CN109072480A

CN109072480A - 数字聚合酶保真度测定

Info

Publication number: CN109072480A
Application number: CN201780026222.2A
Authority: CN
Inventors: 郑旻; 孟祥栋; J·z·梅格德
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2016-04-29
Filing date: 2017-04-28
Publication date: 2018-12-21
Also published as: WO2017189973A1; US10287620B2; EP3449045B1; EP3449045A4; US20170314060A1; EP3449045A1

Abstract

提供的确定聚合酶保真度的方法。在一个实施方式中，该方法包括用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中缺口填充的质粒包含根据聚合酶保真度编码功能性或非功能性蛋白质的基因；从溶液中形成多个分区，所述溶液包含缺口填充的质粒和用于检测缺口填充的质粒存在的标记物；检测一个或多个分区中缺口填充的质粒的存在；并且通过确定含有编码功能性蛋白质的基因的分区与含有编码非功能性蛋白质的基因的分区的比例来确定聚合酶的保真度。

Description

数字聚合酶保真度测定

本申请要求2016年4月29日提交的美国临时申请62/329,733的权益，该申请通过引用整体并入本文。

背景技术

DNA聚合酶用于许多生物技术应用，例如DNA测序和聚合酶链式反应。这些应用需要具有高准确度或保真度的DNA聚合酶。因此，还需要一种测量DNA聚合酶保真度的简单方法。

测量保真度的一种常用方法是使用聚合酶填充噬菌体M13mp2 lacZα基因片段中的缺口，该片段编码α-肽，一种β-半乳糖苷酶的非活性区段。当准确复制并随后引入带有剩余β-半乳糖苷酶基因的互补拷贝的大肠杆菌中时，功能性β-半乳糖苷酶被重构，导致X-gal和蓝色细菌斑块的水解(参见Bebenek K.，Kunkel T.A.Methods Enzymol.1995；262：217-232)。不准确的聚合酶活性可能导致α-肽缺陷，最终导致β-半乳糖苷酶活性降低或消失，由浅蓝色或无色斑块表示。从蓝色/无色斑块比计算错误率，并且可以通过DNA测序确定突变。虽然这种方法被广泛用于评估DNA聚合酶的保真度，但该方法是劳动和时间密集的。

还开发了基于质粒的DNA聚合酶测定法(参见Keith B.J.，Jozwiakowski S.K.，和Connolly B.A.Anal.Biochem.2013年2月15日；433(2)：153-161)。该测定基于在单链区域中含有lacZα报道基因的带缺口质粒。在lacZα侧翼的两个位点处切口，并且在互补竞争物DNA存在下通过热循环除去切除的链用于产生缺口。聚合酶的准确度可以通过在体外复制基因然后将质粒导入大肠杆菌中来确定，该方法的概念类似于上述噬菌体系统的方法。再次根据蓝色/无色斑块比计算错误率。质粒系统在带缺口DNA模板制备步骤上是相对于对噬菌体系统的改进，但蓝色/无色菌落评分步骤仍然是耗时且繁琐的。

发明内容

本文公开了确定聚合酶保真度的方法。在一些实施方式中，该方法包括用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中缺口填充的质粒包含根据聚合酶保真度编码功能性或非功能性蛋白质的基因；从溶液中形成多个分区，所述溶液包含聚合酶缺口填充的质粒和用于检测缺口填充的质粒存在的标记物；检测一个或多个分区中缺口填充的质粒的存在；并且通过确定含有编码功能性蛋白质的基因的分区与含有编码非功能性蛋白质的基因的分区的比例来确定聚合酶的保真度。在一些实施方式中，毒素和抗毒素是由缺口填充的质粒中的基因编码的蛋白质。在一些实施方式中，蛋白质是选自β-半乳糖苷酶，荧光素酶和靶特异性蛋白酶的酶。在酶是β-半乳糖苷酶的一些实施方式中，分区包括选自下组的诱导物：异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，甲基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，乳糖和乳糖衍生物。在酶是β-半乳糖苷酶的实施方式中，底物选自荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，萘并荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，(9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)β-D-吡喃半乳糖苷)，4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷和试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。在一些实施方式中，用于检测质粒存在的标记物选自荧光团，生物素，由质粒编码的荧光蛋白和由质粒编码的蛋白质。在一些实施方式中，在形成多个分区之前将缺口填充的质粒转化到细胞中，并且每个分区包含用于检测细胞存在的指示剂。在某些实施方式中，指示剂选自荧光蛋白，酶，自发荧光蛋白，活细胞染色染料或核酸酶警报试剂，以及抗生素抗性。在一些实施方式中，荧光蛋白选自mKO荧光蛋白，绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白，红色荧光蛋白，红色荧光蛋白变体和黄色荧光蛋白。在某些实施方式中，缺口填充的质粒包含编码荧光蛋白的基因区段。

在缺口填充的质粒在细胞中的一些实施方式中，该方法还包括在一温度下孵育溶液或分区以使细胞生长并在形成分区之前或之后表达酶。在一些实施方式中，细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞和昆虫细胞。在某些实施方式中，缺口填充的质粒处于无细胞表达系统中。在一些实施方式中，该聚合酶是DNA聚合酶。在一些实施方式中，所述聚合酶是逆反转录酶。在某些实施方式中，质粒选自双链DNA质粒，双链RNA质粒，DNA/RNA杂交质粒和噬菌粒。

在使用基于毒素/抗毒素细胞的系统的实施方式中，用于确定聚合酶保真度的方法包括用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中所述缺口填充的质粒包含编码细胞的毒素的基因和编码抗毒素的基因，其中毒素根据聚合酶的保真度是功能性的或非功能性的；将缺口填充的质粒转化到细胞中；形成包含多个转化体和用于检测细胞存在的指示剂的溶液；将溶液平分为第一集合和第二集合；从第一和第二集合中的每一个形成多个分区，其中第一集合包含用于诱导抗毒素表达的诱导物；检测来自第一集合的一个或多个分区中抗毒素中和的毒素和突变毒素的存在以确定转化体的总数并检测来自第二集合的一个或多个分区中突变毒素的存在确定含有突变毒素的分区的数量；从转化体总数中减去含有突变毒素的分区的数量，以确定含野生型毒素的分区的数量；并且通过确定含突变毒素的分区的数量与含野生型毒素的分区的数量的比率来确定聚合酶的保真度。在一些实施方式中，毒素是CcdB并且抗毒素是CcdA。在一些实施方式中，毒素是MazF且抗毒素是MazE。在某些实施方式中，毒素是HicA且抗毒素是HicB。

还提供了用于实践主题方法的试剂盒。

附图说明

图1是显示根据本发明的一个实施方式确定聚合酶保真度的方法的流程图。

图2显示了可用于根据本发明的实施方式的方法和系统的示例性计算机系统的框图。

图3描绘了用于测定聚合酶保真度(例如，DNA聚合酶保真度)的“方案1”，如实施例1中所述。

图4描绘了用于测定聚合酶保真度(例如，逆转录酶保真度)的“方案2”，如实施例2中所述。

图5显示了如实施例3中所述的液滴中细菌生长验证的不同方面。图5A显示了液滴中没有细菌细胞，并且图5B显示了液滴中的细胞生长。

图6显示了如实施例4中所述的液滴中β-半乳糖苷酶活性的功能检测和验证的不同方面。图6A和6D显示了用pUC19转化的JM109细胞的液滴，图6B和6E显示了用pET11转化的JM109细胞的液滴，并且图6C和6F显示没有细胞的液滴。图6B显示来自细胞的背景荧光，并且图6C显示由于不存在细胞而没有荧光。

图7显示了如实施例5中所述的测定液滴中细胞和β-半乳糖苷酶活性的不同方面。图7A是来自切割的β-半乳糖苷酶底物的信号(例如，FAM信号；Y-轴)对来自切割的核酸酶底物的信号(例如，HEX信号；X-轴)的图。图7B是具有FAM(Ch1)荧光信号和/或HEX(Ch2)荧光信号的液滴数的表。

