CN107208146A - 用于核酸扩增的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于扩增和/或分析核酸的组合物和方法。

Description

用于核酸扩增的组合物和方法
交叉引用
本申请要求2014年11月20日提交的第62/082,534号美国临时专利申请、2014年11月20日提交的第62/082,538号美国临时专利申请和2014年11月20日提交的第62/082,541号美国临时专利申请的优先权，这些申请均通过引用以其全文并入本文以用于所有目的。
背景技术
核酸扩增方法允许扩增样品如生物样品中的核酸分子。核酸分子可以经由例如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(PCR))或经由等温方法来扩增。核酸扩增还可以用于制备核酸分子以供与核酸分析相关的许多应用中的后续分析，这些应用例如是检测靶核酸序列、检测样品中的罕见核酸分子/序列和/或制备用于测序反应的核酸分子。因此，由于核酸扩增对于广泛应用的适用性，对于可用于扩增核酸分子和/或可用于分析由核酸扩增生成的扩增的核酸分子的组合物和方法存在需要。
发明内容
本公开内容提供了用于核酸扩增及分析的探针、装置、引发寡核苷酸、组合物和方法。
本公开内容的一方面提供了具有互补于单链靶核酸分子的核酸序列的探针。该核酸序列可具有(i)至少一个可切割部分，(ii)可检测部分和(iii)猝灭剂。当探针不与该单链靶核酸分子杂交时，该猝灭剂可猝灭该可检测部分。
在一些实施方案中，所述探针可以是单链的。在一些实施方案中，该探针可能无法进行分子内杂交。在一些实施方案中，该探针可包含多个可切割部分。在一些实施方案中，可检测部分可以是荧光团。在一些实施方案中，该可检测部分可适合于在该探针与单链靶核酸分子杂交时提供可检测信号。
在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分可以是核糖部分。此外，溶液可以含有探针并且可以例如包含碱性缓冲液。
在一些实施方案中，所述探针可以包含位于所述至少一个可切割部分侧翼的核苷酸序列A和核苷酸序列B。核苷酸序列A和核苷酸序列B可各自互补于单链靶核酸分子的一部分。在一些实施方案中，在探针与单链靶核酸分子杂交时，该可切割部分可以是可切割的。在一些实施方案中，该可切割部分可以是在碱性条件下可切割的和/或在不借助于酶的情况下可切割的。
在一些实施方案中，所述探针可适合于与单链靶核酸分子杂交，使得所述至少一个可切割部分位于该单链靶核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)位点。在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分相对于SNP位点处的核苷酸是互补的。
此外，所述探针可固定在包含基底例如固体基底的阵列上。该固体基底可包含选自金属、半金属、玻璃、聚合物、金属氧化物、氧化硅和氮化硅的材料。在一些实施方案中，该探针可固定在阵列的孔中。
本公开内容的附加方面提供了用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法可包括提供包含单链靶核酸分子和探针的反应混合物。该探针可具有核酸序列，该核酸序列具有(i)至少一个可切割部分，(ii)可检测部分和(iii)猝灭剂。而且，该探针可互补于该单链靶核酸分子，并且当该探针不与该单链靶核酸分子杂交时，该猝灭剂可猝灭可检测部分。该方法可进一步包括使该探针与该单链靶核酸分子杂交，其中在杂交时，该可切割部分被设置为与该单链靶核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)位点上的核苷酸相邻。该方法可进一步包括检测来自该探针的信号，该信号指示在SNP位点上存在核苷酸。
在一些实施方案中，提供反应混合物并使探针与单链靶核酸分子杂交使得可切割部分被设置为与该单链靶核酸分子的SNP位点上的核苷酸相邻，可在不借助于酶的情况下和/或不对反应混合物的温度进行循环的情况下进行。在一些实施方案中，该方法进一步包括将反应混合物的pH维持在7以上，例如8到11。
在一些实施方案中，所述单链靶核酸分子可不含有可检测部分。在一些实施方案中，在探针与单链靶核酸分子杂交时可以切割可切割部分。在一些实施方案中，该可检测部分可适合于在探针与单链靶核酸分子杂交时提供信号。该信号可以是，例如光信号、静电信号或电化学信号。
在一些实施方案中，所述探针包含多个可切割部分。在一些实施方案中，该探针可以包含位于所述至少一个可切割部分侧翼的核苷酸序列A和核苷酸序列B。核苷酸序列A和核苷酸序列B可各自互补于单链靶核酸分子的一部分。在一些实施方案中，该可切割部分可相对于SNP位点上的核苷酸是互补的。在一些实施方案中，该探针可固定在阵列的基底上。在一些实施方案中，该探针可固定在阵列的孔中。
本公开内容的附加方面提供了用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法可包括提供第一反应混合物，其包含(i)靶核酸分子的第一链和(ii)第一引物，该第一引物在其核苷酸位点处具有嘌呤衍生物，该核苷酸位点对应于怀疑包含单核苷酸多态性(SNP)的第一核苷酸位点的第一链的核苷酸位点。相比于第一链的其他类型的碱基，该嘌呤衍生物可优先与第一链的嘧啶碱基杂交。该方法可进一步包括提供第二反应混合物，其包含(i)靶核酸分子的第一链的互补链和(ii)第二引物，该第二引物在其核苷酸位点处具有嘧啶衍生物，该核苷酸位点对应于怀疑包含该SNP的第二核苷酸位点的互补链的核苷酸位点。相比于互补链的其他类型的碱基，该嘧啶衍生物可优先与互补链的嘌呤碱基杂交。该方法可进一步包括使第一和第二反应混合物经受这样的条件，该条件使得第一引物在与第一链杂交时可延伸以产生第一核酸产物，并且使得第二引物在与互补链杂交时可延伸以产生第二核酸产物，以及测定第一和第二核酸产物的相对量。
在一些实施方案中，第一链的嘧啶碱基可以是胞嘧啶碱基。在一些实施方案中，互补链的嘌呤碱基可以是腺嘌呤碱基。在一些实施方案中，该嘌呤衍生物可以不是鸟嘌呤。在一些实施方案中，该嘌呤衍生物可以是次黄嘌呤或其衍生物。在一些实施方案中，该嘧啶衍生物可以不是胸腺嘧啶。在一些实施方案中，该嘧啶衍生物可以是尿嘧啶或其衍生物。在一些实施方案中，该嘌呤衍生物借助于具有3’到5’外切核酸酶活性的酶可被腺嘌呤碱基代替。在一些实施方案中，该嘧啶衍生物借助于具有3’到5’外切核酸酶活性的酶可被胞嘧啶碱基代替。
在一些实施方案中，第一和第二反应混合物可以在单独的容器中。在一些实施方案中，第一和第二反应混合物中的每一个可包含可检测部分，例如光学可检测部分(例如，SYBR绿、EvaGeen、BEBO、BOXTO、嵌入染料)。
在一些实施方案中，测定第一和第二核酸产物的相对量可借助于解链曲线分析来完成。在一些实施方案中，测定第一和第二核酸产物的相对量可借助于循环阈值的变化(ΔCt)来完成。在一些实施方案中，测定第一和第二核酸产物的相对量可借助于凝胶电泳来完成。在一些实施方案中，测定该第一和第二核酸产物的相对量可借助于被编程为比较第一和第二核酸产物的相对量的计算机处理器来完成。在一些实施方案中，与第二核酸产物相比第一核酸产物的量较多可表明在该SNP的第一核苷酸位点处存在嘌呤碱基。在一些实施方案中，与第一核酸产物相比第二核酸产物的量较多可表明在该SNP的第二核苷酸位点处存在嘧啶碱基。
本公开内容的附加方面提供了可钝化的(inactivatable)引发寡核苷酸。该可钝化的引发寡核苷酸可包含引发区，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中核酸序列A的3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链，和(ii)至少一个可切割部分。该可钝化的引发寡核苷酸可进一步包含可与引发区显示出序列互补性的与引发区相邻的核酸序列B。
在一些实施方案中，核酸序列A的3’端可以仅在等于或高于核酸序列B的解链温度的温度下可延伸。在一些实施方案中，引发区从3’到5’可以包含核酸序列A、可切割部分和可互补于单链靶核酸分子的核酸序列A’。在一些实施方案中，核酸序列B可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于单链靶核酸分子的互补体。在一些实施方案中，核酸序列B可以包含不与引发区和/或单链靶核酸分子互补的间隔区。在一些实施方案中，该间隔区可以不被聚合酶拷贝。在一些实施方案中，该间隔区可以是一个或多个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，所述引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。在一些实施方案中，第一解链温度可以为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以比第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
在一些实施方案中，所述引发区可进一步包含核酸序列A’。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有低于第一解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可低于第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分可以是核糖。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可光解的。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可酶切的，例如，可被具有内切核酸酶活性的酶切割。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可化学切割的。在一些实施方案中，所述可钝化的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。在一些实施方案中，所述可钝化的引发寡核苷酸可以是环形可钝化的引发寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述可钝化的引发寡核苷酸可包含在溶液中，在一些实施方案中，该溶液可包含碱性缓冲液。
本公开内容的附加方面提供了可钝化的引发寡核苷酸。该可钝化的引发寡核苷酸可包含引发区，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中核酸序列A具有适合于在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端，和(ii)至少一个可切割部分。该可钝化的引发寡核苷酸还可以包含与该引发区相邻的核酸序列B，其中该引发区具有第一解链温度并且核酸序列B具有低于第一解链温度的第二解链温度。
