JP2010532999A - 高精度制限エンドヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
図1−32に関して、
*記号は、その左側のレーンが、スター活性が観察された酵素の最低濃度を含有することを示す。
本発明の一実施形態において、以下のプロトコールを用いて、制限エンドヌクレアーゼのスター活性の程度が検査される。エンドヌクレアーゼ活性は、原エンドヌクレアーゼの高い初濃度及びその系列希釈(例えば、2倍又は3倍希釈)を用いて、適切な基質に対して測定される。希釈時に、スター活性がもはや検出されないような少なくとも1つの濃度において、スター活性の観察を可能とするのに十分である限り、制限エンドヌクレアーゼの初濃度は重要でない。
NEB1:10mMBisTrisプロパン−HCl、10mMMgCl2、1mMジチオスレイトール(25℃で、pH7.0);
NEB2:50mMNaCl、10mMTris−HCl、10mMMgCl2、1mMジチオスレイトール(25℃で、pH7.9);
NEB3:100mMNaCl、50mMTris−HCl、10mMMgCl2、1mMジチオスレイトール(25℃で、pH7.9);
NEB4:50mM酢酸カリウム、20mMTris−酢酸、10mM酢酸マグネシウム、1mMジチオスレイトール(25℃で、pH7.9)。
希釈液A:50mMKCl、10mMTris−HCl、0.1mMEDTA、1mMジチオスレイトール、200mg/mLBSA、50%グリセロール(25℃で、pH7.4);
希釈液B:300mMNaCl、10mMTris−HCl、0.1mMEDTA、1mMジチオスレイトール、500mg/mLBSA、50%グリセロール(25℃で、pH7.4);
希釈液C:250mMNaCl、10mMTris−HCl、0.1mMEDTA、1mMジチオスレイトール、0.15%TritonX−100、200mg/mLBSA、50%グリセロール(25℃で、pH7.4)。
宿主細胞が、低下したスター活性が求められている変異体制限エンドヌクレアーゼを過剰発現することができるのであれば都合がよい。制限酵素がイー・コリ中で高度に発現されていれば、スター活性は未精製抽出物中で容易に検出することが可能であり、これは、高精度制限エンドヌクレアーゼのスクリーニングを簡略化する。しかしながら、酵素切断から生じる毒性から何らかの方法で宿主細胞が保護されているのであれば、変異された制限エンドヌクレアーゼは、あらゆる宿主細胞中で発現させることができる。これには、メチラーゼの存在;ゲノムへの接近に対して障壁を与える細胞の区画(封入体又は周辺質など)中での生産;インビトロでの合成、エマルジョン中での生産(米国特許出願第12/035,872号参照)宿主ゲノム中での切断部位の不存在の;インテインによって媒介される連結に供される構成要素部分中での酵素の製造(米国特許第6,849,428号参照)などが含まれ得る。
制限エンドヌクレアーゼ中の各帯電した基又は極性基をコードするDNAを個別に標的として、変異されたDNAを検査のためにクローニングし、調製し得る。各制限エンドヌクレアーゼ遺伝子中に、複数の変異を導入し得る。制限エンドヌクレアーゼの標的化された突然変異導入は、本分野において公知のあらゆる方法によって達成され得る。本明細書において使用される都合のよい方法は、逆PCRである。このアプローチでは、標的化されたコドンに加えて、コドンの5’及び3’両側に複数のヌクレオチド(例えば、18ヌクレオチド)を含有する相補的なプライマーの対が合成される。適切なプライマーの選択は、目的のアミノ酸残基周囲において、目的のエンドヌクレアーゼの遺伝子配列を概観することによって容易に達成することができる。遺伝子配列の入手は、REBASE及びGenBankを通じて行われる。本明細書において実施例中に記載されているエンドヌクレアーゼに対する配列は、図31から38及び44に記載されている。PCRに対するテンプレートは、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有するプラスミドである。ポリメラーゼは、好ましくは、Vent(R)又はDeepVentTMDNAポリメラーゼなどの高精度ポリメラーゼである。徐冷温度及びMg2+濃度を変動させることによって、多くの変異の導入を首尾よく達成することができる。次いで、PCR増幅産物を精製し、好ましくは、DpnIによって消化する。本発明の一実施形態において、対応するメチラーゼで予め修飾された形質転換受容性宿主細胞(例えば、イー・コリ)中に消化された産物を形質転換した。各変異体から得られたコロニーを拾い上げ、WTがその中で増殖された条件と類似の条件下で(例えば、類似の増殖培地、薬物選択及び温度を用いて)増殖させた。得られた制限エンドヌクレアーゼを低下したスター活性に関してスクリーニングした。
変異体制限エンドヌクレアーゼ中のスター活性を測定するために、緩衝液組成、温度及び希釈液などの条件を確定すべきである。表2及び3は、37℃で、3つの異なる希釈液を用いる4つの異なる緩衝液中での変異前及び後における組換えエンドヌクレアーゼのFIを示している。従って、何れの変異体が少なくとも2、10超、少なくとも50又は500超の全体的な望ましい改善された精度指数係数を有するかを決定し、好ましい高精度変異体として酵素を選択することが可能である。
前節に記載されているように、第一の工程は、制限エンドヌクレアーゼ中の標的アミノ酸をAlaに変異させることである。結果が満足できるものでなければ、飽和突然変異導入が行われる。これは、好ましくは、2つの方法のうちの1つによって行われる。1つの方法は、意図されるコドンをNNN中に変化させることである。突然変異導入後に、正常な条件下及びスター活性を促進する条件下で、複数のコロニーをアッセイする。あるいは、標的とされるアミノ酸のそれぞれの突然変異導入のために、異なるコドンを選択することができる。Ala:GCT;Cys:TGC;Asp:GAC;Glu:GAA;His:CAC;Ile:ATC;Lys:AAA;Leu:CTG;Met:ATG;Asn:AAC;Pro:CCG;GIn:CAG;Arg:CGT;Ser:TCC;Thr:ACC;Val:GTT;Trp:TGG及びTyr:TAC。
単一の変異がスター活性を十分に低下させなければ、2以上の変異を制限エンドヌクレアーゼ遺伝子中に導入することができる。変異の組み合わせ及び飽和突然変異導入は、何れの順序でも実施することができる。
高精度変異体は、様々なクロマトグラフィーカラムの使用など、様々な方法で精製され得る。通常の品質評価に関しては、調製物由来のDNA及び非特異的ヌクレアーゼを除去するのに、1つのFPLCヘパリンカラムで十分である。イオン交換、疎水性、サイズ排除及びアフィニティーカラムを含む複数のカラムをさらなる精製のために使用することができる。
一文字コードによって、アミノ酸が表記されている場合には、これは、標準的な命名法であることが意図されている。コードに対する鍵は、例えば、NEBカタログ2007/2008の280ページ上に与えられている。
1.BamHIメチラーゼ及びBamHIエンドヌクレアーゼを含有するプラスミドの抽出
形質転換受容性イー・コリ宿主細胞をpUC18−BamHIR及びpACYC184−BamHIMで形質転換し、標準的なminiprep技術を使用する標準的なQiagenMini−prep法(Qiagen,Valencia,CA)によって、BamHIRを抽出した。
BamHI及び関連する制限エンドヌクレアーゼOkrAIをクローニングし、配列決定した。反応がNEB緩衝液(1、2及び4)中において、37℃で行われれば、OrkAIは著しいスター活性を有することが見出された。本分析は、スター活性に必要なアミノ酸残基がBamHIとOkrAIエンドヌクレアーゼの間で類似しているという仮定を調べた。
選択された変異の点突然変異導入は、逆PCRによって行った。対応するコドンは全て、GCA(アラニン)に変化させた。突然変異導入のために、以下のプライマーを使用した。
A.異なるNEB緩衝液中でのBamHI(E86P)の活性
λDNA基質を用いて、37℃で1時間、NEB1、NEB2、NEB3、NEB4及びNEBBamHI緩衝液中で、精製されたBamHI(E86P)の活性を測定した。BamHI(E86P)は、NEB1緩衝液及びNEB2中で最も高い活性を有していたが、NEB3、NEB4及びBamHI緩衝液中で、50%、50%及び25%の活性レベルを有していた。
pUC19中には、1つのGGATCC部位(BamHI部位)及び6つのAGATCC部位(BamHIスター活性部位)が存在したので、BamHI(E86P)及びWTBamHIを比較するための好ましい基質として、pUC19を選択した。
精度指数を計算するために、希釈緩衝液で制限酵素を希釈し、グリセロール濃度は常に5%に保った。ここで使用される標準的な反応条件では、λDNA基質濃度は1μgであり、合計反応容量は50μLであった。酵素容量を10%に保つために、5μLの容量で酵素を添加した。これは、30μLの合計容量で、制限酵素3μLによって消化された基質0.6μgに等しい。37℃で1時間、NEB1、NEB2、NEB3、NEB4及びNEBBamHI緩衝液中で、1から32768までの1:2系列希釈中において、WTBamHI及びBamHI(E86P)3μLによって、λDNA0.6mgを消化した。
1時間のレベルで、BamHI(E86P)は、優れた高精度BamHI変異体であるように見受けられた。しかしながら、反応時間を延長すると(例えば、一晩又は14時間)、E86Pのスター活性が1時間の時点で検出されなかった場合でさえ、スター活性バンドが出現した(図3)。改善された高精度BamHIの検索を継続した。
配列番号19中の2、4、5、6、10、11、13、14、18、19、20、43、51、62、69、70、76、77、78、81、87、89、94、98、101、104、107、111、113、132、133、135、137、160、167、200、204、205、207、208、209、211、213の位置において、他の帯電した残基(Arg、Lys、His、Asp、Glu)をAlaへ変異させた。pUC19−BamHI(K30A)のテンプレートに対して、変異を行った。
