CN105441407A

CN105441407A - 高保真度限制性内切核酸酶

Info

Publication number: CN105441407A
Application number: CN201610040472.9A
Authority: CN
Inventors: 朱振宇; A·布兰查德; 徐双勇; 管胜昔; 魏华; 张鹏华; 孙大鹏; 陈少康
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2007-07-12
Filing date: 2008-07-14
Publication date: 2016-03-30
Also published as: US8628945B2; US20160102306A1; CN105441408A; US9034625B2; EP2167655B1; WO2009009797A2; US20130122568A1; EP2392651B1; US9249396B2; JP6684250B2; EP2463363B1; CN101802183A; US20130115679A1; EP2390315B1; EP2392651A1; US20130115678A1; EP2392653A1; EP2392653B1; CN105441409B; US20130115681A1

Abstract

提供针对具有改变性质的酶的组合物和方法，其包括诱变的系统方法和允许选择希望的蛋白质的筛查分析。该方法的实施方式特别适于改变限制性内切核酸酶的特定性质如星号活性。该组合物包括具有减少星号活性的限制性内切核酸酶，如通过总保真度指数改进因子限定的。

Description

高保真度限制性内切核酸酶

本申请是申请日为2008年7月14日、申请号为200880106647.5、题为“高保真度限制性内切核酸酶”的专利申请的分案申请。

背景技术

限制性内切核酸酶是以序列特异性方式切割双链DNA的酶(Roberts，R.J.，ProcNatlAcadSciUSA，102：5905-5908(2005)；Roberts，etal.，NucleicAcidsRes，31：1805-1812(2003)；Roberts，etal.，NucleicAcidsRes，33：D230-232(2005)；Alves，etal.，RestrictionEndonucleases，“ProteinEngineeringofRestrictionEnzymes，”ed.Pingoud，Springer-VerlagBerlinHeidelberg，NewYork，393-407(2004))。它们在原核生物中是普遍存在的(Raleigh，etal.，BacterialGenomesPhysicalStructureand Analysis，Ch.8，eds.DeBruijin，etal.，Chapman&Hall，NewYork，78-92(1998))，其中它们形成限制修饰系统的一部分，其主要由内切核酸酶和甲基转移酶构成。同源的(cognate)甲基转移酶甲基化与其配对内切核酸酶识别的序列相同的特异性序列，并赋予被修饰DNA对内切核酸酶切割的抗性，以便宿主DNA可以被恰当地保护。然而，当存在外源DNA侵入时，特别是噬菌体DNA侵入时，外源DNA将在其可被完全甲基化之前降解。限制修饰系统的主要生物功能是保护宿主免于噬菌体感染(Arber，Science，205：361-365(1979))。其他的功能也已被提出，例如涉及重组和转座(Carlson，etal.，MolMicrobiol，27：671-676(1998)；Heitman，GenetEng(NY)，15：57-108(1993)；McKane，etal.，Genetics，139：35-43(1995))。

大约3,000种已知的限制性内切核酸酶对它们的超过250种不同靶序列的特异性可以被考虑为它们最令人感兴趣的特性。在发现第一种限制性内切核酸酶的序列特异性性质(Danna，etal.，ProcNatlAcadSciUSA，68：2913-2917(1971)；Kelly，etal.，JMolBiol，51：393-409(1970))之后，科学家们没有花费太长时间发现了某些限制性内切核酸酶在非最适条件下切割与其限定识别序列相似但不相同的序列(Polisky，etal.，ProcNatlAcadSciUSA，72：3310-3314(1975)；Nasri，etal.，NucleicAcidsRes，14：811-821(1986))。该松弛的特异性(relaxedspecificity)被称为限制性内切核酸酶的星号活性(staractivity)。已提出，限制性内切核酸酶和DNA之间水介导的相互作用是特异性复合物和星复合物(starcomplexes)之间的主要差异(Robinson，etal.，JMolBiol，234：302-306(1993)；Robinson，etal.，ProcNatlAcadSciUSA，92：3444-3448(1995)，Sidorova，etal.，BiophysJ，87：2564-2576(2004))。

星号活性是分子生物学反应中的问题。星号活性在克隆载体或其他DNA中引入不希望的切割。在例如法医应用的情况中，在这种情况下某些DNA底物需要被限制性内切核酸酶切割以产生独特的指纹图谱，星号活性将改变切割图案特性，从而使分析复杂化。避免星号活性在例如链置换扩增技术(Walker，etal.，ProcNatlAcadSciUSA，89：392-396(1992))和基因表达的系列分析(Velculescu，etal.，Science，270：484-487(1995))的应用中也是关键的。

发明概述

在本发明的一个实施方式中，提供组合物，所述组合物包含具有至少一个人工引入突变和至少2的总保真度指数(FI)改进因子(overallfidelityindeximprovementfactor)的限制性内切核酸酶，在预定的缓冲液中所述限制性内切核酸酶能以与不存在所述人工引入突变的限制性内切核酸酶的切割活性至少相似的切割活性切割底物，所述人工引入突变是靶向突变、饱和诱变或通过PCR扩增过程引入的突变的至少一个的产物。

在本发明的进一步的实施方式中，人工引入突变中的至少一个是靶向突变，其是由用带相反电荷的残基置换天然存在的残基产生的。丙氨酸或苯丙氨酸可以置换靶位点处的天然存在的残基。

在本发明的进一步的实施方式中，上面描述类型的组合物包括选自下列的不存在人工引入突变的限制酶：BamHI、EcoRI、ScaI、SalI、SphI、PstI、NcoI、NheI、SspI、NotI、SacI、PvuII、MfeI、HindIII、SbfI、EagI、EcoRV、AvrII、BstXI、PciI、HpaI、AgeI、BsmBI、BspQI、SapI、KpnI和BsaI。

本发明进一步的实施方式包括在表4中列出的组分。

在本发明的进一步的实施方式中，提供编码在表4中列出的酶的任一种的DNA，包含该DNA的载体和从该载体表达蛋白质的宿主细胞。

在本发明的一个实施方式中，提供具有下列步骤的方法：(a)鉴定在具有星号活性的限制性内切核酸酶的氨基酸序列中，哪些氨基酸残基是带电荷的氨基酸；(b)在编码该限制性内切核酸酶的基因序列中，突变编码一个或更多个带电荷的残基的一个或更多个密码子；(c)产生在不同的带电荷的残基具有一个或更多个不同密码子突变的基因序列文库；(d)获得突变的基因序列表达的蛋白质组(asetofproteins)；和(e)测定每一表达蛋白质在预定缓冲液中的FI和切割活性。

该方法的一个实施方式包括在限定的缓冲液组中对属于该蛋白质组的蛋白质测定总FI改进因子的步骤，其中例如，缓冲液组包含NEB1、NEB2、NEB3和NEB4缓冲液。

该方法的一个实施方式包括上面描述的步骤和另外地，在突变带电荷的氨基酸的密码子的同一步骤或随后步骤中，突变编码羟化氨基酸或酰胺氨基酸的密码子。

在上面描述的本发明的一个实施方式中，将除了酪氨酸以外的密码子突变为丙氨酸，将酪氨酸突变为苯丙氨酸。

在一个进一步的实施方式中，使用对一个或更多个突变密码子的饱和诱变，改进总FI改进因子。

附图简述

对于图1-32：

*标记表示其左侧的泳道含有最低浓度的观察到星号活性的酶。

#标记指示出不完全切割的泳道，该泳道与含有足够完全切割底物的浓度的酶的泳道相邻并位于其右侧。

灰色三角形表示限制性内切核酸酶浓度的连续减少(serialdecrease)。

“U”表示酶单位。

在图1-32中描述的每一反应中，反应混合物含有3μl体积的——除非另外规定——来自NewEnglandBiolabs，Inc.(NEB)，Ipswich，MA的缓冲液(参见表1和NEB目录)，3μl体积的——除非另外规定——来自NEB，Ipswich，MA的稀释剂中的指定限制性内切核酸酶(参见表1和NEB目录)，以及不定体积的指定底物(含有0.6νg)和使反应混合物达到总共30μl的体积的水。在37℃下进行反应，温育时间为1小时。在0.8％琼脂糖凝胶上分析结果。当反应混合物总体积、底物量、反应温度或温育时间与上述不同时，在图的说明中提供数值。

在图1、5、8、11-18和20-32中，在凝胶的右侧提供理论消化图谱。那些仅具有一个限制性内切核酸酶位点的底物应该从超螺旋形式消化为一个线性带。

图1显示通过在NEB3缓冲液中使用稀释剂A对WTScaI(1,200U)制剂进行两倍连续稀释而消化1.2μlλDNA底物(0.6μg)、并在琼脂糖凝胶上检查消化产物，对野生型(WT)ScaI的FI进行的测定。没有星号活性的限制性内切核酸酶的最高浓度用实心箭头显示；和引起底物完全消化的最小浓度用空心箭头示出。

图2A-D示出用WTBamHI或BamHI(E86P)酶消化0.5μlpUC19底物(0.5μg)1小时的结果，所述WTBamHI或BamHI(E86P)酶是用稀释剂A三倍连续稀释的，其起始浓度为172U或512U。中间的泳道是NEB1kb标记(NewEnglandBiolabs，Inc.(NEB)，Ipswich，MA)。

图2A示出使用NEB1缓冲液的结果。

图2B示出使用NEB2缓冲液的结果。

图2C示出使用NEB3缓冲液的结果。

图2D示出使用NEB4缓冲液的结果。

图3A-B示出在两个时间期间BamHI(E86P)活性的比较，其在NEB2缓冲液使用0.6μlpBR322底物(其仅包含1个BamHI切割位点)，使用初始浓度600U、用稀释剂A以2-倍连续稀释的酶。

图3A示出1小时的结果。

图3B示出14小时的结果。

图4A-B示出在琼脂糖凝胶上，在两种不同的缓冲液中温育14小时后，使用以稀释剂A2倍连续稀释的BamHI-HF(E163A/E167T)，对0.6μlpBR322底物的切割。

图4A示出使用NEB2缓冲液和600U初始浓度酶的结果。

图4B示出使用NEB1缓冲液和2,400U初始浓度酶的结果。

图5A-B示出在NEB4缓冲液中应用BamHI-HF和WTBamHI的切割反应的比较。该反应在NEB4缓冲液中进行，使用1.2μlλDNA底物，处于使用稀释剂A的2-倍连续稀释中。

图5A示出起始浓度1,200U的WTBamHI，其中FI等于4。

图5B示出起始浓度2,400U的BamHI-HF，其中FI≥4000。

图6A-D示出在使用NEB稀释剂C3-倍连续稀释下，在NEB1-4缓冲液中WTEcoRI和EcoRI(K62A)的比较。反应混合物包含在NEB1-4缓冲液中的2μlλDNA底物(1μg)。

图6A示出两倍连续稀释后，在NEB2缓冲液中120UWTEcoRI和240U的EcoRI(K62A)的切割结果。

图6B示出两倍连续稀释后，在NEB4缓冲液中120UWTEcoRI和240U的EcoRI(K62A)的切割结果。

图6C示出两倍连续稀释后，在NEB1缓冲液中60UWTEcoRI和120U的EcoRI(K62A)的切割结果。

图6D示出两倍连续稀释后，在NEB3缓冲液中120UWTEcoRI和60U的EcoRI(K62A)的切割结果。

图7A-C示出用两种不同的EcoRI突变体和WTEcoRI的切割结果。示出100,000U酶和其在稀释剂C中的10倍连续稀释物在10小时中的消化，其在各种缓冲液中使用0.6μl的Litmus28底物进行。在Litmus28底物中仅存在一个EcoRI切割位点。

图7A：在NEB4缓冲液中的EcoRI突变体K62E。

图7B：在NEB4缓冲液中的EcoRI突变体K62A。

图7C：在EcoRI缓冲液中的WTEcoRI(参见NEB目录2007-8)。

图8A-B示出在NEB4缓冲液中EcoRI-HF和WTEcoRI的比较。反应使用1.2μlλDNA底物，其处于使用稀释剂C的2-倍连续稀释下。

图8A：在NEB4缓冲液中，具有19,200U起始浓度的WTEcoRI显示FI＝4。

图8B：在NEB4缓冲液中，具有38,400起始浓度的UEcoRI-HF显示FI＝16,000。

图9A-B示出WTScaI(4.8U)、ScaI(H193A)(9.6U)、ScaI(S201F)(19.2U)和ScaI(H193A/S201F)(19.2U)的连续稀释的比较。每一样品最初稀释1/10，然后在具有指定百分比甘油的NEB2缓冲液中2-倍连续稀释。每一反应混合物包含2μl的λDNA底物(1μg)。

图9A：5％甘油。

图9B：37％甘油。

图10A-D示出WTScaI和ScaI-HF(H193A/S201F)的比较。酶(如规定的单位浓度)各自用稀释剂A以2.5-倍连续稀释。该反应混合物含有2μlλDNA底物和NEB1-4缓冲液。

图10A：在NEB2缓冲液中切割。

图10B：在NEB4缓冲液中切割。

图10C：在NEB1缓冲液中切割。

图10D：在NEB3缓冲液中切割。

图11A-H示出对SalI-HF和WTSalI的FI测定。两种酶都使用稀释剂A以2-倍连续稀释。该反应混合物含有2μlHindIII-消化的λDNA底物。

图11A、B、C和D示出1,200U、1,200U、300U和1,200U的SalI-HF的连续稀释，其分别在NEB1、2、3和4缓冲液中显示FI≥1,000、FI≥2,000、FI≥500和FI≥2,000。

图11E、F、G和H示出19.2U、150U、9,600U和38.4U的WTSalI的连续稀释，其分别在NEB1、2、3和4缓冲液中显示FI＝8、FI＝1、FI＝32和FI＝1。

图12A-B示出在NEB4缓冲液中与1.2μlλDNA底物反应的、在稀释剂A中的SphI-HF(19,200U)和在稀释剂B中的WTSphI(143,600U)的2-倍连续稀释的结果。

图12A示出WTSphI的切割。

图12B示出SphI-HF的切割。

图13A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的PstI-HF(300U和150U)和2-倍连续稀释的WTPstI(2,400U和4,800U)对1.2μlλDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂C中进行。

图13A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中PstI-HF的切割。

图13B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTPstI的切割。

图14A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的NcoI-HF(4,800U和600U)和2-倍连续稀释的WTNcoI(4,800U和1,200U)对1.2μlλDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂A中进行。

图14A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中NcoI-HF的切割。

图14B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTNcoI的切割。

图15A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的NheI-HF(287,200U和76.8U)和2-倍连续稀释的WTNheI(9,600U和300U)对1.2μlpXbaDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂A中进行。

图15A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中NheI-HF的切割。

图15B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTNheI的切割。

图16A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的SspI-HF(9,600U和38.4U)和2-倍连续稀释的WTSspI(19,200U和19,200U)对1.2μlλDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂C中进行。

图16A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中SspI-HF的切割。

图16B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTSspI的切割。

图17A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的NotI-HF(287,200U和19,200U)和2-倍连续稀释的WTNotI(19,200U和76,800U)对1.2μlpXbaDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂C中进行。

图17A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中NotI-HF的切割。

图17B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTNotI的切割。

图18A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的SacI-HF(4,800U和76.8U)和2-倍连续稀释的WTSacI(19,200U和1200U)对1.2μlpXbaDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂A中进行。

图18A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中SacI-HF的切割。

图18B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTSacI的切割。

图19A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的PvuII-HF(9,600U和19.2U)和2-倍连续稀释的WTPvuII(19,200U和300U)对0.6μlpBR322DNA底物的切割。连续稀释在稀释剂A中进行。

图19A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中PvuII-HF的切割。

图19B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTPvuII的切割。

图20A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的MfeI-HF(300U和19.2U)和2-倍连续稀释的WTMfeI(2,400U和38.4U)对1.2μlλDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂A中进行。

图20A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中MfeI-HF的切割。

图20B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTMfeI的切割。

图21A-B示出分别在NEB3和NEB4缓冲液中，使用2-倍连续稀释的HindIII-HF(4,800U和1,200U)和2-倍连续稀释的WTHindIII(9,600U和4,800U)对1.2μlλDNA底物的切割。连续稀释在稀释剂A中进行。