在一些实施方案中，核酸序列A的3’端可以仅在等于或高于第二解链温度的温度下是可延伸的。在一些实施方案中，所述引发区从3’到5’可以包含核酸序列A、与核酸序列A相邻的可切割部分以及与该可切割部分相邻的核酸序列A’。在一些实施方案中，核酸序列A’可互补于单链靶核酸分子。在一些实施方案中，核酸序列B可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于单链靶核酸分子的互补体。在一些实施方案中，核酸序列B可以包含不与引发区和/或单链靶核酸分子互补的间隔区。在一些实施方案中，该间隔区可以是一个或多个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，第一解链温度可以为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以比第一解链温度低至少约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有低于第一解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，第三解链温度可低于第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分可以是核糖。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可光解的。在一些实施方案中，该可切割部分是可酶切的，例如，可被具有内切核酸酶活性的酶切割。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可化学切割的。在一些实施方案中，该可钝化的引发寡核苷酸包含多个可切割部分。在一些实施方案中，该可钝化的引发寡核苷酸可以是环形可钝化的引发寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述可钝化的引发寡核苷酸可包含在溶液中。这样的溶液可包含碱性缓冲液。
本公开内容的附加方面提供了用于钝化可钝化的引发寡核苷酸的方法。该方法可包括提供含有可钝化的引发寡核苷酸的溶液，该可钝化的引发寡核苷酸包含(a)引发区，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中核酸序列A的3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链，和(ii)至少一个可切割部分；以及提供与该引发区显示出序列互补性的与该引发区相邻的核酸序列B。该方法可进一步包括切割可切割部分，从而钝化该可钝化的引发寡核苷酸的引发区。
在一些实施方案中，可以采用酶，例如采用内切核酸酶来切割可切割部分。在一些实施方案中，可以采用光来切割可切割部分。在一些实施方案中，可以经由大于7的溶液pH来切割可切割部分。
本公开内容的附加方面提供了用于钝化可钝化的引发寡核苷酸的方法。该方法可包括提供含有可钝化的引发寡核苷酸的溶液，该可钝化的引发寡核苷酸包含(a)引发区，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中核酸序列A的3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链，和(ii)至少一个可切割部分；以及提供与该引发区相邻的核酸序列B，其中该引发区具有第一解链温度并且核酸序列B具有低于该第一解链温度的第二解链温度。该方法可进一步包括切割可切割部分，从而钝化该可钝化的引发寡核苷酸的引发区。
在一些实施方案中，所述引发区从3’到5’可以包含核酸序列A、与核酸序列A相邻的可切割部分以及与该可切割部分相邻的核酸序列A’。在一些实施方案中，该方法进一步包括使溶液的温度降至等于或低于第二解链温度。在一些实施方案中，该可切割部分可以在等于或低于第二解链温度的溶液温度下切割。在一些实施方案中，该方法进一步包括在切割可切割部分之后使该溶液的温度升至等于或高于第二解链温度。
在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A在等于或高于其解链温度和/或第一解链温度的温度下可能不与单链靶核酸分子稳定地杂交。在一些实施方案中，第一解链温度可以为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以比第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有低于第一解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可低于第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，该方法进一步包括使溶液的温度升至等于或高于第三解链温度。
在一些实施方案中，可切割部分的切割可以采用酶来进行。在一些实施方案中，可切割部分的切割可以采用光来进行。在一些实施方案中，可切割部分的切割经由大于7的溶液pH来进行。
本公开内容的附加方面提供了可激活的引发寡核苷酸。该可激活的引发寡核苷酸可包含引发区，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A和(ii)至少一个可切割部分，其中核酸序列A具有适合于仅在切割该可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。该可激活的引发寡核苷酸还可以包含核酸序列B，核酸序列B位于引发区的3’侧并且显示出与该引发区的序列互补性。
在一些实施方案中，所述引发区从5’到3’可以包含核酸序列A、可切割部分和核酸序列A’。在一些实施方案中，核酸序列A’可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于单链靶核酸分子的互补体。在一些实施方案中，该引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B具有低于第一解链温度的第二解链温度。在一些实施方案中，第一解链温度可以为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以比第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
在一些实施方案中，所述引发区可进一步包含核酸序列A’。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有低于第一解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可低于或高于第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分可以是核糖。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可光解的。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可酶切的，例如，可被内切核酸酶切割。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可化学切割的。在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。在一些实施方案中，该可激活的引发寡核苷酸可以是环形可激活的引发寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可被包含在溶液内。这样的溶液可包含碱性缓冲液。
本公开内容的附加方面提供了可激活的引发寡核苷酸。该可激活的引发寡核苷酸可包含引发区，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A和(ii)至少一个可切割部分，其中核酸序列A具有适合于仅在切割该可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。该可激活的引发寡核苷酸可进一步包含核酸序列B，核酸序列B位于引发区的3’侧，其中该引发区具有第一解链温度并且核酸序列B具有低于第一解链温度的第二解链温度。
在一些实施方案中，所述引发区从5’到3’可以包含核酸序列A、可切割部分和核酸序列A’。在一些实施方案中，引发区核酸序列A’可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于单链靶核酸分子的互补体。
在一些实施方案中，第一解链温度可以为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以比第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有低于第一解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可低于或高于第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分可以是核糖。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可光解的。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可酶切的，例如，可被内切核酸酶切割。在一些实施方案中，该可切割部分可以是可化学切割的。在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。在一些实施方案中，该可激活的引发寡核苷酸可以是环形可激活的引发寡核苷酸。
所述可激活的引发寡核苷酸可包含在溶液中。这样的溶液可包含碱性缓冲液。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括提供含有可激活的引发寡核苷酸的溶液，该可激活的引发寡核苷酸包含引发区和核酸序列B，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，(ii)至少一个可切割部分，该核酸序列B位于引发区的3’侧并且显示出与该引发区的序列互补性。核酸序列A可具有适合于仅在切割该可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。该方法进一步包括切割该可切割部分以及利用核酸序列A进行引物延伸反应以形成该互补核酸链。
在一些实施方案中，可以采用酶，例如内切核酸酶来切割可切割部分。在一些实施方案中，可以采用光来切割可切割部分。在一些实施方案中，可以经由大于7的溶液pH来切割可切割部分。
在一些实施方案中，所述引发区从5’到3’可以包含核酸序列A、可切割部分和核酸序列A’。在一些实施方案中，核酸序列A’可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于单链靶核酸分子的互补体。
