CN115537419A - 一种尿苷二磷酸的核酸适体及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种尿苷二磷酸的核酸适体及其筛选方法和应用，核酸适体的序列如SEQ ID NO:1所示；筛选方法为CIVT‑SELEX，即先采用Capture‑SELEX方法进行初筛，得到可以与目标配体结合的单链核酸，然后利用体外转录过程再次进行筛选，从而获得与目标配体结合后发生显著构象变化的核酸适体。本发明成功得到了既能以单链线性的形式检测酶促反应液中的尿苷二磷酸，又可以在体外转录过程中响应不同浓度尿苷二磷酸，而对下游基因转录做出激活调控的核酸适体序列；CIVT‑SELEX有希望应用于其他靶标配体的适体序列筛选，可用于检测和作为基因元件应用于基因回路中进行调控。

Description

一种尿苷二磷酸的核酸适体及其筛选方法和应用

技术领域

本发明具体涉及一种尿苷二磷酸的核酸适体及其筛选方法和应用，属分子生物学技术领域。

背景技术

核酸适体是一类对小分子或大分子等配体具有高亲和力的单链寡核苷酸，由于其制备简单、成本低、体积小、通用性好等优点，在检测、治疗等方面具有广阔的应用前景。核酸适体不仅可以作为目标检测对象，还可用于调节基因表达，类似转录因子来响应各种小分子和蛋白质。因此，适体已被广泛用于调节转录或翻译。作为基因调控元件，核酸适体提供了几个实际优势：1)SELEX筛选核酸文库为任何感兴趣的配体选择适体；2)可以预测和合理设计核酸结构域；3)工程化核酸结构域的易用性和可预测性使适体能够作为靶标结合底物用于可调谐传感和驱动。

核酸适体可以通过称为SELEX(通过指数富集的配体系统进化)的迭代体外选择过程获得。与大分子核酸适体相比，由于核酸适体和靶标之间的尺寸差异很大并且靶标上的结合位点很少，小分子核酸适体的选择更为困难。虽然使用传统的SELEX方法可以选择与配体具有高亲和力的核酸适体，但在配体结合时获得具有构象变化的核酸适体并非易事。目前，大多数基于核酸适体的检测方法都基于结构切换的核酸适体，其在靶标存在下会发生较大的构象变化。此外，核酸适体已被广泛用于调节靶基因的转录或翻译，通常是通过结合适体配体相互作用和随后的构象变化而实现。因此，通过将核酸适体插入基因回路中，核酸适体的结构切换能力可用于合成生物开关的构建，从而极大地扩展了遗传调节元件的库。因此，开发一种可以专门选择在与目标配体结合时具有构象变化的核酸适体的方法既有用又具有挑战性。

科学家们已开发了多种新的筛选方法，如CE-SELEX(毛细管电泳 -SELEX)、GO-SELEX(氧化石墨烯-SELEX)、Capture-SELEX等。

CN201410390057.7公开了一种联合毛细管电泳技术与SELEX技术筛选特异性结合甲胎蛋白的核酸适体的方法。

CN201710055516.X公开了一种联合毛细管电泳技术与SELEX技术筛选特异性GPC3的核酸适体的方法。

CN202010401091.5公开了一种非固定GO-SELEX技术筛选磺胺二甲嘧啶的核酸适体的方法。

CN201610646875.8公开了一种采用GO-SELEX技术筛选人胰多肽的核酸适体的方法。

CN201710168491.4公开了一种利用Capture-SELEX技术定向筛选能识别多种不同革兰氏阴性菌来源的脂多糖广谱性核酸适体的方法。

CN202010875370.5公开了一种体外筛选PD-L1的DNA核酸适体的方法及其应用，三个技术模块，每个技术模块采用一种SELEX技术。

SELEX技术应用较广，但由于小分子靶标和寡核苷酸之间的巨大尺寸差异，发现高亲和力、用于小分子的选择性DNA适体仍然具有挑战性。以上筛选方法获得的大多数小分子核酸适体在靶标结合时的构象变化并不显著；小分子倾向于简单地结合到核酸适体的茎环区域，而不影响它们的构象。

