethyl-dTTP，ATTP)底物则需4.5h。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施方式中3’-O-封闭的核苷酸脱保护的原理示意图；
图2为本发明实施方式中无模板酶促DNA合成的原理示意图；
图3为本发明实施例1中TdT酶促DNA延伸反应的凝胶电泳检测结果；
图4为本发明实施例2中脱保护反应的凝胶电泳检测结果；
图5为本发明实施例3中3'-O-氰乙烯基-dNTP的合成流程示意图；
图6为本发明3'-O-氰乙烯基-dNTP底物与TdT酶(PDB：4I2J)的分子对接图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明通过利用氰基乙烯基(又称氰乙烯基)对核苷酸的3’-OH实现可逆封闭，即本发明的3’-O-封闭的核苷酸为将核苷酸的3’-OH替换为3’-O-氰基乙烯基。
氰基乙烯基体积较小，结构相对稳定，易于合成，成本低。同时，3’-O-氰基乙烯基团(3’-O-Cyanovinyl)作为一种乙烯基醚，可以方便高效地由[Pd]催化裂解，实现正交脱保护。此外，针对TdT酶，对接分析显示(如图6)，3’-O-封闭的核苷酸与TdT酶具有独特的结合作用：3’-O-氰基乙烯基上的亲水性氰基体积小，电负性高，可以伸入到由TdT酶(PDB：4I2J)上残基Lys338、Arg336、Ser453、Gly452、Arg454等形成的正电荷区域及其溶剂化空腔中，与磷酸基团、水分子及Arg454发生氢键相互作用，稳定3’-O-氰基乙烯基-dNTP构象及其与TdT酶的结合作用，非常有利于TdT酶催化反应，提高酶促核酸合成的反应速率，例如，在同样条件下，以3’-O-氰基乙烯基-dTTP(3’-O-Cyanovinyl-dTTP，CTTP)为底物，引物可在1h完成延伸，而对照的3’-O-叠氮甲基-dTTP(3’-O-Azidomethyl-dTTP，ATTP)底物则需4.5h。
需要说明的是，“3’-O-封闭的核苷酸”是指用于核酸合成的核苷酸，其3’末端的3’-OH被额外的基团保护(封闭基团，又称保护基团)，防止进一步加入核苷酸，实现核酸合成的停止。在本发明中，3’-O-封闭的核苷酸的封闭基团为氰基乙烯基，核苷酸例如可以为脱氧腺苷酸及衍生物、脱氧鸟苷酸及衍生物、脱氧胞苷酸及衍生物、脱氧胸苷酸及衍生物、腺苷酸及衍生物、鸟苷酸及衍生物、胞苷酸及衍生物和尿苷酸及衍生物中的任一种，进一步优选为dATP、dGTP、dCTP、dTTP、ATP、GTP、CTP或TTP。
本发明提供的3’-O-封闭的核苷酸可以作为酶促核酸合成的原料，其封闭基团为氰基乙烯基，氰基乙烯基的作用是实现核苷酸的3’-OH的可逆封闭，在酶促核酸合成的过程中，使用该3’-O-封闭的核苷酸，由于其3’-OH被封闭，所以可以实现酶促核酸合成的停止，同时，由于氰基乙烯基又可以被切割，使得3’-O-氰基乙烯基变为3’-OH，酶促核酸合成又可以重启，如此重复“停止-重启”的过程，就可以实现高效精准控制特定序列核酸的合成。酶促核酸合成的酶优选为TdT酶，进一步优选为可逆终止的无模板酶促核酸合成方法，更进一步优选为无模板DNA合成(Template-independent EnzymaticOligonucleotideSynthesis,TiEOS)。酶促核酸合成是指利用酶合成DNA长度的方法，也可以为酶合成RNA长度的方法，通过引入核苷酸(n+1)实现核酸(n)链的延伸。
本发明提供的3’-O-封闭的核苷酸的制备方法，是用3’-O-氰基乙烯基替代核苷酸的3’-OH，得到3’-O-封闭的核苷酸。具体地，可以为：核苷酸的3’-OH先与甲酸发生酯化反应生成甲酯，再与三苯基亚正膦基乙腈反应生成3’-O-氰基乙烯基，得到3’-O-封闭的核苷酸。为了使得核苷酸仅有3’端羟基参与反应，以5’-OTBDMS保护核苷为原料，5’-OTBDMS保护核苷的3’-OH先与甲酸发生酯化反应生成甲酯，再与三苯基亚正膦基乙腈反应生成3’-O-氰基乙烯基，得到3’-O-氰基乙烯基后，依次经脱除5’-OTBDMS和磷酸化，得到3’-O-封闭的核苷酸。
本发明提供的3’-O-封闭的核苷酸，其3’端的封闭基团氰基乙烯基可以被裂解剂切割，变成3’-OH，即脱保护使其可以加入核苷酸完成核酸的延伸。其中裂解剂优选为钯络合物，进一步优选为二乙腈二氯化钯，二乙腈二氯化钯浓度为0.04-0.06M，切割条件为55-65℃反应0.5-10min。二乙腈二氯化钯浓度可以但不限于为0.04M、0.05M或0.06M；切割条件可以但不限于为55℃、57℃、59℃、61℃、63℃或65℃；切割时间可以但不限于为0.5min、1min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min或10min。本发明提供的脱保护方法，其原理示意图如图1所示。