Alaに関してはGCA、Cysに関してはTGC、Aspに関してはGAC、Pheに関してはTTC、Glyに関してはGGT、Hisに関してはCAC、Ileに関してはATC、Lysに関してはAAA、Leuに関してはCTGに、Metに関してはATG、Asnに関してはAAC、Proに関してはCCG、Glnに関してはCAGに、Argに関してはCGTに、Serに関してはTCC、Thrに関してはACC、Valに関してはGTT、Trpに関してはTGG及びTyrに関してはTACへコドンを変化させることによって、pUC19−BamHI中において、E167を他の全ての残基へ変異させた。
上記と同じ操作で、puc19−BamHI(E167T)のテンプレート上において、全ての帯電した残基及び極性残基をAlaに変異させた。
スター活性を低下させるために必要とされる他の変異に付加された場合に、P173Aと同様に、E163への変異の導入は、BamHI変異体の低下した熱安定性をもたらした。
E163A/E167T/P173Aは、スター活性の好ましい低下を有し、さらに、熱的に不安定であると予想された。
1.EcoRIの発現
EcoRIに対するPCRは、以下のプライマーを使用した。
EcoRIのアイソシゾマーであるRsrI(同じく、そのスター活性に関して知られている。)とのEcoRIの比較から得られた標的アミノ酸残基の最初の選択。
各変異に対して、それぞれ3つのコロニーを摘み出し、アンピシリン及びクロラムフェニコールを加えたLB中で一晩増殖させた。変異体がWTEcoRIと少なくとも同様の活性を有することを確認するために、pBR322及びλDNAに対して活性アッセイを行った。次いで、37℃で1時間反応させた、2倍系列希釈、50%グリセロール12μL、NEB1緩衝液3μL、pBR322の0.5μL及び水11.5μL中の細胞抽出物3μLを用いて、これらの変異体を検査した。しかしながら、何れの変異も、スター活性の成績を向上させなかった。
アミノ酸残基5、12、14、26、40、43、44、59、62、65、72、76、100、103、117、123、131、192、221、225、226、227、228、242、244、245、247、249、257、268、272及び277を標的とすることによって、工程2に記載されているように、残り32の全ての帯電した残基をAlaへ変異した。
変異の異なる種類を含有する各試料から、4つのコロニーを摘み出し、CAMを加えたLB4mL中で増殖させた。音波処理後、NEB1緩衝液中の正常なグリセロール条件中でλDNA基質に対して、細胞抽出物を検査した。NEB2緩衝液3μL中の2倍系列希釈中の細胞抽出物3μLをpUC19の0.5μL及び反応混合物中に39.2%グリセロールの最終濃度を与えるための50%グリセロール23.5μLへ添加することによって、類似の活性を有する抽出物をpUC19基質に対して再度検査した。
4つの異なるNEB緩衝液中でλDNA0.6μgを消化することによって、NEB希釈緩衝液Cを用いた3倍系列希釈中で、並列比較を行った(図6)。EcoRI(K62A)は、WTEcoRIより大幅に低いスター活性を有していた。
λDNA基質に対して、EcoRI(K62A)はスター活性を有することは明らかでなかったが、10時間の消化後に、Litmus28基質を用いて、スター活性が観察された。NEB4中のEcoRI(K62A)は、EcoRI緩衝液中のWTEcoRIと比較して、著しく低下したスター活性を有していた(図7)。
希釈液C中でのEcoRI−HF及びWTEcoRIに対するFI測定によって、定量的比較を行った。FI測定のための条件は、基質としてλDNAを用いる表2と同じであった。反応条件は37℃1時間であり、0.8%アガロースゲル上で結果を分析した(図8)。
1.ScaIの発現
ScaI制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼに対する配列はREBASE及びGenBank中に記載されており、図44に示されている(配列番号97)。それぞれ、pRRS−ScaI及びpACYC184−ScaIMを作製するために、これらの酵素を発現する遺伝子をプラスミド中に挿入した。次いで、形質転換受容性イー・コリ宿主細胞中に、pACYC184−ScaIMを形質転換した。pRRSベクターはpUC19に由来し、多重クローニング部位の存在のみが異なる。発現株を作製するために、pRRS−ScaIRをイー・コリ(pACYC−ScaIM)中に形質転換した。播種及び細胞培養は、30℃で行った。
ScaIは、配列決定された2つのアイソシゾマー:LIaDI及びNmeSIを有する。しかしながら、LIaDI又はNmeSIのスター活性に関する既知の情報は存在せず、これらの酵素の活性部位に関する情報も一切存在しない。従って、タンパク質中の位置4、8、11、12、14、18、25、27、30、37、39、40、43、46、51、57、61、68、72、74、80、86、97、103、108、112、114、119、120、121、127、128、129、133、135、139、140、141、147、152、156、158、159、161、162、171、172、175、179、182、184、187、172、175、192、193、195、200、222、227における標的化された変異のために、まず、58の帯電した残基全てを選択した。
ScaI変異体の各変異体から得た4つのコロニーを摘み出し、100μg/mLAmp及び33μg/mLCamを加えたLB4mL中において、30℃で一晩増殖させた。各細胞培養物を音波処理し、NEB2緩衝液中のλDNAに対して、活性を検査した。明らかに活性を有するものを、10、100及び1,000倍希釈で再検査した。ScaIは極めて著しいスター活性を有していたので、スター活性のバンドは、変異体対WT制限エンドヌクレアーゼに対して容易に比較された。NEB希釈緩衝液Aによる2倍系列希釈を用いて、低下したスター活性を有するものを再検査した。変異体の各々に対して、FIを測定した。NEB2緩衝液中のWTScaIに対して、FIは1/8であった。類似の活性レベルを有する4つの変異体は、WTScaIと比較して、大幅に低下したスター活性を有することが見出された。変異体#6−3ScaIは2倍高い活性を有し、FIは、WTScaIより4又は32倍優れていた。#26−2ScaIは2倍高い活性及びWTより8倍又は64倍優れたFIを有する。#28−2ScaIは2倍高い活性を有し、FIはWTより120又は1000倍優れており、#54−3はWTと同じ活性を有しており、FIはTWより250又は2000倍優れている。
4つの異なるNEB緩衝液中のλDNA1μg上に対して、異なるNEB緩衝液中のNEB希釈緩衝液Aによる2.5倍系列希釈で、ScaI−HF及びWTScaIを37℃で、1時間比較した(図10)。
1.SalIの発現
placzz1−SalIR及びpACYC−Hpy166IIMで形質転換されたイー・コリ中でSalIを発現させた(placzzIは、隣接するマルチコピー部位の中に挿入された制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させるために、lacプロモーターを使用するpUC19プラスミドである。)。Hpy166IIMは、SalIの4つの塩基の外側を保護する。
前実施例中の類似のPCR法を用いて、SalI中の86の帯電した残基をAlaに変異した。5、6、8、9、12、13、19、27、31、34、35、37、42、43、45、50、60、63、65、67、73、82、83、84、90、93、97、100、101、103、107、109、111、114、116、119、126、129、131、134、140、143、145、147、148、156、157、164、168、172、173、174、180、181、186、190、191、193、210、218、226、232、235、237、238、244、246、250、256、257、258、259、260、261、264、266、271、275、297、300、304、305、306、308、309、311。
前実施例に記載されているように、SalI−HFの選択を行った。主要な差は、5%グリセロール又は高グリセロール濃度の何れかの中で、未精製抽出物中において、SalIのスター活性を容易にアッセイできないということであった。グリセロールは、SalIのスター活性を促進したのみならず、同族活性も大幅に阻害した。
SalI−HF及びWTSalIのFIを測定した(図11)。結果は、表10として示されている(下記)。
1.SphIの発現
イー・コリ(placzz1−SphIR、pACYC184−CviAIIM)中で、SphIを発現させた。CviAIIMは、SphIの内部の4塩基を保護する。Amp及びCamを加えたLB中で、形質転換された細胞を37℃で一晩増殖させた。
実施例1から実施例4に記載されている方法を用いて、SphI中の全ての帯電した残基をAlaに変異した。計71の変異を行った。3、5、12、18、21、24、25、30、31、35、43、46、51、54、57、58、60、61、72、75、77、78、87、90、91、95、100、104、107、108、110、113、120、123、124、125、129、130、131、139、140、142、146、147、155、157、159、164、170、172、173、175、178、184、186、190、194、196、197、198、206、207、209、212、215、221、227、230、231、232、235。
各変異の4つのコロニーを、37℃で一晩、Amp及びCamを加えたLB中で増殖させた。活性選択は、NEB2中の5%グリセロール及び30%グリセロール中で、主にpBR322に対して行った。前記実施例の経験を用いて、高精度SphIの選択は簡潔であった。SphI変異体D91A、K100A、D139A及びD164Aが、SphI中のスター活性を著しく低下させることが見出された。