图21A示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中HindIII-HF的切割。

图21B示出NEB4缓冲液(上图)和NEB3缓冲液(下图)中WTHindIII的切割。

图22A-B示出在NEB4缓冲液中，使用稀释剂C以2-倍连续稀释SbfI-HF(起始浓度：76,800U)和WTSbfI(起始浓度：76,800U)，对1.2μlλDNA底物的切割。

图22A示出通过WTSbfI的切割。

图22B示出通过SbfI-HF的切割。

图23A-B示出分别在NEB2和NEB1缓冲液中，使用2-倍连续稀释的EagI-HF(1,200U和600U)和2-倍连续稀释的WTEagI(150U和38.4U)对1.2μlpXbaDNA底物的切割，其应用稀释剂C。

图23A示出NEB2缓冲液(上图)和NEB1缓冲液(下图)中EagI-HF的切割。

图23B示出NEB2缓冲液(上图)和NEB1缓冲液(下图)中WTEagI的切割。

图24A-B示出在NEB4缓冲液中，使用稀释剂A以2倍连续稀释EcoRV-HF(起始浓度：38,400U)和WTEcoRV(起始浓度：2400U)，对1.2μlpXbaDNA底物的切割。

图24A示出通过WTEcoRV的切割。

图24B示出通过EcoRV-HF的切割。

图25A-B示出在NEB4缓冲液中，使用稀释剂A以2倍连续稀释AvrII-HF(起始浓度：1,200U)和WTAvrII(起始浓度：1,200U)，对1.2μlT7DNA底物的切割。

图25A示出通过WTAvrII的切割。

图25B示出通过AvrII-HF的切割。

图26A-B示出在NEB4缓冲液中，在稀释剂A中2倍连续稀释BstXI-HF(起始浓度：300U)和WTBstXI(起始浓度：38.4U)，对1.2μlλDNA底物的切割。该反应在55℃进行。

图26A示出通过WTBstXI的切割。

图26B示出通过BstXI-HF的切割。

图27A-B示出在NEB4缓冲液中，使用稀释剂A以2倍连续稀释PciI-HF(起始浓度：600U)和WTPciI(起始浓度：300U)，对1.2μlpXbaDNA底物的切割。

图27A示出通过WTPciI的切割。

图27B示出通过PciI-HF的切割。

图28A-B示出在NEB2缓冲液中，使用稀释剂A以2倍连续稀释HpaI-HF(起始浓度：4,800U)和WTHpaI(起始浓度：9,600U)，对1.2μlλDNA底物的切割。

图28A示出通过WTHpaI的切割。

图28B示出通过HpaI-HF的切割。

图29A-B示出在NEB4缓冲液中，使用稀释剂C以2-倍连续稀释AgeI-HF(起始浓度：600U)和WTAgeI(起始浓度600U)，对1.2μlpXbaDNA底物的切割。

图29A示出通过WTAgeI的切割。

图29B示出通过AgeI-HF的切割。

图30A-B示出在NEB4缓冲液中，使用稀释剂C以2-倍连续稀释BsmBI-HF(起始浓度：300U)和WTBsmBI(起始浓度4,800U)，对1.2μlλDNA底物的切割。该反应在55℃下进行。

图30A示出通过WTBsmBI的切割。

图30B示出通过BsmBI-HF的切割。

图31A-B分别示出MluCIM的DNA序列(SEQIDNO：1)和蛋白序列(SEQIDNO：2)，用于EcoRI和MfeI的表达。

图32示出Hpy166IIM的DNA序列(SEQIDNO：3)，用于SalI的表达。

图33A-B分别示出MfeI的DNA序列(SEQIDNO：4)和蛋白序列(SEQIDNO：5)。

图34A-B分别示出BstXI的DNA序列(SEQIDNO：6)和蛋白序列(SEQIDNO：7)。

图35A-B分别示出M.BstXI的DNA序列(SEQIDNO：8)和蛋白序列(SEQIDNO：9)。

图36A-B分别示出S.BstXI的DNA序列(SEQIDNO：10)和蛋白序列(SEQIDNO：11)。

图37A-B分别示出PciI的DNA序列(SEQIDNO：12)和蛋白序列(SEQIDNO：13)。

图38A-B分别示出M.PciI的DNA序列(SEQIDNO：14)和蛋白序列(SEQIDNO：15)。

图39示出编码MI.EarI的DNA序列(SEQIDNO：17)，所述MI.EarI识别CTCTTC并且在N4胞嘧啶或N6腺嘌呤处甲基化，用于克隆SapI和BspQI。

图40示出编码M2.EarI的DNA序列(SEQIDNO：18)，所述M2.EarI识别CTCTTC并且在N4胞嘧啶或N6腺嘌呤处甲基化，用于克隆SapI和BspQI。

图41A-B示出测定1μlWTBspQI和1μl突变体(K279P/R388F)BspQI(起始浓度分别为512U和1,024U)的FI的琼脂糖凝胶，其通过使用稀释剂A和NEB1缓冲液加10％甘油以2倍连续稀释来切割1μlpUC19DNA底物进行。该反应在50℃进行。

图42示出测定5μlWTSapI和5μl突变体(K273A)SapI(起始浓度分别为32U和16U)的FI的琼脂糖凝胶，其通过使用稀释剂A和NEB2缓冲液加25％DMSO以2倍连续稀释来切割pUC19DNA底物进行。

图43A-B示出通过5μlWTKpnI和5μlD16N/E132A/D148EKpnI(初始浓度分别为32U和256U)得到的pXba的催化活性和星号活性。使用含有10mMpH7.4的Tris-HCl、50mMKCl、0.1mMEDTA、1mMDTT和50％甘油的稀释剂在NEB2缓冲液中，以2-倍连续稀释的该酶消化2μlpXbaDNA底物(0.5μg)，其中使用水补充至50μl的总体积。

图44A-G示出表1中的酶的氨基酸序列，和以前没有公开的表1中酶的DNA序列。

发明详述

本发明的实施方式提供选择具有希望特性的限制性内切核酸酶的一般方法。该一般方法依赖于适当的分析测定希望的限制性内切核酸酶是否已经产生。特别地，该一般方法的一个实施方式提供具有一组步骤的系统筛查方法。通过使用多种限制性内切核酸酶实施数百个反应，已经推导出该方法。本文提供的实例的大多数涉及鉴定具有降低星号活性但是其切割活性至少与WT限制性内切核酸酶相似的限制性内切核酸酶。然而，期望可以成功地运用同一方法以改变(修饰)限制性内切核酸酶的其他性质，例如涉及在期望缓冲液中的改进的切割活性、热稳定性、在限定条件中的反应速率等。

如上所述，所关心的终点是将具有星号活性的限制性内切核酸酶转化为具有显著减少星号活性的高保真度限制性内切核酸酶。星号活性指单个限制性内切核酸酶在切割特异性方面的混乱。术语“星号活性降低”和“保真度增加”在本文可互换使用。尽管限制性内切核酸酶特征为其在特定序列处切割DNA的性质，但是一些限制性内切核酸酶另外地在该DNA的第二(次级)位点处无效率地切割DNA。该种次级切割可以一贯地发生或者可以仅仅在某些条件例如下列条件之一下出现：浓度增加、某些缓冲液、温度、底物类型、存储和温育时间。

通常承认对由构成蛋白质和决定特异性的数以百计的氨基酸产生的复杂环境所知甚少。现有技术的一个方法已经利用晶体学来鉴定酶和其底物之间的接触点。但是，晶体学对于在非自然化学环境中及时冷冻结构方面具有局限性。

使用现有的分析技术，已经证明确定蛋白质中任何位点处氨基酸的贡献和底物分子结构所起的作用的规则是难以捉摸的。例如，这里显示，突变限制性内切核酸酶中的一个氨基酸可以引起所有或部分的活性损失。

在本文中，没有提出结构解释以说明为什么星号活性可以随着高甘油浓度(＞5％v/v)、高的酶与DNA比例(通常每μgDNA＞100单位的酶)、低离子强度(＜25mM的盐)、高pH(＞8.0)、存在有机溶剂(例如DMSO、乙醇)和用其他的二价阳离子(Mn²⁺、Co²⁺)取代Mg²⁺而增加。这里承认因为影响星号活性的因素的多样性，将必需在相同反应条件和在相同的预定缓冲液中对WT和突变星号活性进行比较，并且开发任何高保真度酶必定能示出所述特性的标准反应条件——即使这些特性也在其他的反应条件下观察到。

本发明的实施方式涉及产生具有特定提高性质的修饰的限制性内切核酸酶，即具有增强的切割保真度而没有总切割活性的显著减少或从制造该蛋白质的宿主细胞的显著产量下降。本文已经发展用于发现具有提高性质的突变体的方法是详尽试验的结果，并且生成酶的性质已经在指定条件的背景中限定。本文描述的方法可用来在预定条件下改变任何限制性内切核酸酶的酶促性质，但是不限于所述具体的限定条件。

该方法从负责同源活性和星号活性的氨基酸是不同的这一认识而得出。本文描述的高保真度限制性内切核酸酶的工程化显示同源活性和星号活性可以分开，并且存在影响这些不同活性的不同的关键氨基酸残基。被发现影响星号活性的氨基酸的位置不一定在蛋白质的活性部位内发现。通过发展在确定FI(也参见Weietal.NucleicAcidRes.，36，9，e50(2008))和总保真度指数改进因子的形式方面成功的标准，本文已经第一次确定任何限制性内切核酸酶的切割性质。

“总保真度指数改进因子(overallfidelityindeximprovementfactor)”指在选择的缓冲液组中具有最大切割活性的突变体的最高FI除以具有最大切割活性的相应WT内切核酸酶的最高FI。选择的组可以是大于1的任何大小，但是实际上将含有小于10种不同的缓冲液，并且更优选地含有4种缓冲液。该组也可包括小于4种缓冲液。另外地而不仅仅对于由NEB1、NEB2、NEB3和NEB4组成的缓冲液组，至少2的总FI改进因子应优选地适用于要求保护的发明的任何突变限制性内切核酸酶。

通过将相同量的酶与相同量和类型的底物在相同条件下反应，并且视觉上比较电泳后凝胶上的切割图，以便切割产物的量表现在误差的标准容限内是相同的并且其中定量相似性大于10％，可以测量“相似的切割活性”。

“人工的”指“人造的”。

“标准条件”指从在NEB1-4缓冲液中获得的结果计算的总FI改进因子。

本文描述的一般方法已经用27种限制性内切核酸酶示例：AgeI、AvrII、BamHI、BsaI、BsmBI、BspQI、BstXI、EagI、EcoRI、EcoRV、HindIII、HpaI、KpnI、MfeI、NcoI、NheI、NotI、PciI、PstI、PvuII、SacI、SalI、SapI、SbfI、ScaI、SphI和SspI限制性内切核酸酶。然而，如上所述，预期该方法对工程化具有显著星号活性的任何限制性内切核酸酶是有效的。

该方法的实施方式利用一般的方法产生具有减少星号活性的突变体限制性内切核酸酶。对于某些酶，已经证明突变被确定在两个同切点酶之间保守的带电荷的残基是有用的(参见例如实施例25中的SapI)。然而，一般而言，该方法包括鉴定内切核酸酶的蛋白序列内所有的带电荷和极性残基的第一步骤。例如，带电荷的氨基酸和极性残基包括酸性残基Glu和Asp；碱性残基His、Lys和Arg；酰胺残基Asn和Gln；芳族残基Phe、Tyr和Trp；和亲核残基Cys。各残基被靶向并突变为Ala，并且针对希望的保真度增加的性质，筛查这些靶向突变的产物。如果获得的突变体没有一个提供令人满意的结果，下一步是靶向突变所有的羟化氨基酸，即Ser、Thr和Tyr，优选的突变是Ser和Thr突变为Ala和Tyr突变为Phe。也可能同时靶向突变两类残基，如在实施例16-23中所做的。突变为Ala可以被突变为Val、Leu或Ile所取代。

在这些分析之后，如果上述步骤中产生的一种或更多种优选的突变体在选择的检验下仍然具有低于标准的性能，这些突变体可以被选择并再次突变为另外可能的18种氨基酸的每一种。这被称为饱和诱变。饱和诱变提供EcoRI(实施例2)、部分BamHI(实施例1)和PvuII(实施例12)的优选的高保真度突变体。依赖饱和诱变的结果，下一步将以靶向或随机或者这两种方式将另外的突变引入限制性内切核酸酶。在实施例11中，SacI-HF包括在反向PCR期间偶然产生的随机突变。在实施例20中，PciI-HF是随机突变的结果，而不是靶向突变的结果。在实施例26中，BspQI-HF含有被发现在增强保真度中协同作用的两个突变。

不同的靶向诱变方法例如反向PCR的应用可包括在蛋白质的第二位点引入非靶向突变。这些第二突变可偶然地提供需要的性质(参见实施例20)。检查那些具有多突变的突变酶是希望的，以确定是否所有的突变对观测的效果是必需的。在实施例11中，双突变体中Q117H对活性没有影响。在实施例20中，另外的自发突变表现独自为观察到的提高的保真度的原因，而在实施例24中，各个突变协同地作用。

在一些情况中，突变可提供除了提高的保真度之外的另外的优点(参见例如BamHI，其中E163A或P173A引起酶变得更热不稳定)。

根据其在一组标准缓冲液中的功能，选择实施例中提供的突变体的高保真度/减少星号活性的性质。如果选择不同的缓冲液组合物，那么其他的突变可以是优选的。然而，可以运用相同的方法来发现突变体。表4列出运用于每一限制性内切核酸酶并在标准缓冲液中提供总FI改进因子的突变。

提供至少2的总FI改进因子的高保真度限制性内切核酸酶的工程化包括一个或更多个下列步骤：

1.WT限制性内切核酸酶的星号活性的评估

在本发明的一个实施方式中，限制性内切核酸酶的星号活性的程度通过下列方法检测：对于适当的底物，使用高初始浓度的原液(stock)内切核酸酶和其连续稀释物(例如2倍或3倍稀释)，测定内切核酸酶活性。限制性内切核酸酶的初始浓度是不重要的，只要其足以使在至少一个浓度中观察到星号活性，这样通过稀释，不再检测到星号活性。

适当的底物含有被同源内切核酸酶活性切割的核苷酸序列，并且在其中可以观察到星号活性。该底物可以是含有限制性内切核酸酶基因的载体或第二DNA底物。在表2中使用的底物的实例是pBC4、pXba、T7、lambda和pBR322。

原液限制性内切核酸酶的浓度最初被选择，以便星号活性可以容易地在WT和突变限制性内切核酸酶中识别和分析。根据2007-08NEB目录的指导，选择适当的稀释缓冲液例如NEB稀释剂A、B或C进行连续稀释。连续稀释的限制性内切核酸酶与预定浓度的适当的底物以反应容器大小确定的总反应体积进行反应。例如，在微量滴定板中进行多个反应是方便的，在微量滴定板中，30μl反应混合物是每孔适当的体积。因此，实例通常应用30μl中0.6μg的底物，其相当于50μl中的1μg底物。反应混合物中的底物的量不是关键的，但是优选其在反应之间为恒定。切割反应在预定温度(例如25℃、30℃、37℃、50℃、55℃或65℃)下进行标准时间例如一小时。可以通过任何标准技术例如通过0.8％琼脂糖凝胶电泳测定切割产物，以测定上面定义的保真度指数。

不是所有的限制性内切核酸酶都具有显著的星号活性，如从它们的FI确定的。然而，如果内切核酸酶具有不超过大约250的最高FI和小于100的最低FI，那么该限制性内切核酸酶被分类为具有显著的星号活性。这样的内切核酸酶被选为酶工程的标靶以增加对单一底物的保真度。在一些情况中，具有FI大于约500和FI小于约100的限制性内切核酸酶也被工程化以获得更好的切割活性。

下面表2列出一些工程化限制性内切核酸酶在工程化之前的FI。所有的样品在0.8％琼脂糖凝胶上进行分析。

表2

*底物：λ是λ噬菌体DNA；λ(H3)是HindIII-消化的λ噬菌体DNA；pXba是pUC19，具有XbaI-消化的腺病毒片段；pBC4：较短形式的pXba；T7：T7DNA