在一些实施方案中，所述引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。在一些实施方案中，第一解链温度可以为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以比第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些实施方案中，该引发区进一步包含核酸序列A’。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有低于第一解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可低于或高于第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，该方法可进一步包括在进行引物延伸反应之前使溶液的温度降至等于或低于第三解链温度。
在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分可以是核糖。在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。在一些实施方案中，该可激活的引发寡核苷酸可以是环形可激活的引发寡核苷酸。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括提供含有可激活的引发寡核苷酸的溶液，该可激活的引发寡核苷酸包含引发区和核酸序列B，该引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，(ii)至少一个可切割部分，该核酸序列B位于该引发区的3’侧。该引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。而且，核酸序列A可具有适合于仅在切割该可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成该单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。该方法可进一步包括切割该可切割部分以及使用核酸序列A进行引物延伸反应以形成该互补核酸链。
在一些实施方案中，采用酶，例如内切核酸酶来切割可切割部分。在一些实施方案中，采用光来切割可切割部分。在一些实施方案中，经由大于7的溶液pH来切割可切割部分。
在一些实施方案中，所述引发区从5’到3’可以包含核酸序列A、可切割部分和核酸序列A’。在一些实施方案中，核酸序列A’可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于单链靶核酸分子的互补体。
在一些实施方案中，第一解链温度可以为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，第二解链温度可以比第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。在一些实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有低于第一解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可低于或高于第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可以低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。在一些实施方案中，在进行引物延伸反应之前，该方法进一步包括使溶液的温度降至等于或低于第三解链温度。
在一些实施方案中，所述至少一个可切割部分可以是核糖。在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。在一些实施方案中，该可激活的引发寡核苷酸可以是环形可激活的引发寡核苷酸。
本公开内容的附加方面提供了可包含可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的反应混合物。该可激活的引发寡核苷酸可包含具有可与靶核酸分子杂交的核酸序列A’以及至少一个第一可切割部分的第一引发区。该可激活的引发寡核苷酸可仅在切割第一可切割部分时被激活，使得核酸序列A’的3’端在引物延伸反应中可延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链。此外，该可钝化的引发寡核苷酸可包含具有可与靶核酸分子杂交的核酸序列A以及至少一个第二可切割部分的第二引发区。该可钝化的引发寡核苷酸可在切割第二可切割部分时被钝化，使得核酸序列A不与靶核酸分子形成稳定的复合体以促进基于靶核酸分子序列的引物延伸反应。
在一些实施方案中，所述反应混合物可进一步包含靶核酸分子。在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可进一步包含核酸序列B’，该核酸序列B’位于该可激活的引发寡核苷酸的引发区的3'侧并且与该可激活的引发寡核苷酸的引发区显示出序列互补性。在一些实施方案中，所述可钝化的引发寡核苷酸可进一步包含与该可钝化的引发寡核苷酸的引发区相邻的核酸序列B，该核酸序列B与该可钝化的引发寡核苷酸的引发区显示出序列互补性。
在一些实施方案中，所述第一可切割部分和/或第二可切割部分可以是核糖。在一些实施方案中，第一可切割部分和/或第二可切割部分可被酶例如内切核酸酶切割。在一些实施方案中，第一可切割部分和第二可切割部分可以是可被相同的酶切割的。在一些实施方案中，所述可钝化的寡核苷酸可以在切割可激活的寡核苷酸的第一可切割部分时是可钝化的。在一些实施方案中，所述可激活的寡核苷酸可以在切割可钝化的寡核苷酸的第二可切割部分时是可激活的。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括提供包含靶核酸分子、可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的溶液。该方法进一步包括进行连续的核酸扩增反应。该连续的核酸扩增反应可至少包括第一阶段以及随后的第二阶段，其中第一阶段包括使用该可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分作为引物进行靶核酸分子的扩增，其中第二阶段包括使用该可激活的引发寡核苷酸的至少一部分作为另一引物进行靶核酸分子或其区域的扩增。在第一阶段后，该可激活的引发寡核苷酸可被激活并且该可钝化的引发寡核苷酸可被钝化。而且，该连续的扩增反应可产生靶核酸分子的扩增产物。
在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸可被具有内切核酸酶活性的酶分别激活和钝化。在一些实施方案中，该酶是热稳定的和/或可激活的。在一些实施方案中，该酶是核糖核酸酶，例如核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII。在一些实施方案中，连续的核酸扩增反应可在单一反应混合物中发生。在一些实施方案中，连续的核酸扩增反应可在多于一种反应混合物中发生。在一些实施方案中，溶液可进一步包含至少一种反向引物。
在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可包含引发区和核酸序列B’，该引发区具有(i)可与靶核酸分子杂交的核酸序列A’，(ii)至少一个可切割部分，该核酸序列B’位于该引发区的3’侧并且显示出与该引发区的序列互补性。核酸序列A’可具有适合于仅在切割该可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链的3’端。
在一些实施方案中，所述可钝化的引发寡核苷酸可包含引发区和与该引发区相邻的核酸序列B，该引发区具有(i)可与靶核酸分子杂交的核酸序列A，(ii)至少一个可切割部分，该核酸序列B显示出与该引发区的序列互补性。核酸序列A可具有适合于在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链的3’端。
在一些实施方案中，所述可钝化的引发寡核苷酸可以在切割可激活的引发寡核苷酸的可切割部分时是可钝化的。在一些实施方案中，所述可激活的引发寡核苷酸可以在切割可钝化的引发寡核苷酸的可切割部分时是可激活的。在一些实施方案中，该方法进一步包括检测靶核酸分子的扩增产物。该检测可以经由例如光学检测、静电检测或电化学检测来完成。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括提供包含靶核酸分子、可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的反应混合物，其中每一个均可与靶核酸分子的不同区域杂交。该方法可进一步包括在该反应混合物中采用该可激活的引发寡核苷酸的至少一部分或该可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发靶核酸分子。该方法可进一步包括使用经该可激活的引发寡核苷酸的至少一部分或该可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分选择性引发的靶核酸分子进行核酸扩增反应，以产生该靶核酸分子的扩增产物。
在一些实施方案中，靶核酸分子可在反应混合物中被选择性地引发而无需去除其内含物。在一些实施方案中，采用可激活的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发靶核酸分子可通过酶来实现，该酶激活该可激活的引发寡核苷酸以允许引物延伸反应产生扩增产物。在一些实施方案中，该酶可具有内切核酸酶活性。
在一些实施方案中，采用可激活的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发靶核酸分子可通过酶来实现，该酶钝化可钝化的引发寡核苷酸，使得其不与靶核酸分子形成稳定的复合体。在一些实施方案中，该酶可具有内切核酸酶活性。
在一些实施方案中，采用可钝化的引发寡核苷酸选择性地引发靶核酸分子可在不存在具有内切核酸酶活性的活性酶的情况下实现。
通过以下仅示出并描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的附加方面和优势对于本领域技术人员是显而易见的。应当认识到，本公开内容能够具有其他且不同的实施方案，并且在均不脱离本公开内容的情况下其若干细节能够在各个明显方面进行修改。因此，附图和说明书在本质上应被视为说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地描述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(本文也称为“图”)将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1A是描绘实施例1所述的示例探针的示意图；图1B是对应于图1A中的示例探针的示例靶核酸分子；
图2A是总结实施例1所述的各个实验的表格；图2B是以图示方式总结实施例1所述的各个实验的结果的条形图；
图3A是总结实施例1所述的各个实验的表格；图3B是以图示方式总结实施例1所述的各个实验的结果的条形图；
图4A是总结实施例1所述的各个实验的表格；图4B是以图示方式总结实施例1所述的各个实验的结果的条形图；