SphI−HF及びWTSphIの比較を、それぞれの好ましい緩衝液中において、並列的に行った。NEB希釈緩衝液Aを用いてSphI−HFを2倍系列希釈し、NEB4中で反応させ、WTSphIはNEB希釈緩衝液Bで2倍系列希釈された。λDNA上での消化が、図12中で比較されている。
1.PstIの発現
PstIは、イー・コリ(pACYC−HpyCH4VM、pPR594−PstIR)から発現させた。HpyCH4VMは、PstIの内部の4塩基を保護する。pPR594は、Amp耐性及びptacプロモーターを有する発現ベクターである。Amp及びCamを加えたLB中において、30℃で細胞を増殖させ、次いで、IPTGによって、培養を一晩誘導した。
前実施例中に記載されている方法を用いて、92の帯電した残基をAlaに変異させた。これらは、8、10、11、14、25、26、38、40、41、44、45、47、58、61、63、66、67、69、73、74、77、78、82、85、88、91、92、94、95、99、104、105、116、119、127、128、136、142、145、146、150、151、152、156、159、169、170、174、176、179、180、184、188、191、197、202、204、207、212、214、217、218、226、227、228、231、236、237、238、239、240、246、251、257、258、261、263、273、282、284、286、287、295、297、302、305、306、309、313、314、319及び320であった。
PstI−HFの選択は、先述の試料と類似していた。正常な活性の酵素活性は、5%グリセロールを用いて、λDNAに対して検査し、スター活性は、NB4緩衝液及び20%DMSOの条件で、pBR322基質に対して検査した。DMSOは、同じ濃度のグリセロールより著しくスター活性を増強した。選択の間に、#26、#56及び#65は、WTと比べて、低下したスター活性を有した。それぞれを配列決定すると、変異は、D91A、E204G及びK228A/A289Vであることが明らかとなった。変異体#26PstI(D91A)をPstI−HFと表記した。
PstI−HF及びWTPstIのFIは、NEB1から4緩衝液中で、λDNA基質に対して別個に測定した。希釈緩衝液は、NEB希釈緩衝液Cである。比較は図13に示されており、結果は表12に列記されている(以下)。
1.NcoIの発現
NcoIの発現は、イー・コリ(pSYX20−NcoIM,pRRS−NcoIR)中で行った。pRRSは、pUC19由来のプラスミドであり、pSYX20はpRRSベクターを有する適合的な低コピー数プラスミドである。Amp及びカナマイシン(Kan)を加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
NcoI中の66の帯電した残基の全てをAlaに変異した。これらの残基は、7、8、19、22、27、30、31、32、33、37、39、42、46、55、56、61、62、64、68、69、75、84、88、89、92、93、95、97、100、116、136、144、146、162、166、170、178、183、185、187、188、189、196、199、202、204、209、211、212、213、216、219、227、229、237、241、244、250、251、257、259、261、268、279、282、285。
NcoI−HFの選択は、PstI−HFの選択と同様であった。活性は、5%グリセロールとともに、基質としてλDNAを用いて、上述のようにアッセイした。スター活性は、19%DMSO中のpBR322又はλを用いて測定した。以下の変異が、スター活性を改善させることが見出された。A2T/R31A、D56A、H143A、E166A、R212A及びD268A。これらの変異体のうち、NcoI(A2T/R31A)をNcoI−HFとして選択した。
NcoI−HF及びWTNcoIのFIは、NEB1から4緩衝液中で、λDNA基質に対して別個に測定した。比較は図14に示されており、結果は表13に列記されている(以下)。
1.NheIの発現
pACYC−NheI及びplaczz1−NheIRで形質転換されたイー・コリ中でNheIを発現させた。placzz1は、pUC19由来のプラスミドである。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
NheI中の92の帯電した残基全てを、以下の残基としてAlaに変異した。5、6、7、14、17、19、22、25、28、31、38、39、42、47、49、52、56、58、59、60、64、74、75、76、77、80、91、93、104、105、110、112、116、117、123、126、130、131、133、135、137、147、149、152、159、160、165、167、170、171、174、179、183、195、202、205、207、209、210、211、214、216、218、221、225、231、241、243、244、250、252、256、257、259、264、266、267、281、285、287、288、289、291、297、300、307、313、315、318、321、324、325。
前実施例に従って、NheI−HFの選択を行った。標準及びスター活性アッセイは、それぞれ、NEB4緩衝液及び5%グリセロール及び39%グリセロール中に、基質としてpBR322を含有した。1つの変異のみが、NheIを改善する上で有意であることが明らかとなった。これは、E77Aであった。NheI(E77A)をNheI−HFとして選択した。
NEB1から4緩衝液のそれぞれの中で、pXba(アデノウイルスから得たXbaI消化された片を含有するプラスミド基質)に対して、NheI−HF及びWTNheIのFIを別々に測定した。比較は図15に示されており、結果は表14に列記されている(以下)。
1.SspIの発現
pACYC−SspIM及びplaczz1SspIRで形質転換されたイー・コリからSspIを発現させた。placzz1は、pUC19由来のプラスミドである。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
SspI中の81の帯電した残基全てをAlaに変異させた。これらは、3、8、12、13、18、19、20、35、40、42、44、47、52、60、62、65、68、69、72、74、76、77、78、79、83、85、88、89、90、96、100、108、109、118、119、127、128、129、131、132、137、144、153、154、155、156、158、165、168、170、172、177、178、179、181、185、186、187、191、194、195、197、202、204、215、222、229、237、240、246、250、256、257、259、260、264、265、267、268、269、274であった。
それぞれ、NEB4緩衝液及び5%グリセロール及び39%グリセロール中のΦX174基質を用いて、NheIの標準的な同族及びスター活性アッセイを行った。変異体#16(H65A)、#20(K74A)、#23(E78A)、#26(E85A)、#28(E89A)、#33(K109A)、#34(E118A)、#52(R177A)、#62(K197A)、#67(D229A)は全て、低下したスター活性を示した。K109Aは、最も大きなスター活性の低下を示した。スター活性のさらなる改善を探索することを決定した。
当初Tyrとして同定された全ての残基はPheへ変異されたのに対して、他の残基Cys、Phe、Met、Asn、Gln、Ser、Thr及びTrpはAlaへ変異された。このグループは、以下の位置に、95の残基の変異を含んだ。2、6、7、9、10、13、22、25、26、27、29、30、32、33、34、39、41、51、53、55、56、57、58、59、61、63、71、75、81、84、87、91、94、98、104、106、107、110、111、113、114、123、125、134、136、139、140、141、142、143、146、152、157、159、160、164、173、175、180、183、190、192、193、196、198、199、201、205、207、211、214、218、219、220、221、223、225、226、227、228、230、232、233、235、238、239、241、249、254、255、272、275、276、277、280。
SspI−HF及びWTsspIのFIは、NEB1から4緩衝液中で、λDNA基質を用いて別個に測定した。希釈液は、NEBCであった。比較は図16に示されており、結果は表15に列記されている(以下)。
1.NotIの発現
NotIは、NEB4緩衝液中で著しいスター活性を有し、NEB3緩衝液中ではより低いスター活性を有する。何れのNEB緩衝液中においてもスター活性を低下するように、NotIを改変した。pACYC184−EagIM及びplaczz2−NotIRで形質転換された形質転換受容性イー・コリ中で、NotIを発現させた。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を37℃で一晩増殖させた。
NotI中の97の帯電した残基全てを、以下の残基としてAlaに変異した。2、4、8、10、17、21、22、26、31、34、35、36、49、52、57、59、62、72、74、75、77、84、87、96、97、105、117、121、122、125、126、129、130、133、140、141、145、150、152、156、160、165、167、174、176、177、182、187、189、193、194、200、205、208、210、219、224、225、227、236、237、245、251、253、267、271、272、280、283、290、292、294、296、304、306、308、310、314、319、321、323、327、331、335、336、339、353、354、356、358、361、365、367、368、369、370、378、382。