本发明提供一种酶促核酸合成的方法，该核酸合成的原料包括本发明提供的上述3’-O-封闭的核苷酸。优选酶为TdT酶。
例如，该方法为基于可逆阻断3’-OH成键位点策略的无模板核酸合成方法，原理示意图如图2所示，方法如下：
(1)提供起始序列，(2)加入本发明的3’-O-封闭的核苷酸，在TdT酶存在的情况下，发生起始序列延伸，再除去所有试剂，使用裂解剂将3’-O-封闭的核苷酸的氰基乙烯基切割，然后去除裂解剂。重复步骤(2)，可以实现大于1个核苷酸在起始序列的加入。
本发明最后提供基于上述酶促核酸合成的方法的生成核酸的合成仪器。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中所用的TdT酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
MGHHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMSPSPVPGSQNVPAPAVKKISQYACQRRTTLNNYNQLFTDALDILAENDELRENEGSCLAFMRASSVLKSLPFPITSMKDTEGIPCLGDKVKSIIEGIIEDGESSEAKAVLNDERYKSFKLFTSVFGVGLKTAEKWFRMGFRTLSKIQSDKSLRFTQMQKAGFLYYEDLVSCVNRPEAEAVSMLVKEAVVTFLPDALVTMTGGFRRGKMTGHDVDFLITSPEATEDEEQQLLHKVTDFWKQQGLLLYCDILESTFEKFKQPSRKVDALDHFQKCFLILKLDHGRVHSEKSGQQEGKGWKAIRVDLVMCPYDRRAFALLGWTGSRQFERDLRRYATHERKMMLDNHALYDRTKRVFLEAESEEEIFAHLGLDYIEPWERNA(SEQ ID NO.1)。
对接分析显示，本发明提供的3’-O-封闭的核苷酸(例如3’-O-氰乙烯基-dNTP底物)与TdT酶具有独特的结合作用：3’-O-氰乙烯基上的亲水性氰基体积小，电负性高，可以伸入到由TdT酶(PDB：4I2J)上残基Lys338、Arg336、Ser453、Gly452、Arg454等形成的正电荷区域及其溶剂化空腔中，与磷酸基团、水分子及Arg454发生氢键相互作用，稳定3’-O-氰乙烯基-dNTP构象及其与TdT酶的结合作用，非常有利于TdT酶催化反应，提高基于3’-O-氰乙烯基-dNTP底物的酶促DNA反应速率。
为了说明基于3’-O-氰乙烯基-dNTP底物的无模板TdT酶促DNA延伸及正交脱保护性能，本发明采用3’-O-氰乙烯基-dTTP为底物进行性能检测，并以3'-O-叠氮甲基-dTTP(US10059929B2)、天然dNTP以及空白作为对照。为了快速方便检测OligoDNA的反应情况，本发明通过向反应体系中添加天然dNTP来进行检测，其原理是：TdT酶催化天然dNTP底物添加在DNA链3’-OH末端速率远大于非天然的3’-O-取代-dNTP底物，当在反应体系中加入dNTPmix继续孵育一定时间时，未反应的oligoDNA将发生快速延伸，随机添加核苷酸，生成不同长度的DNA链，而已发生反应的oligo DNA，其3’-OH被可逆终止基团阻断，不能继续添加核苷酸。具体实施方案如下：
实施例1、TdT酶促DNA延伸实验
(一)实验材料
1.OligoDNA序列：5’-GCAGA TAATA CGACT CACTA TAGGG ATTTA GACTA CCCCAAAAAC GAAGG GGACT AAAAC-3’(60nt，SEQ ID NO.2)；
2.TdT(0.12mg/mL)(SEQ ID NO.1)；
3.TdT反应缓冲液：10×TdT reaction buffer,10×CoCl2(2.5mM)(NEB，B0315S),其中1×TdT buffer：20mM Tris-Acetate,50mM KAc,10mM MgAc2,pH 7.9@25℃；
4.底物：3'-O-cyanovinyl-dTTP(CTTP,10mM)，3'-O-Azidomethyl-dTTP(ATTP,10mM)，dNTP mix(dNTP,10mM)；
5.ddH2O；
(二)实验操作
(1)配置四种TdT酶促DNA延伸反应体系：
将oligoDNA(5μL,2.5mM，60nt)、10×TdT reaction buffer(5μL)，2.5mM CoCl2溶液(5μL)，8.3μL TdT(0.12mg/mL)，以及相应核苷酸底物加入到微型离心管(1.5mL)中，用ddH2O将混合液稀释至50μL；
Figure BDA0003114591430000091
Figure BDA0003114591430000101
(2)用ddH2O将混合液稀释至50μL，CTTP体系与ATTP体系的每组做3份，并按后续孵育时间进行分组；