图5A示意性地描绘了实施例2所述的示例探针；图5B是描绘实施例2所述的示例无效(null)探针的示意图；图5C是描绘实施例2所述的示例靶核酸分子的示意图；
图6A和图6B是以图示方式总结实施例2所述的各个实验的结果的条形图；
图7A示意性地描绘了实施例3所述的示例探针；图7B以图示方式总结了实施例3所述的各个实验的结果；
图8A示意性地描绘了实施例4所述的示例双链探针的示例链；图8B以图示方式总结了实施例4所述的各个实验的结果；
图9A示意性地描绘了可钝化的引发寡核苷酸示例及其在扩增反应中的功能；图9B示意性地描绘了可激活的引发寡核苷酸示例及其在扩增反应中的功能；
图10A示意性地描绘了可钝化的引发寡核苷酸示例及其在扩增反应中的功能；图10B示意性地描绘了可激活的引发寡核苷酸示例及其在扩增反应中的功能；图10C提供了总结图10A和图10B所描绘的可钝化和可激活的引发寡核苷酸示例的序列的表格；图10C还提供了总结使用图10A和图10B所描绘的可钝化和可激活的寡核苷酸示例的示例核酸扩增反应的示意图；
图11A是总结实施例6所述的各个实验的表格；图11B示意性地描绘了实施例6所述的实验所描述的示例处理程序；图11C是实施例6所述的凝胶电泳分析的照片；
图12示意性地描绘了示例计算机系统；
图13A是描绘核酸分子中示例单核苷酸多态性(SNP)的示意图；图13B和图13C是描绘用于检测图13A所描绘的示例SNP的示例方法的示意图；
图14A提供了实施例5所述的具有示例SNP位点的示例靶核酸序列和检测该SNP位点上的核苷酸的示例方法；图14B提供了实施例5所述的示例正向和反向引物；图14C和图14D提供了各种反应混合物的解链曲线分析的示例图形描绘和总结实施例5所述的各种反应混合物的内含物的表格。
具体实施方式
虽然本文已示出并描述了本发明的各种实施方案，但此类实施方案仅通过实例的方式予以提供对于本领域技术人员是显而易见的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。
除非上下文另有明确规定，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一个核酸分子”包括多个核酸分子，包括其混合物。
如本文所用，术语“扩增(amplify)”和“扩增(amplication)”可互换使用且通常是指产生核酸的一个或多个拷贝。“扩增反应”通常是指发生核酸扩增的反应。
如本文所用，术语“退火”和“杂交”通常是指一个核酸分子(例如，引物或探针)经由核酸分子之间的互补性与另一个核酸分子(例如，模板核酸分子、靶核酸分子)的结合。
如本文所用，术语“可切割部分”通常是指核酸分子(例如，引发寡核苷酸、探针)中所包含的不稳定物质或可分离基团，其可被切割使得核酸分子被分成多个较短的核酸分子。可切割部分可通过任何合适的路径切割，其非限制性实例包括酶切、光切割和化学切割(例如，经由合适的pH条件)。
“互补性”、“互补的”通常是指核酸根据Watson-Crick碱基配对原则或其他类型的碱基配对原则与另一个核酸形成氢键的能力。核酸链的“互补体”通常是指与该核酸链互补的核酸的另一条链。“部分互补的”通常意指第一核酸序列的一部分会与第二核酸序列的一部分形成氢键(例如，碱基对)。“基本上互补的”或“基本互补性”通常是指在3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的互补性的程度。
如本文所用，术语“循环阈值”或“Ct”通常是指在扩增反应期间的循环，其中由扩增产物引起的可检测信号的增加达到背景信号以上的统计显著性水平。
如本文所用，术语“变性(denaturing)”和“变性(denaturation)”可互换使用且通常是指双链核酸的螺旋结构的全部或部分解旋，并且在一些实施方案中是指单链核酸的二级结构的解旋。
如本文所用，“可检测部分”通常是指产生可检测信号的组合物，其存在或不存在可用来检测核酸和/或核酸的拷贝的存在与否。在一些实施方案中，可检测部分可以是可光学检测的部分，使得该可检测部分在存在(或不存在)电磁辐射例如光的情况下产生可检测信号。在一些实施方案中，可检测部分可被包含在探针中。在一些实施方案中，可检测部分可与猝灭剂偶联，当适当接近可检测部分时，猝灭剂使可检测部分产生其可检测信号降至最低或得以防止。在一些实施方案中，可检测部分可以是可鉴定与该可检测部分缔合的物质的标记。
如本文所用，术语“解链温度”通常是指杂交并形成双链分子的两个单链核酸分子彼此解离(例如，通过热破坏杂交的互补碱基之间的氢键键合)时的温度。在一些实施方案中，解链温度可指一群相同的双链核酸分子的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的相同核酸链与它们的互补链解离时的温度。例如，双链核酸分子的解链温度可指该双链核酸分子的约一半的分子解离成其组成链时的温度。在一些实施方案中，核酸序列的解链温度可以为约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高。
如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”可互换使用且通常是指任何长度的聚合物形式的核苷酸——脱氧核糖核苷酸(dNTP)或核糖核苷酸(rNTP)或其类似物。核酸可具有任何三维结构，并且可行使任何已知或未知的功能。核酸的非限制性实例包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)、基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。核酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在的话，可在核酸的组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核酸的核苷酸的序列可被非核苷酸组分中断。核酸可以在聚合反应之后例如通过与可检测部分的缀合或结合进一步修饰。在一些实施方案中，核酸可以为在一些实施方案中可用来扩增另一个核酸分子的引物。
如本文所用，术语“引物”通常是指能够与模板核酸分子杂交且能够经由该模板核酸分子以模板指导的方式延伸的核酸分子。如本文所用，“引发寡核苷酸”通常是指包含可用作引物的核酸序列的寡核苷酸。这样的核酸序列可以被包含在引发寡核苷酸的“引发区”中。在一些实施方案中，引物可以是单链的或部分双链的。
如本文所用，“引物延伸反应”通常是指引物与核酸链的结合(例如，“退火”)，然后使用核酸链作为模板将核苷酸随该引物掺入(例如，该引物的“延伸”或“延伸”该引物)。引物延伸反应可借助于例如聚合酶的酶来完成。
如本文所用，术语“探针”通常是指在与靶核酸分子杂交和/或扩增靶核酸分子时可产生可检测信号(或其不存在)的核酸分子(例如，寡核苷酸)。在一些实施方案中，探针可以包含可检测部分、猝灭剂和可切割部分，使得当切割该可切割部分时，该可检测部分和猝灭剂分离，从而允许该可检测部分产生其可检测信号。
如本文所用，术语“反应混合物”或“扩增反应混合物”通常是指包含完成引物延伸反应和/或核酸扩增所需的一种或多种试剂的组合物，此类试剂的非限制性实例包括对于靶核酸具有特异性的一种或多种引物、聚合酶、合适的缓冲液、辅因子(例如，二价和单价阳离子)、核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸(dNTP))以及任何其他的酶。在一些实施方案中，反应混合物还可以包含一种或多种适合于在扩增反应中检测物质的探针和/或可检测部分。
如本文所用，术语“靶核酸”和“靶核酸分子”可互换使用且通常是指具有靶序列的核酸分子的起始群体中的核酸分子，需要确定该核酸分子的存在、量和/或核苷酸序列或其中一项或多项的变化。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是双链的。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是单链的。例如，单链靶核酸分子可包括双链核酸分子的链。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是部分单链的和部分双链的。靶核酸分子可以是基因、调节序列、基因组DNA、cDNA、包括mRNA、miRNA、rRNA在内的RNA，或其他的一部分。靶核酸分子可以是来自样品或二级靶标如扩增反应的产物的靶核酸分子。
本公开内容的一些方面提供了用于使用这样的探针检测单核苷酸多态性(SNP)的探针和方法。这样的探针可包含在与靶核酸分子杂交时可被切割的可切割部分。该可切割部分的切割可以产生来自与探针缔合的可检测部分的可检测信号。
一方面，本公开内容提供了一种探针。该探针可包含互补于单链靶核酸分子且具有至少一个可切割部分、可检测部分和猝灭剂的核酸序列。当探针不与单链靶核酸分子杂交时，该猝灭剂可猝灭该可检测部分。
所述探针可以是单链的或双链的。而且，在一些实施方案中，该探针可能无法进行分子内杂交。例如，该探针可能无法进行自我杂交，如在该探针采取包含与其序列的另一部分杂交的其序列的至少一部分的构型的情况下。在一些实施方案中，该探针可以包含位于至少一个可切割部分侧翼的核苷酸序列A和核苷酸序列B。核苷酸序列A和核苷酸序列B可各自互补于单链靶核酸分子的一部分。
所述探针的可切割部分可以是任何合适的可切割部分，其中可切割部分的非限制性实例包括核糖部分、二硫化物部分、叠氮化物部分、可酶切连接体、亲核体/碱敏感性连接体、还原敏感性连接体、可光解连接体、亲电体/酸敏感性连接体、金属辅助切割连接体、氧化敏感性连接体及其组合。在一些实施方案中，该探针可包含多个可切割部分。而且，该探针的可切割部分可通过任何合适的路径而切割。例如，在探针与单链靶核酸分子杂交时，该探针的可切割部分可以是可切割的。在一些实施方案中，可切割部分可以在碱性条件(例如，pH大于7)下是可切割的。例如，可切割部分可以在约7到14、约8到11或约9到10的pH下是可切割的。在一些实施方案中，该可切割部分可以在约7.1、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5或14.0的pH下是可切割的。此外，该探针可以在不借助于酶(例如，聚合酶、包含内切核酸酶活性的酶、包含3’到5’内切核酸酶活性的酶等)的情况下是可切割的。
在一些实施方案中，所述探针可适合于与单链靶核酸分子杂交，使得可切割部分位于该单链靶核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)位点。该可切割部分可以相对于SNP位点处的核苷酸是互补的或非互补的。该可切割部分与在SNP位点上的核苷酸的互补性可以帮助促使该可切割部分更不稳定。相反，该可切割部分与在SNP位点上的核苷酸缺乏互补性或互补性弱可使该可切割部分较为稳定。因此，被设计为检测SNP的探针的可切割部分可被设计为使得该可切割部分与该SNP位点上的特定核苷酸互补。