前実施例に記載されているように、NotI−HFの選択を行った。標準的な同族及びスター活性アッセイは、それぞれ、NEB4緩衝液及び5%グリセロール及びNEBExoI緩衝液(67mMグリシン−KOH、pH9.5、6.7mMMgCl2、10mM2−メルカプトエタノール)及び37%グリセロール中で、pXba基質を使用した。#37(K150A)、#44(K176A)、#45(R177A)、#63(R253A)は全て、低下したスター活性を示した。K150Aは、スター活性を低下させるための好ましい変異であった。NotI(K150A)をNotI−HFとして選択した。
NotI−HF及びWTNotIのFIは、NEB1から4緩衝液中でpXba基質を用いて別個に測定した。比較は図17に示されており、結果は表16に列記されている(以下)。
1.SacIの発現
pLG−SacIM及びpRRS−SacIRで形質転換されたイー・コリ中でSacIを発現した。pRRSは、pUC19由来のプラスミドであり、pLGは、低コピー数の適合的プラスミドである。Amp及びKanを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
SacI中の101の帯電した残基全てを、以下の残基としてAlaに変異した。6、7、11,15、16、19、24、25、29、30、39、40、42、45、58、61、62、63、65、67、70、71、72、74、75、76、81、85、94、98、104、105、114、116、120、123、127、129、133、134、141、143、144、145、146、150、151、154、169、170、172、181、187、196、197、200、201、211、216、220、221、224、227、228、232、238、240、246、248、250、258、270、271、277、281、288、289、295、296、297、299、303、306、313、314、321、322、324、332、336、337、340、342、344、345、347、349、350、353、357。
前実施例と類似の方法を用いて、SacI−HFの選択を行った。標準的な活性のチェックはNEB4中の5%グリセロールを加えたpUC19を使用し、スター活性のチェックは、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中においてpUC19に対して行った。#52SacI(Q117H/R154A/L284P)及び#60SacI(Q117H/R200A)は何れも、低下したスター活性を有し、SacIQ117H/R200Aは、好ましい変異であることが判明した。Q117Hは、テンプレートから持ち越された変異であり、SacIの活性に影響を及ぼさなかった。SacI(Q117H/R200A)をSacI−HFとして選択した。
SacI−HF及びWTSacIのFIは、NEB1から4緩衝液中でpXba基質に対して別個に測定した。比較は図18に示されており、結果は表17に列記されている(以下)。
1.PvuIIの発現
pACYC−PvuIIM及びplaczz2−PvuIIRで形質転換されたイー・コリ中でPvuIIを発現させた。placzz2は、pUC19由来のプラスミドであり、pACYCは、低コピー数の適合的プラスミドである。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
PvuII中の47の帯電した残基全てを、以下の残基としてAlaへ変異させた。3、5、8、11、15、18、21、25、26、30、34、38、54、55、58、61、66、68、70、75、78、83、84、85、93、95、105、110、114、116、118、119、121、125、126、128、129、130、134、136、137、138、143、147、151、152及び155。
PvuII−HFの選択は、前実施例と同様であった。標準的な活性のチェックはNEB4中の5%グリセロールを加えたλDNA基質を使用し、スター活性のチェックは、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中においてpBR322に対して行った。何れの変異体も、高精度PvuIIとして認定されなかった。
さらなる突然変異導入工程は、PvuII中のSer、Thrの全てのAlaへの変異及びTyrのPheへの変異であった。変異された位置は、2、19、46、49、67、71、77、81、82、94、104、113、123、124、132、133、148、154及び157であった。
NEB1から4緩衝液中の希釈液Aを用いて、pBR322に対して、PvuII−HF及びWTPvuIIのFIを別個に測定した。比較は図19に示されており、結果は表18に列記されている(以下)。
1.MfeIの発現
pACYC−MluCIM及びpRRS−MfeIRで形質転換されたイー・コリ中でMfeIを発現させた。pRRSは、pUC19由来のプラスミドであり、pACYCは、低コピー数の適合的プラスミドである。MluCIMは、MfeIの4つの内部核酸配列であるAATTをメチル化する。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を37℃で一晩増殖させた。
MfeIの突然変異導入を3つのバッチで行った。第一のバッチは、以下のアミノ酸位置としてAlaへ変異された帯電された残基の全てである。3、5、9、19、24、36、39、44、45、47、48、50、60、61、64,65、72、83、87、90、92、93、98、100、101、103、107、109、110、115、119、120、121、124、132、135、142、143、144、153、155、158、159、161、162、164、165、171、172、175、181、184、187、188、192、195、196、198、199、200。第二のバッチは、水酸基を有する残基(Ser、Thr及びTyr)の全てであり、Ser及びThrはAlaへ変化され、TyrはPheへ変化される。残基は、4、7、21、28、38、40、43、53、74、75、76、81、89、91、112、122、127、134、136、157、167、170、173、177、185及び200である。第三のバッチは、Cys、Phe、Met、Asn、Gln、Trpの残基であり、全てAlaへ変化され、残基は、10、12、13、25、26、29、31、32、35、51、55、67、68、77、78、84、88、96、102、105、117、123、126、141、148、149、152、168、169、174、176、178、179、180、183、191、193、194である。
前実施例と類似の方法を用いて、MfeI−HFの選択を行った。NEB4中の5%グリセロールとともにΦX174基質を用いて、切断活性を測定し、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中でΦX174基質を用いて、スター活性を測定した。この酵素に対する著しい困難は、多くの変異が低下したスター活性を有する酵素の切断活性を改善したが、WT酵素より高いグリセロール濃度を必要としたということであった。MfeI(K50A)は、高濃度のグリセロール中で低下したスター活性及び高い切断活性を有する1つの例であるが、より低いグリセロール濃度では、活性は低かった。MfeI(Y173A)も、スター活性を低下させた。好ましい変異は、Q13A/F35Yであった。F35Yの変異はテンプレートから得られ、Q13Aは標的化された変異であった。MfeI(Q13A/F35Y)をMfeI−HFと表記した。
NEB1から4緩衝液中のNBE希釈液A中での希釈を用いて、λDNA基質に対して、MfeI−HF及びWTMfeIのFIを別個に測定した。比較は図20に示されており、結果は表19に列記されている(以下)。
1.HindIIIの発現
HindIIIエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子の両方を含有するpUC19−HindIIIRMで形質転換されたイー・コリ中でHindIIIを発現させた。Ampを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
HindIII中の88の帯電した残基をAlaへ変異させた。これらは、2、3、7、8、14、20、22、34、37、39、42、45、52、55、61、62、66、69、74、84、87、89、94、100、101、109、111、114、117、120、123、124、126、128、132、134、135、136、137、138、153、158、162、163、171、172、180、182、183、190、197、198、201、202、207、209、214、215、218、222、225、227、228、229、237、238、243、244、245、249、250、251、254、255、261、265、266、267、270、274、275、281、283、286、290、293、296、297であった。
前実施例と類似の方法を用いて、HindIII−HFの選択を行った。標準的な活性のチェックはNEB4中の5%グリセロールを加えたλDNAを使用し、スター活性は、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中においてλDNA基質を用いて測定した。HindIIIの2つの変異体が、低下したスター活性を有することが見出された。これらは、HindIII(K198A)及びS188P/E190Aであった。HindIII(K198A)を、HindIII−HFと表記した。