图8描绘了用于测定聚合酶保真度的“方案3”，如实施例7中所述。

图9显示了如实施例8中所述的测定液滴中细胞和β-半乳糖苷酶活性的不同方面。图9A是来自切割的β-半乳糖苷酶底物的信号(例如，FAM信号；Y-轴)对来自切割的C12-刃天青底物的信号(例如，HEX信号；X-轴)的图。图9B是具有FAM(Ch1)荧光信号和/或HEX(Ch2)荧光信号的液滴数的表。

具体实施方式

本文提供了用于确定聚合酶保真度的方法。已发现不需要蓝/无色菌落评分步骤的方法。如本文所述，在分区中实施所述方法(例如，在乳液中的液滴中)。

I.定义

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Green等，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)(第4版)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约2012)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。

如本文所用，“核酸”意指包含核苷酸单体链的化合物。核酸可以是单链或双链(即，与另一种核酸碱基配对)等。核酸链可以由任何合适数量的单体组成，例如至少约十或一百个。通常，核酸链的长度对应于其来源，合成核酸(例如，核酸试剂，例如引物和探针)通常较短，并且生物学产生的核酸(例如，核酸分析物)通常较长。

核酸可具有天然或人工结构，或其组合。有天然结构的核酸，即脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，具有交替的戊糖基团和磷酸基团的骨架。每个戊糖基团与核碱基(例如嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(T))或嘧啶(例如胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)))连接。具有人工结构的核酸是天然核酸的类似物，并且可以例如通过改变天然骨架的戊糖和/或磷酸基团来产生。示例性人工核酸包括乙二醇核酸(GNA)，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNA)，苏糖核酸(TNA)等。

核酸的序列由核碱基沿骨架排列的顺序定义。该序列通常决定核酸通过氢键特异性结合伴侣链(或形成分子内双链体)的能力。具体地，腺嘌呤与胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，鸟嘌呤与胞嘧啶配对。通过与另一种核酸形成连续的腺嘌呤-胸腺嘧啶和鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，可以以反平行方式与另一种核酸结合的核酸被称为“互补的”。

术语“基因”是指沿着DNA区段的核苷酸的线性序列，其提供用于合成RNA的编码指令，其被翻译成蛋白质。

“聚合酶”是指进行多核苷酸(例如DNA和/或RNA)的模板(例如，DNA和/或RNA)-定向(或模板依赖性)合成的酶。该术语同时包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于分离或衍生自水生栖热菌(Thermusaquaticus)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、滨海嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的DNA聚合酶或其修饰版本。市售可得的聚合酶的其他示例包括但不限于：克列诺片段(新英格兰生物实验室公司、Taq DNA聚合酶(凯杰公司(QIAGEN))、9°N^TM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Deep Vent^TM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Manta DNA聚合酶(酶学公司)、Bst DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、和phi29 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)。聚合酶包括DNA-依赖聚合酶和RNA-依赖聚合酶，如逆转录酶。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族，虽然大多数落入A、B和C家族。各家族之间几乎没有或没有序列相似性。大多数A家族聚合酶是可含有多重酶促功能(包括聚合酶、3′到5′核酸外切酶活性和5′到3′核酸外切酶活性)的单链蛋白质。B家族聚合酶通常有具有聚合酶和3′到5′核酸外切酶活性的单个催化结构域，以及辅助因子。C家族聚合酶通常是具有聚合和3′到5′核酸外切酶活性的多亚基蛋白质。在大肠杆菌中，已经发现了3种类型的DNA聚合酶，DNA聚合酶I(A家族)、DNA聚合酶II(B家族)和DNA聚合酶III(C家族)。在真核细胞中，核复制中涉及3种不同的B家族聚合酶，DNA聚合酶α、δ和ε，并且A家族聚合酶，聚合酶γ用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。相似地，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III，和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性和RNA依赖性的。

术语“保真度”是指DNA聚合酶复制所需模板的准确程度。复制DNA模板涉及多个步骤，包括读取模板链的能力，选择合适的核苷三磷酸并在3′引物末端插入正确的核苷酸，以维持Watson-Crick碱基配对。除了有效区分正确与不正确的核苷酸掺入之外，一些DNA聚合酶具有3′→5′核酸外切酶活性。这种被称为“校对”的活性用于切除错误掺入的单核苷酸，然后用正确的核苷酸替换。高保真PCR利用DNA聚合酶将低错误掺入率与校对活性结合起来，以忠实地复制感兴趣靶DNA。

术语“标记物”、“可检测标记物”和“指示剂”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标记包括荧光染料(荧光团)、荧光猝灭剂、发光剂、高电子密度试剂、酶(例如切割可检测底物的酶)、荧光蛋白、生物素、地高辛、³²P和其它同位素、半抗原、蛋白质、核酸或可被检测的其他物质，例如通过将标记整合至与目标分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。

“连接”至标记物的分子(例如本文所述经标记核酸或酶)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子，从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。

术语“划分”或“划分的”指将水性溶液样品分隔为多个部分或“分区(partitions)”，该水性溶液含有一种或多种样品和反应物。分区可以是固体或流体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道。在一些实施方式中，分区是流体分区，例如液滴。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。

II.方法

参考图1，现在将描述用于确定聚合酶保真度的方法100。所述步骤可以任意顺序、任意组合实施，并且可与本公开的任意其他合适的方面进行组合或改进。

A.缺口填充的质粒形成

在示例性步骤110中，用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒。带缺口的质粒是指具有单链部分的质粒。在一些实施方式中，质粒的单链部分包含SEQ ID NO：1(参见实施例5的列表)。缺口填充的质粒包含编码蛋白质(例如酶)的基因，该蛋白质根据聚合酶保真度是功能性的或非功能性的。在一些实施方式中，编码酶的基因是lacZα基因，酶是β-半乳糖苷酶。在一些实施方式中，酶是荧光素酶或靶特异性蛋白酶。在一些实施方式中，缺口填充的质粒包含在毒素-抗毒素系统中编码毒素和抗毒素的基因。在一些实施方式中，毒素-抗毒素系统是CcdB-CcdA并且CcdB毒素靶向促旋酶，其在DNA复制中起作用。根据聚合酶的保真度，该系统中的CcdB毒素是功能性的或非功能性的。在某些实施方式中，毒素-抗毒素系统是MazF/MazE，并且MazF毒素根据聚合酶的保真度是功能性的或非功能性的。在一些实施方式中，毒素-抗毒素系统是HicA/HicB，并且HicA毒素根据聚合酶的保真度是功能性的或非功能性的。

B.分区形成

在示例性步骤120中，将包含具有编码蛋白质的基因的聚合酶缺口填充的质粒的溶液划分到多个分区中。在一些实施方式中，溶液包括具有缺口填充的质粒的细胞。在溶液包括细胞的实施方式中，溶液以等于或低于0.15个细胞/分区(例如，液滴)划分，以确保少于1％的分区携带两个或更多个细胞。

在溶液包括多个具有编码毒素和抗毒素的缺口填充的质粒的细胞的实施方式中，将具有多个转化体的溶液等分为第一集合和第二集合，然后从第一和第二集合中的每一个形成多个分区。

在一些实施方式中，形成分区的溶液包括酶的底物。在酶是β-半乳糖苷酶的实施方式中，底物包括但不限于荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，萘并荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，(9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)β-D-吡喃半乳糖苷)，4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷和试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。

在一些实施方式中，缺口填充的质粒包括用于检测分区中缺口填充的质粒的存在的标记物。示例性标记物包括但不限于由质粒中的基因编码的荧光蛋白，由切割可检测底物的质粒中的基因编码的酶，荧光团(或荧光剂)和生物素。示例性荧光蛋白包括但不限于mKO荧光蛋白，绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白，红色荧光蛋白(和红色荧光蛋白变体)和黄色荧光蛋白。