所述探针的可检测部分可以是任何合适的可检测部分，包括本文别处所述的可检测部分。在一些实施方案中，该可检测部分可以是光学可检测部分，例如荧光团或其他的染料。此外，该探针的可检测部分可适合于在探针与单链靶核酸分子杂交时提供可检测信号(例如，光信号、电化学信号、静电信号)。而且，可检测部分可位于该探针的任何合适的位置，例如，在探针的3’端，在探针的5’端，在探针的3’与5’端之间的位置，在不含有猝灭剂的双链探针的一条链上，或在与猝灭剂相对的探针一端。可检测部分可与探针直接偶联或经由连接体间接地偶联。可检测部分的偶联可以经由任何合适的路径实现，包括本文别处所述的共价和/或非共价路径。
此外，所述探针的猝灭剂可以是任何合适的猝灭剂，其中猝灭剂的非限制性实例包括IABkFQ猝灭剂、ABkFQ猝灭剂和黑洞猝灭剂(BHQ)。而且，猝灭剂可位于该探针的任何合适的位置，例如，在探针的3’端，在探针的5’端，在探针的3’与5’端之间的位置，在不含有可检测部分的双链探针的一条链上，或在与可检测部分相对的探针一端。猝灭剂可与探针直接偶联或经由连接体间接地偶联。猝灭剂的偶联可以经由任何合适的路径实现，包括本文别处所述的共价和/或非共价路径。
探针的实例示意性地示于图1A中。如图1A所示，示例探针从5’到3’包含可检测部分(例如，FAM荧光团)101、可切割部分(例如，核糖部分“rC”)102和猝灭剂(例如，ABkFQ)103。该探针还包含位于可切割部分102侧翼且与靶核酸分子上的序列互补的核苷酸序列100A和核苷酸序列100B。在探针与序列杂交时，可切割部分102可被切割，使得可检测部分101与猝灭剂103分离，从而导致生成来自可检测部分101的可检测信号。在以下提供的实施例部分提供了另外的示例探针。
在一些实施方案中，所述探针可被包含在溶液例如扩增反应混合物中。如本文别处所述，这样的反应混合物可以包含探针、单链靶核酸分子和适合于扩增该单链靶核酸分子的任何附加试剂。溶液的其他实例包括水、缓冲液、溶剂、生物流体、含盐的流体、含核苷酸的流体、含酶的流体、含添加剂的流体及其组合。在一些实施方案中，该溶液可包含碱性缓冲液，此类缓冲液的非限制性实例包括包含tris碱的缓冲液、包含氢氧化钠的缓冲液、包含氢氧化钾的缓冲液、包含氢氧化铵的缓冲液以及包含碳酸钠的缓冲液。该溶液中的碱性条件可帮助切割该探针的可切割部分。
在一些实施方案中，所述探针可固定在阵列的基底上。阵列的这种基底可以是固体基底，该固体基底可包含选自金属、半金属、玻璃、聚合物(例如，有机聚合物)、金属氧化物、氧化硅、氮化硅、其组合以及其复合物的材料。在一些实施方案中，该探针可以固定在阵列的基底的孔，例如微孔板的孔中。探针可经由包括共价和非共价附接在内的任何合适的方法固定于阵列的基底。探针与阵列的共价附接可以是直接的或经由探针与阵列之间的连接体间接的。非共价附接可以经由例如范德华力、离子相互作用、疏水相互作用或结合对(例如，链霉亲和素/生物素)的成员的结合。
本公开内容的另一方面提供了用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法可包括提供包含单链靶核酸分子和探针的反应混合物。该探针可具有核酸序列，该核酸序列具有至少一个可切割部分、可检测部分和猝灭剂。而且，该探针可互补于单链靶核酸分子，并且当该探针不与该单链靶核酸分子杂交时，该猝灭剂可猝灭可检测部分。该探针与单链靶核酸分子杂交，其中在杂交时，该可切割部分被设置为与单链靶核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)位点上的核苷酸相邻。随后可从探针检测信号，该信号指示在SNP位点上存在核苷酸。
探针与单链靶核酸分子的杂交和/或检测来自探针的信号可在不借助于酶(例如，聚合酶、具有内切核酸酶活性的酶、具有3’到5’外切核酸酶活性的酶)和/或不对反应混合物的温度进行循环的情况下进行。在一些实施方案中，该反应的pH可以维持在碱性条件(例如，pH大于7)下。例如，该反应混合物的pH可以维持在约7到14、约8到11或约9到10的pH。在一些实施方案中，反应的pH可以维持在约7.1、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5或14.0的pH。
此外，来自探针的信号可以是如本文别处所述的光信号、静电信号或电化学信号。在一些实施方案中，单链靶核酸分子可不含有可检测部分。而且，如本文别处所述，该探针可以固定在阵列的基底上。例如，该探针可固定在阵列的孔中。
所述探针可包含任何附加的特征，包括本文别处所述的探针的附加特征。例如，该探针可包含多个可切割部分和/或可包含位于该可切割部分侧翼的核苷酸序列A和核苷酸序列B，并且其中核苷酸序列A和核苷酸序列B各自互补于单链靶核酸分子的一部分。此外，该可切割部分可以相对于SNP位点上的核苷酸是互补的或非互补的。而且，该探针的可检测部分可具有任何合适的特征，包括如本文别处所述的探针的可检测部分的特征。例如，该可检测部分可适合于在探针与单链靶核酸分子杂交时提供信号。此外，该探针的可切割部分可具有任何合适的特征，包括如本文别处所述的探针的可切割部分的特征。例如，在探针与单链靶核酸分子杂交时该可切割部分可以被切割。
本公开内容的附加方面提供了经由采用包含嘌呤或嘧啶衍生物的引物的核酸扩增来检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。这类嘌呤或嘧啶衍生物可优先与SNP位点上特定类型的核苷酸杂交。靶核酸分子可以在平行的反应混合物中扩增，其中一组反应混合物包含一种引物，该引物在其对应于靶核酸分子的SNP位点的位点上包含嘌呤衍生物，并且另一组反应混合物包含一种引物，该引物在其对应于靶核酸分子的SNP位点的位点上包含嘧啶衍生物。可以在每一种反应混合物中检测到扩增产物并比较检测结果。
本公开内容的一方面提供了用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法。该方法包括提供第一反应混合物，其包含靶核酸分子的第一链和第一引物，该第一引物在其核苷酸位点处具有嘌呤衍生物，该核苷酸位点对应于怀疑包含单核苷酸多态性(SNP)的第一核苷酸位点的第一链的核苷酸位点。相比于第一链的其他类型的碱基，该嘌呤衍生物可优先与第一链的嘧啶碱基杂交。该方法进一步包括提供第二反应混合物，其包含靶核酸分子的第一链的互补链和第二引物，该第二引物在其核苷酸位点处具有嘧啶衍生物，该核苷酸位点对应于怀疑包含SNP的第二核苷酸位点的互补链的核苷酸位点，其中相比于该互补链的其他类型的碱基，该嘧啶衍生物优先与该互补链的嘌呤碱基杂交。随后使第一和第二反应混合物经受这样的条件，该条件使得第一引物在与第一链杂交时可延伸以产生第一核酸产物，并且第二引物在与互补链杂交时可延伸以产生第二核酸产物。在生成第一和第二核酸产物之后，随后测定第一和第二核酸产物的相对量。
在一些实施方案中，第一和第二反应混合物可以彼此分离开，例如位于单独的容器中。此外，与第二核酸产物相比所测定的第一核酸产物的量较多可表明在SNP的第一核苷酸位点处存在嘌呤碱基。与第一核酸产物相比所测定的第二核酸产物的量较多则可表明在SNP的第二核苷酸位点处存在嘧啶碱基。
第一引物的嘌呤衍生物可以是任何合适的嘌呤衍生物，包括核酸分子的天然嘌呤(例如，腺嘌呤或鸟嘌呤)或非天然嘌呤中的一种。但是，在一些实施方案中，第一引物的嘌呤衍生物可以不是鸟嘌呤或可以不是腺嘌呤。在这样的实施方案中，第一引物的嘌呤衍生物可以是次黄嘌呤或其衍生物。次黄嘌呤可见于肌苷核苷酸中。而且，在一些实施方案中，第一引物的嘌呤衍生物可以借助于酶，例如具有3’到5’外切核酸酶活性的酶或内切核酸酶可被腺嘌呤碱基或鸟嘌呤代替。具有3’到5’外切核酸酶活性的酶的非限制性实例包括Phusion聚合酶、Pfu聚合酶、DEEPVENT聚合酶、外切核酸酶I、外切核酸酶III、外切核酸酶IV、外切核酸酶V、KOD聚合酶、Q5聚合酶、Accura高保真度聚合酶、Phi29聚合酶、Bst聚合酶、DNA聚合酶I、T4聚合酶和T7聚合酶。具有内切核酸酶活性的酶(例如，内切核酸酶)的非限制性实例包括脱氧核糖核酸酶I、I型限制性内切核酸酶、II型限制性内切核酸酶、III型限制性内切核酸酶、核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII)、尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)、T7内切核酸酶、T4内切核酸酶IV、Bal 31内切核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、内切核酸酶I、内切核酸酶II和内切核酸酶R。在一些实施方案中，具有内切核酸酶活性的酶可以是热稳定的。在一些实施方案中，具有内切核酸酶活性的酶可以是可激活的或可钝化的。内切核酸酶的激活或钝化可以例如经由热稳定的化学修饰来实现。钝化或激活也可以例如采用适体或抗体来实现。
类似地，第二引物的嘧啶衍生物可以是任何合适的嘧啶衍生物，包括天然嘧啶(例如，胸腺嘧啶或胞嘧啶)中的一种，或可以是核酸分子的非天然嘧啶。但是，在一些实施方案中，第二引物的嘧啶衍生物可以不是胸腺嘧啶或胞嘧啶。在这样的实施方案中，第二引物的嘧啶衍生物可以是尿嘧啶或其衍生物。而且，在一些实施方案中，第二引物的嘌呤衍生物可以借助于酶，例如具有3’到5’外切核酸酶活性的酶或内切核酸酶可被胸腺嘧啶或胞嘧啶碱基代替。此外，第一引物的嘌呤衍生物优先杂交的第一链的嘧啶碱基可以是任何嘧啶碱基，包括胞嘧啶和胸腺嘧啶。第二引物的嘧啶衍生物优先杂交的互补链的嘌呤碱基可以是任何嘌呤碱基，包括腺嘌呤和鸟嘌呤。
在一些实施方案中，第一和第二反应混合物可以包含可检测部分。该可检测部分可以是任何合适的可检测部分，包括本文别处所述的可检测部分的示例类型。例如，该可检测部分可以是光学可检测部分，如荧光染料(例如，SYBR绿、EvaGreen、BEBO、BOXTO、嵌入染料)。反应混合物中的可检测部分可以帮助检测在扩增期间该反应混合物中的扩增产物。经由合适的检测方式(包括本文别处所述的示例检测方式)的检测可以帮助测定第一和第二核酸产物的相对量。
在一些实施方案中，第一和第二核酸产物的相对量的测定可借助于解链曲线分析进行。在解链曲线分析中，可以加热包含双链核酸分子(例如，扩增产物)的混合物(例如，扩增反应混合物)，并且可以相对于温度测量该混合物中双链核酸分子的解离(例如，变性)。双链核酸分子的链的温度依赖性解离可利用可嵌入或结合双链核酸分子的可检测部分来测量。例如，在当与双链核酸分子结合时发荧光的嵌入剂(例如，SYBR绿)的情况下，在加热期间双链核酸分子的解离以及结合的嵌入剂的释放可以通过产生的荧光的减少来确定。游离的嵌入剂可不发荧光(或不在与结合的物质相同的波长下发荧光)，因此荧光的减少可用来表明双链核酸分子的解离。可将解离相对于温度的一阶导数或负一阶导数(例如，荧光的负一阶导数)进行绘图，以经由曲线图中的峰值来确定解离的温度(例如，50％解离发生时的温度)。核酸分子可以经由获得的解离谱和/或解离的温度来鉴定。
在一些实施方案中，第一和第二核酸产物的相对量的确定可借助于循环阈值的变化(ΔCt)来进行。可以测定第一和第二核酸产物中的每一个的Ct值，并求差以确定第一和第二核酸产物的相对量。
在一些实施方案中，第一和第二核酸产物的相对量的确定可借助于任何其他合适的方法，包括例如凝胶电泳。在一些实施方案中，第一和第二核酸产物的相对量的确定可借助于被编程为比较第一和第二核酸产物的相对量的计算机处理器来进行。如本文别处所述，这样的计算机处理器可以作为计算机系统的一部分被包含在内。