希釈液Bを加えたNEB1から4緩衝液の各々の中で、λDNA基質を用いて、HindIII−HF及びWTHindIIIのFIを別個に測定した。比較は図21に示されており、結果は表20に列記されている(以下)。
1.SbfIの発現
pUC19−SbfIRMで形質転換されたイー・コリ中で、SbfIを発現させた。Ampを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
SbfI中の78の帯電した残基をAlaへ変異させた。これらは、5、8、15、18、23、27、30、34、46、49、50、53、58、63、66、70、71、74、81、82、83、85、86、87、90、94、103、115、120、121、127、132、135、136、143、144、147、150、152、154、164、169、170、183、184、187、188、192、196、204、206、208、213、214、215、218、219、226、228、230、233、237、238、239、241、248、251、253、257、258、259、260、262、266、282、284、285、288、293、297、299、304、305、307、311、316及び322であった。
前実施例に記載されているように、SbfI−HFの選択を行った。標準的な活性のチェックはNEB4中の5%グリセロールとともにλDNA基質を使用し、スター活性のチェックは、エキソヌクレアーゼI緩衝液中のλDNAに対して行った。SbfI(K251A)をSbfI−HFと表記した。
SbfI−HF及びWTSbfIのFIは、希釈液Cを加えたNEB1から4緩衝液中で、λDNAに対して別個に測定した。比較は図22に示されており、結果は表21に列記されている(以下)。
1.EagIの発現
pBR322−EagIIRMで形質転換されたイー・コリ中で、EagIを発現させた。20μg/mLテトラサイクリンを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
Asp、Glu、His、Lys、Arg、Ser、Thr、Asn及びGln残基は、Alaに変異した。Tyrは、Pheに変異した。これらは、以下の残基であった。2、3、4、5、6、9、13、14、17、19、21、23、27、35、36、37、40、42、43、44、45、46、49、51、53、55、56、58、60、66、67、69、71、72、73、74、75、77、78、80、82、86、87、92、93、94、95、98、99、100、102、103、104、105、112、113、114、116、117、119、122、125、127、132、134、135、137、139、140、141、145、147、148、150、152、154、155、156、157、160、162、163、164、166、169、172、173、176、177、178、179、182、185、187、188、189、193、196、197、201、202、203、204、205、206、208、209、212、217、220、221、222、224、225、230、235、236、237、238、239、240、241、243、245、246、247、248、251、255、257、258、259、260、263、264、265、266、270、272、273、275、276、277、279、280、283、286、288、289、291、295、296。
EagI−HFの選択は、グリセロールの高濃度、DMSOの高濃度又は高いpHを使用する、前実施例とは異なる方法を用いて行った。発現が低すぎて、未精製抽出物中でスター活性を示すことができなかったので、スター活性をチェックするために変異体の各々を精製することは極めて退屈である。前実施例から、HFエンドヌクレアーゼはNEB3と比べてNEB4中で増加した切断活性を有する傾向があると推定された。従って、未精製抽出物中のEagIの活性は、NEB3及びNEB4の両方の中で測定した。NEB4/NEB3の最も高い比を有するものを選択した。EagI(H43A)をEagI−HFと表記した。
EagI−HF及びWTEagIのFIは、NEB1から4緩衝液の各々の中でpXba基質に対して別個に測定した。比較は図23に示されており、結果は表22に列記されている(以下)。
1.EcoRVの発現
pACYC−EcoRVM及びplaczz1−EcoRVで形質転換されたイー・コリ株中でEcoRVを発現させた。placzz1は、pUC19由来のプラスミドであり、pACYCは、低コピー数の適合的プラスミドである。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を37℃で一晩増殖させた。
Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr及びTrp残基をAlaに変化させた。Tyrは、Pheに変化させた。これらは、2、4、5、6、9、12、13、14、15、16、17、18、19、21、25、27、29、31、35、36、37、38、41、42、44、45、47、48、49、53、54、57、58、59、61、64、65、67、68、69、70、71、72、74、75、76、78、79、81、82、84、85、86、90、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、104、105、106、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、123、125、126、127、128、131、132、136、138、139、140、143、144、145、146、147、149、150、151、152、154、155、157、158、161、163、164、167、169、171、172、173、174、179、183、185、186、187、188、191、193、195、196、197、198、199、201、203、206、207、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、226、227、228、229、230、231、232、234、235、236、237、238、239、241、242、244及び245であった。
前実施例と類似の方法を用いて、EcoRV−HFの選択を行った。標準的な活性のチェックはNEB4中の5%グリセロールを加えたpXba使用し、スター活性のチェックは、39%グリセロールを加えたエキソヌクレアーゼI緩衝液中においてpXbaに対して行った。EcoRV(D19A/E27A)は、WTEcoRVと比較して、低下したスター活性を有することが明らかとなった。この変異体は、EcoRV−HFと表記した。この変異体に関して、E27Aは標的化された変異であり、D19Aは自発的変異であった。二重変異体は、D19A及びE27A単変異体より大きなスター活性の低下を有していた。
EcoRV−HF及びWTEcoRVのFIは、NEB1から4緩衝液の各々の中でpXba基質に対して別個に測定した。比較は図24に示されており、結果は表23に列記されている(以下)。
1.AvrIIの発現
pUC19−AvrIIRMで形質転換されたイー・コリ中で、AvrIIを発現させた。Ampを加えたLB中で、細胞を30℃で一晩増殖させた。
Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr及びTrp残基をAlaに変化させ、TyrをPheに変化させた。これらは、2、3、4、6、8、9、10、12、15、17、19、20、22、23、27、29、30、31、32、34、36、40、41、42、43、44、46、47、48、50、51、53、55、56、57、58、59、60、65、68、70、72、74、75、76、77、79、80、82、83、84、86、87、88、94、95、96、97、100、104、105、106、107、108、110、112、113、116、117、119、120、121、122、123、124、126、127、129、130、131、132、134、136、139、142、143、144、145、150、151、152、153、154、156、157、158、161、163、164、165、166、168、169、173、174、177、178、181、182、184、186、187、188、189、190、191、192、195、198、200、202、206、207、211、215、216、220、223、224、226、229、230、231、232、233、234、235、236、237、239、243、244、245、246、248、249、253、255、256、260、262、264、265、266、267、268、269、270、272、274、276、277、278、279、280、281、284、285、286、288、289、290、291、299、302、303、304、305、306、308、310、312、314、315、316、318、321、322、324、325、328、331、333、335、337、338、339、340、342、343、346、347、348、350、351、353、354、355、356、358であった。
前実施例と類似の方法を用いて、AvrII−HFの選択を行った。NEB4中の5%グリセロールとともにpBC4を用いて、切断活性を測定し、39%グリセロールを加えたExoI緩衝液中でpBC4を用いて、スター活性を測定した。変異体#16(M29A)、#57(E96A)、#60(Y104F)、#62(K106A)、#154(S127A)、#170(F142A)は全て、改善を示した。AvrII(Y104F)をAvrII−HFと表記した。
NEB1から4緩衝液の各々の中で希釈液Bを用いて、T7DNA基質に対して、AvrII−HF及びWTAvrIIのFIを別個に測定した。比較は図25に示されており、結果は表24に列記されている(以下)。
1.BstXIの発現