糖基转移酶(GTs)所催化的糖基化反应是糖苷类化合物修饰的关键步骤，对于植物糖苷类天然产物生物合成具有重要意义。但目前只有少数糖基转移酶已被研究并注释功能，其主要原因在于采用微生物细胞对糖基转移酶进行异源表达和纯化的步骤繁琐且耗时，同时鉴定酶催化活性通常需要昂贵的仪器和复杂的操作。在糖基化反应中，尿苷二磷酸葡萄糖糖基转移酶(UGTs) 将糖供体尿苷二磷酸葡萄糖上的葡萄糖转移至催化底物上而产生尿苷二磷酸 (UDP)。

有学者利用固定化酶制备UDP-葡萄糖，再双酶偶联合成UDP-葡萄糖醛酸，最后进行槲皮素的糖基化修饰。利用生物酶法制备UDP-葡萄糖和UDP- 葡萄糖醛酸。

CN201810162561.X利用啤酒酵母混合发酵的方法制备尿苷二磷酸。

尿苷二磷酸糖基转移酶(UGT)催化的底物种类繁多，产物活性差异较大，其催化的糖基化反应在植物和人体生长发育及代谢调节过程中具有十分重要的作用。于安东等学者由UGT参与植物的次生代谢、激素调控、逆境响应与脱毒反应四个方面重点总结了UGT的功能作用，同时对UGT在调控作物农艺性状中的作用和应用前景做出了肯定。

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGTs)是机体重要的Ⅱ相代谢酶,在肝脏中高表达,在物质代谢和清除中发挥重要作用。薛庆凯等学者总结了肝脏疾病状态下机体对于UGTs的转录调控在疾病的发生发展中具有重要作用，在肝脏疾病中的表达和转录调控对于疾病诊断和治疗有着重要的意义。

筛选尿苷二磷酸糖基转移酶或其基因亚型并不容易，有通过核酸检测的方法，也有通过尿苷二磷酸检测的方法。

CN201210347972.9公开了一种试剂盒，通过体外核酸检测来定性检测尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1基因分型。

宋发军等学者利用生物信息学工具及qRT-PCR技术对七叶一枝花的转录组数据库中尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)的基因结构、系统进化、基因表达特征及其蛋白质理化性质和蛋白质结构等进行了分析。

有学者利用高效液相色谱法分析尿苷二磷酸的含量，CN201410120185.X 公开一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测，利用了尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(UXS6)基因与表达载体pEGX-4T-2的重组质粒，导入到细菌中进行原核表达。

周楠等学者深入研究尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶调控网络以及其介导的相关中药-药物相互作用，对于临床更安全、有效的使用中药提供了指导。

上述方法在筛选尿苷二磷酸的核酸适体和检测尿苷二磷酸水平上，具有应用死板、成本高、效率低等问题。现有方法Capture-SELEX可以提供可与尿苷二磷酸结合的适体，但可能存在假阳性结合适体。因此，急需一种易于合成、特异性强、结合后能够发生显著构象变化的尿苷二磷酸的DNA核酸适体，及获得该核酸适体的低假阳性、低成本的高效筛选方法。

本发明公开了一种名为CIVT-SELEX的新方法，该方法将Capture-SELEX 和体外转录筛选相结合，以寻找不仅可以与配体结合，而且在结合时表现出显著构象变化的DNA适体。随着体外转录筛选的加入，只有能与配体结合、发生显著构象变化、影响下游基因转录的适体才会被筛选出来。从而进一步筛选出能真正响应UDP的双功能适体(适体处于单、双链情况下都能响应)。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种可以在体外转录系统的基因回路中响应尿苷二磷酸的核酸适体及其筛选方法和应用，以体外转录系统为媒介，筛选得到在单链情况下可检测酶促反应液中尿苷二磷酸的存在以及在基因回路中能够响应体系中尿苷二磷酸的存在、发生显著构象变化、对转录过程做出调控的适体序列，是能真正响应尿苷二磷酸的双功能适体(适体处于单、双链情况下都能响应)。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明的目的之一在于提供一种尿苷二磷酸的核酸适体，所述核酸适体的序列如SEQ ID NO:1所示：