荧光剂可包括各种有机和/或无机小分子及其衍生物。例如，荧光剂可包括但不限于：花青(例如Cy^TM3，Cy^TM5)、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FAM、FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、丁酸芘、吖啶、蒽醌、硫族吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPY^TM和BODIPY^TM衍生物，及其类似物。在一些实施方式中，荧光剂是Alexa Fluor染料。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(PierceBiotechnology，Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)。在一些实施方式中，所述标记物是嵌入染料。插入染料包括但不限于SYBR绿和Pico绿(来自分子探针公司(Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市))、化乙啶、碘化丙啶、色霉素、吖啶橙、Hoechst 33258、TOTO-I、YOYO-1和DAPI(4′，6-二眯基-2-苯基吲哚盐酸盐)。

在一些实施方式中，荧光剂是聚合物点或量子点。使用的特定量子点(QB)对于本发明而言并不重要。量子点是本领域已知的且描述于例如Han等“Quantum-dot-taggedMicrobeads for Multiplexed Optical Coding of Biomolecules(用于生物分子的多重光学编码的量子点标记的微珠)”，Nat Biotechnol(2001年7月)第19卷，第631-635页。本领域技术人员应理解存在多种量子点，其可用作荧光标记物并用于本发明的实施方式并可从多个销售商处获得。示例性量子点(OD)包括但不限于以下：硒化镉(CdSe)量子点纳米颗粒(例如CdSe量子点核心，480-640nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-))；硫化镉(CdS)量子点纳米颗粒(例如CdS量子点核心，380-480nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)；硫化锌加帽的硒化镉(ZnS加帽的CdSe)纳米晶体(例如CdSe/ZnS Lumidots^TM和CdSe/ZnS NanoDots^TM，480-640nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)；以及无镉的量子点(例如CFQD^TM，400-650nm发射光谱，西格玛-奥德里奇公司)。

在一个实施方式中，荧光团以足够的量存在，使得荧光团是可检测的。在一个实施方式中，每1纳升体积的分区中存在至少1-100个荧光团、100-1000个荧光团、1000-10000个荧光团、10000-100000个荧光团、100000-1百万个荧光团、1百万-1千万个荧光团、或至少1千万-1亿个荧光团。在分区体积小于1纳升的实施方式中，每份分区中存在更少的荧光团(例如每50毫微微升分区体积为1-100个荧光团)。

缺口填充的质粒可以在基于细胞的表达系统中或在无细胞表达系统中。在表达系统是细胞的实施方式中，可以将缺口填充的质粒转化到细菌，酵母细胞，昆虫细胞或哺乳动物细胞中。在一些实施方式中，细菌细胞，酵母细胞，哺乳动物细胞或昆虫细胞包含聚合酶缺口填充和切开的质粒，其具有来自M13mp2噬菌体或质粒的P_lac/lacZα基因区段。在一些实施方式中，酵母细胞包含衍生自逆转录酶缺口填充和切开的RNA/DNA杂交模板的环状单链DNA，其通过使用由MS2噬菌体和合成的单链DNA制备的单链RNA产生。

在具有细胞的实施方式中，每个分区或细胞可包括用于检测细胞存在的指示剂。示例性指示剂包括但不限于荧光蛋白，自发荧光蛋白，细胞染色染料，核酸酶警报试剂(例如，荧光淬灭的寡核苷酸探针的试剂，其仅在核酸酶降解后发射荧光信号)，核酸酶活性(例如，来自质粒编码的核酸酶的核酸酶活性或来自细胞的内源核酸酶活性)和抗生素抗性(例如，可通过浊度或质量检测)。示例性活细胞染色染料包括但不限于羰花青(例如，来自ThermoFisher公司的DiI(DiIC18(3))，DiO(DiOC18(3))，DiD(DiIC18(5))和DiR(DiIC18(7)))，吖啶橙，苯胺黄，俾斯麦棕Y，羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯，DiOC6，Green S，亚甲蓝，中性红，新亚甲蓝，尼罗蓝，尼罗红，番红，FAM^TM和HEX^TM。

在具有基于细胞的表达系统的实施方式中，形成分区的溶液还包括生长细胞所需的和细胞中表达由质粒编码的酶所需的任何组分。在一些实施方式中，溶液包含培养基(例如，改良伊氏培养基，Luria肉汤)和抗生素以选择具有抗生素抗性的细胞。含有细胞的溶液可以在一温度下孵育以生长细胞并在形成分区之前或之后表达酶。用于培养细胞的孵育温度取决于所使用的细胞系统，温度范围可为30℃至100℃。在使用细菌细胞的一些实施方式中，用于培养细菌细胞的孵育温度可以是37℃。在使用酵母细胞的一些实施方式中，用于培养酵母细胞的孵育温度可以是32℃。

在具有无细胞表达系统的实施方式中，除了缺口填充的质粒之外，形成分区的溶液还可包括体外转录和翻译所需的组分，包括但不限于细胞提取物，能源，氨基酸供应和镁等辅助因子。示例性能源包括但不限于磷酸烯醇丙酮酸盐，乙酰磷酸盐和肌酸磷酸盐。

每个分区还可以包括诱导物，用于诱导质粒编码的酶的表达。在酶是β-半乳糖苷酶的实施方式中，诱导物可以是异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，甲基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，乳糖或乳糖衍生物。在使用毒素-抗毒素系统的实施方式中，由第一集合形成的分区包括诱导抗毒素表达的诱导物。在其中CcdB/CcdA毒素-抗毒素由质粒表达的实施方式中，CcdA的诱导物可以是四环素。在一些实施方式中，编码毒素-抗毒素的质粒包括Lac启动子，诱导物是IPTG。在一些实施方式中，编码毒素-抗毒素的质粒包括araS启动子，诱导物是阿拉伯糖。

分区可包括多种类型的分区中的任一种，包括固体分区(如孔或管)和流体分区(如油相内的水相或液滴)。在一些实施方式中，分区是液滴。在一些实施方式中，分区是微通道。用于划分溶液的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2012/135259、WO2014/117088、WO 2010/036352和US 9156010，其全部内容各自通过引用纳入本文。

在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，生成的液滴中少于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。

在一个实施方式中，使油相流过水相，从而形成液滴。用于油相的油可经合成或天然存在。在一些实施方式中，所述油包括碳和/或硅。在一些实施方式中，所述油包括氢和/或氟。示例性的油包括但不限于硅油、矿物油、氟碳油、植物油或其组合。

该油相可包含氟化原油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该原油包括以下一种或多种：HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或其他常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62％。

在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.18％(w/w)的浓度。

在一些实施方式中，通过使油相流过水溶液相来形成液滴，所述水溶液相具有缺口填充的质粒或含缺口填充的质粒的细胞和用于确定聚合酶保真度的一种或多种组分(例如，试剂)。在一些实施方式中，用于测定水性液滴中聚合酶保真度的一种或多种组分可溶于和/或混溶于水，包括但不限于，一种或多种盐、缓冲剂、试剂(例如底物)、表面活性剂、和/或可用于在所形成的液滴内发生期望反应所需的任意其他组分。所有这种其他组分可经选择以与所需的反应或待进行的试验相容。

在其中液滴具有缓冲剂的一些实施方式中，可以将质粒或细胞和其他测定组分(例如底物)注射到分区中。可以以任何顺序或同时将质粒或细胞和测定组分注射到分区中。在一些实施方式中，将质粒或细胞注射到分区中，然后注射底物。在某些实施方式中，将底物注射到分区中，然后注射质粒或细胞。

在其中分区由具有质粒或细胞的水相形成的一些实施方式中，将底物注入分区中。在其中分区由具有底物的水相形成的一些实施方式中，将质粒或细胞注入分区中。

向分区中注射流体的方法描述于，例如，WO2012/135259和US2012/0132288，其各自通过引用其全文纳入本文。

在一些实施方式中，形成了至少500个分区(如液滴)、至少1000个分区、至少2000个分区、至少3000个分区、至少4000个分区、至少5000个分区、至少6000个分区、至少7000个分区、至少8000个分区、至少10,000个分区、至少15,000个分区、至少20,000个分区、至少30,000个分区、至少40,000个分区、至少50,000个分区、至少60,000个分区、至少70,000个分区、至少80,000个分区、至少90,000个分区、至少100,000个分区、至少200,000个分区、至少300,000个分区、至少400,000个分区、至少500,000个分区、至少600,000个分区、至少700,000个分区、至少800,000个分区、至少900,000个分区、至少1,000,000个分区、至少2,000,000个分区、至少3,000,000个分区、至少4,000,000个分区、至少5,000,000个分区、至少10,000,000个分区、至少20,000,000个分区、至少30,000,000个分区、至少40,000,000个分区、至少50,000,000个分区、至少60,000,000个分区、至少70,000,000个分区、至少80,000,000个分区、至少90,000,000个分区、至少100,000,000个分区、至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。