pACYCBstXIMS及びpUC19−BstXIRで形質転換されたイー・コリ中で、BstXIを発現させた。pACYCは、低コピー数適合的プラスミドである。メチラーゼ機能を有するために、BstXIは、メチラーゼ遺伝子と特異性遺伝子の両方を有さなければならない。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を37℃で一晩増殖させた。
BstXI中に、237のアミノ酸変異を以下のように施した。Cys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、TrpをAlaに変化させた。Tyrは、Pheに変異した。これらは、4、6、7、9、11、12、14、15、17、18、20、21、22、23、24、26、27、29、30、31、32、33、34、35、36、37、39、40、42、43、46、48、50、53、54、57、58、59、60、62、63、64、65、66、71、72、73、75、76、78、80、81、82、83、84、86、89、91、93、94、95、96、97、98、103、105、106、108、110、111、112、114、117、118、120、123、124、125、126、127、128、129、130、131、137、138、139、141、142、144、145、146、148、151、152、153、154、155、156、159、162、163、166、168、169、171、172、173、174、175、176、177、178、182、185、188、189、191、193、194、195、196、198、199、201、204、208、209、210、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、223、228、229、230、233、235、236、238、239、240、244、245、248、249、250、253、254、255、258、259、260、261、263、264、265、267、268、269、272、276、277、278、279、280、282、285、286、287、288、289、291、293、294、295、300、301、302、304、305、306、308、309、312、314、317、318、319、320、323、324、325、326、330、331、333、334、335、337、343、344、345、346、347、349、353、355、356、357、358、359、360、362、363、364、365、367、369、371、373、374、376、377、378、379、380、381、382及び383であった。
前実施例と類似の方法を用いて、BstXI−HFの選択を行った。NEB4中の5%グリセロールとともにpBC4を用いて、切断活性を測定し、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中でpBC4DNA基質を用いて、スター活性を測定した。変異体#36(Y57F)、#44(N65A)、#48(E75A)、#49(N76A),及び#124(K199A)は全て、低下したスター活性を有していた。BstXI(N65A)をBstXI−HFと表記した。
NEB1から4緩衝液の各々の中で希釈液Aを用いて、λDNA基質に対して、BstXI−HF及びWTBstXIのFIを別個に測定した。比較は図26に示されており、結果は表25に列記されている(以下)。
1.PciIの発現
pACYC−PciI及びplaczz1−PciIRで形質転換されたイー・コリ中でPciIを発現させた。placzz1は、pUC19由来のプラスミドであり、pACYCは、低コピー数の適合的プラスミドである。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を37℃で一晩増殖させた。
PciI中の151アミノ酸残基をCys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thrで変異させた。TrpをAlaに変化させ、TyrをPheに変化させた。これらは、2、3、4、6、8、9、10、11、12、14、17、18、19、21、24、25、26、28、29、30、31、33、34、35、36、38、39、41、44、46、47、49、50、51、54、55、56、58、59、60、63、67、68、69、71、74、75、78、80、81、82、85、86、91、92、95、97、98、101、103、104、107、109、113、114、115、118、119、120、121、122、124、126、127、129、130、131、132、133、135、136、137、138、143、145、146、147、148、149、151、152、153、154、155、157、158、159、161、164、165、167、172、175、178、179、180、182、184、185、186、190、192、193、196、197、198、199、200、202、203、206、207、209、210、215、218、221、222、228、229、230、231、232、233、234、235、237、238、239、241、242、243、244、246、247、248、253、254、255、256。
前実施例と類似の方法を用いて、PciI−HFの選択を行った。NEB4中の5%グリセロールとともにSalI切断されたpBR322を用いて、切断活性を測定し、39%グリセロールを加えたExoI緩衝液中でSalI切断されたpBR322を用いて、スター活性を測定した。二重変異体PciI(E78A/S133A)は、低下したスター活性及び強力な切断活性を有していた。この変異体は、上記標的化された変異の1つではなく、偶然のランダムな現象であった。
NEB1から4緩衝液の各々の中で希釈液Aを用いて、pXab基質に対して、PciI−HF及びWTPciIのFIを別個に測定した。比較は図27に示されており、結果は表26に列記されている(以下)。
1.HpaIの発現
pACYC−MseIM及びplaczzl−HpaIRで形質転換されたイー・コリ中でHpaIを発現させた。placzz1は、pUC19由来のプラスミドであり、pACYCは、低コピー数の適合的プラスミドである。Amp及びCamを加えたLB中で、細胞を37℃で一晩増殖させた。
HpaI中の156アミノ酸残基をCys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser及びThrで変異させた。TrpをAlaに変化させ、TyrをPheに変化させた。これらは、7、8、9、13、14、16、17、19、20、21、22、23、26、27、29、30、33、34、35、36、37、38、40、41、42、46、47、48、50、51、56、57、59、60、65、67、69、71、72、74、75、78、79、80、81、82、83、84、85、86、89、91、93、94、95、99、100、104、105、106、108、109、110、113、115、117、119、121、122、123、124、127、128、130、131、133、135、136、137、138、139、141、142、146、147、149、150、152、156、158、159、160、162、164、165、166、167、168、169、170、172、173、176、177、180、181、182、184、185、187、188、190、191、192、193、195、196、197、202、204、206、208、209、211、212、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、228、230、231、233、234、235、236、237、238、240、241、242、243、244、245、247、248、249。
前実施例と異なる方法を用いて、HpaII−HFの選択を行った。NEB2緩衝液中のλDNA基質を用いて、切断活性及びスター活性を測定した。このHpaIは、NEB4よりNEB2中でずっと高いスター活性を有し、5%グリセロール中で明確に観察することができた。
NEB1から4緩衝液の各々の中で希釈液Aを用いて、λDNA基質に対して、HpaI−HF及びWTHpaIのFIを別個に測定した。比較は図28に示されており、結果は表27に列記されている(以下)。
1.AgeIの発現
pRRS−AgeIRM及びpsyx20−lacIqで形質転換されたイー・コリ中でAgeIを発現した。pRRSは、pUC19由来のプラスミドであり、psyx20−lacIqは、lacIqプロモーター下で発現されるlacIを有する低コピー数の適合的プラスミドである。200Klett単位になるように、Amp及びKanを加えたLB中において、37℃で細胞を増殖し、次いで、0.5mMIPTGとともに、一晩25℃で誘導された。AgeIの発現は不安定であるため、これを達成することが極めて困難であった。
AgeI中の149アミノ酸残基をCys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser及びThrで変異させた。TrpをAlaに変化させ、TyrをPheに変化させた。これらは、2、4、6、7、9、14、16、18、19、21、22、23、24、25、26、27、29、30、31、32、37、38、40、42、43、44、45、49、51、53、55、56、58、60、62、64、65、67、68、69、72、73、75、77、78、79、82、83、85、86、87、88、90、91、92、94、96、97、102、103、104、105、110、111、114、116、119、120、122、123、128、129、130、134、135、138、139、140、142、144、146、147、148、152、153、155、157、159、166、168、170、173、174、176、177、178、182、183、185、186、188、192、195、198、200、201、206、211、212、214、217、219、220、222、223、224、225、226、227、229、231、233、234、235、237、238、239、240、241、243、245、247、248、250、251、253、255、256、258、260、262、265、266、267、268、269、271、272であった。