**FI-1到FI-4：NEB缓冲液1、2、3和4中的酶的保真度指数。括号中的数是与缓冲液组的任何缓冲液中突变体限制性内切核酸酶的“最好”切割活性相比，在该缓冲液组的指定缓冲液中同一突变体限制性内切核酸酶的相对切割活性的值。

NEB缓冲液的组成如下：

NEB1：10mMBisTris丙烷-HCl、10mMMgCl₂、1mM(25℃下，pH7.0)；

NEB2：50mMNaCl、10mMTris-HCl、10mMMgCl₂、1mM二硫苏糖醇(25℃下，pH7.9)；

NEB3：100mMNaCl、50mMTris-HCl、10mMMgCl₂、1mM二硫苏糖醇(25℃下，pH7.9)；

NEB4：50mM乙酸钾、20mMTris-乙酸盐、10mM乙酸镁、1mM二硫苏糖醇(25℃下，pH7.9)。

***NEB稀释剂的组成如下。(在稀释中使用稀释剂代替水将保持反应中甘油浓度为常数。)

稀释剂A：50mMKCl、10mMTris-HCl、0.1mMEDTA、1mM二硫苏糖醇、200mg/mlBSA。50％甘油(25℃下，pH7.4)；

稀释剂B：300mMNaCl、10mMTris-HCl、0.1mMEDTA、1mM二硫苏糖醇、500mg/mlBSA、50％甘油(25℃下，pH7.4)；

稀释剂C：250mMNaCl、10mMTris-HCl、0.1mMEDTA、1mM二硫苏糖醇、0.15％TritonX-100、200mg/mlBSA、50％甘油(25℃下，pH7.4)。

2.高表达宿主细胞株的构建

如果宿主细胞能过表达针对其寻找减少星号活性的突变体限制性内切核酸酶，这是方便的。如果该限制酶在大肠杆菌中高度表达，那么星号活性可以容易在粗提物中检测到，这简化了高保真度限制性内切核酸酶的筛查。然而，突变的限制性内切核酸酶可以在任何宿主细胞中表达，条件是宿主细胞以某些方式被保护免于从酶切割产生的毒性。这可能包括：甲基化酶的存在；在提供接近基因组的屏障的细胞区室(例如包含体或周质)中产生；体外合成；在缺少宿主基因组中的切割位点的情况下在乳液(参见美国专利申请序列号12/035,872)中产生；在经受内含肽介导的连接的构成部件中制造酶，等。

为了生产，突变限制性内切核酸酶的过表达可以使用标准克隆技术来实现，例如使用大肠杆菌(E.coli)宿主，将内切核酸酶插入pUC19-衍生的表达载体，这是高拷贝的；和使用相对小的质粒，其能持续表达重组蛋白质。该载体可优选地含有适当的启动子例如lac启动子和邻近该启动子定位的多拷贝插入位点。可选地，可以选择需要基因表达的IPTG诱导的启动子。如果粗提物中的活性不是足够的，那么在粗提物中限制性内切核酸酶的柱纯化步骤可被进行。

3.限制性内切核酸酶的诱变

编码限制性内切核酸酶内的每个带电荷的基团或极性基团的DNA可以被单独靶向，并且突变的DNA被克隆并制备进行检测。可将多突变引入单独的限制性内切核酸酶基因。限制性内切核酸酶的靶向诱变可通过本领域已知的方法完成。本文使用的一个便利的方法是反向PCR。在该方法中，合成含有靶向密码子加在该密码子5’和3’侧上的多个核苷酸(例如18nt)的互补引物对。通过评估目的氨基酸残基周围的目的内切核酸酶的基因序列，可容易地完成适当引物的选择。通过REBASE和GenBank提供对基因序列的访问。本文在实施例中描述的内切核酸酶的序列在图31到38和44中提供。PCR的模板是含有限制性内切核酸酶基因的质粒。优选地，聚合酶为高保真度聚合酶，例如或DeepVent^TMDNA聚合酶。通过改变退火温度和Mg²⁺浓度，可以实现大多数突变的成功引入。然后，纯化并优选通过DpnI消化PCR扩增产物。在本发明的一个实施方式中，将消化的产物转化入感受态宿主细胞(例如大肠杆菌)，其已经使用相应的甲基化酶预修饰。来自每个突变体的菌落被挑选并在与WT生长条件相似的条件下生长(例如，使用相似的生长培养基、药物选择和温度)。针对减少的星号活性，筛查所得限制性内切核酸酶。

4.筛查具有减少的星号活性的突变体限制性内切核酸酶

条件例如缓冲液组成、温度和稀释剂应该被限定，以测定突变体限制性内切核酸酶中的星号活性。表2和3示出重组内切核酸酶在37℃下使用三种不同的稀释剂在四种不同的缓冲液中突变之前和之后的FI。因此，可能确定哪些突变体具有至少2、超过10、至少50或超过500的总的希望提高的保真度指数因子并且选择酶作为优选的高保真度突变体。

在本发明的一个实施方式中，首先，在正常缓冲液条件下(不超过5％甘油)，筛查突变体限制性内切核酸酶的活性。对于那些具有至少大约10％的WT限制性内切核酸酶活性的突变体，在促进星号活性的星号活性提高条件下——例如高甘油浓度和任选地高pH下，也测定活性。优选地，选择在正常的缓冲液中具有最小星号活性但是具有可接受的同源活性的突变体。然后，可提取质粒并测序，以验证该突变体。在一些情况中，星号活性不容易测量——甚至在高甘油和高pH条件下。替代地，测量和比较不同缓冲液中的活性，并且NEB4与NEB3切割活性比率最高的突变体可进一步针对星号活性改进进行检测。

5.对一个单个残基的饱和诱变

如前面部分所述的，第一步是将限制性内切核酸酶中的靶氨基酸突变为Ala。如果该结果不令人满意，那么进行饱和诱变。优选地，这通过两个方法之一进行。一个方法是将意图密码子改为NNN。诱变后，在正常条件下和促进星号活性的条件下分析多个菌落。可选地，可以选择不同的密码子，用于进行下列靶氨基酸的每一个的诱变，例如：Ala：GCT；Cys：TGC；Asp：GAC；Glu：GAA；His：CAC；Ile：ATC；Lys：AAA；Leu：CTG；Met：ATG；Asn：AAC；Pro：CCG；Gln：CAG；Arg：CGT；Ser：TCC；Thr：ACC；Val：GTT；Trp：TGG和Tyr：TAC。

6.组合

如果单一突变不充分减少星号活性，那么可以将超过一个的突变引入限制性内切核酸酶基因。突变组合和饱和诱变可以以任何顺序进行。

7.突变体纯化和改进的评估

高保真度突变体可以以多种方式纯化，其包括使用不同的色谱柱。对于常规的质量评估，一个FPLC肝素柱足以从该制品除去DNA和非特异性核酸酶。包括离子交换柱、疏水柱、大小排阻柱和亲和柱的多个柱可被用于进一步纯化。

在四种NEB缓冲液中，测量纯化的高保真度限制性内切核酸酶的FI，并且将其与WT限制性内切核酸酶的FI进行比较。高保真度限制性内切核酸酶在其最佳缓冲液中的FI与WT的FI的比率是总改进因子。

表3-示例性限制性内切核酸酶的FI*

*FI是不示出星号活性的最高浓度与完全消化底物的最低浓度的比率。

**括号中的数是与缓冲液组的任何缓冲液中突变体限制性内切核酸酶的最大切割活性相比，在该缓冲液组的指定缓冲液中同一突变体限制性内切核酸酶的相对切割活性的值。

表4-提供具有高保真度的限制性内切核酸酶的突变

对每种酶的突变通过分号分开。

所有上面和下面引用的参考文献，以及美国临时申请序列号60/959,203，被通过引用并入。

实施例

在氨基酸用单字母代码表示时，这拟为标准命名。该代码的解答例如在NEB目录2007/2008第280页上提供。

被用来克隆和作为底物的质粒具有如下序列：

pLaczz2(SEQIDNO：102)、pSyx20-lacIq(SEQIDNO：105)、pBC4(SEQIDNO：103)、pXba(SEQID.NO：104)和pAGR3(SEQIDNO：106)。pACYC在GenBankXO6403中描述，T7在GenBankNC001604中描述，pUC18在GenBankL09136中描述，和pRRS在Skoglundetal.Gene，88：1-5(1990)中描述。pSX33通过将lacI基因插入pLG339中EcoRI位点处进行构建。pLG339在Stoker，etal.Gene19，335-341(1982)中描述。

本文使用的称为NEB缓冲液的所有缓冲液可从NewEnglandBiolabs，Inc.(NEB)，Ipswich，MA获得。

实施例1：工程化高保真度BamHI

1.提取包含BamHI甲基化酶和BamHI内切核酸酶的质粒

用pUC18-BamHIR和pACYC184-BamHIM转化感受态大肠杆菌宿主细胞，并且通过使用标准小量制备技术的标准Qiagen小量制备方法(Qiagen，Valencia，CA)提取BamHIR。

2.诱变靶的选择

克隆并测序BamHI和相关的限制性内切核酸酶OkrAI。如果反应在37℃下、在NEB缓冲液(1、2和4)中进行，那么发现OkrAI具有显著的星号活性。本分析检验如此假设：作为星号活性原因的氨基酸残基(一个或更多个)在BamHI和OkrAI内切核酸酶之间是相似的。

BamHI的完整蛋白序列(SEQIDNO：19)为：

OkrAI的完整蛋白序列(SEQIDNO：20)为：

通过GCG对BamHI和OkrAI内切核酸酶的蛋白序列的“最佳拟合(Bestfit)”相似性分析示出下列结果，其中上面的蛋白序列是BamHI，下面的蛋白序列是OkrAI：

bamhir.pepxokrair.pep

发现BamHI中相似的带电荷的残基(D、E、H、K、R)是E28、K30、K52、K61、E77、K84、E86、K88、D94、K97、K106、E111、E113、H121、R122、K126、K146、D154、R155、E161、E163、E170、E182、K193、D196和R201。在上面的比较中，这些残基被加下划线。已知的突变体E77K、D94N、E111K和E113K以前被报道为失活的(Xu,Shuang-yongetal.J.Bacteriol.266:4425-4429(1991))，所以排除它们。最初的诱变选择靶向22个共有的带电荷的氨基酸残基，将其突变为丙氨酸：E28A、K30A、K52A、K61A、K84A、E86A、K88A、K97A、K106A、H121A、R122A、K126A、K146A、D154A、R155A、E161A、E163A、E170A、E182A、K193A、D196A和R201A。

3.BamHI的诱变

选择突变的点诱变通过反向PCR进行。将相应密码子全部变为GCA(丙氨酸)。

下列引物用于诱变：

E28A

5’ATTCAACAAGCATACAATGCAGTTAAAACATCTATTGT3’

(SEQIDNO:23)

5’ACAAATAGATGTTTTAACTGCATTGTATGCTTGTTGAAT3’

(SEQIDNO:24)

K30A

5’CAAGCATACAATGAAGTTGCAACATCTATTTGTTCACCT3’

(SEQIDNO:25)

5’AGGTGAACAAATAGATGTTGCAACTTCATTGTATGCTTG3’

(SEQIDNO:26)

K52A

5’ACGATTAACAACACCGAAGCAAATTGTAACGGTGTAGTA3’

(SEQIDNO:27)

5’TACTACACCGTTACAATTTGCTTCGGTGTTGTTAATCGT3’

(SEQIDNO:28)

K61A

5’AACGGTGTAGTACCAATTGCAGAACTATGTTACACCTTA3’

(SEQIDNO:29)

5’TAAGGTGTAACATAGTTCTGCAATTGGTACTACACCGTT3’

(SEQIDNO:30)

K84A

5’AACCCCCTTGATATACTTGCACTTGAAAAGAAAAAAGGT3’

(SEQIDNO:31)

5’ACCTTTTTTCTTTTCAAGTGCAAGTATATCAAGGGGTTT3’

(SEQIDNO:32)

E86A

5’GATATACTTAAACTTGCAAAGAAAAAAGGTGGTCCG3’

(SEQIDNO:33)

5’CGGACCACCTTTTTTCTTTGCAAGTTTAAGTATATCAAG3’

(SEQIDNO:34)

K88A

5’ATACTTAAACTTGAAAAGGCAAAAGGTGGTCCGATTGAT3’

(SEQIDNO:35)

5’ATCAATCGGACCACCTTTTGCCTTTTTCAAGTTTAAGTAT3’

(SEQIDNO:36)

K97A

5’GGTCCGATTGATGTTTATGCAGAGTTCATAGAAAACAGT3’

(SEQIDNO:37)

5’ACTGTTTTCTATGAACTCTGCATAAACATCAATCGGACC3’

(SEQIDNO:38)

K106A

5’ATAGAAAAACAGTGAACTTGCACGTGTAGGTATGGAA3’

(SEQIDNO:39)

5’AAATTCCATACCTACACGTGCAAGTTCACTGTTTTCTAT3’

(SEQIDNO:40)

H121A

5’GGAAATATTAGTTCTGCCGCACGTTCAATGAACAAACTT3’

(SEQIDNO:41)

5’AAGTTTGTTCATTGAAACGTGCGGCAGAACTAATATTCC3’

(SEQIDNO:42)

R122A

5’AATATTAGTTCTGCCCACGCATCAATGAACAAACTTCTA3’

(SEQIDNO:43)

5’TAGAAGTTTGTTCATTGATGCGTGGGCAGAACTAATATT3’

(SEQIDNO:44)

K126A

5’GCCCACCGTTCAATGAACGCACTTCTATTAGGATTAAAACAT3’

(SEQIDNO:45)

5’ATGTTTTAATCCTAATAGAAGTGCGGTCATTGAACGGTGGGC3’

(SEQIDNO:46)

K146A

5’ATTATCCTTATGCCTATTGCACAATTGGCCTATTATCTT3’

(SEQIDNO:47)

5’AAGATAATAGGCCAATTGTGCAATAGGCATAAGGATAAT3’

(SEQIDNO:48)

D154A

5’TTGGCCTATTATCTTACAGCACGTGTTACCAATTTCGAG3’

(SEQIDNO:49)

5’CTCGAAATTGGTAACACGTGCTGTAAGATAATAGGCCAA3’

(SEQIDNO:50)

R155A

5’GCCTATTATCTTACAGATGCAGTTACCAATTTCGAGGAA3’

(SEQIDNO:51)

5’TTCCTCGAAATTGGTAACTGCATCTGTAAGATAATAGGC3’

(SEQIDNO:52)

E161A

5’CGTGTTACCAATTTCGAGGCATTAGAACCTTATTTTGAA3’

(SEQIDNO:53)

5’TTCAAAATAAGGTTCTAATGCCTCGAAATTGGTAACACG3’

(SEQIDNO:54)

E163A

5’ACCAATTTCGAGGAATTAGCACCTTATTTTGAACTTACT3’

(SEQIDNO:55)

5’AGTAAGTTCAAAATAAGGTGCTAATTCCTCGAAATTGGT3’

(SEQIDNO:56)

E170A

5’CCTTATTTTGAACTTACTGCAGGACAACCATTTATTTTTATT3’

(SEQIDNO:57)

5’AATAAAAATAAATGGTTGTGCTGCAGTAAGTTCAAAATAAGG3’

(SEQIDNO:58)

E182A

5’TTTATTTTTATTGGATTTAATGCTGCAGCTTATAATTCTAATGTC3’

(SEQIDNO:59)

5’GACATTAGAATTATAAGCTGCAGCATTAAATCCAATAAAAATAAA3’

(SEQIDNO：60)

K193A

5’AATGTCCCTTTAATTCCCGCAGGTTCTGACGGTATGTCA3’

(SEQIDNO：61)

5’TGACATACCGTCAGAACCTGCGGGAATTAAAGGGACATT3’

(SEQIDNO：62)

D196A

5’TTAATTCCCAAAGGTTCTGCAGGTATGTCAAAACGCTCA3’

(SEQIDNO：63)

5’TGAGCGTTTTGACATACCTGCAGAACCTTTGGGAATTAA3’

(SEQIDNO：64)

R201A

5’TCTGACGGTATGTCAAAAGCATCAATTAAGAAATGGAAA3’

(SEQIDNO：65)

5’TTTCCATTTCTTAATTGATGCTTTTGACATACCGTCAGA3’

(SEQIDNO：66)

PCR反应的反应体积为100μl，包含2μl的每种PCR引物、1μlpUC18-bamhiR、400μMdNTP、4单位的DeepVent^TMDNA聚合酶和10μl10x含有0、2或6μlMgSO₄的Thermopol缓冲液加余量的水。