在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。

在一些实施方式中，生成的液滴在体积上基本均匀。例如，在一些实施方式中，生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL、或约50nL。

在一些实施方式中，这些分区(如液滴)是稳定的且能够长期储存。在一些实施方式中，这些分区可在约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下长时间储存(例如至少30天、至少60天、至少90天或更长)。

本文描述的分区能够含有一种或多种表面活性剂以减少移动过程中液滴的聚结。本文所用的“表面活性剂”是表面活性物质，能够减少含有该物质的液体的表面张力。表面活性剂，也可以或选择性地描述为洗涤和/或润湿剂，可引入亲水部分和疏水部分，它们可同时赋予表面活性剂双重亲水性-疏水性。表面活性剂在一些情况下可通过其亲水性与疏水性之比来表征。在一些实施方式中，水相纳入至少一种亲水性表面活性剂。水相可包括至少一种非离子表面活性剂和/或离子表面活性剂。在某些实施方式中，水相包括表面活性剂，该表面活性剂是聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物。在一些实施方式中，表面活性剂是以商品名PLURONIC及TETRONIC(巴斯夫(BASF)公司)销售的聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的嵌段共聚物。在一些实施方式中，表面活性剂是以商品名PLURONIC F-68销售的聚环氧丙烷和聚环氧乙烷的非离子嵌段共聚物。在一些实施方式中，水相的表面活性剂是水溶性和/或亲水性氟表面活性剂。水相的示例性氟表面活性剂以商品名ZONYL(杜邦(DuPont)公司)销售，例如ZONYL FSN氟表面活性剂。在一些情况下，表面活性剂可包括聚山梨醇酯20(以商品名TWEEN-20美国ICI公司(ICI Americas，Inc.)销售)。水相中的特定表面活性剂或总表面活性剂的浓度可经选择以在加热前使乳液液滴稳定。在一些实施方式中，水相的表面活性剂的浓度以重量计为0.01-10％，0.05-5％，0.1-1％或0.5％。

C.检测

在示例性步骤130中，检测缺口填充的质粒的存在。在一些实施方式中，通过例如下述方法检测缺口填充的质粒的存在：检测由缺口填充的质粒标记物发射的信号，检测由缺口填充的质粒编码的荧光蛋白或检测由缺口填充的质粒编码的酶切割的底物产生的信号。在缺口填充的质粒在细胞中的实施方式中，通过下述方法检测细胞的存在：例如，细胞的抗生素抗性，检测来自细胞的内源核酸酶活性，检测由缺口填充的质粒编码的荧光蛋白或检测由缺口填充的质粒编码的酶切割的底物产生的信号。

在使用毒素/抗毒素(例如，CcdB/CcdA)基于细胞的系统的实施方式中，检测来自第一集合的一个或多个分区中抗毒素中和的毒素和突变毒素的存在以确定转化体的总数并且检测来自第二集合的一个或多个分区中突变体毒素的存在以确定含突变毒素的分区的数量。

在一些实施方式中，数字读出测定(例如，数字分析)可用于通过鉴定含有缺口填充的质粒标记物和/或细胞指示剂的分区来检测缺口填充的质粒和/或细胞。通常，数字分析的过程涉及：针对待检测标记物和/或指示剂的存在，确定各分区是阳性还是阴性。如果在分区中检测到来自标记物或指示剂的信号，则分区对于缺口填充的质粒或细胞的存在而言是“阳性的”。如果在分区中没有检测到信号，则分区对于缺口填充的质粒或细胞的存在而言是“阴性的”。

在一些实施方式中，能够检测单个信号或多个信号的检测器被用于分析各分区中是否存在缺口填充的质粒和/或细胞。例如，在一些实施方式中，使用双色读取器(荧光检测器)。阳性计数分区的分数可用于确定聚合酶的保真度，如将在下一部分中描述的。

D.保真度确定

在示例性步骤140中，通过确定含有编码功能性酶的基因的分区与含有编码非功能性酶的基因的分区的比率来确定聚合酶保真度。在一些实施方式中，以下等式用于确定聚合酶的保真度或错误率(参见Fortune J.M.等，J.Biol.Chem.2005；280：29980-29987)，

其中：

Ni＝特定突变类型的数量(例如，删除/插入或碱基取代)

N＝突变的总数

MF＝观察到的突变频率-背景突变频率

D＝特定突变的可检测位点的数量

P＝表达突变体lacZα基因的概率(表达频率)

对于等式1，突变类型(Ni)可以仅通过对突变lacZα基因的DNA测序来确定。在没有测序的情况下，Ni/N＝1，并且该等式可以仅确定总突变。其他蛋白质的表达频率可以凭经验确定。

为了用毒素/抗毒素系统确定聚合酶的保真度(或错误率)作为示例，从转化体的总数中减去含有突变毒素的分区的数量，以确定含有野生型毒素的分区的数量，然后确定含突变毒素的分区数量与含野生型毒素的分区数量之比。

III.试剂盒

在另一方面，提供用于根据本文所述的方法确定聚合酶保真度的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒包含从中形成带缺口的质粒的质粒，或如本文所述的带缺口质粒。在一些实施方式中，带缺口的质粒包含双链DNA或杂交DNA/RNA。在一些实施方式中，试剂盒还包含由质粒编码的酶的底物。在一些实施方式中，试剂盒还包含试验组分(例如缓冲液、缓冲盐和/或表面活性剂)。在一些实施方式中，试剂盒还包含油(例如硅油，矿物油，氟烃油和/或植物油)，用于制备包含缺口填充的质粒的油包水液滴。在一些实施方式中，试剂盒还包括用来进行本文所述方法的说明。

IV.系统

还提供了进行本发明所述方法的系统。在一些实施方式中，这些系统包括一个或多个储器，其包含本文所述的反应组分或多个分区(如液滴)。在一些实施方式中，该系统还包含一个或多个微流体通道，该微流体通道提供一个或多个储器和检测器之间的流体连通。在一些实施方式中，所有上述组件都以单个筒匣的一部分提供。在一些实施方式中，该筒匣可继而插入歧管中以接合一个或多个泵，这些泵设置成将推动液滴通过微流体通道。

在一些实施方式中，该系统还包含一种或多种液滴注射器。在一些实施方式中，该系统包括一个或多个液滴注射器，所述液滴注射器经配置以将样品、结合剂和/或标志物中的一个或多个注射入分区。液滴注射器描述于，例如，WO2012/135259和US2012/0132288，其各自通过引用其全文纳入本文。

示例性系统组件描述于，例如，US2011/0151578、US2011/0218123、US2012/0222748、US2011/0218123、US2012/0222748、WO2012/135201、WO2012/135259、WO2014/043388、WO2012/135327。

本文所述的检测器可检测来自(i)质粒标记物和/或(ii)质粒编码的酶中的一种或两种信号，以确定聚合酶保真度。在一些实施方式中，乳液流中的液滴流过微流体通道，其通过测量来自液滴的荧光信号的光学检测器。