前実施例と類似の方法を用いて、AgeI−HFの選択を行った。標準的な活性のチェックはNEB4中の5%グリセロールを加えたpXbaを使用し、スター活性のチェックは、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中においてpXbaに対して行った。発現系の困難のために、意味のある変異体が得られる前に、この選択を8回繰り返した。2つの変異体S201A及びR139Aは低下したスター活性を有し、R139AをAgeI−HFと表記した。
NEB1から4緩衝液の各々の中で希釈液Aを用いて、pXba基質に対して、AgeI−HF及びWTAgeIのFIを別個に測定した。比較は図29に示されており、結果は表28に列記されている(以下)。
1.BsmBIの発現
pACYC−BsmAIM、ptaczz2−BsmBIR及びpsyx20−lacIqで形質転換されたイー・コリ中で、BsmBIを発現させた。ptaczz2は、誘導性ptacプロモーターを担持するpUC19由来のプラスミドであり、pACYCは、低コピー数の適合的プラスミドである。BsmAIM(GTCTC)は、BsmBI(CGTCTC)の特異性を包含する。psyx20−lacIqは、lacIの強い発現を有する低コピー数ベクターである。細胞を37℃で一晩増殖させ、次いで、Amp、Cam及びKanを加えたLB中で誘導した。
BsmBI中の358アミノ酸残基をCys、Asp、Glu、Phe、His、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Ser及びThrで変異させた。TrpをAlaに変化させ、TyrをPheに変化させた。これらは、8、9、12、13、14、15、17、18、19、20、21、24、25、26、27、28、29、31、33、37、38、40、42、43、44、46、47、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、60、61、62、63、64、65、66、67、69、70、72、76、78、79、80、81、82、83、84、88、91、93、95、96、98、99、101、103、104、105、106、109、110、111、113、114、115、117、118、119、120、121、122、124、126、127、128、130、131、132、133、134、135、138、141、143、144、145、147、149、150、154、155、157、158、160、162、163、164、165、166、167、168、169、172、174、175、176、177、179、180、181、182、184、185、186、188、189、191、194、195、197、200、201、203、205、206、207、208、211、212、213、214、215、216、217、220、221、222、223、224、225、226、228、229、230、231、232、233、235、236、237、238、239、240、242、243、247、250、251、252、257、258、260、262、263、264、265、266、268、269、271、273、274、279、280、282、283、284、287、288、289、292、294、295、296、297、299、300、301、302、303、304、305、306、307、309、310、313、314、315、316、317、318、320、321、324、325、326、328、331、332、333、334、335、336、339、340、341、342、343、344、345、348、349、351、352、353、355、356、357、358、360、361、363、364、366、367、368、370、372、375、376、377、379、381、382、384、385、386、388、389、390、393、394、395、396、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、418、421、424、425、426、428、430、431、432、433、434、436、437、438、439、442、443、444、445、446、446、448、449、450、451、452、453、454、457、458、460、461、462、464、466、467、468、470、471、472、473、474、477、478、479、480、482、483、484、485、486、487、488、489、491、492、495、496、497、498、499、500、502、503、504、505、506、507、510、511、515、516、517、518、519、522、523。
前実施例と類似の方法を用いて、BsmBI−HFの選択を行った。NEB4中の5%グリセロールとともにλDNAを用いて、切断を測定し、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中でLitmus28iを用いて、スター活性を測定した。好ましい変異体には、H230A、D231A及びN185Y/R232Aが含まれた。N185Y/R232AをBsmBI−HFと表記した。
NEB1から4緩衝液の各々の中で希釈液Aを用いて、λDNA基質に対して、BsmBI−HF及びWTBsmBIのFIを別個に測定した。比較は図30に示されており、結果は表29に列記されている(以下)。
1.BspQI制限エンドヌクレアーゼの部位指定突然変異導入
KmR及びAmpRであるpSX33−EarIMIM2及びpZZlacI−PspQIでイー・コリを形質転換した。M.EarI(CTCTTC)は、BspQI部位(GCTCTTC)も修飾し、従って、イー・コリ染色体を同時形質転換及び修飾するために、pSX33−earIMIM2(図17及び18)を使用した。WTアミノ酸配列が、図16に示されている。
対応する位置がSapI中のK273及びR380であるBspQI中に、保存されたK279及びR388アミノ酸残基が見出された。まず、6×Hisタグ付加されたSapI発現クローンをpUC19中に構築した。SpaI発現株は、pSX33−earIM1M2並びにKmR及びAmpRであったpUC−SapIで形質転換されたイー・コリであった。部位指定突然変異導入によって、Lys273からPro(K273P)への及びArg380からPhe(R380F)へのアミノ酸置換をSapI中に導入した。SapI単一変異体R380Aも構築した。制限活性及びスター活性の反応が実施されたときに、SapI変異形R380A及びK273P/R380Fの何れもが低下したスター活性を示した(図42)。
2つの活性を含有するKpnIを、より低いスター活性を有する変異体へ変化させた(国際公開WO07/027464号)。以下の実施例は、改善されたスター活性及び野生型と類似の切断活性を有する新規変異体を記載する。
1.BsaIの発現
pACYC−BsmAIM、pUC19−BsaIR及びpsyx20−laclqで形質転換されたイー・コリ中で、BsaIを発現させた。pACYCは、低コピー数適合的プラスミドである。BsmAIM(GTCTC)は、BsmBIの特異性(CGTCTC)を包含する。psyx20−lacIqは、lacIの強い発現を有する低コピー数ベクターである。Amp、Cam及びKanを加えたLB中で、細胞を37℃で一晩増殖させた。
BsaIのアミノ酸は、BsmBIのアミノ酸と似ている。対応する以前の有効部位周囲及びこの部位の11アミノ酸を、R229A、S230A、Y231F、T232A、T233A、D234A、R235A、R236A、F238A、E239A、Y240Fとして変異させる。
前実施例と類似の方法を用いて、BsaI−HFの選択を行った。標準的な活性のチェックはNEB4中の5%グリセロールを加えたλDNAを使用し、スター活性のチェックは、39%グリセロールを加えたNEB4緩衝液中においてLitmus28iに対して行った。設計された11の変異体のうち1つの変異体Y231Fは、スター活性を低下させ、BsaI−HFと表記される。
NEB1から4緩衝液中の希釈液Aを用いて、λDNAに対して、BsaI−HF及びWTBsaIのFIを別個に測定した。結果は、表32に列記されている(下記)。
Claims (41)
- 少なくとも1つの人工的に導入された変異及び少なくとも2の全体的な精度指数(FI)改善係数を有する制限エンドヌクレアーゼを含み、該制限エンドヌクレアーゼが、所定の緩衝液中において、人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼの切断活性と少なくとも類似の切断活性で基質を切断することが可能であり、前記人工的に導入された変異が標的化された変異、飽和突然変異導入又はPCR増幅操作を通じて導入された変異の少なくとも1つの産物である、組成物。