(3)混合液依据不同底物在37℃条件下孵育1h，4.5以及5h等；
(4)将50μL混合液置于3％琼脂凝胶(制胶用2.4克溶质加80mL1×TBE)之上，进行凝胶电泳检测；
(5)对于CTTP体系以及ATTP体系，在进行孵育后，不进行灭活操作，向其中各加入2μL dNTP，并孵育3h后进行凝胶电泳检测，以检测体系中oligoDNA是否已反应完全。
(三)实验结果
TdT酶促DNA延伸反应检测结果如图3所示(Lan 1：CTTP体系，孵育5h；Lan2：ATTP体系，孵育5h；Lan 3：CTTP体系，孵育5h后加入dNTP；Lan 4：ATTP体系，孵育5h后加入dNTP；Lan5：CTTP体系，孵育4.5h后加入dNTP；Lan 6：ATTP体系，孵育4.5h后加入dNTP；Lan7：CTTP体系，孵育1h后加入dNTP；Lan8：ATTP体系，孵育1h后加入dNTP；Lan9：空白体系；Lan 10：dNTP体系，孵育3h；Lan 11：760bp marker)，本发明所提供的3’-O-氰乙烯基-dTTP(CTTP)底物可在1h完成oligo DNA延伸，而对照的3’-O-叠氮甲基-dTTP(ATTP)需4.5h。
实施例2、脱保护实验
(一)实验材料
脱保护试剂：0.5M TCEP(pH＝10)溶液用于ATTP底物，0.05M二乙腈二氯化钯(PdCl2(CH3CN)2)溶液用于CTTP底物；
(二)实验操作
(1)配置四种TdT酶促DNA延伸反应体系：
将oligoDNA(15μL,2.5mM，60nt)、10×TdT reaction buffer(15μL)，2.5mM CoCl2溶液(15μL)，16.6μL TdT(0.12mg/mL)，以及相应核苷酸底物加入到微型离心管(1.5mL)中，用ddH2O将混合液稀释至150μL；
# 底物及体系 体积(μL)
1 CTTP 1.5
2 ATTP 1.5
3 dNTP 12
4 空白 --(不添加)
(2)混合液依据不同底物在37℃条件下孵育1h，4.5以及5h等；
(3)将反应液取出，在ATTP体系中加入2.5μL 0.5M TCEP(pH＝10)溶液，在CTTP体系中加入0.05M PdCl2(CH3CN)2溶液；
(4)加热至60℃，反应5min以达到脱保护；
(5)采用DNA纯化柱(EZ-10，生工生物)对产物进行纯化，收集洗脱液，浓缩；
(6)向浓缩后得到的ATTP体系和CTTP体系分别加入10×TdT reaction buffer(15μL)，CoCl2溶液(2.5mM，15μL)，dNTP(10mM，12μL)以及16.6μL TdT(0.12mg/ml)后在37℃条件下孵育1.5h，用ddH2O将混合液稀释至150μL；
(7)将50μL混合液置于3％琼脂凝胶(制胶用2.4克溶质加80ml 1×TBE)之上，进行检测。
(三)实验结果
脱保护反应检测结果如图4所示(Lan 1：空白体系；Lan 2：空白体系，加入Pd试剂脱保护；Lan 3：ATTP体系，孵育5h后加入TCEP试剂脱保护；Lan 4：CTTP体系，孵育5h后，加入Pd试剂脱保护；Lan 5：ATTP体系，孵育5h后，TCEP试剂脱保护后加入dNTP；Lan 6：CTTP体系，孵育5h后，Pd试剂脱保护后加入dNTP；Lan 7：CTTP体系，孵育1h后，Pd试剂脱保护后加入dNTP；Lan 8：760bp marker)，本发明所提供的3’-O-氰乙烯基-dTTP(CTTP)底物可在60℃，反应5min完成正交脱保护。
实施例3、3'-O-氰乙烯基-dNTP的合成
采用5’-OTBDMS保护核苷为原料，首先通过缩合反应，选择性地在3'-OH与甲酸直接发生酯化反应，生成相应甲酯。利用甲酯的wittig反应活性，与磷叶立德试剂(三苯基亚正膦基)乙腈反应生成3’-O-氰基乙烯基，脱除5’-OTBDMS后获得3'-O-氰乙烯基-dNTP前体，随后三磷酸化，脱保护即可合成所需底物。其具体合成流程图如图5所示((i)HCOOH,EDCI,DMAP,DCM,0℃-室温,6h；(ii)(1)2-(triphenylphosphaneylidene)acetonitrile(Wittigreagents),Toluene,120℃,9h；(2)TBAF·3H2O,THF,室温,1h；(iv)(1)POCl3,1,8-Bis(dimethyl amino)naphthalene,(MeO)3PO,0℃,2h；(2)Tributylammoniumpyrophosphate,Bu3N,CH3CN,0℃,10min；(3)NH4OH,25℃,16h)。
a:B＝T
2a 3’-O-甲酰基-5’-O-叔丁基二甲基硅基-dT