可通过本领域技术人员了解和理解的用于分光光度分析的任何方法来测量标记物和/或指示剂的分光光度强度和波长。可用于本发明的分光光度方法包括但不限于：本领域技术人员已知的激光和光检测器对系统或更复杂的光学器件，其中光束的路径与分光光度物质的路径相交且标记物和/或标志物的激发或照射被光程捕捉，所述光程包括一个或多个物镜、反光镜和/或透镜，以将光导向光电倍增管(PMT)或光敏照相机。在一个实施方式中，荧光检测方法使用流式细胞术仪器。分光光度强度测量可包括一种或多种方法，包括但不限于光散射、吸收、化学发光、荧光强度、辐射衰减计数、比色。将待测试分区置于激发能量源(如光源)的路径中，所述光源选自但不限于激光器、发光二极管(LED)、弧光灯、宽频带光源和高强度灯泡。待测试分区中的标记物和/或指示剂以波长基本不同于光源的波长的光的形式散射、吸收、发化学光(chemiluminesce)或发荧光(在本文中也称作“信号”)。随后通过检测器或传感器捕获该来自待测试分区的光，所述检测器或传感器选自但不限于照相机、电荷偶联装置(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)(或者称作互补对称金属氧化物半导体(COS-MOS))、一种或多种单一光电二极管、光电二极管阵列(PDA)、雪崩光电二极管(APD)、雪崩光电二极管阵列、光电倍增管(PMT)或光电倍增管阵列。

已知的光学或电子方法可任选地用于扩增来自光源的光和/或来自待测试样品的光和/或将一种或全部两种分离为其组分波长。

在一些但不是所有实施方式中，本发明所述系统和方法的所有组件都是微流体的。本文中，“微流体”指含至少一个流体通道的装置、仪器或系统包，该流体通道的截面尺寸小于1mm，且长度与垂直于通道的最大截面尺寸比为至少约3∶1。本文所用的“微流体通道”是符合这些标准的通道。

可提供能够导致两个或更多个液滴融合或聚结成一个液滴的微流体系统，例如在两个或更多个液滴通常无法融合或聚结的情况中，例如由于组成、表面张力、液滴尺寸等，如本领域普通技术人员已知的那样。可使用任何合适的技术将流体液滴融合在一起，例如，参见Link等2005年10月7日提交的美国专利申请系列号11/246,911(标题为“Formationand Control of Fluidic Species(流体物质的形成和控制)”)，其在2006年7月27日公开为美国专利申请公开号2006/0163385；或Link等2006年2月23日提交的美国专利申请系列号11/360,845(标题为“Electronic Control of Fluidic Species(流体物质的电子控制)”)，其在2007年1月4日公开为美国专利申请公开号2007/0003442，其各自通过引用纳入本文。例如，在微流体系统中，相对于液滴尺寸的液滴表面张力可阻止发生液滴的融合或聚结。在一个实施方式中，对两个液滴给予相反的电荷(即正电荷和负电荷，无需相同幅度)，其可提高两个液滴的电相互作用从而发生液滴的融合或聚结。通过使用泰勒锥或通过任何其他合适的技术将电荷(正或负)施加到液滴上。例如，可对含有液滴的反应器施加电场，这些液滴可通过电容器，可发生化学反应以导致液滴带电荷，在具有相反湿润性质的区域上流动液滴，等。

通道的“截面尺寸”以垂直于流体流动方向测量。在一些实施方式中，流体通道的最大截面尺寸小于约2mm，且在一些情况中小于约1mm。在一组实施方式中，所有流体通道都是微流体或最大截面尺寸不超过约2mm或约1mm。在某些实施方式中，这些流体通道可部分通过单一组件形成(例如蚀刻的底物或模塑单元)。较大的通道、管道、腔体、储器等可用于储存大量流体和将流体递送至本发明的组件。在一些实施方式中，包含本发明的实施方式的通道的最大截面尺寸小于约500微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米或小于约25微米。

本文中，“通道”指至少部分引导流体流的制品(物质)上方或内部的特征。该通道可具有任何截面形状(圆形、椭圆形、三角形、不规则形状、方形或矩形等)并可以是被覆盖的或未覆盖的。在其被完全覆盖的实施方式中，至少一部分通道可具有完全闭合的截面，或整个通道可沿其整个长度完全闭合(其入口和出口除外)。通道还可具有至少约2∶1的纵横比(长度与平均截面尺寸的比率)，更通常是至少约3∶1、至少约5∶1或至少约10∶1或更多。开放的通道通常将包括促进对流体运输控制的特性，例如结构特性(延长的压痕)和/或物理或化学特性(疏水性对比亲水性)或可对流体施加作用力(如包含力(containing force))的其他特性。通道内的流体可部分或全部充满通道。在一些情况中，当使用开放的通道时，流体可维持在通道内，例如使用表面张力(即凸形或者凹形弯月面)。

该通道可以是任何尺寸，例如，与流体流垂直的最大尺寸小于约5mm或约2mm，或小于约1mm，或小于约500微米，小于约200微米，小于约100微米，小于约60微米，小于约50微米，小于约40微米，小于约30微米，小于约25微米，小于约10微米，小于约3微米，小于约1微米，小于约300nm，小于约100nm，小于约30nm，或小于约10nm。在一些情况中，可选择通道的尺寸使得流体能够自由地流过制品或物质。还可选择通道的尺寸以例如允许通道内流体有特定体积或线性流速。当然，可通过本领域普通技术人员已知的任何方法改变通道的数目和通道的形状。在一些情况中，可以使用超过一条通道或毛细管。例如，可以使用两条或更多条通道，其中其位于彼此内部，彼此相邻，彼此相交等。

可用于本发明的微流体系统的非限制性示例公开于：2005年10月7日提交标题为“Formation and Control of Fluidic Species(流体物质的形成和控制)”的美国专利申请系列号11/246,911，其在2006年7月27日公开为美国专利申请公开号2006/0163385；2004年12月28日提交标题为“Method and Apparatus for Fluid Dispersion(流体分散的方法和设备)”的美国专利申请系列号11/024,228，其在2005年8月11日公开为美国专利申请公开号2005/0172476；2006年2月23日提交标题为“Electronic Control of FluidicSpecies(流体物质的电子控制)”的美国专利申请系列号11/360,845，其在2007年1月4日公开为美国专利申请公开号2007/000342；2006年3月3日提交的标题为“Method andApparatus for Forming Multiple Emulsions(形成多种乳液的方法和设备)”的国际专利申请号PCT/US2006/007772，其在2006年9月14日公开为WO 2006/096571；2006年3月3日提交的标题为“System and Method for Forming Particles(形成颗粒的系统和方法)”的美国专利申请系列号11/368,263，其在2007年3月8日公开为美国专利申请公开号2007/0054119；2007年3月28日提交的标题为“Multiple Emulsions and Techniques forFormation(多种乳液及其形成技术)”的美国临时专利申请系列号60/920,574；以及2006年1月20日提交的标题为“Systems and Methods for Forming Fluidic propletsEncapsulated in Particles Such as Colloidal Particles(用于形成包封在诸如胶体颗粒的颗粒中的流体液滴的系统和方法)”的国际专利申请号PCT/US2006/001938，其在2006年7月27日公开为WO 2006/078841，其各自通过引用全文纳入本文。

计算机执行的方法和系统

本文所述任何方法均可全部或部分地使用包括一个或多个处理器的计算机系统进行，可对其进行配置以完成所述方法的步骤。因此，实施方式可指向被配置以执行本文所述任意方法的步骤的计算机系统，潜在地具有执行相应步骤或相应步骤组合的不同组分。虽然以编号或有序步骤呈现，但本文所述方法的步骤可在同一时间或以不同顺序执行。此外，这些步骤的部分可与来自其他方法的其他步骤的部分联用。同样，步骤的全部或部分可以是任选的。此外，任何方法的任何步骤都可使用模块、循环或用于执行这些步骤的其他手段执行。

在一些实施方式中，所述计算机执行方法通过计算机系统执行，该系统与能够检测例如微流体装置的通道中或微流体装置中的图像中的分区发出的信号的检测器电子通信。

本公开还提供了一种能够执行本文所述的方法的任何一个或所有步骤的计算机产品。因此在一些实施方式中，所述计算机产品包括非瞬时计算机可读介质，其储存用于控制处理器执行本发明所述的一种或多种方法步骤操作的多项指令。