检测对应于靶核酸分子中的SNP的两种基因型的实例示意性地描绘在图13A-13C中。如图13A所示，特定的靶核酸可具有SNP位点1320，在第一基因型1301中，SNP位点1320包含其有义链1303中的含腺嘌呤的核苷酸(“A”)以及其反义链1304中的含胸腺嘧啶的核苷酸(“T”)。在第二基因型1302中，该靶核酸分子在SNP位点1320上包含其有义链1305中的含鸟嘌呤的核苷酸(“G”)以及其反义链中的含胞嘧啶的核苷酸(“C”)。
为了检测第一基因型1301，靶核酸分子可以与如图13B示意性描绘的正向引物1307、反向引物1308、包含3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶(例如，Pfu聚合酶)以及进行靶核酸分子扩增所需的任何其他试剂一起提供于反应混合物中。如图13B所示，正向引物1307和反向引物1308均可包含可经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割的尾部。正向引物1307和反向引物1308的尾部可在靶核酸分子的扩增期间帮助引物二聚体副产物的生成降至最低。在其尾部中，正向引物1307可包含肌苷核苷酸1309(“I”)，当与靶核酸分子的反义链1304的SNP位点1330上的含胸腺嘧啶的核苷酸结合时，肌苷核苷酸1309可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶来去除。
肌苷核苷酸1309包含次黄嘌呤碱基，与含胸腺嘧啶的核苷酸(肌苷核苷酸1309的“非优选”互补核苷酸)相比，该次黄嘌呤碱基在靶核酸分子的反义链1304的SNP位点1330处通常与含胞嘧啶的核苷酸(肌苷核苷酸1309的“优选”互补核苷酸)更好地结合。由于肌苷核苷酸1309与靶核酸分子的反义链1304的含胸腺嘧啶的核苷酸的相对较弱的结合，在正向引物1307的尾部的切割期间，聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可从正向引物1307去除肌苷核苷酸1309。在尾部从正向引物1307切割之后，聚合酶随后可延伸正向引物1307的3’端，使得反义链1304的SNP位点1330上的含胸腺嘧啶的核苷酸的天然互补核苷酸(含腺嘌呤的核苷酸“A”)在SNP位点1330处被添加至正向引物1307。
如本文别处所述，所述反应混合物的温度从退火到延伸温度进行循环，使得正向引物1307与靶核酸分子的反义链1304退火，经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性去除包含肌苷核苷酸1309的尾部，并延伸正向引物1307的3’端。延伸可导致包含含腺嘌呤的核苷酸的扩增的双链核酸分子的生成，该含腺嘌呤的核苷酸在双链核酸分子的有义链SNP位点上代替肌苷核苷酸1309。因为通过聚合酶去除了肌苷核苷酸1309，所以该双链核酸分子随后可经历使用正向引物1307和反向引物1308的扩增1340的多个循环，以生成附加的扩增的双链核酸分子1350。可检测到扩增的双链核酸分子1350，并且靶核酸分子的基因型根据扩增的双链核酸分子1350的存在而被确定为基因型1301。
在一些情况下，引物1307可在正向引物1307的肌苷核苷酸1309没有切割的情况下延伸。当这种情况发生时，反向引物1308可与新合成的链退火，而聚合酶(例如，Pfu聚合酶)可在遇到作为模板核苷酸的肌苷核苷酸1309时失去活性或不再具有活性。聚合酶活性的这种降低或丧失可使包含肌苷核苷酸1309的不良扩增产物的产生量降至最低。例如，如果使用正向引物1307扩增包含基因型1302的核酸链，则肌苷核苷酸1309将通常不被切割，而是存在于包含正向引物1307的延伸链中。然而，如上所讨论的，在与肌苷核苷酸1309接触时该延伸链中的这种肌苷核苷酸1309将导致聚合酶的丧失或抑制。因此，相对于包含基因型1302的核酸，正向引物1307可用来选择性地扩增含有基因型1301的核酸。
为了检测第二基因型1302，靶核酸可以与如图13C示意性描绘的正向引物1317、反向引物1318、包含3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶(例如，Pfu聚合酶)以及进行靶核酸分子扩增所需的任何其他试剂一起提供于反应混合物中。如图13C所示，正向引物1317和反向引物1318均可包含可经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性切割的尾部。在其尾部中，正向引物1317可包含含尿嘧啶的核苷酸1319(“U”)，当与靶核酸分子的有义链1305的SNP位点1360上的含鸟嘌呤的核苷酸结合时，含尿嘧啶的核苷酸1319可被具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶去除。
含尿嘧啶的核苷酸1319包含尿嘧啶碱基，与含鸟嘌呤的核苷酸(含尿嘧啶的核苷酸1319的“非优选”互补核苷酸)相比，该尿嘧啶碱基在靶核酸分子的有义链1305的SNP位点1360处通常与含腺嘌呤的核苷酸(含尿嘧啶的核苷酸1319的“优选”互补核苷酸)更好地结合。由于含尿嘧啶的核苷酸1319与靶核酸分子的有义链1305的含鸟嘌呤的核苷酸的相对较弱的结合，在正向引物1317的尾部的切割期间，聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性可从正向引物1317去除含尿嘧啶的核苷酸1319。在尾部从正向引物1317切割之后，聚合酶随后可延伸正向引物1317的3’端，使得有义链1305的SNP位点1360上的含鸟嘌呤的核苷酸的天然互补核苷酸(含胞嘧啶的核苷酸“C”)在SNP位点1360处被添加至正向引物1317。
如本文别处所述，所述反应混合物的温度可从退火到延伸温度进行循环，使得正向引物1317与靶核酸分子的有义链1305退火，经由聚合酶的3’到5’外切核酸酶活性去除包含含尿嘧啶的核苷酸1319的尾部，并延伸正向引物1317的3’端。延伸可导致包含含胞嘧啶的核苷酸的扩增的双链核酸分子的生成，该含胞嘧啶的核苷酸在双链核酸分子的反义链SNP位点上代替含尿嘧啶的核苷酸1319。因为通过聚合酶去除了含尿嘧啶的核苷酸1319，所以该双链核酸分子随后可经历使用正向引物1317和反向引物1318的扩增1370的多个循环，以生成附加的扩增的双链核酸分子1380。可检测到扩增的双链核酸分子1380，并且靶核酸分子的基因型根据扩增的双链核酸分子1380的存在而被确定为基因型1302。
在一些情况下，正向引物1317可在正向引物1317的尿嘧啶核苷酸1319没有切割的情况下延伸。当这种情况发生时，反向引物1318可与新合成的链退火，而聚合酶(例如，Pfu聚合酶)可在遇到作为模板核苷酸的尿嘧啶核苷酸1319时失去活性或不再具有活性。聚合酶活性的这种降低或丧失可使包含尿嘧啶核苷酸1319的不期望的扩增产物的产生量降至最低。例如，如果使用正向引物1317扩增包含基因型1301的核酸链，则尿嘧啶核苷酸1319将通常不被切割，而是存在于包含正向引物1317的延伸链中。然而，如上所讨论的，在与尿嘧啶核苷酸1319接触时，该延伸链中的这种尿嘧啶核苷酸1319将导致聚合酶的丧失或抑制。因此，相对于包含基因型1301的核酸，正向引物1317可用来选择性地扩增含有基因型1302的核酸。
图13A-图13C所示的用于检测基因型1301和1302的示例方法可同时用来检测核酸样品中的特定基因型。该核酸样品可以分开并且提供给两种扩增反应混合物。除了合适的反向引物、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶以及扩增核酸样品中的靶核酸分子所需的任何其他试剂以外，反应混合物中的每一种还可以包含正向引物1307或正向引物1317。反应混合物随后可经受适合于扩增核酸样品中的靶核酸分子的条件。在每种反应混合物中的扩增产物(对应于经由正向引物1307或正向引物1317的扩增)的相对水平可一起用来确定哪一种基因型存在于最初的核酸样品中。如果包含正向引物1307的反应混合物与包含正向引物1317的反应混合物相比生成更高水平的扩增产物，则通常可以确定该核酸样品包含基因型1301。如果包含正向引物1317的反应混合物与包含反向引物1307的反应混合物相比生成更高水平的扩增产物，则通常可以确定该核酸样品包含基因型1302。
本公开内容的附加方面提供了可钝化的引发寡核苷酸以及用于钝化这类引发寡核苷酸的方法。可钝化的引发寡核苷酸可包含具有不同解链温度的可切割部分和/或序列。这类可钝化的引发寡核苷酸可经由可切割部分的切割和/或温度的操纵而被钝化。
本公开内容的附加方面提供了可钝化的引发寡核苷酸。该可钝化的引发寡核苷酸可包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A的引发区。核酸序列A的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链。该引发区还可以包含至少一个可切割部分。此外，该可钝化的引发寡核苷酸还可以包含与引发区显示出序列互补性的与引发区相邻的核酸序列B。
在另一方面，本公开内容提供了可钝化的引发寡核苷酸。该可钝化的引发寡核苷酸可包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A的引发区。核酸序列A的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链。该引发区还可以包含至少一个可切割部分。此外，该可钝化的引发寡核苷酸还可以包含与引发区相邻的核酸序列B。该引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。
本文所述的可钝化的引发寡核苷酸可以是环形可钝化的引发寡核苷酸，因为其序列可包含彼此互补的区域。环形可钝化的引发寡核苷酸的这类区域可彼此杂交，以在该可钝化的引发寡核苷酸中形成环形结构(例如，发夹结构)。例如，核酸序列B的全部或一部分可与可钝化的引发寡核苷酸的引发区显示出序列互补性。
而且，在一些实施方案中，核酸序列A的3’端可以仅在等于或高于核酸序列B的解链温度的温度下是可延伸的。在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸的引发区从3’到5’可以包含核酸序列A、可切割部分和互补于单链靶核酸分子的核酸序列A'。核酸序列A’可以与或可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。
引发区的第一解链温度可以是任何合适的解链温度。例如，引发区的第一解链温度可以为约50℃至约80℃、约60℃至约75℃或约65℃至约70℃。在一些实施方案中，根据特定的可钝化的引发寡核苷酸，引发区的第一解链温度为至少约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。核酸序列B的第二解链温度可以是可低于引发区的第一解链温度的任何合适的解链温度。例如，根据特定的可钝化的引发寡核苷酸，核酸序列B的第二解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。