冰浴下，向1a(5g,14mmol)，DMAP(180mg,10％mol)，EDCI(10.7g,56mmol)的30mL二氯甲烷(DCM)溶液中，慢慢滴加甲酸(2g/1.6mL,27.6mmol)，待加完后室温反应6h，TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝30:1]，DCM萃取，无水MgSO4干燥，柱层析[DCM/CH3OH＝0-10％]纯化得到4.7g红色固体产物2a,收率87％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.69(br s,1H),8.06(s,1H),7.54(d,J＝1.2Hz,1H),6.39(dd,J＝9.2,5.2Hz,1H),5.39(d,J＝5.6Hz,1H),4.15(d,J＝1.2Hz,1H),3.93(d,J＝1.6Hz,2H),2.48(dd,J＝14.0,5.2Hz,1H),2.19-2.10(m,1H),1.93(d,J＝1.2Hz,3H),0.93(s,9H),0.14(s,6H)。
3a 3’-O-氰乙烯基-dT
取耐压瓶，加入2a(4g,10.4mmol)，2-氰亚甲基三苯基磷(6.28g,20.8mmol)，用40mL甲苯溶液中，升温至120℃，加热反应9h，TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝30:1]，直接旋干，柱层析[CH3OH/DCM＝0-10％]纯化，得到8g含杂质中间产物。用THF(40mL)将其溶解，加入TBAF·3H2O(6.08g,16mmol)，反应1h，TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝10:1]，EA萃取，无水Na2SO4干燥，柱层析[DCM/CH3OH＝0-10％]纯化得到2.12g产物3a,收率75％。
1H NMR(400MHz,CH3OH-d3)δ7.78(d,J＝1.2Hz,1H),7.46(d,J＝12.8Hz,1H),6.24(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H),5.05(d,J＝12.8Hz,1H),4.16-4.13(m,1H),3.90-3.78(m,2H),2.43-2.38(m,2H),1.88(d,J＝1.2Hz,3H)。
4a 3’-O-氰乙烯基-dTTP
取化合物3a(2.0g,7.16mmol,1.0eq)和1,8-双甲氨基萘(3.07g，14.3mmol，2.0eq)溶于29mL磷酸三甲酯中，氩气置换三次，冰水浴将体系冷却至0℃。将POCl3(1.61g,10.7mmol,1.5eq)溶于2.4mL磷酸三甲酯中并缓慢滴加至反应体系，滴加完毕移保持0℃下反应2小时。新取反应瓶将三丁基焦磷酰胺(7.8g，14.3mmol，2eq)和Bu3N(6.62g，35.8mmol，5eq)溶于50mL ACN中，氩气置换三次用冰水浴降温至0℃。将前面生成的单磷酸缓慢滴加到后面新体系中，保持冰水浴反应10min。用TEAB(24mL，1mol/L)进行淬灭。将反应液经过DEAE(22g，H2O:TEAB＝1:0～4:1)分离洗脱，将包含产品的馏分收集，在30℃下减压浓缩至50mL，prep-HPLC(流动相A为50mM醋酸三乙胺，流动相B为色谱纯乙腈，洗脱程序为0-8min由A增加到20％B,8-12min保持20％B,12-15min B成分增加到40％后保持至出产品)。将制备后的产品浓缩，换盐后冻干得白色固体440mg，yield：10.5％。
1H NMR(400MHz,D2O)δ7.81(d,J＝0.8Hz,1H),7.53(d,J＝13.2Hz,1H),6.41(dd,J＝9.0,5.8Hz,1H),5.16(d,J＝4.8Hz,1H),5.08(d,J＝13.0Hz,1H),4.49(s,1H),4.30-4.24(m,2H),2.56-2.50(m,2H),1.96(s,3H)；31PNMR(162MHz,D2O)δ-5.88(d),-11.37(d),-21.65(t)。
b:B＝ABz
2b 3’-O-甲酰基-5’-O-叔丁基二甲基硅基-N6-苯甲酰基-dA
冰浴下，向1b(5g,10.65mmol)的DCM(35mL)溶液中，加入DMAP(0.124g,1.01mmol)和EDCI(8.16g,42.59mmol)，缓慢滴加甲酸(0.98g/0.803mL,21.29mmol)的DCM(10mL)溶液，待加完后室温反应6h。TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝10:1]。水洗，DCM萃取，无水MgSO4干燥，柱层析CH3OH/DCM＝0-10％]纯化，得到4.85g产物2b，产率：91.5％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.17(br s,1H),8.82(s,1H),8.40(s,1H),8.13(s,1H),8.06(d,J＝7.6Hz,2H),7.64(t,J＝7.2Hz,1H),7.56(t,J＝7.6Hz,2H),6.63(dd,J＝8.2,6.0Hz,1H),5.60(d,J＝5.2Hz,1H),4.29(s,1H),3.96(d,J＝2.2Hz,2H),2.80-2.69(m,2H),0.93(s,9H),0.13(s,6H)。