SEQ ID NO:1：

AGGGCTATGAGCCCTGCGCCGACGTCAGGCGCACCGAGAC

本发明提供的核酸适体还包括SEQ ID NO:1所示序列的突变体或截短序列或延长序列。

进一步地，上述核酸适体的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素或地高辛任一化学修饰。

本发明的目的之二在于提供一种尿苷二磷酸核酸适体的筛选方法 CIVT-SELEX，基于核酸适体的Capture-SELEX筛选方式和体外转录过程筛选相结合。

进一步地，所述筛选方法，包括如下步骤：

S1：筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：

5’-GCAACTCCTAGATGGTCTCAAACG-N40-GGACTAGATTCTA-N10-AAAAATGTGAGACCAAAGGAGAATAA-3’

S2：将ssDNA文库与3’端带有生物素标记的单链DNA Capture-Oligo互补配对形成部分双链DNA；

S3：将经过S2所得的部分双链DNA与链霉亲和素磁珠进行过夜孵育，使得ssDNA文库以DNA Capture-Oligo为媒介固定在链霉亲和素磁珠上，洗去未能固定的ssDNA序列，获得磁珠-CO-ssDNA Library复合物；

S4：将经过S3所得的磁珠-CO-ssDNA Library复合物与靶标配体尿苷二磷酸进行孵育，竞争结合与其有特异亲和力的ssDNA适体序列，获得孵育混合物；

S5：磁性分离经S4后的孵育混合物，收集洗脱得到与人尿苷二磷酸特异性结合的ssDNA适体序列，即ssDNA富集文库，并且在后续筛选过程中不断减少靶标配体浓度，增加筛选压力；

S6：将经过S5所得到的ssDNA富集文库进行PCR扩增，其中PCR扩增用引物为：

引物P1：5’-GCAACTCCTAGATGGTCTCA-3’；

引物P2：5’-AGTGAAAAGTTATTCTCCTTTGGTCTC-3’；

S7：将经过S6扩增得到的富集后的带有磷酸化标记的dsDNA文库，利用LambdaExonuclease在37℃水浴酶切30min得到ssDNA文库，经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssDNA文库；

S8：循环筛选：将经过S7所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复S2～S7的筛选过程，完成正向筛选，获得正向筛选完成后的ssDNA文库；

S9：正向筛选完成后的ssDNA文库，进行体外转录过程筛选。

进一步地，S9的体外转录过程筛选的步骤如下：

S9.1：将正向筛选完成后的ssDNA文库经PCR扩增为dsDNA文库，利用Golden GateAssembly方法将带有启动子、输出信号和终止子的载体与 dsDNA文库进行连接，获得连接产物；

S9.2：将经过S9.1中插入有dsDNA文库的连接产物进行转化、涂布、挑菌、ColonyPCR以及凝胶电泳验证，选择插入正确的条带，PCR产物回收其所对应的Colony PCR后线性DNA产物并进行编号；

S9.3：将所有回收得到的包含有启动子、适体序列、输出信号以及终止子的线性DNA，在含有或不含有靶标尿苷二磷酸的体外转录系统中进行转录过程，观察其输出信号的变化，从而选择可以对靶标配体做出响应，影响下游基因转录的适体序列。