图2显示了可用于根据本发明的实施方式的方法和系统的示例性计算机系统200的框图。

本发明提及的任何计算机系统都可利用任何适当数量的子系统。这类子系统的示例如图2中计算机设备200所示。在一些实施方式中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是该计算机设备的组件。在其他实施方式中，计算机系统可包括多个计算机设备，其各是子系统，具有内部组件。

图2所示的子系统经由系统总线275互联。显示了其他子系统，如打印机274、键盘278、储存装置279、与显示适配器276偶联的监视器282等。与输入/输出(I/O)控制器271偶联的周边和I/O装置可通过任何数量的本领域已知方式(如串行端口277)连接至计算机系统。例如，串行端口277或外部接口281(例如以太网、Wi-Fi等)可用于将计算机系统200连接至广域网(如因特网)、鼠标输入装置或扫描仪。经由系统总线275的互联允许中央处理器273与各子系统连通并控制来自系统内存272或储存装置279(例如固定磁盘，如硬盘或光盘)指令的执行以及子系统间信息的交换。系统存储器272和/或储存装置279可包含计算机可读介质。本文所述的任何数据都可从一种组件输出至另一种组件并可输出至用户。

计算机系统可包括多种相同的组件或子系统，例如通过外部接口281或通过内部接口连接在一起。在一些实施方式中，计算机系统、子系统或设备可通过网络连通。在这种情况下，可将一台计算机作为客户端并将另一台计算机作为服务器，其中各计算机都可以是同一计算机系统的部分。客户端和服务器可各包括多个系统、子系统或组件。

应理解，上述实施方式可使用硬件(例如专用集成电路或现场可编程门阵列)以控制逻辑的形式和/或采用一般可编程的处理器使用计算机软件以模块化或集成化的方式来实施。本文中，处理器包括同一集成芯片上的多核处理器或者单个电路板上或网络连接的多个处理单元。基于本发明的公开和教导，本领域普通技术人员应知晓并理解使用硬件以及硬件和软件的组合来实施本文所述的实施方式的其他方式和/或方法。

本申请中描述的任何软件组件或函数都可作为软件代码使用，以由处理器使用任何适当的计算机语言(如Java、C++或Perl)、使用例如常规或面向对象的技术来执行。软件代码可作为一系列指令或命令储存于计算机可读介质上用于储存和/或传输，合适的介质包括随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、磁性介质(如硬盘或软盘)、光学介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘)、闪速存储器等)。计算机可读介质可以是这里储存或传输装置的任意组合。

也可使用适用于传输的载波信号经由遵循多种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)编码和传输这类程序。同样地，可使用这类程序编码的数据信号来建立本公开的一个实施方式所述的计算机可读介质。程序代码编码的计算机可读介质可与兼容性装置打包或由其他装置单独提供(例如通过因特网下载)。任何这类计算机可读介质可存在于单个计算机产品(例如硬盘、CD或整个计算机系统)之上或之内，且可存在于系统或网络中不同计算机产品之上或之内。计算机系统可包括监视器、打印机或将本发明所述任何结果提供给用户的其他合适显示装置。

实施例

仅以说明的形式而非限制的形式提供以下实施例。本领域技术人员不难了解，可改变或调整各种非关键参数而获得基本相同或相似的结果。

实施例1-确定聚合酶保真度的方案1

该实施例说明了确定DNA聚合酶保真度的方法。在该方案中(参见图3)，基于如Keith B.J.，Jozwiakowski S.K.，和Connolly B.A.Anal.Biochem.2013年2月15日；433(2)：153-161所述的修饰的基于质粒的带缺口DNA制备方法制备带缺口DNA模板。带缺口的质粒具有编码β-半乳糖苷酶的基因用于确定DNA聚合酶的保真度，并具有mKO荧光蛋白用于检测分区中细胞的存在。在用DNA聚合酶缺口填充质粒后，将切开的质粒转化到感受态细菌细胞中。分区由含有细菌细胞和β-半乳糖苷酶和mKO荧光蛋白表达和检测所需的组分(例如，β-半乳糖苷酶诱导物和底物，具有低荧光的培养基)的溶液形成。根据泊松分布调整细胞与分区的比率，使得每个分区包含一个细胞或不含细胞。将分区在37℃孵育过夜以允许细胞生长和蛋白质表达。第二天，当每个分区暴露于光时，如果存在，切割的β-半乳糖苷酶底物和mKO荧光蛋白发出荧光信号。如确定具有功能性与非功能性β-半乳糖苷酶的分区那样确定空的和含细胞的分区。含有细胞的分区中功能性与非功能性β-半乳糖苷酶分区的比率用于确定DNA聚合酶的保真度。

实施例2-确定聚合酶保真度的方案2

该实施例说明了确定逆转录酶保真度的方法。根据该方案(参见图4)，通过使用由MS2噬菌体制备的单链RNA和合成的单链DNA产生带缺口的RNA/DNA杂交模板。带缺口的质粒具有编码β-半乳糖苷酶的基因用于确定逆转录酶的保真度，并具有mKO荧光蛋白用于检测分区中细胞的存在。在用逆转录酶缺口填充质粒后，将切开的杂交质粒转化到酵母细胞中。分区由含有酵母细胞和β-半乳糖苷酶和mKO荧光蛋白表达和检测所需的组分(例如，β-半乳糖苷酶诱导物和底物)的溶液形成。根据泊松分布调整细胞与分区的比率，使得每个分区包含一个细胞或不含细胞。将分区在32℃孵育过夜以允许细胞生长和蛋白质表达。第二天，当每个分区暴露于光时，如果存在，切割的β-半乳糖苷酶底物和mKO荧光蛋白发出荧光信号。如确定具有功能性与非功能性β-半乳糖苷酶的分区那样确定空的和含细胞的分区。含有细胞的分区中功能性与非功能性β-半乳糖苷酶分区的比率用于确定逆转录酶的保真度。

实施例3-液滴中细菌细胞生长的验证

该实施例说明了液滴系统中细胞的生长。将含有或不含有JM109细菌细胞的油包水滴在37℃下孵育过夜。第二天，在显微镜下观察细菌细胞的集落，如图5B中的箭头所示。图5A显示没有细菌细胞的液滴。

实施例4-液滴中β-半乳糖苷酶活性的验证和功能性检测

该实施例说明了油包水滴中的β-半乳糖苷酶活性的检测和验证。分别用质粒pUC19或pET11转化JM109细菌细胞。pUC19质粒含有LacZα-肽，并与β-半乳糖苷酶α-互补系统相容。pET11质粒用作阴性对照。转化后，在荧光素二-β-D-半乳糖吡喃糖苷(FDG)和诱导物异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)存在下，使用油包水液滴系统划分转化体。用于EvaGreen的Bio-Rad QX200^TM液滴生成油(目录号1864005)用于制备油包水液滴。将含有转化体的液滴在37℃下孵育过夜，以允许细胞生长，蛋白质表达和底物切割。在底物切割后，通过半乳糖苷酶将FDG转化为半乳糖，并且在荧光显微镜下检测具有绿色荧光的荧光素，如图6A所示。图6A和6D显示了用pUC19转化的JM109细胞的液滴，图6B和6E显示了用pET11转化的JM109细胞的液滴，并且图6C和6F显示没有细胞的液滴。图6B显示来自细胞的背景荧光，并且图6C显示由于不存在细胞而没有荧光。

实施例5-使用HEX的核酸酶敏感型寡聚物底物检测液滴中细胞和β-半乳糖苷酶活性

该实施例说明了液滴中β-半乳糖苷酶活性和细胞存在的检测。将lac操纵子和lacZα片段的以下基因区段在Cla-1和AfI-II限制酶位点处克隆到双表达载体(例如，pETDuet-1，诺瓦基公司(Novagen))中：

Cla-I(ATCGAT)

ATCGATccTcAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGAcCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTcAgcGGCGAATGGCGCTTTGCCTGGTTTCCGGCACCAGAAGCGGTGCCGGAAAGCTGGCTGGAGTGCGATCTTCCTGAGGCCGATACGGTCGTCGTCCCCTCAAACTGGCAGATGCACGGTTACGATGCGCCCATCTACACCAACGTAACCTATCCCATTACGGTCAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGAGAATCCGACGGGTTGTTACTCGCTCACATTTAATGTTGATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCCAGACGCGAATTATTTTTGATGGCGTTCCTATTGGTTAATGCTTAAG