3b 3’-O-氰乙烯基-N6-苯甲酰基-dA
取耐压瓶，加入2b(5.78g,12.2mmol)，用40mL甲苯溶解，加入三苯基亚正膦基乙腈(7.3g,24.4mmol)油浴加热至120-130℃，反应9h。TLC检测反应完全[DCM/EA＝1mL:0.4mL]。直接旋干，柱层析[CH3OH/DCM＝0-10％]纯化，得到含杂中间体8.27g。将中间体溶于THF(40mL)中，向其中加入TBAF·3H2O(11.5g,36.6mmol)，室温反应1h。TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝10:1]。水洗多次，EA萃取，无水MgSO4干燥，柱层析[CH3OH/DCM＝0-10％]纯化，得到3.16g产物3b，两步总产率：79.8％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.28(br s,1H),8.76(s,1H),8.13(s,1H),8.04(d,J＝7.2Hz,2H),7.65(t,J＝7.4Hz,1H),7.55(t,J＝7.6Hz,2H),7.21(d,J＝13.0Hz,0.75H),6.86(d,J＝6.4Hz,0.25H),6.46-6.34(m,1H),6.06(br s,1H),5.04-5.00(m,1H),4.81(d,J＝13.0Hz,0.75H),4.62(d,J＝6.4Hz,0.25H),4.44-4.39(m,1H),4.05(d,J＝12.8Hz,1H),3.84(d,J＝12.8Hz,1H),3.25-3.18(m,1H),2.61-2.58(m,1H)。
4b 3’-O-氰乙烯基-dATP
取化合物3b(2.2g,5.42mmol,1.0eq)和1,8-双甲氨基萘(2.31g，10.8mmol，2.0eq)溶于22mL磷酸三甲酯中，氩气置换三次，冰水浴将体系冷却至0℃。将POCl3(1.22g,8.13mmol,1.5eq)溶于2.4mL磷酸三甲酯中并缓慢滴加至反应体系，滴加完毕移保持0℃下反应2小时。新取反应瓶将三丁基焦磷酰胺(5.9g，10.8mmol，2eq)和Bu3N(5.01g，27.1mmol，5eq)溶于50mL ACN中，氩气置换三次用冰水浴降温至0℃。将前面生成的单磷酸缓慢滴加到后面新体系中，保持冰水浴反应10min。用TEAB(18mL,1mol/L)进行淬灭。将反应液经过DEAE(22g，H2O:TEAB＝1:0～4:1)分离洗脱，将包含产品的馏分收集并在30℃下减压浓缩至200mL，加入22mL氨水室温下反应16小时。停止反应，将反应体系在30℃下减压浓缩至50mL，prep-HPLC(流动相A为50mM醋酸三乙胺，流动相B为色谱纯乙腈，洗脱程序为0-8min由A增加到20％B,8-12min保持20％B,12-15min B成分增加到40％后保持至出产品)。将制备后的产品浓缩后冻干得淡黄色固体453mg，yield：9.8％，产品经过LC-MS确认，HPLC纯度为98.14％。MS:calcd for C13H17N6O12P3[M-H]-541.0,found 541.2。
c:B＝CBz
2c 3’-O-甲酰基-5’-O-叔丁基二甲基硅基-N4-苯甲酰基-dC
冰浴下，向1c(5.5g,12.3mmol)的DCM(35mL)溶液中，加入DMAP(0.143g,1.17mmol)和EDCI(9.46g,49.4mmol)，缓慢滴加甲酸(1.14g/0.931mL,24.68mmol)的DCM(10mL)溶液，待加完后室温反应6h。TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝10:1]。水洗，DCM萃取，无水MgSO4干燥，柱层析[DCM/MeOH＝0-10％]纯化，得到5.78g产物2c，产率：99％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.72(br s,1H),8.37(d,J＝7.4Hz,1H),8.08(s,1H),7.92(d,J＝7.6Hz,2H),7.66(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(t,J＝7.6Hz,2H),6.41(dd,J＝7.6,5.9Hz,1H),5.43(d,J＝6.0Hz,1H),4.29(d,J＝1.3Hz,1H),4.02-3.92(m,2H),2.84-2.79(m,1H),2.26-2.18(m,1H),0.95(s,9H),0.15(s,6H)。
