CN102071210A - 一种Nisin的红色荧光素检测方法及所用的指示菌和重组质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种nisin的红色荧光素检测方法及所用的指示菌和重组质粒，通过重组质粒载体转化宿主乳酸链球菌NZ9000得到一株能响应nisin而生成红色荧光素的基因工程指示菌。重组质粒载体含有一个受诱导型强启动子PnisA控制的红色荧光素酶cobA基因，一个氯霉素抗性基因。本发明构建的基因工程指示菌TD304可以用于快速检测nisin发酵液中nisin的含量，为确立nisin发酵生产的最佳终止点提供科学的参数，也可以用来快速检测水、食品、牛奶饮料中的nisin含量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及菌株的构建，尤其是一种nisin的红色荧光素检测方法及所用的指示菌和重组质粒。
背景技术
Nisin为乳酸链球菌素，是由某些乳酸链球菌产生的一种小分子肽，对许多引起食物腐败的革兰氏阳性菌如Clostridium，Bacillus，Listeria，Staphylococcus等属的菌株有很好的抑制作用，且对人畜无毒性，由于nisin具有的较广抗菌谱活性，因此，作为防腐剂被广泛用于食品、乳品等工业中。
目前检测nisin的常用的方法有：平板扩散法、酶联免疫吸附法、生物荧光检测法等，平板扩散法的缺点是影响精确度和敏感度的因素较多，而且所需时间长；酶联免疫吸附法虽然敏感度较高，但是易产生各种交叉反应；生物荧光检测法具有快速、灵敏且特异性强等特点，但常见的荧光素酶报告基因检测系统和绿色荧光蛋白(GFP)报告系统因受细胞、材料等自发荧光的干扰，常造成信号噪音比不高，且荧光素酶报告系统需要添加外源底物，检测方法较繁琐。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种Nisin检测特异性高、检测方法简单、检测更加快捷的一种Nisin的红色荧光素检测方法及所用的指示菌和重组质粒。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种重组质粒，其特征在于：含有一个PnisA启动子，一种选择性标记，一个复制起点，一个编码产红色荧光素酶的基因cobA。
而且，所述PnisA的启动子来自于乳酸链球菌亚种NZ9700菌株。
而且，所述选择性标记为绿霉素抗性基因Cm。
而且，所述编码产红色荧光素酶的基因cobA来自于Propionibacterium freudenreichii。
一种nisin检测指示菌，在宿主菌中转化引入如权利要求1所述的重组质粒。
而且，所述宿主菌为不产生nisin的乳酸链球菌NZ9000菌株，该受体菌含有染色体编码的nisin响应蛋白NisK和NisR。
一种nisin检测指示菌检测nisin的方法，检测的步骤是：
(1)在含有氯霉素的M17GS液体培养基中静止培养指示菌至OD600为0.5-1；
(2)稀释步骤(1)的指示菌液，制备nisin标准样品液，在标准样品液中加入0.05-0.15％吐温80并将pH调至2.5-3.5，将不同体积的标准样品液加入1ml的稀释指示菌液中；
(3)在25-35℃静止培养1.5-2.5小时；
(4)用荧光测量仪测定在紫外波长区内样品荧光强度。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明构建的工程指示菌TD304在感应nisin信号后，诱导红色荧光素酶cobA基因表达，使从而导致红色荧光素西罗双氢叶绿三酸积。红色荧光素的积累量与细胞外nisin的浓度成正比，通过检测红色荧光素的荧光强度，能够间接地得出指示菌TD304细胞外nisin的含量。
2、本发明构建的基因工程指示菌TD304可以用于快速检测nisin发酵液中nisin的含量，为确立nisin发酵的最佳终止点提供科学的参数，也可以用来快速检测水、食品、牛奶饮料中的nisin含量。
3、本发明nisin的检测方法灵敏度高，检测的nisin浓度为≥0.015ng/ml，所需时间仅为2个小时，克服了现有技术的缺点，同常用的生物荧光素(Luciferase)和绿色荧光蛋白(GFP)基因报告系统相比，本检测方法以在紫外光下发红色荧光的西罗双氢叶绿三酸作为测量对象，大大降低了自发荧光的干扰，具有背景噪音低，特异性高的优点。
附图说明
图1为本发明nisin浓度与荧光强度标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明的构建和表达原理是：
在nisin生产菌中，nisin结构基因nisA的转录受细胞外nisin自身的正向调控，而nisin作为信号分子反过来促进自身的合成则依赖于nisA的启动子PnisA、基因nisR和基因nisK三者的协调功能，nisR编码一种反应调节因子NisR，nisK编码一种组氨酸激酶NisK，该激酶能感应环境中的nisin信号分子，NisR和NisK偶联形成一个二元系统来感应和传递细胞外nisin信号并将信号传递给PnisA启动子。