AfI-II(CTTAAG) SEQ ID NO：1

在将质粒转化入JM109细菌细胞后，在FDG，HEX/猝灭剂标记的核酸(核酸酶底物)，IPTG和羧苄青霉素(抗生素)存在下，使用油包水液滴系统划分转化体。用于EvaGreen的Bio-Rad QX200^TM液滴生成油(目录号1864005)用于制备油包水液滴。然后将含有转化体的液滴在37℃下孵育过夜，以允许细胞生长，蛋白质表达和底物切割。

孵育过夜后，通过使用Bio-Rad QX200液滴读数器检测每个液滴内FAM(Ch1)和HEX(Ch2)荧光信号的存在。图7A是来自切割的β-半乳糖苷酶底物的信号(例如，FAM信号；Y-轴)对来自切割的核酸酶底物的信号(例如，HEX信号；X-轴)的图。图7A显示了两种不同的液滴群的检测：空液滴和具有带功能性半乳糖苷酶活性的细胞的液滴。在图7A中，在抗生素存在下细菌细胞的生长导致内源细菌核酸酶的释放，其又切割HEX/猝灭剂标记的核酸寡聚物并产生HEX信号(X-轴)。此外，细胞内功能性β-半乳糖苷酶的表达切割底物FDG并产生FAM信号(Y轴)。结果，没有FAM和HEX信号的液滴群表示空液滴(图7B的Ch1-/Ch2-)。相反，具有FAM和HEX信号(图7B的Ch1+/Ch2+)的液滴群表明存在活细菌细胞和功能性β-半乳糖苷酶活性。

实施例6-确定聚合酶保真度

该实施例说明了根据本发明确定聚合酶保真度。

实施例5的双表达载体用于通过使用Keith B.J.，Jozwiakowski S.K.，和Connolly B.A.Anal.Biochem.2013年2月15日；433(2)：153-161中描述的方法产生带缺口的质粒。简言之，携带lac操纵子和lacZα的双链质粒区段的侧翼是两个单链切口核酸内切酶位点。切口位点的存在允许切割双链之一，并且随后在互补竞争DNA的存在下除去切割链。单链区域中含有lac操纵子和lacZα报道基因片段的纯化的带缺口质粒用于确定聚合过程中聚合酶的错误率。整个过程统称为聚合酶保真度测试。

在聚合酶保真度测试期间，将带缺口的质粒与靶聚合酶在该聚合酶的所需温度下孵育。带缺口的质粒的游离3′末端用作起始点，而带缺口的质粒的单链区用作聚合模板。聚合后，产生单切口质粒，并转化到JM109细菌细胞中。接下来，通过使用等于或低于0.15个细胞/液滴(CPD)水平的油包水液滴系统来划分JM109转化体，以确保少于1％的液滴携带2个或更多细胞。除了带切口的质粒外，每个分区还含有荧光素二-D-吡喃半乳糖苷(FDG，β半乳糖苷酶底物)，HEX/猝灭剂标记的核酸寡聚物(核酸酶底物)，乳糖(蛋白质表达的诱导物)和羧苄青霉素(抗生素)。然后将含有转化体的液滴在37℃下孵育过夜，以允许细胞生长，蛋白质表达和底物切割。

孵育过夜后，通过使用Bio-Rad QX200液滴读数器检测每个液滴内FAM(Ch1)和HEX(Ch2)荧光信号的存在。如在前面的实施例中，通过HEX信号检测活细菌细胞的存在，并且通过FAM信号检测细胞内功能性β-半乳糖苷酶的表达。没有FAM和HEX信号的液滴指示空液滴(例如，如图7B中的Ch1-/Ch2-)。具有FAM和HEX信号的液滴(例如，如图7B中的Ch1+/Ch2+)表明存在活细菌细胞和功能性β-半乳糖苷酶活性。仅具有HEX信号的液滴表示聚合期间聚合酶引入的lacZα片段中的突变(例如，如图7B中的Ch1-/Ch2+)。然后通过计算突变体与非突变液滴群的比率来确定聚合的错误率。

实施例7-确定聚合酶保真度-毒素/抗毒素系统

该实施例说明了根据本发明使用液滴中细胞内的CcdA/CCdB II型毒素-抗毒素系统确定DNA聚合酶保真度。CcdB是来自大肠杆菌F质粒上的ccd系统的毒素，并且用作促旋酶毒物。CcdA是一种与CcdB相互作用以中和其毒性的解毒剂。含有CcdA/CCdB II型毒素-抗毒素系统的质粒用于通过使用Keith B.J.，Jozwiakowski S.K.，和ConnollyB.A.Anal.Biochem.2013年2月15日；433(2)：153-161中描述的方法产生带缺口的质粒。简言之，将CcdA的表达置于特定诱导物(例如IPTG或四环素)的控制下。相反，CcdB在本系统中组成型表达。携带CcdB基因的双链质粒区段的侧翼是两个单链切口核酸内切酶位点。切口位点的存在允许切割双链之一，并且随后在互补竞争DNA的存在下除去切割链。单链区域中含有CcdB基因片段的纯化的带缺口质粒用于确定聚合过程中聚合酶的错误率。

在聚合酶保真度测试期间，将带缺口的质粒与靶聚合酶在该聚合酶的所需温度下孵育。带缺口的质粒的游离3′末端用作起始点，而带缺口的质粒的单链区用作聚合模板。聚合后，产生单切口质粒，然后转化到细菌细胞中。接着将转化体分成两个相等的部分，即集合A和集合B，然后用HEX/猝灭剂标记的核酸寡聚物(核酸酶的底物)、抗生素和诱导物(仅用于集合-A)划分转化体，通过以等于或低于0.15个细胞/液滴(CPD)水平使用油包水液滴系统来实现，其确保少于1％的滴剂携带2个或更多个细胞(参见图8)。将液滴在37℃孵育过夜以允许细胞生长和蛋白质表达。孵育过夜后，通过使用Bio-Rad QX200液滴读数器检测每个液滴内HEX荧光信号的存在。

如图8所示，在特异性诱导物(例如IPTG或四环素)存在下，CcdA的表达中和野生型CcdB毒性，而突变体CcdB(在聚合期间产生)保持非功能性。它们一起导致液滴内的细胞生长。因此，集合A的HEX阳性群表示转化体的总数。没有HEX信号的液滴表示空液滴。相反，集合B的HEX阳性群表示聚合期间产生的突变体的总数。结果，用集合B中的阳性液滴数减去集合A中的阳性液滴数得到野生型CcdB的数量。可通过计算集合B中突变体与野生型液滴群的比率来确定聚合的错误率。

实施例8-使用HEX的染料底物检测液滴中细胞和β-半乳糖苷酶活性

该实施例说明了液滴中β-半乳糖苷酶活性和细胞存在的检测。在FDG，C12-刃天青(HEX染料底物)，IPTG和羧苄青霉素(抗生素)存在下，使用油包水液滴系统划分实施例5的转化体。用于EvaGreen的Bio-Rad QX200^TM液滴生成油(目录号1864005)用于制备油包水液滴。然后将含有转化体的液滴在37℃下孵育过夜，以允许细胞生长，蛋白质表达和底物切割。

孵育过夜后，通过使用Bio-Rad QX200液滴读数器检测每个液滴内FAM(Ch1)和HEX(Ch2)荧光信号的存在。图9A是来自切割的β-半乳糖苷酶底物的信号(例如，FAM信号；Y-轴)对来自切割的HEX底物的信号(例如，HEX信号；X-轴)的图。图9A显示了四种不同液滴群的检测：空液滴，具有带功能性半乳糖苷酶活性的细胞的液滴，具有带半乳糖苷酶和HEX活性的细胞的液滴，以及具有带功能性HEX活性的细胞的液滴。在图9A中，在抗生素存在下细菌细胞的生长导致刃天青还原为试卤灵，其产生HEX信号(X-轴)。此外，细胞内功能性β-半乳糖苷酶的表达切割底物FDG并产生FAM信号(Y轴)。结果，没有FAM和HEX信号的液滴群表示空液滴(图9B的Ch1-/Ch2-)。相反，具有FAM和HEX信号(图9B的Ch1+/Ch2+)的液滴群表明存在活细菌细胞和功能性β-半乳糖苷酶活性。