3c 3’-O-氰乙烯基-N4-苯甲酰基-dC
取耐压瓶，加入2c(5.78g,12.2mmol)，40mL甲苯溶解，加入三苯基亚正膦基乙腈(7.3g,24.4mmol)，油浴加热至120℃反应9h。TLC检测反应完全[DCM/EA＝1mL:0.4mL]。直接旋干，柱层析[DCM/MeOH＝0-10％]纯化，得到含杂中间体12.27g。将中间体溶于THF(40mL)中，向其中加入TBAF·3H2O(11.5g,36.6mmol)，室温反应3h。TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝10:1]。水洗，EA萃取，无水MgSO4干燥，柱层析[MeOH/DCM＝0-10％]纯化，得到产物1.6g，两步总产率：34.3％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.29(s,1H),8.37(d,J＝7.2Hz,1H),8.02(d,J＝7.6Hz,2H),7.65-7.50(m,4H),7.39(d,J＝7.2Hz,1H),6.15(t,J＝7.2Hz,1H),5.36(br s,1H),5.24(d,J＝13.0Hz,1H),4.88(t,J＝2.8Hz,1H),4.19(d,J＝2.4Hz,1H),3.68(d,J＝3.0Hz,2H),2.60-2.31(m,2H)。
4c 3’-O-氰乙烯基-dCTP
取化合物3c(1.9g，4.96mmol,1.0eq)和1,8-双甲氨基萘(2.12g，9.9mmol，2.0eq)溶于19mL磷酸三甲酯中，氩气置换三次，冰水浴将体系冷却至0℃。将POCl3(1.14g,7.4mmol,1.5eq)溶于2.5mL磷酸三甲酯中并缓慢滴加至反应体系，滴加完毕移保持0℃下反应2小时。新取反应瓶将三丁基焦磷酰胺(5.45g，9.9mmol，2eq)和Bu3N(4.59g，24.8mmol，5eq)溶于50mL ACN中，氩气置换三次用冰水浴降温至0℃。将前面生成的单磷酸缓慢滴加到后面新体系中，保持冰水浴反应10min。用TEAB(19mL，1mol/L)进行淬灭。将反应液经过DEAE(22g，H2O:TEAB＝1:0～4:1)分离洗脱，将包含产品的馏分收集并在30℃下减压浓缩至190mL，加入57mL氨水室温下反应16小时。停止反应，将反应体系在30℃下减压浓缩至25mL，prep-HPLC(流动相A为50mM醋酸三乙胺，流动相B为色谱纯乙腈，洗脱程序为0-8min由A增加到20％B,8-12min保持20％B,12-15min B成分增加到40％后保持至出产品)。将制备后的产品浓缩后冻干得淡黄色固体436mg，yield：10.7％，产品经过LC-MS确认，HPLC纯度为97.23％。MS:calcd for C12H17N4O13P3[M-H]-517.2,found 517.2。
d:B＝GiBu
2d 3'-O-甲酰基-5’-O-叔丁基二甲基硅基-N2-异丁基-dG
冰浴下，向1d(5g,11.07mmol)的DCM(35mL)溶液中，加入DMAP(0.129g,1.05mmol)和EDCI(8.49g,44.29mmol)，缓慢滴加甲酸(1.01g/0.835mL,22.14mmol)的DCM(10mL)溶液，待加完后室温反应6h。TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝10:1]。水洗，DCM萃取，无水MgSO4干燥，柱层析[MeOH/DCM＝0-10％]纯化，得到4.91g产物2d，产率：92.7％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.21(s,1H),9.69(s,1H),8.09(s,1H),8.01(s,1H),6.22(dd,J＝8.2,5.8Hz,1H),5.53(d,J＝5.4Hz,1H),4.21(s,1H),3.91-3.83(m,2H),2.83-2.51(m,3H),1.27(t,J＝6.6Hz,6H),0.89(s,9H),0.09(s,6H)。
3d 3'-O-氰乙烯基-N2-异丁基-dG
取耐压瓶，加入2d(4.91g,10.23mmol)，40mL甲苯溶解，加入三苯基亚正膦基乙腈(6.17g,20.5mmol)，油浴加热至120℃，反应9h。TLC检测反应完全[DCM/EA＝1mL:0.4mL]。直接旋干，柱层析[MeOH/DCM＝0-10％]纯化，得到含杂中间体4.6g。将中间体溶于THF(40mL)中，向其中加入TBAF·3H2O(9.68g,30.69mmol)，室温反应1h。TLC检测反应完全[DCM/MeOH＝15:2]。水洗多次，EA萃取，无水MgSO4干燥，柱层析[MeOH/DCM＝0-10％]纯化，得到2.2g产物，两步总产率：55.4％。。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.08(s,1H),11.69(s,1H),8.27(s,1H),7.63(d,J＝13.0Hz,1H),6.21(dd,J＝8.2,5.9Hz,1H),5.25-5.21(m,2H),4.99(d,J＝4.2Hz,1H),4.09(s,1H),3.59(s,2H),2.92-2.72(m,2H),2.61-2.2.51(m,1H),1.13(d,J＝6.8Hz,6H)。