PCR反应条件是94℃进行5min，然后25个循环的94℃30sec、55℃30sec、72℃4min，并且在72℃下最后延伸时间为7mins。PCR产物在标准Qiagen离心柱(Qiagen，Valencia，CA)上纯化。用20单位的DpnI消化6到16μl的PCR产物1小时。将消化的产物转化入大肠杆菌(pACYC-bamHIM)。

6个PCR反应后，获得工程化的22种突变中的14种：E28A、K30A、K61A、E86A、K97A、H121A、K126A、K146A、E161A、E163A、E170A、E182A和R201A。从过夜培养物中的细胞溶胞产物中提取突变体蛋白质，并且将其活性与WTBamHI比较。在有或者没有5％甘油的NEB2缓冲液中，分析正常的酶活性，而在具有39.2％甘油的NEB2中测定星号活性，尽管最初可以使用较低百分比的甘油。用于不同的反应的底物是pBR322、pUC19或λDNA。切割反应在37℃下进行30分钟或1小时。发现突变体K97A、H121A、K126A、E161A、E182A、R201A是失活的(小于1％的WTBamHI活性)，而E28A、K146A、E163A、E170A突变体具有与WT酶相似水平的包括星号活性在内的活性。发现与WTBamHI相比，三种突变体K30A、E86A和K126A具有显著减少的星号活性。也发现K30A和E86A具有与WT酶相似的总切割活性，同时其示出星号活性明显减少。相反，K126A仅具有25％的总WT酶切割活性，并且与对K30A和E86A观察到的星号活性相比具有较不显著的改进。

对pUC18-bamHIR质粒再检查显示正常的高拷贝质粒已突变为低拷贝质粒。设计引物对以将bamHIR基因转移入高拷贝质粒：

5’GGTGGTGCATGCGGAGGTAAATAAATGGAAGTAGAAAAAGAGTTTATTACT

GAT3’(SEQIDNO：67)

5’GGTGGTGGTACCCTATTTGTTTTCAACTTTATCTTTCCATTTCTTAATTGA3’

(SEQIDNO：68)

模板是pUC18-bamhIRWT，其在K30A、E86A或K126A处带有突变。PCR组合物包含：5μl模板、2μl每种引物、400μMdNTP、10μl10xThermopol缓冲液、4单位2μlDeepVent^TM聚合酶、72μlH₂Q加0、2、6μlMgSQ₄。PCR条件是94℃持续5min，然后94℃30sec、55℃30sec和72℃40sec进行25个循环和7分钟的最终延伸时期。使用SphI和KpnI消化PCR产物，将其连接至具有相同的酶消化对的pUC19。将连接的产物转化入含有pACYC-bamHIM的感受态大肠杆菌。含有BamHIRK30A的pUC19形式的26个菌落和含有E86A的那些的12个被鉴定并生长。检查来自这些培养物的BamHI的活性。所有它们都具有活性。提取来自每个突变的五个菌落的质粒并且来自每个突变的3个的BamHIR质粒被测序。证实质粒pUC19-BamHI(K30A)和pUC19-BamHI(E86A)的身份(identity)。

使用pUC19-BamHI(K30A)载体重复那些在pUC18-BamHIR中不成功的突变。PCR混合物包含：1μl模板和含有2μl每种引物、400μMdNTP、10μl10xThermopol缓冲液、4单位2μlDeepVent^TM聚合酶、76μlH₂Q加0、2、6μ1100μMMgSO₄的扩增混合物。PCR条件是94℃持续5min，然后94℃30sec、55℃30sec和72℃3分30秒进行25个循环和7分钟的最终延伸时期。使用DpnI消化PCR产物，并且将其转化入用pACYC-BamHIM转化的感受态大肠杆菌。在pUC19底物上检测酶活性。反应组合物为：3μl细胞提取物、3μlNEB2、3μl50％甘油、0.5μl0.5μgpUC19、20.5μlH₂O。该反应在37℃下进行1小时。K30A/R122A、K30A/R155A和K30A/K193A是失活的。K30A/K52A和K30A/K88A是K30A活性的大约1/10。K30A/K106A、K30A/D154A和K30A/D196A的正常活性与K30ABamHI的活性相似。这三种突变体与K30A在高浓度甘油(39.2％)下的星号活性的比较显示K30A/D196A具有与K30A相似的星号活性，K30A/D154A甚至具有比K30A更多的星号活性，并且K30A/K106A具有比K30A更少的星号活性。因为细胞毒性，分离在pUC19载体中的BamHI的K106A突变的尝试失败。

使用反向PCR，组合在K30、E86和K106位点上的突变：K30A/E86A、E86A/K106A、K30A/K106A和K30A/E86A/K106A。K30A/E86A表现为优选的突变体。纯化后，发现BamHI突变体的FI在所有NEB缓冲液中提高25％。

在K30和E86位点上，随机进行进一步诱变：

对K30：

5’CAAGCATACAATGAAGTTNNNACATCTATTTGTTCACCT3’

(SEQIDNO：69)

5’AGGTGAACAAATAGATGTNNNAACTTCATTGTATGCTTG3’

(SEQIDNO：70)

对E86：

5’GATATACTTAAACTTNNNAAGAAAAAAAGGTGGTCCG3’

(SEQIDNO：71)

5’CGGACCACCTTTTTTCTTNNNAAGTTTAAGTATATCAAG3’

(SEQIDNO：72)

PCR组合物是：1μl模板(pUC19-BamHIR(K30A)或pUC19-BamHIR(E86A))并且使用如上描述的扩增混合物。进行PCR：94℃5min，然后94℃30sec、55℃30sec和72℃3分30秒25个循环和7分钟的最终延伸时期。通过DpnI消化PCR产物，并将其转化入大肠杆菌(pACYC-BamHIM)。

对K30随机突变选取共155个菌落，和对E86位点选取158个菌落。将菌落生长过夜并制成细胞提取物。在具有42.5％甘油的NEB2缓冲液中用1μl细胞提取物在37℃下，消化0.5μgpUC19，1小时。在具有39.2％甘油的NEB2缓冲液中，具有明显更少星号活性的细胞提取物在37℃下在1、4、16倍稀释下对0.5μgpUC19进行重新分析30分钟。对于观察到具有减少星号活性的那些突变体，提取相应的质粒并且测序以证实突变。总共3个克隆(#12、#66和#82)含有K30突变，并且总过33个克隆(#5、#15、#16、#19、#29、#47、#51、#55、#56、#58、#61、#69、#71、#73、#76、#82、#86、#88、#93、#94、#97、#98、#100、#104、#107、#113、#117、#118、#129、#132、#136、#139和#151)被测序。测序后，发现#12和#66含有K30G突变，和#82含有K30N突变。令人惊奇地，所有33个突变是E86P突变，恰好在不同的密码子中(CCA、CCT、CCC、CCG)。在这些密码子中，CCG在大肠杆菌以最高频率发生(克隆#98、#136和#139)。

相应于K30G、K30N和K30A的细胞提取物被连续稀释为1、2、4、8、16和32倍，而E86P和E86A被连续稀释1、2、4、8、16、32、64、128和256倍。连续稀释的提取物与0.5μgpUC19在具有39.2％甘油的NEB2中在37℃下反应30分钟。在极端的条件下，E86P显示比其他突变体更优良。在上至32倍消化下，没有明显星号活性带。E86P和K30突变体(K30G、K30N和K30A)之间的差异是如此大以致不另外需要在E86P突变体中组合这些突变中的任一个。

对1μgλDNA——底物——测定BamHI(E86P)活性(也用于WTBamHI活性测定)。在NEB1缓冲液中，在37℃下，进行分析1小时。

4.BamHI(E86P)和WTBamHI的详细比较

A.不同NEB缓冲液中BamHI(E86P)的活性

使用λDNA底物在37℃下，在NEB1、NEB2、NEB3、NEB4和NEBBamHI缓冲液中测定纯化的BamHI(E86P)的活性1小时。BamHI(E86P)在NEB1缓冲液和NEB2中是最有活性的，而在NEB3、NEB4和BamHI缓冲液中具有50％、50％和25％的活性水平。

B.比较BamHI(E86P)和WTBamHI对pUC19的切割活性

在pUC19中具有一个GGATCC位点(BamHI位点)和6个AGATCC位点(BamHI星号活性位点)，所以pUC19被选择作为比较BamHI(E86P)和WTBamHI的优选底物。

在不同的缓冲液中，用NEB稀释缓冲液A以1、3、9、27、81、243、729、2181、6561和19683倍连续稀释的WTBamHI和BamHI(E86P)消化0.5mgpUC19。WTBamHI示出每种NEB正常缓冲液中的星号活性，而BamHI(E86P)根本没有示出星号活性带(图2-5)。这证明BamHI(E86P)已经极大地减少星号活性，同时保持同源切割活性。

C.BamHI(E86P)和WTBamHI对λDNA底物切割活性的比较

为了计算保真度指数，用稀释缓冲液稀释限制酶，并且将甘油浓度恒定保持在5％。在本文使用的标准反应条件中，λDNA底物浓度为1μg，并且总反应体积为50μl。为了保持酶体积为10％，酶以5μl的体积加入。这等于在30μl总体积中3μl限制酶消化的0.6μg的底物。在NEB1、NEB2、NEB3、NEB4和NEBBamHI缓冲液中，从1到32768的1∶2连续稀释的3μlWTBamHI和BamHI(E86P)在37℃下对0.6mgλDNA消化1小时。

表5：在不同缓冲液中，WT和突变体BamHI的保真度指数

5.针对高保真度突变体的BamHI的进一步改进

在一小时水平，BamHI(E86P)表现为好的高保真度BamHI突变体。然而，尽管E86P的星号活性在一小时没有检测到，但是当延长反应时间时(例如过夜或14小时)，星号活性带出现。(图3)。继续进行对改进高保真度BamHI的研究。

6.其他带电荷的和极性残基的突变

在SEQIDNO：19中位置2、4、5、6、10、11、13、14、18、19、20、43、51、62、69、70、76、77、78、81、87、89、94、98、101、104、107、111、113、132、133、135、137、160、167、200、204、205、207、208、209、211、213处，将其他带电荷的残基(Arg、Lys、His、Asp、Glu)突变为Ala。在pUC19-BamHI(K30A)的模板上进行突变。

在SEQIDNO：19的位置9、17、26、32、36、41、42、44、46、50、65、66、71、72、75、96、103、114、118、119、123、150、151、153、157、165、169、184、186、195、199、202处，将其他极性残基(Ser、Thr和Tyr)突变为Ala，而将Tyr突变为Phe。

通过使用相似的突变和筛查方法，发现下列突变具有减少的星号活性：K30A/K87A、E86P/K87E、E86A/Y165F和K30A/E167A。鉴定E86P/K87E为在存在另外的DMSO情况下具有改进性质的突变体。然而，在正常反应缓冲液中该突变体的活性比WTBamHI的活性低得多。

进行下列突变组合：E86P/Y165F、E86P/E167A、E86P/Y165F/E167A、K30A/Y165F/E167A、K30G/Y165F/E167A、K30A/Y165F/E167A、E86A/Y165F/E167A。它们都具有低活性。

到现在为止，发现对BamHI星号活性，E167A和Y165F具有强效果，K87A具有中等效果，以及K30A和E86A具有弱效果。E86P是在1小时水平而非过夜地减少星号活性的特异性突变。

7.将E167和Y165突变为所有其他残基

在pUC19-BamHI中，将E167突变为所有其他的残基，这通过将密码子改变为GCA——Ala、TGC——Cys、GAC——Asp、TTC——Phe、GGT——Gly、CAC——His、ATC——Ile、AAA——Lys、CTG——Leu、ATG——Met、AAC——Asn、CCG———Pro、CAG——Gln、CGT——Arg、TCC——Ser、ACC——Thr、GTT——Val、TGG——Trp和TAC——Tyr进行。

在比较所有的突变体之后，优选E167T突变，而与E167A相比，E167R、E167K、E167L和E167I突变示出在减少星号活性方面的改进。

也将Y165突变为所有其他氨基酸残基，这通过将相应的密码子改变为GCT——Ala、TGC——Cys、GAC——Asp、GAA——Glu、GGT——Gly、CAC——His、ATC——Ile、AAA——Lys、CIG——Leu、ATG——Met、AAC——Asn、CCG——Pro、CAG——Gln、CGT——Arg、TCC——Ser、ACC——Thr、GTT——Val、TGG——Trp进行。

在比较所有的突变体之后，Y165F的存在导致显著的切割活性，而刚刚在上文列出的其他突变示出低活性或没有切割活性。

8.对BamHI(E167T)进一步突变

在puc19-BamHI(E167T)的模板上，将所有带电荷的和极性残基突变为Ala，方法同上。

作为优选突变，将E163A/E167T鉴定为BamHI-HF。

9.BamHI-HF与WTBamHI的比较

在E163处引入突变产生减少热稳定性的BamHI突变体，这与突变P173A被加入其他负责减少星号活性的突变时一样。

与BamHI(E86P)不同，BamHI-HF在NEB1-4缓冲液中过夜反应没有显著的星号活性。图4示出在NEB1和NEB2中的结果。因此，选择BamHI(E163A/E167T)为优选的高保真度BamHI。

在37℃下，在所有四种NEB缓冲液中，用稀释剂A，在λDNA底物上，测量BamHI-HF的保真度指数，并且与WT酶比较。

表6：BamHI-HF和WTBamHI的比较

在NEB1中，BamHI-HF具有最高的活性，保真度指数为≥8000，在NEB2和NEB3中，WTBamHI具有最高的活性，并且最高的FI为32。总FI改进因子——其为每种突变体和WT酶在最好的缓冲液中的FI的比率，是≥8000/32＝250倍。

10.BamHI的另外突变

预测E163A/E167T/P173A具有优选的星号活性减少，并且另外是热不稳定的。

检测(E86P/K87S/K88P/E163S/E170T/P173A)。该突变体在比活性方面显示10倍减少，而具有来自宿主细胞的补偿增加的蛋白质产率。

共享减少的热稳定性、减少的星号活性和可接受的比活性的其他BamHI突变体包括：

E86P/K87R/K88G/E163S/E170T/P173A

E86P/K87P/K88R/E163S/E170T/P173A/E211K

E86P/K87T/K88R/E163S/E170T/P173A/N158S

E86P/K87S/K88P/E163S/E170T/P173A

E86P/K87G/K88S/E163S/E170T/P173A

E86P/K87R/K88Q/E163S/E170T/P173A

实施例2：制备高保真度EcoRI

1.EcoRI的表达

对EcoRI的PCR使用下列引物：

GGTGGTGCATGCGGAGGTAAATAAATGTCTAATAAAAAACAGTCAAATAGGCTA(SEQIDNO：73)

GGTGGTGGTACCTCACTTAGATCTAAGCTGTTCAAACAA

(SEQIDNO：74)

然后，用第二对限制性内切核酸酶——SphI和Acc65I——消化PCR产物，并且连接入用同样的第二对限制性内切核酸酶消化的pUC19。然后，连接的质粒被转化入用pACYC-MlucIM预修饰的感受态大肠杆菌。

2.EcoRI的诱变

靶氨基酸残基的最初选择是EcoRI与其同切点酶RsrI比较的结果，RsrI的星号活性也是已知的。

EcoRI对RsrI

除了D91、E111和K113——其为已知的活性中心残基，在两种内切核酸酶中，42个带电荷的残基是相同或相似的。带电荷的残基如下：

K4、R9、K15、K29、H31、D32、E37、E49、R56、R58、K63、E68、K71、D74、K89、E96、K98、K99、R105、H114、D118、K130、D133、D135、E144、R145、H147、K148、E152、E160、H162、E170、E177、R183、D185、R200、D202、R203、E253、R264、D269。

将所有这些带电荷的残基突变为Ala(密码子GCA、GCT、GCC或GCG)，并且突变的基因被如下扩增和克隆：

扩增混合物与在实施例1中使用的扩增混合物相同(2μl每种PCR引物，400mMdNTP，4单位DeepVentDNA聚合酶，具有另外0、2、6μlMgSO₄的10μl10xThermopol缓冲液，并且总反应体积为100μl)，并且加入到1μlpUC19-EcoRI中。

PCR反应条件为94℃持续5min，然后25个循环的94℃30sec、55℃30sec、72℃3分30秒，并且在72℃下最后延伸时间为7min。PCR后，产物通过标准Qiagen离心柱(Qiagen，Valencia，CA)纯化。用20单位的DpnI消化16μl的PCR产物1小时。将消化的产物转化入甲基化酶保护的感受态大肠杆菌制品。