在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可以比引发区的第一解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可以比引发区的第一解链温度低约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。
在一些实施方案中，引发区可包含核酸序列A的附加序列。例如，引发区可包含核酸序列A’。在这样的实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有可低于引发区整体的第一解链温度和/或核酸序列B的第二解链温度的第三解链温度。核酸序列A的第三解链温度可以是任何合适的解链温度。在一些实施方案中，根据特定的可钝化的引发寡核苷酸，核酸序列A的第三解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些实施方案中，核酸序列A的第三解链温度可以比引发区的第一解链温度和/或核酸序列B的第二解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。
而且，核酸序列B可以与或可以不与单链靶核酸分子和/或该单链靶核酸分子的互补体互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于单链靶核酸分子的互补体。在一些实施方案中，核酸序列B可以包含不与引发区和/或单链靶核酸分子互补的间隔区。这样的间隔区可以是可钝化的引发寡核苷酸的区域，该区域在引物延伸反应中不能经由聚合酶拷贝。例如，该间隔区可以是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个核苷酸的序列。寡核苷酸的这种序列可包含抑制聚合酶作用的一种或多种物质，其非限制性实例包括dSpacer(脱碱基(abasic)呋喃)、间隔区C3、己二醇间隔区、间隔区9、间隔区12和间隔区18。
可钝化的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以是任何合适的物质。在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。可包含在可钝化的引发寡核苷酸的引发区中的可切割部分的非限制性实例包括核糖、二硫化物键、重氮苯衍生物(例如，可用Na2S2O4切割的)、基于腙的连接体、可光解的间隔区(例如，PC间隔区)、热可切割的亚胺碱/异氰酸酯加合物、含叠氮化物的连接体、基于乙酰丙基酯的连接体以及烯丙基连接体。而且，可钝化的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可通过任何合适的路径而切割。例如，可钝化的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以是可光解的(例如，经由可切割部分暴露于光)、可酶切的(例如，经由酶如内切核酸酶、限制酶、核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶HIII)的作用)或可化学切割的(例如，经由合适的还原剂、pH条件或反应混合物中的其他条件)。在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以在碱性pH下是可切割的。
在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸可被包含在溶液例如扩增反应混合物中。如本文别处所述，这样的反应混合物可以包含可钝化的引发寡核苷酸、单链靶核酸分子和适合于扩增该单链靶核酸分子的任何附加试剂。本文别处所述的示例溶液的其他类型的附加类型实例还可以包含可钝化的引发寡核苷酸。例如，包含可钝化的引发寡核苷酸的溶液可包含碱性缓冲液。
本公开内容的附加方面提供了用于钝化可钝化的引发寡核苷酸的方法。该方法包括提供含有可钝化的引发寡核苷酸的溶液，该可钝化的引发寡核苷酸包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A的引发区。核酸序列A的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链。该引发区还可以包含至少一个可切割部分。该可钝化的引发寡核苷酸还可以包含与引发区显示出序列互补性的与引发区相邻的核酸序列B。该方法进一步包括切割可切割部分，所述切割使可钝化的引发寡核苷酸的引发区钝化。
本公开内容的附加方面提供了用于钝化可钝化的引发寡核苷酸的方法。该方法包括提供含有可钝化的引发寡核苷酸的溶液，该可钝化的引发寡核苷酸包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A的引发区。核酸序列A的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链。此外，该引发区还可以包含至少一个可切割部分。该可钝化的引发寡核苷酸还可以包含与引发区相邻的核酸序列B。该引发区可具有第一解链温度，并且该核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。该方法进一步包括切割可切割部分，所述切割使可钝化的引发寡核苷酸的引发区钝化。
发生可钝化的引发寡核苷酸钝化的溶液可以是任何合适的溶液，包括在其中扩增单链靶核酸分子的扩增反应混合物。在一些实施方案中，引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B具有低于第一解链温度的第二解链温度。在一些实施方案中，可切割部分可以在等于或低于核酸序列B的第二解链温度的溶液温度下切割。因此，方法可进一步包括使溶液的温度降至低于或等于核酸序列B的第二解链温度。在使溶液的温度降至等于或低于核酸序列B的第二解链温度并切割可切割部分之后，该溶液的温度可随后升至等于或高于引发区的第一解链温度的温度。在一些实施方案中，核酸序列A在等于或高于其解链温度和/或第一解链温度的温度下可能不与单链靶核酸分子稳定地杂交。
而且，在一些实施方案中，引发区从3’到5’可以包含核酸序列A、与核酸序列A相邻的可切割部分以及与可切割部分相邻的核酸序列A'。在一些实施方案中，引发区可具有高于核酸序列B的第二解链温度的第一解链温度。在一些实施方案中，引发区可包含核酸序列A的附加序列(例如，核酸序列A’)。在这样的实施方案中，核酸序列A可具有第三解链温度，在切割可切割部分时，该第三解链温度可低于引发区的第一解链温度，在一些实施方案中，还低于核酸序列B的第二解链温度。在一些实施方案中，方法可进一步包括使溶液的温度升至等于或高于核酸序列A的第三解链温度的温度。这样的温度升高可帮助防止可钝化的引发寡核苷酸的切割核酸序列A与单链靶核酸分子退火。
引发区的第一解链温度、核酸序列B的第二解链温度以及必要时核酸序列A的第三解链温度可以是任何合适的解链温度。例如，根据特定的可钝化的引发寡核苷酸，引发区的第一解链温度可以为至少约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些实施方案中，核酸序列A的第三解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可以比引发区的第一解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。在一些实施方案中，核酸序列A的第三解链温度可以比引发区的第一解链温度和/或核酸序列B的第二解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。
可钝化的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以是可钝化的引发寡核苷酸的任何合适的可切割部分，包括本文别处所述的实例(例如，核糖)。在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。而且，可钝化的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可通过任何合适的方法被切割。例如，可钝化的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以采用酶(例如，内切核酸酶，包括本文别处所述的示例内切核酸酶，如核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶HIII、切口限制性内切核酸酶、Nb、BbvCI、NtAlwI、NbBsmI、BsaI、SapI、NbBsrDI)、采用光、采用还原剂(例如，DTT或TCEP)以及采用大于7的溶液pH(例如，碱性溶液)中的一种或多种来切割。在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸可以是如本文别处所述的环形可钝化的引发寡核苷酸。
图9A示意性地描绘了可钝化的引发寡核苷酸的实例、采用这种可钝化的引发寡核苷酸进行核酸扩增的示例方法以及用于钝化可钝化的引发寡核苷酸的示例方法。如图9A所示，可钝化的引发寡核苷酸900从3’到5’包含核酸序列900A、可切割部分(例如，核糖R)、核酸序列900A’和核酸序列900B。核酸序列900A和900A’以及可切割部分R被包含在该引发寡核苷酸的引发区901中。核酸序列900B互补于引发区901且不与单链靶核酸分子904互补。而且，核酸序列900B包含间隔区S，该间隔区S是不与引发区901或单链靶核酸分子904互补的核苷酸的序列。间隔区S可防止序列900B在经由聚合酶作用的核酸扩增反应中用作模板。而且，核酸序列900B的解链温度低于引发区901的解链温度。
如图9A所示，在等于或低于核酸序列900B的解链温度的温度902下，核酸序列900B与引发区901杂交，从而产生了采取环形寡核苷酸结构的引发寡核苷酸910。可切割部分R被切割903，并且核酸序列900A经由可切割部分R的切割903从环形寡核苷酸910释放，以生成钝化的结构920。切割可经由任何合适的路径实现，例如，经由酶(例如，具有内切核酸酶活性的热稳定的和/或可激活的酶，如核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII)的作用。游离核酸序列900A在等于或高于其解链温度的温度下不与单链靶核酸分子904稳定杂交。因此，可钝化的引发寡核苷酸的引发区被钝化。
如图9A所示，在等于或高于核酸序列900B的解链温度的温度905下，核酸900B从引发区901变性，并且引发区901可引发其在单链靶核酸分子904上的互补序列。如图9A所示，核酸序列900A’和900A互补于靶核酸分子904。经由聚合酶的作用，单链靶核酸分子904可以在引物延伸反应中延伸906，以生成核酸产物907。在生成核酸产物907之后，可切割部分R可被切割以去除核酸序列900A’和900B，从而在核酸产物907上生成“粘性末端”。