本发明的目的之三在于将尿苷二磷酸的核酸适体应用于识别、分析和检测尿苷二磷酸，或应用于基因回路中以响应尿苷二磷酸调控下游基因的转录水平。

相较于现有技术，本发明的有益效果：

1、本发明提供的核酸适体无毒性，分子量小，易于合成与标记；

2、本发明提供的核酸适体特异性强，能够与配体结合、发生显著构象变化、并影响下游基因转录，是真正响应UDP的双功能适体(适体处于单、双链情况下都能响应)，可应用于识别、分析和检测尿苷二磷酸，或应用于基因回路中以响应尿苷二磷酸调控下游基因的转录水平；

3、本发明提供的核酸适体的合成成本低，且周期短，重现性较好，无假阳性；

4、本发明提供的核酸适体作为生物探测器可用于植物中糖基转移酶的快速筛选，同时也可用于筛选其他无需翻译后修饰的酶，所建立的酶筛选方法相比于传统的蛋白异源表达技术，其跳过了传统方法耗时耗力的繁琐步骤，大大缩短了实验周期，可在24h内迅速实现新酶的筛选鉴定，该方法学也可以应用于其他酶和生物，成为高效快速筛选新型酶的强大工具；

5、本发明公开了一种名为CIVT-SELEX的新方法，结合了 Capture-SELEX筛选方式和体外转录过程筛选，所得到的尿苷二磷酸核酸适体既保证了与靶标配体的特异且构象变化的结合，又适用于基因回路中转录水平的调控，为筛选其他用于基因回路调控的目标适体和配体组合提供了一种新的方法和思路。

6、Capture-SELEX所筛选出的可与配体结合的适体，可能存在假阳性结合适体，适合用于单链情况下的检测，但不适用于体内检测和回路调控；而本发明公开的CIVT-SELEX的筛选方法在Capture-SELEX的基础上结合体外转录筛选，既可以用于体外小分子检测，也可以用于基因回路调控。在核酸适体作为基因元件等领域方面具有广阔的应用前景和重要的科学、社会、经济价值。

附图说明

图1为本发明的核酸适体Aptamer 3-83空间结构的生物信息学模拟图；

图2为本发明的核酸适体Aptamer 3-83筛选流程示意图；

图3为本发明的核酸适体Aptamer 3-83作为基因元件插入pT7启动子下游，3WJdB作为报告基因时，所得到的线性DNA响应体外系统中不同浓度尿苷二磷酸的实时荧光变化；

图4本发明的核酸适体Aptamer 3-83作为基因元件插入pT7启动子下游， 3WJdB作为报告基因时，所得到的线性DNA响应体外系统中加入不同尿苷二磷酸前后的荧光峰值变化；

图5为本发明的核酸适体Aptamer 3-83 N40序列的圆二色谱CD图谱；

图6为本发明中核酸适体Aptamer 3-83结合尿苷二磷酸的亲和力等温滴定量热仪分析示意图；

图7为本发明的核酸适体Aptamer 3-83作为检测酶促反应液中尿苷二磷酸的生物探测器的检测结果：5组检测反应的荧光扫描结果；

图8为本发明的核酸适体Aptamer 3-83作为检测酶促反应液中尿苷二磷酸的生物探测器的检测结果：实验组和阴性组四组在525nm处的荧光差异， F0：阴性组荧光值，F1：实验组荧光值。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了更好地理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，并不会对本发明构成任何限定。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

如图2所示，一种尿苷二磷酸的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤：

S1：筛选文库的准备：设计中间固定区域为13个核苷酸，固定部分两端随机区域分别为40和10个核苷酸以及5’和3’端固定引物部分的随机ssDNA 文库(5’-GCAACTCCTAGATGGTCTCAAACG-N40-GGACTAGATTCTA-N10 -AAAAATGTGAGACCAAAGGAGAATAA-3’，其中N40是随机的40个碱基， N10是随机的10个碱基，合成的文库中N40和N10有上千万种以上的不同的碱基序列组合)，并委托生工生物工程股份有限公司合成，同时合成带有生物素标记的；