3.筛查EcoRI高保真度突变体

对每一突变选取3个菌落，并且在具有氨苄青霉素和氯霉素的LB中生长过夜。对pBR322和λDNA进行活性分析以确保突变体与WTEcoRI至少具有相似的活性。然后，使用2倍连续稀释的3μl的细胞抽提物、12μl50％甘油、3μlNEB1缓冲液、0.5μlpBR322和11.5μl水，检测这些突变体，其在37℃下反应1小时。然而，没有突变改进星号活性的性能。

从该结果，推导出在同切点酶之间有效突变不总是被识别为同源残基。

4.对剩余的32个带电荷的残基重复诱变

如在步骤2中所述的，通过靶向氨基酸残基5、12、14、26、40、43、44、59、62、65、72、76、100、103、117、123、131、192、221、225、226、227、228、242、244、245、247、249、257、268、272和277，将所有剩余的32个带电荷的残基突变为Ala。

上面的数字相应于EcoRI蛋白序列(SEQIDNO：83)中的氨基酸位置。

5.重复选择

从含有不同类型突变的每种样品中选取四个菌落，并且在4ml具有CAM的LB中生长。超声处理后，在NEB1缓冲液中在正常甘油条件下，在λDNA底物上检测细胞提取物。通过在3μlNEB2缓冲液中加入2倍连续稀释的3μl细胞提取物至0.5μl的pUC19和23.5μl50％甘油以在反应混合物中提供39.2％甘油的终浓度，具有相似活性的那些提取物在pUC19底物上再次检测。

在所有这些突变体中，发现K62A是具有最少星号活性和高FI的突变。R9A、K15A、R123A、K130A、R131A、R183A突变体都示出星号活性的部分减少。令人感兴趣地，含有靶向突变K5A的一个克隆示出部分改进。另外地，测序后，发现第二突变S2Y。分离这两个突变显示该分离物有效的突变是S2Y。D135A和R187AEcoRI也具有少得多的星号活性。然而，这些突变体的切割活性不是最佳的。

6.EcoRI(K62A)与WTEcoRI的比较

通过在四种不同NEB缓冲液中消化0.6μg的λDNA，在使用NEB稀释缓冲液C进行3倍连续稀释中进行并行比较(图6)。EcoRI(K62A)具有实质上比WTEcoRI小的星号活性。

通过测定EcoRI(K62A)和WTEcoRI的保真度指数量度，进行更定量的比较。保真度指数测量的条件与表2相同，其使用λDNA作为底物并使用稀释缓冲液C。该反应在37℃温育1小时，并且在0.8％琼脂糖凝胶上分析消化产物。

表7：EcoRI(K62A)和WTEcoRI的保真度指数

7.EcoRI的进一步突变

尽管对于λDNA底物，EcoRI(K62A)并不明显具有星号活性，但是使用Litmus28底物在10小时消化之后观察到星号活性。与EcoRI缓冲液中的WTEcoRI相比，NEB4中的EcoRI(K62A)具有显著减少的星号活性(图7)。

研究进一步的改进。通过如在实施例1中将K改变为相应密码子，将EcoRI(K62)突变为所有其他的氨基酸残基。K62S和K62L与K62A相似。当与EcoRI(K62A)相比时，EcoRI(K62E)具有≥100倍总保真度指数改进因子，如在图6中所示。EcoRI(K62E)被命名为EcoRI-HF。

8.EcoRI-HF和WTEcoRI的比较

通过在稀释剂C中EcoRI-HF和WTEcoRIA上的FI测量，进行定量比较。FI测量的条件与表2中相同，其使用λDNA作为底物。反应条件是37℃持续1小时，并且在0.8％琼脂糖凝胶上分析结果(图8)。

表8：EcoRI-HF和WTEcoRI的比较

发现总保真度指数改进因子为64倍(EcoRI-HF在NEB4中的16000比NEB3中WTEcoRI的250)。

实施例3：工程化高保真度ScaI

1.ScaI的表达

ScaI限制性内切核酸酶和甲基化酶的序列在REBASE和GenBank中描述，并且在图44(SEQIDNO：97)中提供。将表达这些酶的基因插入质粒以分别产生pRRS-ScaI和pACYC184-ScaIM。然后，将pACYC184-ScaIM转化入感受态大肠杆菌宿主细胞。pRRS载体从pUC19得到，并且差异仅仅为存在多克隆位点。将pRRS-ScaIR转化入大肠杆菌(pACYC-ScaIM)以制造表达菌株。铺板和细胞培养在30℃下进行。

2.ScaI的诱变

ScaI具有两种测序的同切点酶：LlaDI和NmeSI。然而，没有已知的关于LlaDI或NmeSI的星号活性的信息，也没有关于这些酶活性位点的任何信息。因此，最初选择在该蛋白质的位置4、8、11、12、14、18、25、27、30、37、39、40、43、46、51、57、61、68、72、74、80、86、97、103、108、112、114、119、120、121、127、128、129、133、135、139、140、141、147、152、156、158、159、161、162、171、172、175、179、182、184、187、172、175、192、193、195、200、222、227处所有58个带电荷的残基进行靶向突变。

上面的数字相应于ScaI蛋白序列(SEQIDNO：97)中的氨基酸位置。

引物设计方法和PCR方法与对实施例1中BamHI和实施例2中EcoRI描述的相似。通过改变退火温度和DNA聚合酶，实现诱变。用DpnI消化PCR产物，并转化入感受态大肠杆菌(pACYC184-ScaIM)。

3.ScaI高保真度突变体的选择

选取来自ScaI突变体的每个突变体的4个菌落，并且在30℃下、4ml具有100μg/mlAmp和33μg/mlCam的LB中生长过夜。将每个细胞培养物进行超声处理，并且在NEB2缓冲液中对λDNA检测活性。明显具有活性的那些以10、100和1000倍稀释再次检验。因为ScaI具有非常显著的星号活性，所以对于突变体对WT限制性内切核酸酶，星号活性带容易比较。具有减少的星号活性的那些用使用NEB稀释缓冲液A进行2倍连续稀释再次检验。对每一突变体测量FI。对于NEB2缓冲液中的WTScaI，FI为1/8。发现具有相似活性水平的四种突变体与WTScaI相比具有大量减少的星号活性。突变体#6-3ScaI与WTScaI相比具有2倍的活性并且FI为4或32倍。#26-2ScaI与WT相比具有2倍的活性并且FI为8或64倍；#28-2ScaI与WT相比具有2倍的活性并且FI为120或1000倍；#54-3与WT具有相似的活性，并且FI为WT的250或2000倍。

四种突变体：#6-3、#26-2、#28-2和#54-3ScaI在存在36.7％甘油的情况下进一步检测消化λDNA底物。#54-3在减少星号活性方面示出比其他3种突变体更大的提高。

在提取质粒后，测序#6-3，并且发现其具有R18A的突变。测序#26-2，并且发现其具有R112A的突变。测序#28-2，并且发现其具有E119A的突变。这些突变被预测到。然而，发现#54-3具有双突变体——H193A/S201F。S201F是在PCR期间发生的自发第二突变，并且位于H193A突变的引物区域外。

为了理解哪个残基主要负责星号活性的减少，使用下列引物，将单一突变(S201F)引入ScaI：

5’-GATTGGGTGGCGCAGAAATTTCAAACGGGCCAGCAGTCG-3’

(SEQIDNO：77)

5’-CGACTGCTGGCCCGTTTGAAATTTCTGCGCCACCCAATC-3’

(SEQIDNO：78)。

证实ScaI(H193A)、ScaI(S201F)和ScaI(H193A/S201F)的序列。在5％和37％甘油水平下，比较三种突变体和WTScaI(图9)。与仅微弱有助于FI的H193A相反，S201F明显有助于FI。然而，这两种突变在提高FI方面表现是加和的。在5％甘油中，S201F没有显示星号活性，但是在37％甘油中显示一些星号活性。在5％甘油中，H193A具有一些星号活性，在37％甘油中具有显著的星号活性。然而，对于这两种突变的组合，在5％或37％甘油中，都没有检测到星号活性。该发现不但示出具有羟基的氨基酸可以是星号活性的主要活性残基，而且该突变的正确组合可以推动保真度提高到非常高的水平。如果带电荷的残基的突变不能改进星号活性，这里观察到对Ser、Thr和Tyr的突变可成功提高保真度指数。将ScaI(H193A/S201F)标记为ScaI-HF。

4.ScaI-HF和WTScaI的比较

37℃下，在不同的NEB缓冲液中，用NEB稀释缓冲液A进行的2.5倍连续稀释下，对4种不同的NEB稀释液中的1μgλDNA，比较ScaI-HF和WTScaI，1小时(图10)。

表9：ScaI-HF与WTScaI的保真度指数的比较

在NEB2和NEB4缓冲液中，ScaI-HF表现最好，其中最好的FI为250；在NEB2缓冲液中，WTScaI表现最好，其中FI为1/8。总FI改进因子为250/(1/8)＝4000。

实施例4：工程化高保真度SalI

1.SalI的表达

SalI在用placzz1-SalIR和pACYC-Hpy166IIM转化的大肠杆菌中表达，其中placzzI是pUC19质粒，其利用lac启动子表达插入到邻近多拷贝位点的限制性内切核酸酶基因。Hpy166IIM保护SalI的外部4个碱基。

2.SalI的诱变

使用在先前实施例中相似的PCR方法，将SalI的86个带电荷的残基突变为Ala：5、6、8、9、12、13、19、27、31、34、35、37、42、43、45、50、60、63、65、67、73、82、83、84、90、93、97、100、101、103、107、109、111、114、116、119、126、129、131、134、140、143、145、147、148、156、157、164、168、172、173、174、180、181、186、190、191、193、210、218、226、232、235、237、238、244、246、250、256、257、258、259、260、261、264、266、271、275、297、300、304、305、306、308、309、311。

上面的数字相应于SalI蛋白序列(SEQIDNO：94)中的氨基酸位置。

突变体在30℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

3.SalI-HF的选择

SalI-HF的选择如在前面实施例中描述的进行。主要差别是SalI的星号活性在粗提物中不能容易地分析——不论在5％甘油或更高甘油浓度中。甘油不仅促进SalI的星号活性，而且极大地抑制同源活性。

在5％甘油和37％甘油中，对HindIII消化的λDNA分析活性突变体。在所有4种NEB缓冲液中，检测突变体#22、#26、#29、#31、#43和#51的切割活性。在不同条件和底物中数轮比较后，发现#31——SalI(R107A)——是优选的突变体，其保留高的切割活性，但是显示大量减少的星号活性。将SalI(R107A)标记为SalI-HF。

4.SalI-HF和WTSalI的比较

测定SalI-HF和WTSalI的FI(图11)。结果如在表10(下面)中所示出的：

表10：SalI-HF和WTSalI的比较

在NEB2和NEB4缓冲液中，SalI-HF表现最好，其中FI都≥2000；WTSalI在NEB3缓冲液中表现最好，其中FI为4。总FI改进因子为≥2000/4＝≥500。

实施例5：工程化高保真度SphI

1.SphI的表达

在大肠杆菌(placzz1-SphIR、pACYC184-CviAIIM)中表达SphI。CviAIIM保护SphI的内部四个碱基。转化的细胞在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.SphI的诱变

使用在实施例1至实施例4中描述的方法，将SphI的所有带电荷的残基突变为Ala。进行共71个突变：3、5、12、18、21、24、25、30、31、35、43、46、51、54、57、58、60、61、72、75、77、78、87、90、91、95、100、104、107、108、110、113、120、123、124、125、129、130、131、139、140、142、146、147、155、157、159、164、170、172、173、175、178、184、186、190、194、196、197、198、206、207、209、212、215、221、227、230、231、232、235。

上面的数字相应于SphI蛋白序列(SEQIDNO：98)中的氨基酸位置。

3.SphI-HF的选择

每种突变的四个菌落在在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。活性选择主要针对NEB2中的5％甘油和30％甘油中的pBR322。使用前面实施例的经验，高保真度SphI的选择是简单的。发现SphI突变体D91A、K100A、D139A和D164A显著减少SphI中的星号活性。在它们中，K100A是具有最小星号活性的优选突变。SphI(K100A)被命名为SphI-HF。

4.SphI-HF和WTSphI的比较

在它们各自优选的缓冲液中，并行进行SphI-HF和WTSphI的比较。使用NEB稀释缓冲液A，将SphI-HF2倍连续稀释，并且在NEB4中反应，使用NEB稀释缓冲液B，将WTSphI2倍连续稀释。对λDNA的消化在图12中进行比较。

表11：SphI-HF和WTSphI的FI的比较

在NEB4中，SphI-HF表现最好，其中FI≥2000；WTSphI在NEB1或NEB2中表现最好，其中优选的FI是64。总FI改进因子为≥32。

实施例6：工程化高保真度PstI

1.PstI的表达

从大肠杆菌(pACYC-HpyCH4VM、pPR594-PstIR)表达PstI。HpyCH4VM保护PstI的内部四个碱基。pPR594是具有Amp抗性和ptac启动子的表达载体。细胞在30℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长，然后通过IPTG诱导培养物过夜。

2.PstI的诱变

使用在先前实施例中描述的方法，将92个带电荷的残基突变为Ala。这些是：8、10、11、14、25、26、38、40、41、44、45、47、58、61、63、66、67、69、73、74、77、78、82、85、88、91、92、94、95、99、104、105、116、119、127、128、136、142、145、146、150、151、152、156、159、169、170、174、176、179、180、184、188、191、197、202、204、207、212、214、217、218、226、227、228、231、236、237、238、239、240、246、251、257、258、261、263、273、282、284、286、287、295、297、302、305、306、309、313、314、319和320。

上面的数字相应于PstI蛋白序列(SEQIDNO：91)中的氨基酸位置。

在用DpnI消化PCR产物后，将样品转化入感受态大肠杆菌(pACYC-HpyCH4VM)，并且在具有Amp和Cam的LB板上生长。

3.PstI-HF的选择

PstI-HF的选择与前面的样品相似。在5％甘油下，在λDNA上检测正常活性酶活性，并且在NEB4缓冲液和20％DMSO的条件下在pBR322底物上检测星号活性。DMSO比相同浓度的甘油更显著地增强星号活性。在选择期间，#26、#56和#65与WT相比，具有减少的星号活性。当对每一个测序时，发现突变为D91A、E204G和K228A/A289V。将突变体#26PstI(D91A)标记为PstI-HF。

4.PstI-HF和WTPstI的比较

在NEB1-4缓冲液中，对λDNA底物，分别测量PstI-HF和WTPstI的FI。稀释缓冲液是NEB稀释缓冲液C。比较如在图13中所示，并且结果在表12(下面)中列出。

表12：PstI-HF和WTPstI的比较

在NEB2和NEB4缓冲液中，PstI-HF表现最好，其中优选的FI为≥2000；WTPstI在NEB3缓冲液中表现最好，其中FI为120。总FI改进因子为≥2000/120＝16倍。

实施例7：工程化高保真度NcoI

1.NcoI的表达

在大肠杆菌(pSYX20-NcoIM、pRRS-NcoIR)中实现NcoI的表达。pRRS是pUC19衍生质粒，并且pSYX20是与pRRS载体相容的低拷贝数质粒。细胞在30℃下，在具有Amp和卡那霉素(Kan)的LB中生长过夜。

2.NcoI的诱变

将NcoI中所有66个带电荷的残基突变为Ala。这些残基是：7、8、19、22、27、30、31、32、33、37、39、42、46、55、56、61、62、64、68、69、75、84、88、89、92、93、95、97、100、116、136、144、146、162、166、170、178、183、185、187、188、189、196、199、202、204、209、211、212、213、216、219、227、229、237、241、244、250、251、257、259、261、268、279、282、285。

上面的数字相应于NcoI蛋白序列(SEQIDNO：88)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后进行DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pSYX20-NcoIM)。

3.NcoI-HF的选择

NcoI-HF的选择与PstI-HF的选择相似。如上所述，在5％甘油下，用λDNA作为底物，检测活性。使用pBR322或λ在19％DMSO中测定星号活性。发现下面的突变改进星号活性：A2T/R31A、D56A、H143A、E166A、R212A和D268A。在这些突变体中，选择NcoI(A2T/R31A)为NcoI-HF。