Nisin信号的强弱在一定范围内与nisin的浓度成正比，而nisin的浓度则决定PnisA启动子的转录活性，进而控制结构基因nisA的表达量，因此，nisin合成的自调控信号转导可以用来构建检测细胞外nisin浓度的报导系统，即将PnisA启动子同红色荧光素合成酶基因cobA融合，放在一个能在乳酸链球菌表达的质粒上，转入不产生nisin但含有编码NisK和NisR基因的乳酸链球菌宿主菌株而形成nisin工程指示菌。
1、重组质粒pLHC-cobA的构建，该质粒载体包含一个PnisA的启动子，一种选择性标记，一个复制起点，一个编码产红色荧光素酶的基因cobA。
构建过程如下：
(1)启动子PnisA的来源
质粒pNZ8048含有PnisA启动子。用限制内切酶EcoRI、NcoI于37℃双酶切质粒pNZ80482-3小时，然后用琼脂糖胶电泳纯化线性化的质粒。
(2)产红色荧光素酶基因cobA的获得及连接
红色荧光素合成酶基因cobA来自于Propionibacterium freudenreichii
上游引物P1：5’-GATCGAAGCTTGCCGCCATGACCACCACACTGTTGC-3’
下游引物P2：5’-GATCGGCGGCCGCTCAGTGGTCGCTGG-3’
以质粒pISA417为模板
PCR反应体系为：ddH2O 20μl，10×buffer 2.5μl，dNTP 1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，模板10ng，Taq酶0.25U。
扩增条件为：94℃预变性1min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，反应30个循环；72℃延伸5min。
PCR产物(cobA)经琼脂糖凝胶电泳检测，其大小与NCBI上报道的吻合，随后在PCR扩增的上游和下游引物中分别加入BspHI和EcoRI限制酶位点，因BspHI酶切末端和NcoI酶切末端相匹配，cobA基因PCR产物经BspHI和EcoRI双酶切和纯化后直接克隆到pNZ8048的EcoRI/NcoI位点，产生的重组质粒pLHC-cobA。在该重组质粒中cobA基因位于PnisA启动子的下端，其表达受PnisA启动子控制。
2、指示菌株TD304的构建
(1)宿主菌乳酸链球菌NZ9000菌株的转化
制备宿主菌乳酸链球菌NZ9000菌株的感受态细胞，用电击法将pLHC-cobA引入受体乳酸链球菌NZ9000，涂布含有氯霉素(5ug/ml)的M17GS平板，30℃过夜培养。
(2)阳性转化子的验证
通过质粒提取，酶切和琼脂糖胶电泳来验证从平板上收集的菌落是否含有pLHC-cobA，获得的转化子为TD304指示菌。
3、一种利用指示菌TD304检测nisin的方法，过程如下：
(1)在含有氯霉素的M17GS液体培养基中静止培养指示菌TD304至OD600为0.7；
(2)稀释以上菌液150倍，制备适当浓度nisin标准样品液，在样品中加入0.1％吐温80并将pH调至3.0，将2ul到40ul不同体积的标准样品加入1ml的稀释指示菌液中；
(3)在30℃静止培养2小时；
(4)用荧光测量仪测定在紫外波长区内样品荧光强度。根据nisin浓度和所测荧光强度绘制标准曲线。该方法在nisin生产发酵液检测的最低量为0.015ng/ml。
Claims (7)
1.一种重组质粒，其特征在于：含有一个PnisA启动子，一种选择性标记，一个复制起点，一个编码产红色荧光素酶的基因cobA。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述PnisA的启动子来自于乳酸链球菌亚种NZ9700菌株。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述选择性标记为绿霉素抗性基因Cm。
4.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：所述编码产红色荧光素酶的基因cobA来自于Propionibacterium freudenreichii。
5.一种nisin检测指示菌，其特征在于：在宿主菌中转化引入如权利要求1所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的nisin检测指示菌，其特征在于：所述宿主菌为不产生nisin的乳酸链球菌NZ9000菌株，该受体菌含有染色体编码的nisin响应蛋白NisK和NisR。
7.一种利用如权利要求5或6所述指示菌检测nisin的方法，其特征在于：检测的步骤是：
(1)在含有氯霉素的M17GS液体培养基中静止培养指示菌至OD600为0.5-1；
(2)稀释步骤(1)的指示菌液，制备nisin标准样品液，在标准样品液中加入0.05-0.15％吐温80并将pH调至2.5-3.5，将不同体积的标准样品液加入1ml的稀释指示菌液中；
(3)在25-35℃静止培养1.5-2.5小时；
(4)用荧光测量仪测定在紫外波长区内样品荧光强度。
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