S2：进行正向筛选：测定合成的初始ssDNA文库和3’端带有生物素标记的单链DNACapture Oligo(CO)浓度，每轮筛选使用200μL链霉亲和素磁珠(1mg磁珠可以结合>400pmol生物素标记Capture Oligo DNA)大约可以结合320pmol CO，将ssDNA文库与CO按等摩尔比在洗涤缓冲液(Washing Buffer：5mM Tris-HCl，1M NaCl，0.5mM EDTA)体系中进行退火；退火程序：变性95℃，10min，每秒-0.1℃，×350次，直到60℃，5min，4℃放置；

S3：取200μL磁珠在磁力架上吸附去除上清，用200μL Washing Buffer 重复清洗三次磁珠，将退火后的ssDNA Library-CO复合物与磁珠在旋转仪上 35rpm/min进行过夜旋转孵育，使得ssDNA Library-CO复合物与磁珠通过生物素标记结合；

S4：将经过S3孵育过夜的混合物在磁力架上吸附收集上清，用200μL WashingBuffer重复清洗4次磁珠混合物，每次收集上清并编号；

S5：将100μL含4mM尿苷二磷酸目标配体的Binding Buffer(10mM Tris-HCl，100mMNaCl，1mM MgCl₂)加入清洗后的ssDNA Library-CO-磁珠复合物中，混匀置于旋转仪上35r/min，25℃孵育60min，靶标配体竞争性结合与其具有亲和力的适体序列，使其从CO-磁珠上脱落后置于磁力架上吸附，收集上清，再用上述等体积Binding Buffer含有同样浓度的配体进行洗脱保留上清，重复2次，分别编号洗脱1/2/3(在正向筛选过程中不断减小体系中靶标配体浓度至1mM，增大筛选压力)；

S6：用100μL SSC Buffer(20mM Tris–HCl，2mM MgCl2，5mM KCl， 1mM CaCl2，100mM NaCl)洗涤磁珠，95℃孵育10min，高温下解开CO 与未和靶标配体结合的ssDNALibrary之间的碱基互补配对，重复3次，每次收集上清编号HOT1/2/3；

S7：RT-qPCR绝对定量计算洗脱率监测筛选进程，将本轮筛选所用ssDNA Library稀释到2ng/μL后作为制定标准曲线的扩增模板，进行梯度稀释 10-1～10-7，同时将上述编号洗脱1/2/3、HOT1/2/3和最终磁珠稀释到合适浓度同时进行RT-qPCR扩增；根据制定的标准曲线计算R²值以及扩增效率，计算洗脱1/2/3、HOT1/2/3和最终磁珠的拷贝数，后带入公式：{(洗脱1+洗脱2+ 洗脱3)拷贝数/(HOT1+HOT2+HOT3+最终磁珠)拷贝数}×100％计算洗脱率； 20μL扩增体系：10μL2×SYBR qPCR SuperMix，引物P1和P2各2μL，DNA 模板1μL，用DEPC水补足至20μL；扩增程序：95℃预变性1min，95℃变性 20s，58℃退火30s，读取数据，72℃延伸30s，运行39个循环；熔解曲线程序：95℃10s，65℃→95℃0.5℃/0.5s，读取数据；

其中，RT-qPCR扩增引物为：

引物P1：5’-GCAACTCCTAGATGGTCTCA-3’；

引物P2：5’-TTATTCTCCTTTGGTCTCACA-3’；

S8：将每一轮筛选过程中靶标竞争结合得到的洗脱1/2/3全部混合均匀到 1.5mL离心管中，加入混合后液体体积1/10的3M醋酸钠溶液(pH＝5.2)，再加入混合液体体积2.5倍的无水乙醇，全部混合均匀，置于-20℃冰箱60 min，后在冷冻离心机12000rpm，4℃冷冻离心30min沉淀DNA，小心取出将上清液体用移液枪全部吸出，待乙醇挥发完全在离心管中加入19μL DEPC 水，进行振荡将沉淀得到的DNA完全溶解在水中，利用高保真ExTaq酶进行扩增；