4.NcoI-HF和WTNcoI的比较

在NEB1-4缓冲液中，对λDNA，分开测定NcoI-HF和WTNcoI的FI。比较在图14中示出，并且结果在表13(下面)中列出。

表13：NcoI-HF和WTNcoI的比较

在NEB4中，NcoI-HF示出最大的星号活性减少，其中优选的FI为≥16000；WTNcoI在NEB1、NEB2和NEB4中表现最好，其中优选的FI为120。总FI改进因子为≥16000/120＝125。

实施例8：工程化高保真度NheI

1.NheI的表达

NheI在用pACYC-NheIM和placzz1-NheIR转化的大肠杆菌中表达。placzz1是pUC19衍生质粒。细胞在30℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.NheI的诱变

将NheI中所有92个带电荷的残基突变为Ala，其为下面的残基：5、6、7、14、17、19、22、25、28、31、38、39、42、47、49、52、56、58、59、60、64、74、75、76、77、80、91、93、104、105、110、112、116、117、123、126、130、131、133、135、137、147、149、152、159、160、165、167、170、171、174、179、183、195、202、205、207、209、210、211、214、216、218、221、225、231、241、243、244、250、252、256、257、259、264、266、267、281、285、287、288、289、291、297、300、307、313、315、318、321、324、325。

上面的数字相应于NheI蛋白序列(SEQIDNO：89)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后进行DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-NheIM)。

3.NheI-HF的选择

根据前面的实施例，进行NheI-HF的选择。标准和星号活性分析包含NEB4缓冲液以及分别5％甘油和39％甘油中的pBR322作为底物。发现仅一种突变显著改进NheI。这是E77A。选择NheI(E77A)作为NheI-HF。

4.NheI-HF和WTNheI的比较

在NEB1-4缓冲液的每一种中，在pXba上，分开测定NheI-HF和WTNheI的FI，pXba是含有来自腺病毒的XbaI消化片段的质粒底物。比较在图15中示出，并且结果在表14(下面)中列出。

表14：NheI-HF和WTNheI的比较

在NEB1缓冲液中，NheI-HF示出最佳活性，其中其FI为≥128,000。WTNheI在NEB1和NEB4缓冲液具有最大的活性，其中其最佳FI是32。所以，总FI改进因子为≥128,000/32＝≥4000。

实施例9：工程化高保真度SspI

1.SspI的表达

从用pACYC-SspIM和placzz1-SspIR转化的大肠杆菌表达SspI。placzz1是pUC19衍生质粒。细胞在30℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.SspI的诱变

将SspI中所有81个带电荷的残基突变为Ala；这些是：3、8、12、13、18、19、20、35、40、42、44、47、52、60、62、65、68、69、72、74、76、77、78、79、83、85、88、89、90、96、100、108、109、118、119、127、128、129、131、132、137、144、153、154、155、156、158、165、168、170、172、177、178、179、181、185、186、187、191、194、195、197、202、204、215、222、229、237、240、246、250、256、257、259、260、264、265、267、268、269、274。

上面的数字相应于SspI蛋白序列(SEQIDNO：99)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后进行DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-SspIM)。

3.SspI高保真度突变体的选择

在NEB4缓冲液以及分别5％甘油和39％甘油中，使用ΦX174底物，进行NheI的标准同源和星号活性分析。突变体#16(H65A)、#20(K74A)、#23(E78A)、#26(E85A)、#28(E89A)、#33(K109A)、#34(E118A)、#52(R177A)、#62(K197A)、#67(D229A)都示出减少的星号活性。K109A示出星号活性的最大减少。决定寻求星号活性的进一步改进。

4.进一步突变

将最初鉴定为Tyr的所有残基突变为Phe，而将其他残基Cys、Phe、Met、Asn、Gln、Ser、Thr和Trp突变为Ala。该组包括在下列位置处的95个残基突变：2、6、7、9、10、13、22、25、26、27、29、30、32、33、34、39、41、51、53、55、56、57、58、59、61、63、71、75、81、84、87、91、94、98、104、106、107、110、111、113、114、123、125、134、136、139、140、141、142、143、146、152、157、159、160、164、173、175、180、183、190、192、193、196、198、199、201、205、207、211、214、218、219、220、221、223、225、226、227、228、230、232、233、235、238、239、241、249、254、255、272、275、276、277、280。

上面的数字相应于SspI蛋白序列(SEQIDNO：113)中的氨基酸位置。

通过上面相同的方法，进行PCR和选择。在这些突变体中，发现Y98F具有最少的星号活性，并且其在这方面比SspI(K109A)好。将SspI(Y98F)标记为SspI-HF，并且作为生产株储存。

5.SspI-HF和WTSspI的比较

在NEB1-4缓冲液中，使用λDNA底物，分开测定SspI-HF和WTSspI的FI。稀释剂是NEBC。比较在图16中示出，并且结果在表15(下面)中列出。

表15：SspI-HF和WTSspI的比较

在NEB4中，SspI-HF表现最好，其中优选的FI是500；WTSspI在NEB1、NEB2和NEB4中表现最好，其中优选的FI是64。总FI改进因子为500/64＝8。

实施例10：工程化高保真度NotI

1.NotI的表达

NotI在NEB4缓冲液中具有显著的星号活性，并且在NEB3缓冲液中具有较少的星号活性。工程化NotI以在任何NEB缓冲液中减少星号活性。NotI在用pACYC184-EagIM和placzz2-NotIR转化的感受态大肠杆菌中表达。细胞在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.NotI的诱变

将NotI中所有97个带电荷的残基突变为Ala，如下列残基：2、4、8、10、17、21、22、26、31、34、35、36、49、52、57、59、62、72、74、75、77、84、87、96、97、105、117、121、122、125、126、129、130、133、140、141、145、150、152、156、160、165、167、174、176、177、182、187、189、193、194、200、205、208、210、219、224、225、227、236、237、245、251、253、267、271、272、280、283、290、292、294、296、304、306、308、310、314、319、321、323、327、331、335、336、339、353、354、356、358、361、365、367、368、369、370、378、382。

上面的数字相应于NotI蛋白序列(SEQIDNO：90)中的氨基酸位置。

将突变体引入酶的方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入含有pACYC-EagIM的大肠杆菌。

3.NotI-HF的选择

如在前面实施例中描述的，进行NotI-HF的选择。标准同源和星号活性分析使用pXba底物，在NEB4缓冲液以及分别5％甘油和NEBExoI缓冲液(67mM甘氨酸-KOH，pH9.5，6.7mMMgCl₂，10mM2-巯基乙醇)以及37％甘油中进行。#37(K150A)、#44(K176A)、#45(R177A)、#63(R253A)都示出减少的星号活性。K150A是优选的减少星号活性的突变。选择NotI(K150A)为NotI-HF。

4.NotI-HF和WTNotI的比较

在NEB1-4缓冲液中，使用pXba底物，分开测定NotI-HF和WTNotI的FI。比较在图17中示出，并且结果在表16(下面)中列出。

表16：NotI-HF和WTNotI的比较

ND：不可检测，因为两个FI都是超出限度的不确定数。

在NEB2中，NotI-HF表现最好，其中优选的FI是≥128000；WTNheI在NEB3中表现最好，其中优选的FI是4000。总保真度指数改进因子为≥128000/4000＝≥32。工程化NotI不但进一步提高NotI的FI，而且改变最佳缓冲液。

实施例11：工程化高保真度SacI

1.SacI的表达

SacI在用pLG-SacIM和pRRS-SacIR转化的大肠杆菌中表达。pRRS是pUC19衍生质粒，pLG是低拷贝相容性质粒。细胞在30℃下，在具有Amp和Kan的LB中生长过夜。

2.SacI的诱变

将SacI中所有101个带电荷的残基突变为Ala，如下列残基：6、7、11、15、16、19、24、25、29、30、39、40、42、45、58、61、62、63、65、67、70、71、72、74、75、76、81、85、94、98、104、105、114、116、120、123、127、129、133、134、141、143、144、145、146、150、151、154、169、170、172、181、187、196、197、200、201、211、216、220、221、224、227、228、232、238、240、246、248、250、258、270、271、277、281、288、289、295、296、297、299、303、306、313、314、321、322、324、332、336、337、340、342、344、345、347、349、350、353、357。

上面的数字相应于SacI蛋白序列(SEQIDNO：93)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pLG-SacIM)。

3.SacI-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成SacI-HF的选择。标准活性检查使用pUC19、在NEB4中、具有5％甘油，并且星号活性检查在39％甘油下、在NEB4缓冲液中对pUC19进行。#52SacI(Q117H/R154A/L284P)和#60SacI(Q117H/R200A)都具有减少的星号活性，和SacIQ117H/R200A证明是优选的突变。Q117H是来自模板的遗留突变，其不影响SacI的活性。选择SacI(Q117H/R200A)为SacI-HF。

4.SacI-HF和WTSacI的比较

在NEB1-4缓冲液中，对pXba底物，分开测定SacI-HF和WTSacI的FI。比较在图18中示出，并且结果在表17(下面)中列出。

表17：SacI-HF和WTSacI的比较

在NEB4中，SacI-HF表现最好，其中FI是4000；WTSacI在NEB1和NEB4中表现最好，其中优选的FI是120。总FI改进因子为4000/120＝32。

实施例12：工程化高保真度PvuII

1.PvuII的表达

PvuII在用pACYC-PvuIIM和placzz2-PvuIIR转化的大肠杆菌中表达。Placzz2是pUC19衍生质粒；pACYC是低拷贝相容性质粒。细胞在30℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.PvuII的诱变

将PvuII中所有47个带电荷的残基突变为Ala，如下列残基：3、5、8、11、15、18、21、25、26、30、34、38、54、55、58、61、66、68、70、75、78、83、84、85、93、95、105、110、114、116、118、119、121、125、126、128、129、130、134、136、137、138、143、147、151、152和155。

上面的数字相应于PvuII蛋白序列(SEQIDNO：92)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-PvuIIM)。

3.PvuII高保真度突变体的选择

PvuII-HF的选择与前面的实施例相似。标准活性检查使用λDNA底物、在NEB4中、具有5％甘油，并且星号活性检查在39％甘油下、在NEB4缓冲液中对pBR322进行。没有突变体具有高保真度PvuII的资格。

4.另外的诱变步骤

另外的诱变步骤是在PvuII中将所有Ser、Thr突变为Ala，将Tyr突变为Phe。突变的位置是：2、19、46、49、67、71、77、81、82、94、104、113、123、124、132、133、148、154和157。

PvuII(T46A)表现具有比WTPvuII更少的星号活性，然而，期望进一步改进。

将T46突变为所有其他氨基酸残基，这通过将密码子改变为相应氨基酸进行。在所有这些突变中，T46H、T46K、T46Y、T46G都比T46A更好。选择T46G作为PvuII-HF。

5.PvuII-HF和WTPvuII的比较

在NEB1-4缓冲液中，使用稀释剂A，分开测定PvuII-HF和WTPvuII对pBR322的FI。比较在图19中示出，并且结果在表18(下面)中列出。

表18：PvuII-HF和WTPvuII的比较

在NEB4中，PvuII-HF表现最好，其中FI是500；WTPvuII在NEB1和NEB4中表现最好，其中优选的FI是250。总FI改进因子为500/250＝2。尽管总FI改进因子对PvuII不高，但是在NEB4中FI提高2000倍。

实施例13：工程化高保真度MfeI

1.MfeI的表达

MfeI在用pACYC-MluCIM和pRRS-MfeIR转化的大肠杆菌中表达。pRRS是pUC19衍生质粒；pACYC是低拷贝相容性质粒。MluCIM甲基化AATT，其是MfeI的内部四个核酸序列。细胞在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.MfeI的诱变

分三批进行MfeI的诱变。第一批是所有的带电荷的残基，将其突变为Ala，如下列氨基酸位置：5、9、19、24、36、39、44、45、47、48、50、60、61、64，65、72、83、87、90、92、93、98、100、101、103、107、109、110、115、119、120、121、124、132、135、142、143、144、153、155、158、159、161、162、164、165、171、172、175、181、184、187、188、192、195、196、198、199、200；第二批是具有羟基的所有残基：Ser、Thr和Tyr，其中Ser和Thr被改变为Ala，并且Tyr被改变为Phe。所述残基是在：4、7、21、28、38、40、43、53、74、75、76、81、89、91、112、122、127、134、136、157、167、170、173、177、185和200。第三批是残基Cys、Phe、Met、Asn、Gln、Trp，都改变成Ala，所述残基是在：10、12、13、25、26、29、31、32、35、51、55、67、68、77、78、84、88、96、102、105、117、123、126、141、148、149、152、168、169、174、176、178、179、180、183、191、193、194。

上面的数字相应于MfeI蛋白序列(SEQIDNO：5)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-MluCIM)。

3.MfeI-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成MfeI-HF的选择。在NEB4中，应用5％甘油、使用ΦX174底物测定切割活性，并且在NEB4中，应用39％甘油、使用ΦX174底物测定星号活性。该酶的显著困难是许多突变改进了酶的切割活性且星号活性减少，但是比WT酶需要更高的甘油浓度。MfeI(K50A)是一个实例，其在高浓度甘油中具有减少的星号活性和高切割活性，而在较低甘油浓度中，所述活性是低的。MfeI(Y173A)也减少星号活性。优选的突变为Q13A/F35Y。F35Y的突变来自模板，并且Q13A是靶向突变。将MfeI(Q13A/F35Y)标记为MfeI-HF。

4.MfeI-HF和WTMfeI的比较

在NEB1-4缓冲液中，对λDNA底物，分开测定MfeI-HF和WTMfeI的FI，其中在NEB稀释剂A中进行稀释。比较在图20中示出，并且结果在表19(下面)中列出。

表19：MfeI-HF和WTMfeI的比较

在NEB1和NEB4中，MfeI-HF表现最好，其中优选的FI为≥1000；在NEB1和NEB4中，WTMfeI表现最好，其中优选的FI为32。总FI改进因子是≥1000/32＝32倍。

实施例14：工程化高保真度HindIII

1.HindIII的表达

HindIII在用pUC19-HindIIIRM转化的大肠杆菌中表达，所述pUC19-HindIIIRM含有HindIII内切核酸酶和甲基化酶基因。细胞在30℃下，在具有Amp的LB中生长过夜。

2.HindIII的诱变

将HindIII中88个带电荷的残基突变为Ala。这些是：2、3、7、8、14、20、22、34、37、39、42、45、52、55、61、62、66、69、74、84、87、89、94、100、101、109、111、114、117、120、123、124、126、128、132、134、135、136、137、138、153、158、162、163、171、172、180、182、183、190、197、198、201、202、207、209、214、215、218、222、225、227、228、229、237、238、243、244、245、249、250、251、254、255、261、265、266、267、270、274、275、281、283、286、290、293、296、297。

在位置4、11、15、17、18、19、21、23、26、27、30、31、36、38、46、57、58、59、60、63、64、76、77、80、82、83、88、91、99、102、103、104、112、113、116、118、121、122、125、131、133、139、143、146、147、148、149、151、152、154、155、157、159、160、164、168、169、170、178、184、185、187、188、189、191、193、194、195、199、200、203、204、206、210、211、212、213、216、217、219、220、221、224、230、232、233、236、240、241、246、252、253、256、258、262、263、264、277、278、279、280、284、287、288、294、295、299处，将所有残基Cys、Met、Asn、Gln、Ser、Thr、Trp改变为Ala，而将Tyr改变为Phe。

上面的数字相应于HindIII蛋白序列(SEQIDNO：85)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌菌株ER3081。

3.HindIII-HF的选择

使用与前面的实施例相似的方法，完成HindIII-HF的选择。标准活性检查使用λDNA、在NEB4中并具有5％甘油，并且星号活性在具有39％甘油的NEB4缓冲液中使用λDNA底物测量。发现HindIII的两个突变体具有减少的星号活性。这些是HindIII(K198A)和S188P/E190A。将HindIII(K198A)标记为HindIII-HF。

4.HindIII-HF和WTHindIII的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，使用λDNA底物，用稀释剂B，分开测定HindIII-HF和WTHindIII的FI。比较在图21中示出，并且结果在表20(下面)中列出。

表20：HindIII-HF和WTHindIII的比较

在NEB2中，HindIII-HF表现最好，其中优选FI是≥64000；WTHindIII在NEB2中表现最好，其中优选的FI是250。总FI改进因子是4000/120＝32。