- 人工的に導入された変異の少なくとも1つが、制限エンドヌクレアーゼ中の標的部位における反対に帯電した残基での、天然に存在する残基の置換である、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異の少なくとも1つが、制限エンドヌクレアーゼ中の標的部位における、フェニルアラニン及びアラニンから選択される残基での、天然に存在する残基の置換である、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限酵素が、BamHI、EcoRI、ScaI、SalI、SphI、PstI、NcoI、NheI、SspI、NotI、SacI、PvuII、MfeI、HindIII、SbfI、EagI、EcoRV、AvrII、BstXI、PciI、HpaI、AgeI、BsmBI、BspQI、SapI、KpnI及びBsaIからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがBamHIであり、及び人工的に導入された変異がE163A/E167T;K30A;E86A;E86P;K87A;K87E;K87V;K87N;P144A;Y165F;E167A;E167R;E167K;E167L;E167I;K30A/E86A;E86A/K106A;K30A/E86A/K106A;K30A/K87A;E86P/K87E;E86A/Y165F;K30A/E167A;E163S/E170T/P173A;E163S/E170T/P173A;E86P/K87T/K88N/E163S/E170T/P173A;E86P/K87R/K88G/E163S/E170T/P173A;E86P/K87P/K88R/E163S/E170T/P173A/E211K;E86P/K87T/K88R/E163S/E170T/P173A/N158S;E86P/K87S/K88P/E163S/E170T/P173A;E86P/K87G/K88S/E163S/E170T/P173A;E86P/K87R/K88Q/E163S/E170T/P173A;及びE86P/K87W/K88V;及びE86P/P173Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがEcoRIであり、及び人工的に導入された変異がK62A;K62S;K62L;R9A;K15A;R123A;K130A;R131A;R183A;S2Y;D135A;R187A及びK62Eからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがScaIであり、及び人工的に導入された変異がR18A;R112A;E119A;H193A;S201F及びH193A/S201Fからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがSalIであり、及び人工的に導入された変異がR82A;K93A;K101A及びR107Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがSphIであり、及び人工的に導入された変異がD91A;D139A;D164A及びK100Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがPstIであり、及び人工的に導入された変異がE204A;K228A;K228A/A289V及びD91Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがNcoIであり、及び人工的に導入された変異がD56A;H143A;E166A;R212A;D268A及びA2T/R31Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがNheIであり、及び人工的に導入された変異がE77Aである、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがSspIであり、及び人工的に導入された変異がH65A;K74A;E78A;E85A;E89A;K109A;E118A;R177A;K197A及びY98Fからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがNotIであり、及び人工的に導入された変異がK176A;R177A;R253A及びK150Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがSacIであり、及び人工的に導入された変異がQ117H/R154A/L284P及びQ117H/R200Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがPvuIIであり、及び人工的に導入された変異がT46A、T46H、T46K、T46Y及びT46Gからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがMfeIであり、及び人工的に導入された変異がY173F及びQ13A/F35Yからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがHindIIIであり、及び人工的に導入された変異がS188P/E190A及びK198Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがSbfIであり、及び人工的に導入された変異がK251Aである、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがEagIであり、及び人工的に導入された変異がH43Aである、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがEcoRVであり、及び人工的に導入された変異がD19A;E27A及びD19A/E27Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがAvrIIであり、及び人工的に導入された変異がY104F、M29A、E96A、K106A、S127A及びF142Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがBstXIであり、及び人工的に導入された変異N65A、Y57F、E75A、N76A及びK199Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがPciIであり、及び人工的に導入された変異がE78A/S133Aである、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがHpaIであり、及び人工的に導入された変異がY29F及びE56Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがAgeIであり、及び人工的に導入された変異がR139A及びS201Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがBsmBIであり、及び人工的に導入された変異N185Y/R232A;H230A;D231A及びR232Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがBspQIであり、及び人工的に導入された変異がK279P/R388F;K279A;K279F;K279P;K279Y;K279E;K279D;R388A;R388F;R388Y;R388L;K279P/R388F;K279A/R388A及びD244Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがSapIであり、及び人工的に導入された変異がK273P;R380A及びK273P/R380Aからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがKpnIであり、及び人工的に導入された変異がD148E;D16N/R119A/D148E;D2A/D16N/D148E;D16N/E134A/D148E及びD16N/E132A/D148Eからなる群から選択される、請求項1に記載の組成物。
- 人工的に導入された変異が存在しない制限エンドヌクレアーゼがBsaIであり、及び人工的に導入された変異がY231Fである、請求項1に記載の組成物。
- 請求項1の組成物をコードするDNA分子。
- 請求項32のDNAを含有するベクター。
- 請求項1の組成物を発現させるためのDNAを含有する宿主細胞。
- (a)スター活性を有する制限エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列中の何れのアミノ酸残基が帯電したアミノ酸であるかを同定すること;
(b)制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子配列中の帯電した残基の1つ又はそれ以上をコードする1つ又はそれ以上のコドンを変異させること;
(c)異なる帯電した残基中に1つ又はそれ以上の異なるコドン変異を有する遺伝子配列のライブラリーを作製すること;
(d)変異された遺伝子配列によって発現されたタンパク質の組を取得すること;及び
(e)各タンパク質に対して、所定の緩衝液中でのFI及び切断活性を測定すること;
を含む、方法。 - 緩衝液の所定の組中のタンパク質の組に属するタンパク質に関して、全体的なFI改善係数を測定することをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 緩衝液の所定の組がNEB1、NEB2、NEB3及びNEB4緩衝液から構成される、請求項35に記載の方法。
- 帯電したアミノ酸に対するコドンを変異させる工程と同じ工程又はその後の工程において、水酸化されたアミノ酸をコードするコドンを変異させることをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- 帯電したアミノ酸に対するコドンを変異させる工程と同じ工程又はその後の工程において、アミド含有アミノ酸をコードするコドンを変異させることをさらに含む、請求項35に記載の方法。
- フェニルアラニンへ変異されるチロシンを除き、コドンがアラニンへ変異される、請求項35、38及び39に記載の方法。
- 変異されたコドンの1つ又はそれ以上の飽和突然変異導入を用いて、全体的なFI改善係数を向上させることをさらに含む、請求項37に記載の方法。
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