4d 3'-O-氰乙烯基-dGTP
取化合物3d(1.8g，4.6mmol，1.0eq)和1,8-双甲氨基萘(1.98g，9.2mmol，2.0eq)溶于18mL磷酸三甲酯中，氩气置换三次，冰水浴将体系冷却至0℃。将POCl3(1.06g，6.9mmol，1.5eq)溶于2mL磷酸三甲酯中并缓慢滴加至反应体系，滴加完毕移保持0℃下反应2小时。新取反应瓶将三丁基焦磷酰胺(5.08g，9.2mmol，2eq)和Bu3N(4.28g，23.2mmol，5eq)溶于ACN中，氩气置换三次用冰水浴降温至0℃。将前面生成的单磷酸缓慢滴加到后面新体系中，保持冰水浴反应10min。用TEAB(18mL,1mol/L)进行淬灭。将反应液经过DEAE(22g，H2O:TEAB＝1:0～4:1)分离洗脱，将包含产品的馏分收集并在30℃下减压浓缩至180mL，加入54mL氨水室温下反应16小时。停止反应，将反应体系在30℃下减压浓缩至25mL，prep-HPLC(流动相A为50mM醋酸三乙胺，流动相B为色谱纯乙腈，洗脱程序为0-8min由A增加到20％B,8-12min保持20％B,12-15min B成分增加到40％后保持至出产品)。将制备后的产品浓缩后冻干得淡黄色固体311mg，yield：7.8％，产品经过LC-MS确认，HPLC纯度为99.32％。MS:calcd forC13H17N6O13P3[M-H]-557.2,found 557.4。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 3'-O-可逆封闭的核苷酸及其在无模板酶促核酸合成中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 403
<212> PRT
<213> TdT酶
<400> 1
Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His
1 5 10 15
Ile Asp Asp Asp Asp Lys His Met Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser
20 25 30
Gln Asn Val Pro Ala Pro Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys
35 40 45
Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala
50 55 60
Leu Asp Ile Leu Ala Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser
65 70 75 80
Cys Leu Ala Phe Met Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Pro Ile Thr Ser Met Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp
100 105 110
Lys Val Lys Ser Ile Ile Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser
115 120 125
Glu Ala Lys Ala Val Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu
130 135 140
Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe
145 150 155 160
Arg Met Gly Phe Arg Thr Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu
165 170 175
Arg Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu
180 185 190
Val Ser Cys Val Asn Arg Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val
195 200 205