实施例15：工程化高保真度SbfI

1.SbfI的表达

SbfI在用pUC19-SbfIRM转化的大肠杆菌中表达。细胞在30℃下，在具有Amp的LB中生长过夜。

2.SbfI的诱变

将SbfI中78个带电荷的残基突变为Ala。这些残基是：5、8、15、18、23、27、30、34、46、49、50、53、58、63、66、70、71、74、81、82、83、85、86、87、90、94、103、115、120、121、127、132、135、136、143、144、147、150、152、154、164、169、170、183、184、187、188、192、196、204、206、208、213、214、215、218、219、226、228、230、233、237、238、239、241、248、251、253、257、258、259、260、262、266、282、284、285、288、293、297、299、304、305、307、311、316和322。

也将SbfI中的Ser和Thr残基突变为Ala。将Tyr突变为Phe。靶向下列位置：3、4、5、10、13、16、31、35、38、54、55、56、68、76、78、80、88、109、111、116、119、129、131、137、146、162、174、197、198、201、205、210、224、252、263、270、272、286、298、315、321。

也将下列位置的另外55个Cys、Phe、Met、Asn、Gln、Trp残基突变为Ala：2、24、26、29、32、51、62、65、67、72、84、91、92、95、97、101、104、106、110、112、114、117、124、134、140、157、160、171、178、179、185、189、193、212、217、225、231、243、245、247、256、265、268、277、279、280、281、283、287、289、290、296、301、313和317。

上面的数字相应于SbfI蛋白序列(SEQIDNO：96)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将突变的产物转化入大肠杆菌菌株ER2984。

3.SbfI-HF的选择

如在前面的实施例中描述的，完成SbfI-HF的选择。标准活性检查使用λDNA、在NEB4中并具有5％甘油，并且星号活性检查针对λDNA在核酸外切酶I缓冲液中进行。将SbfI(K251A)标记为SbfI-HF。

4.SbfI-HF和WTSbfI的比较

在NEB1-4缓冲液中，对λDNA，用稀释剂C，分开测定SbfI-HF和WTSbfI的FI。比较在图22中示出，并且结果在表21(下面)中列出。

表21：SbfI-HF和WTSbfI的比较

在NEB1和NEB4中，SbfI-HF表现最好，其中优选FI是1000；WTSbfI在NEB1中表现最好，其中优选的FI是8。总FI改进因子是1000/8＝125倍。

实施例16：工程化高保真度EagI

1.EagI的表达

EagI在用pBR322-EagIRM转化的大肠杆菌中表达。细胞在30℃下，在具有20μg/ml四环素的LB中生长过夜。

2.EagI的诱变

将Asp、Glu、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Asn和Gln残基突变为Ala。将Tyr突变为Phe。这些是下列残基：2、3、4、5、6、9、13、14、17、19、21、23、27、35、36、37、40、42、43、44、45、46、49、51、53、55、56、58、60、66、67、69、71、72、73、74、75、77、78、80、82、86、87、92、93、94、95、98、99、100、102、103、104、105、112、113、114、116、117、119、122、125、127、132、134、135、137、139、140、141、145、147、148、150、152、154、155、156、157、160、162、163、164、166、169、172、173、176、177、178、179、182、185、187、188、189、193、196、197、201、202、203、204、205、206、208、209、212、217、220、221、222、224、225、230、235、236、237、238、239、240、241、243、245、246、247、248、251、255、257、258、259、260、263、264、265、266、270、272、273、275、276、277、279、280、283、286、288、289、291、295、296。

上面的数字相应于EagI蛋白序列(SEQIDNO：82)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌菌株ER3081中，并且在具有四环素的LB琼脂平板上生长。

3.EagI-HF的选择

使用与前面实施例不同的方法，完成EagI-HF的选择，所述方法使用高浓度甘油、高浓度DMSO或高pH。在粗提物中，因为表达太低而不能示出星号活性，纯化每一突变体以检查星号活性会是非常冗长的。根据前面的实施例，推断与NEB3相比，在NEB4中HF内切核酸酶倾向具有增加的切割活性。因此，粗提物中EagI的活性在NEB3和NEB4中都测量；选择具有最高NEB4/NEB3比率的一个。将EagI(H43A)标记为EagI-HF。

4.EagI-HF和WTEagI的比较

在NEB1-4缓冲液的每一个中，对pXba底物，分开测定EagI-HF和WTEagI的FI。比较在图23中示出，并且结果在表22(下面)中列出。

表22：EagI-HF和WTEagI的比较

在NEB2和NEB4中，EagI-HF表现最好，其中优选FI是500；WTEagI在NEB3和NEB4中表现最好，其中优选的FI是250。总FI改进因子是500/250＝2。

实施例17：工程化高保真度EcoRV

1.EcoRV的表达

EcoRV在用pACYC-EcoRVM和placzz1-EcoRV转化的大肠杆菌中表达。Placzz1是pUC19衍生质粒，并且pACYC是低拷贝相容性质粒。细胞在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.EcoRV的诱变

将Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr和Trp残基改变为Ala。将Tyr改变为Phe。这些是：2、4、5、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19、21、25、27、29、31、35、36、37、38、41、42、44、45、47、48、49、53、54、57、58、59、61、64、65、67、68、69、70、71、72、74、75、76、78、79、81、82、84、85、86、90、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、123、125、126、127、128、131、132、136、138、139、140、143、144、145、146、147、149、150、151、152、154、155、157、158、161、163、164、167、169、171、172、173、174、179、183、185、186、187、188、191、193、195、196、197、198、199、201、203、206、207、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、226、227、228、229、230、231、232、234、235、236、237、238、239、241、242、244和245。

上面的数字相应于EcoRV蛋白序列(SEQIDNO：84)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-EcoRVM)。

3.EcoRV-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成EcoRV-HF的选择。标准活性检查在NEB4中、应用5％甘油使用pXba进行，并且星号活性检查针对pXba、应用39％甘油在核酸外切酶I缓冲液中进行。发现EcoRV(D19A/E27A)与WTEcoRV相比具有减少的星号活性。将该突变体标记为EcoRV-HF。对于该突变体，E27A是靶向突变，并且D19A是自发突变。双突变体比D19A和E27A单突变体在星号活性方面具有更大的减少。

4.EcoRV-HF和WTEcoRV的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，对pXba底物，分开测定EcoRV-HF和WTEcoRV的FI。比较在图24中示出，并且结果在表23(下面)中列出。

表23：EcoRV-HF和WTEcoRV的比较

在NEB2和NEB4中，EcoRV-HF表现最好，其中优选FI是≥64000；WTEcoRV在NEB3中表现最好，其中优选的FI是1000。总FI改进因子为≥64000/1000＝64。

实施例18：工程化高保真度AvrII

1.AvrII的表达

AvrII在用pUC19-AvrIIRM转化的大肠杆菌中表达。细胞在30℃下，在具有Amp的LB中生长过夜。

2.AvrII的诱变

将Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr和Trp残基突变为Ala。将Tyr改变为Phe。这些是：2、3、4、6、8、9、10、12、15、17、19、20、22、23、27、29、30、31、32、34、36、40、41、42、43、44、46、47、48、50、51、53、55、56、57、58、59、60、65、68、70、72、74、75、76、77、79、80、82、83、84、86、87、88、94、95、96、97、100、104、105、106、107、108、110、112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、126、127、129、130、131、132、134、136、139、142、143、144、145、150、151、152、153、154、156、157、158、161、163、164、165、166、168、169、173、174、177、178、181、182、184、186、187、188、189、190、191、192、195、198、200、202、206、207、211、215、216、220、223、224、226、229、230、231、232、233、234、235、236、237、239、243、244、245、246、248、249、253、255、256、260、262、264、265、266、267、268、269、270、272、274、276、277、278、279、280、281、284、285、286、288、289、290、291、299、302、303、304、305、306、308、310、312、314、315、316、318、321、322、324、325、328、331、333、335、337、338、339、340、342、343、346、347、348、350、351、353、354、355、356、358。

上面的数字相应于AvrII蛋白序列(SEQIDNO：80)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌菌株ER2984中。

3.AvrII-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成AvrII-HF的选择。切割活性在NEB4中应用5％甘油使用pBC4测定，并且星号活性在具有39％甘油的ExoI缓冲液中应用pBC4测定。突变体#16(M29A)、#57(E96A)、#60(Y104F)、#62(K106A)、#154(S127A)、#170(F142A)都示出改进。将AvrII(Y104F)标记为AvrII-HF。

4.AvrII-HF和WTAvrII的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，对T7DNA底物，使用稀释剂B，分开测定AvrII-HF和WTAvrII的FI。比较在图25中示出，并且结果在表24(下面)中列出。

表24：AvrII-HF和WTAvrII的比较

在NEB1和NEB4中，AvrII-HF表现最好，其中优选FI是1000；WTAvrII在NEB1和NEB4中表现最好，其中优选的FI是64。总FI改进因子是1000/64＝16。

实施例19：工程化高保真度BstXI

1.BstXI的表达

BstXI在用pACYCBstXIMS和pUC19-BstXIR转化的大肠杆菌中表达。pACYC是低拷贝相容性质粒。BstXI必须具有甲基化酶基因和特异性基因以具有甲基化酶功能。细胞在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.BstXI的诱变

如下，在BstXI中，进行237个氨基酸突变。将Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Trp突变为Ala。将Try突变为Phe。这些是：4、6、7、9、11、12、14、15、17、18、20、21、22、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、42、43、46、48、50、53、54、57、58、59、60、62、63、64、65、66、71、72、73、75、76、78、80、81、82、83、84、86、89、91、93、94、95、96、97、98、103.105、106、108、110、111、112、114、117、118、120、123、124、125、126、127、128、129、130、131、137、138、139、141、142、144、145、146、148、151、152、153、154、155、156、159、162、163、166、168、169、171、172、173、174、175、176、177、178、182、185、188、189、191、193、194、195、196、198、199、201、204、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、223、228、229、230、233、235、236、238、239、240、244、245、248、249、250、253、254、255、258、259、260、261、263、264、265、267、268、269、272、276、277、278、279、280、282、285、286、287、288、289、291、293、294、295、300、301、302、304、305、306、308、309、312、314、317、318、319、320、323、324、325、326、330、331、333、334、335、337、343、344、345、346、347、349、353、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、367、369、371、373、374、376、377、378、379、380、381、382和383。

上面的数字相应于BstXI蛋白序列(SEQIDNO：7)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-BstXIMS)。

3.BstXI-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成BstXI-HF的选择。切割活性在NEB4中应用5％甘油使用pBC4测定，并且星号活性在具有39％甘油的NEB4缓冲液中使用pBC4DNA底物测定。突变体#36(Y57F)、#44(N65A)、#48(E75A)、#49(N76A)和#124(K199A)都具有减少的星号活性。将BstXI(N65A)标记为BstXI-HF。

4.BstXI-HF和WTBstXI的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，对λDNA底物，使用稀释剂A，分开测定BstXI-HF和WTBstXI的FI。比较在图26中示出，并且结果在表25(下面)中列出。

表25：BstXI-HF和WTBstXI的比较

在NEB2和NEB4中，BstXI-HF表现最好，其中优选FI是≥250；WTBstXI在NEB2、NEB3和NEB4中表现最好，其中优选的FI是32。总FI改进因子为≥250/32＝8。

实施例20：工程化高保真度PciI

1.PciI的表达

PciI在用pACYC-PciIM和placzz1-PciIR转化的大肠杆菌中表达。placzz1是pUC19衍生质粒，pACYC是低拷贝相容性质粒。细胞在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.PciI的诱变

利用Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr突变PciI中151个氨基酸残基。将Trp改变为Ala，和将Tyr改变为Phe。这些是：2、3、4、6、8、9、10、11、12、14、17、18、19、21、24、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、41、44、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、60、63、67、68、69、71、74、75、78、80、81、82、85、86、91、92、95、97、98、101、103、104、107、109、113、114、115、118、119、120、121、122、124、126、127、129、130、131、132、133、135、136、137、138、143、145、146、147、148、149、151、152、153、154、155、157、158、159、161、164、165、167、172、175、178、179、180、182、184、185、186、190、192、193、196、197、198、199、200、202、203、206、207、209、210、215、218、221、222、228、229、230、231、232、233、234、235、237、238、239、241、242、243、244、246、247、248、253、254、255、256。

上面的数字相应于PciI蛋白序列(SEQIDNO：15)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-PciIM)。

3.PciI-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成PciI-HF的选择。切割活性在NEB4中应用5％甘油使用SalI-切割pBR322测定，并且星号活性在具有39％甘油的ExoI缓冲液中使用SalI-切割pBR322测定。双突变体PciI(E78A/S133A)具有减少的星号活性和强的切割活性。该突变体不是上面描述的靶向突变之一，而是偶然随机事件。

4.PciI-HF和WTPciI的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，对pXba底物，使用稀释剂A，分开测定PciI-HF和WTPciI的FI。比较在图27中示出，并且结果在表26(下面)中列出。

表26：PciI-HF和WTPciI的比较

在NEB2、NEB3和NEB4中，PciI-HF表现最好，其中优选FI是≥2000；WTPciI在NEB3中表现最好，其中优选的FI是120。总FI改进因子为≥2000/120＝16。

实施例21：工程化高保真度HpaI

1.HpaI的表达

HpaI在用pACYC-MseIM和placzz1-HpaIR转化的大肠杆菌中表达。placzz1是pUC19衍生质粒，pACYC是低拷贝相容性质粒。细胞在37℃下，在具有Amp和Cam的LB中生长过夜。

2.HpaI的诱变

利用Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser和Thr突变HpaI中的156个氨基酸残基。将Trp改变为Ala，和将Tyr改变为Phe。这些是：7、8、9、13、14、16、17、19、20、21、22、23、26、27、29、30、33、34、35、36、37、38、40、41、42、46、47、48、50、51、56、57、59、60、65、67、69、71、72、74、75、78、79、80、81、82、83、84、85、86、89、91、93、94、95、99、100、104、105、106、108、109、110、113、115、117、119、121、122、123、124、127、128、130、131、133、135、136、137、138、139、141、142、146、147、149、150、152、156、158、159、160、162、164、165、166、167、168、169、170、172、173、176、177、180、181、182、184、185、187、188、190、191、192、193、195、196、197、202、204、206、208、209、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、228、230、231、233、234、235、236、237、238、240、241、242、243、244、245、247、248、249。

上面的数字相应于HpaI蛋白序列(SEQIDNO：86)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-MseIM)。

3.HpaI-HF的选择

使用与前面实施例不同的方法，完成HpaI-HF的选择。在NEB2缓冲液中，使用λDNA底物，测定切割活性和星号活性。在NEB2中，该HpaI具有比在NEB4中多得多的星号活性，并且可在5％甘油中明显观察到。

HpaI(Y29F)和HpaI(E56A)都是优选的具有减少星号活性的突变。将HpaI(E56A)标记为HpaI-HF。

4.HpaI-HF和WTHpaI的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，对λDNA底物，使用稀释剂A，分开测定HpaI-HF和WTHpaI的FI。比较在图28中示出，并且结果在表27(下面)中列出。

表27：HpaI-HF和WTHpaI的比较

在NEB2中，HpaI-HF表现最好，其中优选FI是≥2000；WTPciI在NEB4中表现最好，其中优选FI是16。总FI改进因子为≥2000/16＝120。

实施例22：工程化高保真度AgeI

1.AgeI的表达

AgeI在用pRRS-AgeIRM和psyx20-lacIq转化的大肠杆菌中表达。pRRS是pUC19衍生质粒，psyx20-lacIq是低拷贝相容性质粒，其带有在lacIq启动子下表达的lacI。细胞在37℃下，在具有Amp和Kan的LB中生长至200Klett单位，然后用0.5mMIPTG在25℃下诱导过夜。AgeI的表达极难实现，因为它是不稳定的。

2.AgeI的诱变

利用Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser和Thr突变AgeI中149个氨基酸残基。将Trp改变为Ala，和将Tyr改变为Phe。这些是：2、4、6、7、9、14、16、18、19、21、22、23、24、25、26、27、29、30、31、32、37、38、40、42、43、44、45、49、51、53、55、56、58、60、62、64、65、67、68、69、72、73、75、77、78、79、82、83、85、86、87、88、90、91、92、94、96、97、102、103、104、105、110、111、114、116、119、120、122、123、128、129、130、134、135、138、139、140、142、144、146、147、148、152、153、155、157、159、166、168、170、173、174、176、177、178、182、183、185、186、188、192、195、198、200、201、206、211、212、214、217、219、220、222、223、224、225、226、227、229、231、233、234、235、237、238、239、240、241、243、245、247、248、250、251、253、255、256、258、260、262、265、266、267、268、269、271、272。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(psyx20-lacIq)。