本说明书中引用的所有专利、专利申请和其它公开的参考材料都通过引用全文结合入本文中。

序列表

<110> 生物辐射实验室股份有限公司（Bio-Rad Laboratories, Inc.）

<120> 数字聚合酶保真度测定

<130> 094263-1044518 (112310PC)

<150> US 62/329,733

<151> 2016-04-29

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 1

atcgatcctc agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct 60

ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 120

acaggaaaca gctatgacca tgattacgaa ttcactggcc gtcgttttac aacgtcgtga 180

ctgggaaaac cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag 240

ctggcgtaat agcgaagagg cccgcaccga ccgcccttcc caacagttgc gcagcctcag 300

cggcgaatgg cgctttgcct ggtttccggc accagaagcg gtgccggaaa gctggctgga 360

gtgcgatctt cctgaggccg atacggtcgt cgtcccctca aactggcaga tgcacggtta 420

cgatgcgccc atctacacca acgtaaccta tcccattacg gtcaatccgc cgtttgttcc 480

cacggagaat ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat gttgatgaaa gctggctaca 540

ggaaggccag acgcgaatta tttttgatgg cgttcctatt ggttaatgct taag 594

Claims

1.一种确定聚合酶保真度的方法，所述方法包括：

用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中所述缺口填充的质粒包含根据聚合酶保真度编码功能性或非功能性蛋白质的基因；

从溶液中形成多个分区，所述溶液包含所述缺口填充的质粒和用于检测该质粒存在的标记物；

检测一个或多个分区中所述质粒的存在；并且

通过确定含有编码功能性蛋白质的基因的分区与含有编码非功能性蛋白质的基因的分区的比率来确定聚合酶保真度。

2.如权利要求1所述的方法，其中在形成多个分区之前将所述缺口填充的质粒转化到细胞中，并且每个分区包含用于检测细胞存在的指示剂。

3.如权利要求2所述的方法，还包括在某一温度下孵育溶液或分区以使细胞生长并在形成分区之前或之后表达所述蛋白质。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述缺口填充的质粒处于无细胞表达系统中。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是酶并且所述分区还包括所述酶的底物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述酶选自β-半乳糖苷酶，荧光素酶，靶特异性蛋白酶和自杀酶。

7.如权利要求6所述的方法，还包括用于诱导β-半乳糖苷酶表达的诱导物。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述诱导物选自异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，甲基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，乳糖和乳糖衍生物。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于检测所述质粒存在的标记物选自荧光团，生物素，由所述质粒编码的荧光蛋白和由所述质粒编码的蛋白质。

10.如权利要求2或3所述的方法，其中所述指示剂选自荧光蛋白，酶，自发荧光蛋白，活细胞染色染料，核酸酶警报试剂，和抗生素抗性。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述荧光蛋白选自mKO荧光蛋白，绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白，红色荧光蛋白，红色荧光蛋白变体和黄色荧光蛋白。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述缺口填充的质粒包含编码所述荧光蛋白的基因区段。

13.如权利要求6所述的方法，其中所述β-半乳糖苷酶的底物选自荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，萘并荧光素二-(β-D-吡喃半乳糖苷)，(9H-(1，3-二氯-9，9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)β-D-吡喃半乳糖苷)，4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷和试卤灵β-D-吡喃半乳糖苷。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是2种蛋白质，并且所述2种蛋白质包括毒素和抗毒素。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述毒素是CcdB并且所述抗毒素是CcdA。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述毒素是MazF并且所述抗毒素是MazE。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述毒素是HicA并且所述抗毒素是HicB。

18.如权利要求2或3所述的方法，其中所述细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞和昆虫细胞。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

20.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是逆转录酶。

21.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述质粒选自双链DNA质粒，双链RNA质粒，DNA/RNA杂交质粒和噬菌粒。

22.一种用于确定聚合酶保真度的试剂盒，所述试剂盒包含：

包含编码蛋白质的基因的带缺口的质粒，其中所述蛋白质根据聚合酶保真度而是功能性的或非功能性的；

用于形成油包水液滴的油；和

用于实施权利要求1所述的方法的说明书。

23.一种用于确定聚合酶保真度的试剂盒，所述试剂盒包含：

从中形成带缺口的质粒的质粒，其中所述质粒包含编码蛋白质的基因，并且其中所述蛋白质根据聚合酶保真度而是功能性的或非功能性的；

用于形成油包水液滴的油；和

用于实施权利要求1所述的方法的说明书。

24.如权利要求18或19所述的试剂盒，其中所述带缺口的质粒包含双链DNA或杂交DNA/RNA。

25.一种确定聚合酶保真度的方法，所述方法包括：

用聚合酶填充带缺口的质粒以形成缺口填充的质粒，其中所述缺口填充的质粒包含编码细胞的毒素的基因和编码抗毒素的基因，并且其中所述毒素根据聚合酶保真度是功能性或非功能性的；

将所述缺口填充的质粒转化到所述细胞中；

形成包含多个转化体和用于检测所述细胞存在的指示剂的溶液；

将所述溶液等分成第一集合和第二集合；

从所述第一和第二集合各自形成多个分区，其中第一集合包含用于诱导所述抗毒素表达的诱导物；

检测来自第一集合的一个或多个分区中抗毒素中和的毒素和突变毒素的存在以确定转化体的总数并且检测来自第二集合的一个或多个分区中突变毒素的存在以确定含突变毒素的分区的数量；

从转化体的总数中减去含突变毒素的分区的数量以确定含野生型毒素的分区的数量；并且

通过确定含突变毒素的分区的数量与含野生型毒素的分区的数量的比率来确定聚合酶的保真度。

26.如权利要求25所述的方法，还包括在某一温度下孵育所述溶液、第一和第二集合或分区以使细胞生长并表达所述毒素和/或抗毒素。

27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述毒素是CcdB并且所述抗毒素是CcdA。

28.如权利要求25或26所述的方法，其中所述毒素是MazF并且所述抗毒素是MazE。

29.如权利要求25或26所述的方法，其中所述毒素是HicA并且所述抗毒素是HicB。

30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中细胞存在的指示剂选自荧光蛋白，酶，自发荧光蛋白，活细胞染色染料，核酸酶警报试剂，和抗生素抗性。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述荧光蛋白选自mKO荧光蛋白，绿色荧光蛋白，青色荧光蛋白，红色荧光蛋白，红色荧光蛋白变体和黄色荧光蛋白。

32.如权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述细胞选自细菌细胞，哺乳动物细胞，酵母细胞和昆虫细胞。

33.如权利要求25-32中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

34.如权利要求25-32中任一项所述的方法，其中所述聚合酶是逆转录酶。

35.如权利要求25-34中任一项所述的方法，其中所述质粒选自双链DNA质粒，双链RNA质粒，DNA/RNA杂交质粒和噬菌粒。

36.一种用于确定聚合酶保真度的试剂盒，所述试剂盒包含：

包含编码毒素的基因的带缺口的质粒，其中所述蛋白质根据聚合酶保真度而是功能性的或非功能性的；

用于形成油包水液滴的油；和

用于实施权利要求25所述的方法的说明书。

37.一种用于确定聚合酶保真度的试剂盒，所述试剂盒包含：

从中形成带缺口的质粒的质粒，其中所述质粒包含编码毒素的基因，并且其中功能性毒素的产生表明聚合酶保真度；和

用于实施权利要求25所述的方法的说明书。

38.如权利要求36或37所述的试剂盒，其中所述带缺口的质粒包含双链DNA或杂交DNA/RNA。