其中，扩增引物为：

引物P1：5’-GCAACTCCTAGATGGTCTCA-3’；

引物P2-5’P：5’-TTATTCTCCTTTGGTCTCACA-3’；

50μL扩增体系为：19μL DEPC水+ssDNA模板，1μL dNTP Mixture， 25μL 2×BufferMix，引物P1和引物P2-5’P各2μL，1μL High-Fidelity DNA polymerase；扩增程序为：95℃预变性30s，95℃变性15s，58℃退火15s， 72℃延伸10s，运行8～10个循环，72℃终延伸5min(注意由于ssDNA文库的序列多样性，为了减少非特异性扩增，扩增循环数要保持在8～10个循环)；

S9：将扩增产物按上述方法再次沉淀得到5’带有磷酸化标记的dsDNA文库，用适量水溶解后测定浓度利用Lambda Exonuclease在37℃水浴对dsDNA 酶切30min后再次乙醇沉淀得到的ssDNA文库即用于下一轮筛选的文库；

其中，50μL酶切体系包括：5μg dsDNA，5μL 10×Exonuclease Reaction Buffer，1μL Lambda Exonuclease，用DEPC水补足至50μL；

S10：在体外转录系统的基因回路转录过程中进行筛选；首先将初筛6轮后的ssDNA文库扩增为带有正确的酶切位点和识别位点的dsDNA，随后将文库序列通过Golden GateAssembly方法插入含有骨架、启动子pT7、3WJdB 以及终止子的载体片段中，构建成完整环状连接产物，将连接产物分为23组转化克隆菌E.coli DH5α感受态细胞。

S11：共在23个转化成功的平板上挑取1023个单菌落进行Colony PCR，琼脂糖凝胶电泳显示连接成功并且可以扩增出完整的带有启动子pT7、dsDNA 适体序列、输出信号3WJdB和终止子的转录用线性DNA共有932个，回收得到转录用线性DNA，并保存分别对应各自的单菌落。

S12：制备体外转录系统，在有无靶标配体存在的体外转录体系中，将932 个插入有适体序列的转录用线性DNA在转录过程中进行筛选，观察其在加入尿苷二磷酸前后的输出信号3WJdB的荧光变化差异，从中筛选出输出信号变化显著的核酸适体。

实施例2

经过实施例1的筛选方法得到加入尿苷二磷酸前输出信号变化最为显著的核酸适体(命名为Aptamer 3-83)对应的转录用线性DNA，委托福州尚亚生物技术有限公司进行测序获得核酸适体Aptamer 3-83序列，如SEQ ID NO:1 所示：

SEQ ID NO:1：

AGGGCTATGAGCCCTGCGCCGACGTCAGGCGCACCGAGAC

利用DNAFold网络平台分析在25℃，100mM Na⁺，1mM Mg⁺的条件下，核酸适体Aptamer 3-83序列的空间结构示意图如图1所示。所述核酸适体或其突变体或其截短序列或其延长序列的5’端或3’端可进行FITC、氨基、生物素或地高辛任一化学修饰。

实施例3

验证核酸适体Aptamer 3-83可作为小分子尿苷二磷酸(UDP)的检测工具：对核酸适体Aptamer 3-83作为验证生物探测器筛选尿苷二磷酸糖基转移酶的可行性进行验证。

选取文献已报道过的4种不同活性的尿苷二磷酸糖基转移酶进行酶促反应，吸取酶促反应液10μL与10μL Aptamer 3-83(10μM)共孵育后，进行 ExoI/ExoIII双酶切，从而降低背景信号以及放大信号差距，再加入终浓度为 10×SYBR Green I混合。最后用1×Binding Buffer将检测体系定容至100μL，在激发波长为380nm，发射波长范围为490nm～620nm下进行荧光扫描，荧光扫描结果如图7和图8。其中AT17050的酶促反应液中UDP的含量最高， AR42458的酶促反应液中几乎没有UDP的产生，而AR14572和AR43718的酶促反应液中均有UDP。实验结果表明，其中AT17050的活性最高，其次为 AR14572和AR43718。