上面的数字相应于AgeI蛋白序列(SEQIDNO：79)中的氨基酸位置。

3.AgeI-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成AgeI-HF的选择。标准活性检查在NEB4中应用5％甘油使用pXba进行，并且星号活性检查在具有39％甘油的NEB4缓冲液中对pXba进行。因为表达系统的困难性，在获得有意义的突变体之前，重复该选择八次。两个突变体——S201A和R139A——具有减少的星号活性，并且将R139A标记为AgeI-HF。

4.AgeI-HF和WTAgeI的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，对pXba底物，使用稀释剂A，分开测定AgeI-HF和WTAgeI的FI。比较在图29中示出，并且结果在表28(下面)中列出。

表28：AgeI-HF和WTAgeI的比较

在NEB1和NEB4中，AgeI-HF表现最好，其中优选FI是≥500；WTAgeI在NEB3中表现最好，其中优选的FI是16。总FI改进因子为≥500/16＝32。

实施例23：工程化高保真度BsmBI

1.BsmBI的表达

BsmBI在用pACYC-BsmAIM、ptaczz2-BsmBIR和psyx20-lacIq转化的大肠杆菌中表达。Ptaczz2是pUC19衍生质粒，其携带诱导型ptac启动子，pACYC是低拷贝相容性质粒。BsmAIM(GTCTC)遮盖(cover)BsmBI(CGTCTC)特异性。psyx20-lacIq是低拷贝载体，其具有强的lacI表达。细胞在37℃下生长，然后，在具有Amp、Cam和Kan的LB中诱导。

2.BsmBI的诱变

利用Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser和Thr突变BsmBI中358个氨基酸残基。将Trp改变为Ala，和将Tyr改变为Phe。这些是：8、9、12、13、14、15、17、18、19、20、21、24、25、26、27、28、29、31、33、37、38、40、42、43、44、46、47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、60、61、62、63、64、65、66、67、69、70、72、76、78、79、80、81、82、83、84、88、91、93、95、96、98、99、101、103、104、105、106、109、110、111、113、114、115、117、118、119、120、121、122、124、126、127、128、130、131、132、133、134、135、138、141、143、144、145、147、149、150、154、155、157、158、160、162、163、164、165、166、167、168、169、172、174、175、176、177、179、180、181、182、184、185、186、188、189、191、194、195、197、200、201、203、205、206、207、208、211、212、213、214、215、216、217、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、231、232、233、235、236、237、238、239、240、242、243、247、250、251、252、257、258、260、262、263、264、265、266、268、269、271、273、274、279、280、282、283、284、287、288、289、292、294、295、296、297、299、300、301、302、303、304、305、306、307、309、310、313、314、315、316、317、318、320、321、324、325、326、328、331、332、333、334、335、336、339、340、341、342、343、344、345、348、349、351、352、353、355、356、357、358、360、361、363、364、366、367、368、370、372、375、376、377、379、381、382、384、385、386、388、389、390、393、394、395、396、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、418、421、424、425、426、428、430、431、432、433、434、436、437、438、439、442、443、444、445、446、446、448、449、450、451、452、453、454、457、458、460、461、462、464、466、467、468、470、471、472、473、474、477、478、479、480、482、483、484、485、486、487、488、489、491、492、495、496、497、498、499、500、502、503、504、505、506、507、510、511、515、516、517、518、519、522、523。

上面的数字相应于BsmBI蛋白序列(SEQIDNO：81)中的氨基酸位置。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-BsmAIM，psyx20-lacIq)。

3.BsmBI-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成BsmBI-HF的选择。切割在NEB4中应用5％甘油使用λDNA测定，并且星号活性在具有39％甘油的NEB4缓冲液中使用Litmus28i测定。优选的突变体包括H230A、D231A和N185Y/R232A。标记N185Y/R232A为BsmBI-HF。

4.BsmBI-HF和WTBsmBI的比较

在NEB1-4缓冲液中的每一种中，对λDNA底物，使用稀释剂A，分开测定BsmBI-HF和WTBsmBI的FI。比较在图30中示出，并且结果在表29(下面)中列出。

表29：BsmBI-HF和WTBsmBI的比较

在NEB1、NEB2和NEB4中，BsmBI-HF表现最好，其中优选FI是≥500；WTBsmBI在NEB3中表现最好，其中优选的FI是120。总FI改进因子为≥500/120＝4。

实施例24：工程化具有减少星号活性的BspQI变体

1.BspQI限制性内切核酸酶的位点定向诱变

用Km^R和Amp^R的pSX33-EarIM1M2和pZZlacI-PspQ转化大肠杆菌。M.EarI(CTCTTC)也修饰BspQI位点(GCTCTTC)，并因此使用pSX33-earIM1M2(图17和18)共转化和修饰大肠杆菌染色体。WT氨基酸序列在图16中示出。

将BspQI中122个带电荷的或不带电荷的氨基酸残基(Arg、Lys、His、Glu、Asp、Gln、Asn、Cys)通过位点定向诱变改变为Ala。在下列条件下，进行PCR：DNA变性，98℃持续30sec，1个循环；DNA变性/引物退火/延伸，98℃持续10sec，55℃到65℃进行30sec，72℃持续2min，进行18个PCR循环；72℃持续15min，1个循环。在100μl反应中，2单位的Phusion^TMDNA聚合酶(NEB，Ipswich，MA)、1mMdNTP、10ng到100ng模板DNA、20μl5x反应缓冲液、0.04μM引物、无菌水至100μl总体积。

用DpnI消化PCRDNA，以破坏模板DNA(Dam甲基化的)并与pSX33-earIM1M2共转化入大肠杆菌。培养各转化体过夜(5mlLB、50μg/mlKm^R和100μg/mlAmp^R)，并且分成两份。一份(1.5ml)通过离心收获，并通过在超声处理缓冲液(20mMTris-HCl，pH7.5，0.1mMDTT，50mMNaCl，10％甘油)中超声处理进行裂解。细胞提取物在50℃下加热1小时，并且通过离心除去变性的大肠杆菌蛋白。在pUC19DNA上，分析澄清的溶胞产物的限制性活性和星号活性。

BspQI星号活性分析条件：1μgpUC19DNA、5μl10xNEB缓冲液1、25％DMSO、2.5μl澄清细胞提取物、无菌去离子水至50μl总体积，并且在50℃下温育1小时。通过电泳，在0.8到1％琼脂糖凝胶中，解析消化的DNA。

收获第二份细胞培养物(未诱导的)，并通过Qiagen离心柱纯化方法(Qiagen，Valencia，CA)制备质粒DNA。通过大-染料双脱氧-终止子-测序方法(Big-dyedideoxy-terminatorsequencingmethod)，测序bspQIR等位基因，以证实期望的突变。在鉴定减少星号活性突变体之后，获得新转化体，并且制造IPTG-诱导的培养物。再次分析限制性活性和星号活性，以证实在所有四种缓冲液中与WT酶相比减少的星号活性。

在通过位点定向诱变构建的122个BspQI突变体中，两种BspQI变体——R388A和K279A——显示减少的星号活性。在缓冲液1和10％甘油中，R388A的星号活性减少大约16倍。然而，R388A在高酶浓度下仍旧显示星号活性。BspQI变体K279A也显示减少的星号活性(在减少星号活性方面＞8-倍改进)。

为了进一步在高酶浓度下减少星号活性，将R388和K279取代为Phe、Pro、Tyr、Glu、Asp或Leu。分析各种R388X和K279X突变体的IPTG-诱导的细胞提取物的限制性活性和星号活性。发现R388F或K279P在细胞提取物或纯化酶中显示最小的星号活性。氨基酸取代不影响比活性。

为了仍进一步减少BspQI星号活性，通过位点定向诱变，将两种氨基酸取代组合进一个突变体酶中(双突变体，K279P/R388F)。该双突变体在具有10％甘油的缓冲液1和缓冲液2中缺少星号活性(图41B)。

表30：BspQI-HF对WTBspQI

实施例25：工程化具有减少星号活性的SapI变体

在BspQI中发现保守的K279和R388氨基酸残基，其中在SapI中相应位置是K273和R380。6xHis标记SapI表达克隆首先在pUC19中构建。SapI表达菌株是用Km^R和Amp^R的pSX33-earIM1M2和pUC-SapI转化的大肠杆菌。通过位点定向诱变，将Lys273到Pro(K273P)和Arg380到Phe(R380F)的氨基酸取代引入到SapI。也构建SapI单突变体R380A。当进行限制性活性和星号活性反应时，SapI变体R380A和K273P/R380F都示出减少的星号活性(图42)。

PCR、转化、质粒DNA制备和酶活性分析如对BspQI描述的进行，除了在37℃下，测定SapI活性。6xHis-标记SapI变体K273P/R380F通过Ni-NTA柱色谱纯化，并且示出在存在25％DMSO或5％甘油情况下，显示减少的星号活性。

实施例26：工程化KpnI高保真度突变体

包含两种活性的KpnI已被改变为具有较低星号活性的突变体(国际公开号WO07/027464)。下面的实施例描述具有改进的星号活性和与野生型相似的切割活性的新的突变体。

将除了催化残基的带电荷的氨基酸残基(Asp、Glu、Arg、Lys和His)或极性氨基酸(Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Phe、Trp、Cys和Met)单独突变为丙氨酸。

通过反向PCR，使用具有希望突变的引物，进行诱变。一般而言，在100μL终体积中，使用0.4mM的每种4dNTP、1xThermoPol缓冲液(NEB)、20ng的模板DNA、40μmol的每种引物和4U的VentDNA聚合酶(NEB)，实施反向PCR。

分别含有Plac或Ptac启动子控制下的KpnIR的质粒pUC19或pAGR3被用作模板。使用下列温度方案进行PCR：94℃持续4分钟，然后94℃持续30秒进行变性、55℃持续30秒进行退火和72℃持续5分钟进行延伸的25个循环。循环后在72℃下温育7分钟，然后用20U的DpnI(NEB)在37℃下处理反应1小时，以降解模板DNA。在80℃下失活DpnI20分钟后，使用2μl反应物转化用pSYX20-KpnIM预转化的50μL化学感受态NEB5alpha(NEB)。将转化的细菌铺板在含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素的LB板上，并且在37℃下温育12到15小时。每种构建物的3到4个菌落在1ml含有100μg/ml氨苄青霉素和30μg/ml卡那霉素的LB中，在37℃下培养12到15小时，并伴随200rpm的摇动。将培养物离心(spindown)，并且重新悬浮在0.2ml的超声处理缓冲液(20mMTris-HCl，pH8.3，50mMNaCl，1mMEDTA，1mMPMSF)中。将重新悬浮的细胞超声处理20秒，然后在4℃下以13,000rpm离心5分钟。进行上清液稀释，并且分析其中5μL的KpnI切割活性。

对于筛查突变体，使用50μL总体积中5μL以10-或100-倍稀释的溶胞产物上清液、0.5μg的pXbaDNA(NEB)和1xNEBuffer4，进行活性分析反应。在37℃下温育1小时后，通过加入10μl的6xDNA上样染料停止分析反应，并且通过1xTBE中0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。分析示出与亲代酶(KpnID148E)相比具有增加的总切割活性的突变体在含有25％DMSO的缓冲液中减少的星号活性。

在1xNEBuffer4中存在5％甘油和0.2mg/mlBSA的情况下(总体积＝50μL)，使用5μL用1μg的pXbaDNA(NEB)温育的酶稀释物，进行分析。在37℃下温育1小时后，用20μg蛋白激酶K(NEB)在37℃下处理反应15分钟，然后通过1xTBE中0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。使用50U的酶和1μgpXbaDNA，在含有20mMTrisHCl、50mMNaCl，pH7.9、1mMDTT和增加浓度的MgSO₄/CaCl₂/MnCl₂的缓冲液中，在37℃下进行二价金属依赖性分析1小时，然后通过1xTBE中0.8％琼脂糖凝胶电泳。总反应体积为50μL。

随机诱变的结果是优选的突变体KpnID148E，其示出比野生型酶和前面描述的KpnID163I/K165A突变体(国际公开号WO07/027464)低的星号活性。然而，KpnID148E在高酶浓度下显示星号活性。在D148E背景中，构建双或三突变体以减少该观察到的星号活性。发现KpnI(D16N/E132A/D148E)具有比突变体D148E低的星号活性和高的比活性。通过位点定向诱变，引入氨基酸取代D148到E和E132到A。通过PCR引入D16到N的突变。在标准反应条件中，将纯化酶与底物DNApXba(含有6个KpnI位点)，在37℃下)温育1小时产生表31中示出的减少的星号活性。

表31：KpnI突变体的保真度指数

对于突变体D16N/E132A/D148E，上至4000U，没有观察到pXba的星号活性。当用KpnID148E和D16N/E132A/D148E切割时，对于pBR322底物——其不含有KpnI位点——观察到的星号活性也被减少。

实施例27：工程化高保真度BsaI

1.BsaI的表达

BsaI在用pACYC-BsmAIM、pUC19-BsaIR和psyx20-lacIq转化的大肠杆菌中表达。pACYC是低拷贝相容性质粒。BsmAIM(GTCTC)遮盖BsmBI特异性(CGTCTC)。psyx20-lacIq是具有强lacI表达的低拷贝载体。细胞在37℃下生长，然后在具有Amp、Cam和Kan的LB中诱导。

2.BsaI的诱变

BsaI的氨基酸与BsmBI的氨基酸相似。在相应的前述有效位点周围和相应的前述有效位点处的11个氨基酸被突变为R229A、S230A、Y231F、T232A、T233A、D234A、R235A、R236A、F238A、E239A、Y240F。

方法与在前面实施例中的方法相同，其使用反向PCR，然后为DpnI消化。然后，将处理的产物转化入大肠杆菌(pACYC-BsmAIM、psyx20-lacIq)。

3.BsaI-HF的选择

使用与前面实施例相似的方法，完成BsaI-HF的选择。标准活性检查在NEB4中应用5％甘油使用λDNA进行，并且星号活性检查在具有39％甘油的NEB4缓冲液中对litmus28i进行。在11种设计的突变体中的一种突变体Y231F减少星号活性，并将其标记为BsaI-HF。

4.BsaI-HF和WTBsaI的比较

在NEB1-4缓冲液中，对λDNA，使用稀释剂A，分开测定BsaI-HF和WTBsaI的FI。结果在表32(下面)中列出。

表32：BsaI-HF和WTBsaI的比较

在NEB2、NEB3和NEB4中，BsaI-HF表现最好，其中最好FI是≥8000；WTBsaI在NEB2和NEB4中表现最好，其中最好的FI是120。所以，总FI改进因子为≥8000/120＝≥64。

Claims

1.组合物，其包括：具有至少一个人工引入突变和至少2的总保真度指数(FI)改进因子的限制性内切核酸酶，在预定的缓冲液中所述限制性内切核酸酶能以与不存在所述人工引入突变的限制性内切核酸酶的切割活性至少相似的切割活性切割底物，所述人工引入突变是靶向突变、饱和诱变或通过PCR扩增过程引入的突变的至少一个的产物。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个所述人工引入突变是在所述限制性内切核酸酶中的靶位点处，用带相反电荷的残基置换天然存在的残基。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个所述人工引入突变是在所述限制性内切核酸酶中的靶位点处，用选自苯丙氨酸和丙氨酸的残基置换天然存在的残基。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中不存在所述人工引入突变的所述限制性内切核酸酶选自BamHI、EcoRI、ScaI、SalI、SphI、PstI、NcoI、NheI、SspI、NotI、SacI、PvuII、MfeI、HindIII、SbfI、EagI、EcoRV、AvrII、BstXI、PciI、HpaI、AgeI、BsmBI、BspQI、SapI、KpnI和BsaI。

5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其中所述限制性内切核酸酶是具有人工引入突变的AgeI限制性内切核酸酶，其中所述人工突变在对应于SEQIDNo.79中的R139和S201的位点处被引入。

6.DNA分子，其编码权利要求5所述的限制性内切核酸酶。

7.载体，其包含权利要求6所述的DNA。

8.宿主细胞，其含有用于表达所述限制性内切核酸酶的权利要求6所述的DNA或权利要求7所述的载体。