Lys Glu Ala Val Val Thr Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr
210 215 220
Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu
225 230 235 240
Ile Thr Ser Pro Glu Ala Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His
245 250 255
Lys Val Thr Asp Phe Trp Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp
260 265 270
Ile Leu Glu Ser Thr Phe Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val
275 280 285
Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp
290 295 300
His Gly Arg Val His Ser Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly
305 310 315 320
Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg
325 330 335
Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp
340 345 350
Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His
355 360 365
Ala Leu Tyr Asp Arg Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu
370 375 380
Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu
385 390 395 400
Arg Asn Ala
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcagataata cgactcacta tagggattta gactacccca aaaacgaagg ggactaaaac 60

Claims (10)

1.一种3’-O-封闭的核苷酸，其特征在于，封闭基团为氰基乙烯基。
2.根据权利要求1所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸选自脱氧腺苷酸及衍生物、脱氧鸟苷酸及衍生物、脱氧胞苷酸及衍生物、脱氧胸苷酸及衍生物、腺苷酸及衍生物、鸟苷酸及衍生物、胞苷酸及衍生物和尿苷酸及衍生物中的任一种。
3.权利要求1或2所述3’-O-封闭的核苷酸在酶促核酸合成中的应用；
优选地，所述酶为TdT酶；
优选地，所述酶促核酸合成为可逆终止的无模板酶促核酸合成。
4.权利要求1或2所述3’-O-封闭的核苷酸的制备方法，其特征在于，用3’-O-氰基乙烯基替代核苷酸的3’-OH，得到3’-O-封闭的核苷酸。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，核苷酸的3’-OH先与甲酸发生酯化反应生成甲酯，再与三苯基亚正膦基乙腈反应生成3’-O-氰基乙烯基，得到3’-O-封闭的核苷酸；
优选地，以5’-OTBDMS保护核苷为原料，5’-OTBDMS保护核苷的3’-OH先与甲酸发生酯化反应生成甲酯，再与三苯基亚正膦基乙腈反应生成3’-O-氰基乙烯基，得到3’-O-氰基乙烯基后，依次经脱除5’-OTBDMS和磷酸化，得到3’-O-封闭的核苷酸。
6.权利要求1或2所述3’-O-封闭的核苷酸的脱保护方法，其特征在于，采用裂解剂将3’-O-封闭的核苷酸中的封闭基团切割，得到3’-OH核苷酸。
7.根据权利要求6所述的脱保护方法，其特征在于，所述裂解剂为钯络合物，优选为二乙腈二氯化钯；
优选地，二乙腈二氯化钯浓度为0.04-0.06M，切割条件为55-65℃反应0.5-10min。
8.一种酶促核酸合成的方法，其特征在于，所述方法的原料包括权利要求1或2所述的3’-O-封闭的核苷酸。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶促核酸合成为可逆终止的无模板酶促核酸合成；
优选地，所述酶为TdT酶；
优选地，利用权利要求6或7所述的脱保护方法实现核酸延伸终止的重启。
10.基于权利要求8或9所述方法生成核酸的合成仪器。
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