实施例4

验证核酸适体Aptamer 3-83作为基因元件的调控作用，以及对核酸适体 Aptamer3-83作为基因元件调控作用的稳健性。

以RNA适体3WJdB作为报告输出，成功转录后与小分子DFHBI特异性结合发出荧光，实现表征核酸适体Aptamer 3-83作为基因元件的调控作用效果；选用实施例1中通过菌落PCR后产物纯化获得转录用线性DNA:pT7-配体Aptamer 3-83-3WJdB-T500，将转录用线性DNA加入到体外转录反应体系中，终浓度为0，10，20，30，40nM，尿苷二磷酸浓度分别为0、200μM、400μM、600μM、800μM、1mM，在37℃下反应3h，用多功能酶标仪实时监测激发光472nm和发射光507nm下的荧光表征转录水平；

如图3和图4所示核酸适体Aptamer 3-83所对应的转录用线性DNA在进行转录过程中能够响应靶标配体尿苷二磷酸的加入，荧光峰值显著升高，加入尿苷二磷酸的实验组实时荧光始终高于未加入的对照组，且加大配体浓度时这种促进作用更加明显。核酸适体Aptamer 3-83作为基因元件插入在基因回路中与对照组相比降低了下游转录，说明其序列结构较为紧密，只有尿苷二磷酸配体存在时才会明显促进转录，这可能是由于尿苷二磷酸与紧密的适体序列结合使其结构变得松散，导致RNA聚合酶较顺利向下游进行，从而表现出转录过程的促进调控。

实施例5

分别进行核酸适体Aptamer 3-83与靶标配体尿苷二磷酸的圆二色谱表征以及核酸适体Aptamer 3-83与靶标配体尿苷二磷酸的亲和力表征。

核酸适体Aptamer 3-83与靶标配体尿苷二磷酸的圆二色谱表征的具体操作如下：

用1×Binding Buffer分别配置含有50μM尿苷二磷酸，5μM核酸适体 Aptamer 3-83 ssDNA以及含有相同浓度的两者混合物，总体积为200μL，分别将含有ssDNA的组别在未加入配体前，在95℃下孵育10min后立即置于冰上，使得ssDNA变性减少自身二级结构，加入目标配体孵育1h后进行扫描；圆二色谱仪参数设定：氮气流速4～5L/min，扫描波长210nm～320nm，扫描速度50nm/min，带宽1nm，累计3次扫描数据取平均。获得圆二色谱CD图谱(图5)。

核酸适体Aptamer 3-83与靶标配体尿苷二磷酸的亲和力表征，具体操作如下：

使用Waters公司的Nano ITC等温滴定量热仪进行尿苷二磷酸结合核酸适体的ITC实验，在25℃下，每组实验中将1500μL的20μM的核酸适体候选物于1×Binding Buffer中95℃加热10min后立即置于冰上冷却，在注射器中装入100μL含20mM的尿苷二磷酸的1×Binding Buffer；每次以2μL的体积进行注射滴定，25次连续注射，间隔300s，转速为300rpm。

如图5所示，当1×Binding缓冲液含有50μM UDP时并没有观察到明显的CD信号，表明在此条件下不会影响后续验证实验。Aptamer 3-83的结构在1×Binding缓冲液中显示有负峰(250nm)和正峰(280nm)，这是典型的DNA A型双链结构。当UDP存在时，Aptamer 3-83在250nm处可检测到的CD信号上调，在280nm处可检测到的CD信号下调。表明在UDP 存在时，Aptamer 3-83自身的A型双链结构变弱，因此出现了CD图谱在250 nm处的上调和280nm处的下调，该结果证实UDP的存在使得Aptamer 3-83 的A型双链结构变得松散。

如图6所示，Aptamer 3-83与UDP之间存在一定亲和力。利用Launch NanoAnalyze软件分析ITC实验中收集到的数据，应用independent模型进行数据拟合，其Kd＝274.8μM。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种尿苷二磷酸的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种尿苷二磷酸的核酸适体，其特征在于，为权利要求1中所述的SEQ ID NO:1所示序列的突变体或截短序列或延长序列。

3.根据权利要求1或2所述的一种尿苷二磷酸的核酸适体，其特征在于，所述核酸适体的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素或地高辛任一化学修饰。

4.一种尿苷二磷酸核酸适体的筛选方法，用于筛选权利要求1或2所述核酸适体，其特征在于，基于核酸适体的体外SELEX筛选方式和体外转录过程筛选相结合。

5.根据权利要求4所述的一种尿苷二磷酸核酸适体的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：

5’-GCAACTCCTAGATGGTCTCAAACG-N40-GGACTAGATTCTA-N10-AAAAATGTGAGACCAAAGGAGAATAA-3’

S2：将ssDNA文库与3’端带有生物素标记的单链DNA Capture-Oligo互补配对形成部分双链DNA；

S3：将经过S2所得的部分双链DNA与链霉亲和素磁珠进行过夜孵育，使得ssDNA文库以DNA Capture-Oligo为媒介固定在链霉亲和素磁珠上，洗去未能固定的ssDNA序列，获得磁珠-CO-ssDNA Library复合物；

S4：将经过S3所得的磁珠-CO-ssDNA Library复合物与靶标配体尿苷二磷酸进行孵育，竞争结合与其有特异亲和力的ssDNA适体序列，获得孵育混合物；

S5：磁性分离经S4后的孵育混合物，收集洗脱得到与人尿苷二磷酸特异性结合的ssDNA适体序列，即ssDNA富集文库，并且在后续筛选过程中不断减少靶标配体浓度，增加筛选压力；

S6：将经过S5所得到的ssDNA富集文库进行PCR扩增，其中PCR扩增用引物为：

引物P1：5’-GCAACTCCTAGATGGTCTCA-3’；

引物P2：5’-AGTGAAAAGTTATTCTCCTTTGGTCTC-3’；

S7：将经过S6扩增得到的富集后的带有磷酸化标记的dsDNA文库，利用LambdaExonuclease在37℃水浴酶切30min得到ssDNA文库，经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssDNA文库；

S8：循环筛选：将经过S7所得的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复S2～S7的筛选过程，完成正向筛选，获得正向筛选完成后的ssDNA文库；

S9：正向筛选完成后的ssDNA文库，进行体外转录过程筛选。

6.根据权利要求5所述的一种尿苷二磷酸核酸适体的筛选方法，其特征在于，所述S9的体外转录过程筛选的步骤如下：

S9.1：将正向筛选完成后的ssDNA文库经PCR扩增为dsDNA文库，利用Golden GateAssembly方法将带有启动子、输出信号和终止子的载体与dsDNA文库进行连接，获得连接产物；

S9.2：将经过S9.1中插入有dsDNA文库的连接产物进行转化、涂布、挑菌、Colony PCR以及凝胶电泳验证，选择插入正确的条带，PCR产物回收其所对应的Colony PCR后线性DNA产物并进行编号；

S9.3：将所有回收得到的包含有启动子、适体序列、输出信号以及终止子的线性DNA，在含有或不含有靶标尿苷二磷酸的体外转录系统中进行转录过程，观察其输出信号的变化，从而选择可以对靶标配体做出响应，影响下游基因转录的适体序列。

7.根据权利要求1或2中所述的一种尿苷二磷酸的核酸适体，在识别、分析和检测尿苷二磷酸中的应用。

8.根据权利要求1或2中所述的一种尿苷二磷酸的核酸适体，在基因回路中响应环境中尿苷二磷酸水平的应用。

Images