本公开内容的附加方面提供了可激活的引发寡核苷酸以及在核酸扩增反应中使用这类引物的方法。可激活的引发寡核苷酸可包含具有不同解链温度的可切割部分和/或序列。这类可激活的引发寡核苷酸可经由可切割部分的切割和/或温度的操纵而被激活。
本公开内容的另一方面提供了可激活的引发寡核苷酸。该可激活的引发寡核苷酸可包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A以及至少一个可切割部分的引发区。核酸序列A可具有适合于仅在切割可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。此外，该可激活的引发寡核苷酸可以包含核酸序列B，它位于引发区的3’侧并且显示出与该引发区的序列互补性。
本公开内容的附加方面提供了可激活的引发寡核苷酸。该可激活的引发寡核苷酸可包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A以及至少一个可切割部分的引发区。核酸序列A可具有适合于仅在切割可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。此外，该可激活的引发寡核苷酸可以包含核酸序列B，该核酸序列B位于引发区的3’侧。该引发区可具有第一解链温度，并且该核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。
本文所述的可激活的引发寡核苷酸可以是环形可激活的引发寡核苷酸，因为其序列可包含彼此互补的区域。环形可激活的引发寡核苷酸的这类区域可彼此杂交以在该可激活的引发寡核苷酸中形成环形结构(例如，发夹结构)。例如，核酸序列B的全部或一部分可与可激活的引发寡核苷酸的引发区显示出序列互补性。而且，核酸序列B可以与或可以不与单链靶核酸分子和/或该单链核酸分子的互补体互补。在一些实施方案中，核酸序列B可以至少部分互补于靶核酸分子的互补体。
在一些实施方案中，核酸序列B可以包含不与引发区和/或单链靶核酸分子互补的间隔区。这样的间隔区可以是可激活的引发寡核苷酸的区域，该区域在引物延伸反应中不能经由聚合酶拷贝。例如，该间隔区可以是一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个或更多个核苷酸的序列。寡核苷酸的这类序列可包含抑制聚合酶作用的一种或多种物质，其非限制性实例包括dSpacer(脱碱基呋喃)、间隔区C3、己二醇间隔区、间隔区9、间隔区12和间隔区18。
在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸的引发区从5’到3’可以包含核酸序列A、可切割部分和核酸序列A'。核酸序列A’可以与或可以不与单链靶核酸分子互补。在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸的引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。
引发区的第一解链温度可以是任何合适的解链温度。例如，引发区的第一解链温度可以为约50℃至约80℃、约60℃至约75℃或约65℃至约70℃。在一些实施方案中，根据特定的可激活的引发寡核苷酸，引发区的第一解链温度可以为至少约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。
核酸序列B的第二解链温度可以是任何合适的解链温度并且可低于引发区的第一解链温度。例如，根据特定的可激活的引发寡核苷酸，核酸序列B的第二解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可低于引发区的第一解链温度。例如，核酸序列B的第二解链温度可以比引发区的第一解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可以比引发区的第一解链温度低约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。
在一些实施方案中，引发区可包含核酸序列A的附加序列。例如，引发区可包含核酸序列A’。在这样的实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有可低于引发区整体的解链温度和/或核酸序列B的解链温度的第三解链温度。核酸序列A的第三解链温度可以是任何合适的解链温度并且可低于第一解链温度和/或第二解链温度。在一些实施方案中，第三解链温度可低于第一解链温度而高于第二解链温度。在一些实施方案中，根据特定的可激活的引发寡核苷酸，核酸序列A的第三解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些实施方案中，核酸序列A的第三解链温度可以比引发区的第一解链温度和/或核酸序列B的第二解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。
可激活的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以是任何合适的物质。在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。可包含在可激活的引发寡核苷酸的引发区中的可切割部分的非限制性实例包括核糖、二硫键、重氮苯衍生物(例如，可用Na2S2O4切割的)、基于腙的连接体、可光解的间隔区(例如，PC间隔区)、热可切割的亚胺碱/异氰酸酯加合物、含叠氮化物的连接体、基于乙酰丙基酯的连接体以及烯丙基连接体。而且，可激活的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可通过任何合适的路径而切割。例如，可激活的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以是可光解的(例如，经由可切割部分暴露于光)、可酶切的(例如，经由酶如内切核酸酶、限制酶、核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶HIII)的作用)或可化学切割的(例如，经由还原剂(例如，DTT、TCEP)、合适的pH条件或反应混合物中的其他条件)。在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以在碱性pH下切割。
在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸可被包含在溶液例如扩增反应混合物中。如本文别处所述，这样的反应混合物可以包含可激活的引发寡核苷酸、单链靶核酸分子和适合于扩增该单链靶核酸分子的任何附加试剂。本文别处所述的示例溶液的其他类型的附加类型实例还可以包含可激活的引发寡核苷酸。例如，包含可激活的引发寡核苷酸的溶液可包含碱性缓冲液。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法包括提供含有可激活的引发寡核苷酸的溶液，该可激活的引发寡核苷酸包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A和至少一个可切割部分的引发区。该可激活的引发寡核苷酸还可以包含核酸序列B，它位于引发区的3’侧并且显示出与引发区的序列互补性。核酸序列A可具有适合于仅在切割可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。该方法进一步包括切割可切割部分以及使用核酸序列A进行引物延伸反应以形成互补核酸链。
本公开内容的另一方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法包括提供含有可激活的引发寡核苷酸的溶液，该可激活的引发寡核苷酸包含具有可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A和至少一个可切割部分的引发区。该可激活的引发寡核苷酸还可以包含核酸序列B，核酸序列B位于引发区的3’侧。该引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B具有低于第一解链温度的第二解链温度。而且，核酸序列A可具有适合于仅在切割可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端。该方法进一步包括切割可切割部分以及使用核酸序列A进行引物延伸反应以形成互补核酸链。
发生可激活的引发寡核苷酸激活的溶液可以是任何合适的溶液，包括在其中扩增单链靶核酸分子的扩增反应混合物。在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸的引发区从5’到3’可以包含核酸序列A、可切割部分和核酸序列A’。核酸序列A’可以与或可以不与单链靶核酸分子互补。而且，在一些实施方案中，核酸序列B可以与或可以不与单链靶核酸分子和/或该单链靶核酸分子的互补体互补。在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸的引发区可具有第一解链温度，并且核酸序列B可具有低于第一解链温度的第二解链温度。
在一些实施方案中，引发区可包含核酸序列A的附加序列(例如，核酸序列A’)。在这样的实施方案中，在切割可切割部分时，核酸序列A可具有可低于引发区的第一解链温度且在一些实施方案中低于或高于核酸序列B的第二解链温度的第三解链温度。在一些实施方案中，该方法可进一步包括在切割可切割部分和/或进行引物延伸反应之前使溶液的温度降至等于或低于第三解链温度的温度。这样的温度降低可帮助使可激活的引发寡核苷酸的切割核酸序列A与用于引物延伸反应的单链靶核酸分子退火。
引发区的第一解链温度、核酸序列B的第二解链温度以及必要时核酸序列A的第三解链温度可以是任何合适的解链温度。例如，根据特定的可激活的引发寡核苷酸，引发区的第一解链温度可以为至少约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高或更低。在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些实施方案中，核酸序列A的第三解链温度可以低于或等于约50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃。在一些实施方案中，核酸序列B的第二解链温度可以比引发区的第一解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。在一些实施方案中，核酸序列A的第三解链温度可以比引发区的第一解链温度和/或核酸序列B的第二解链温度低约1℃至约80℃、约5℃至约30℃或约10℃至约20℃。
可激活的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以是可激活的引发寡核苷酸的任何合适的可切割部分，包括本文别处所述的实例(例如，核糖)。在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸可包含多个可切割部分。而且，可激活的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可通过任何合适的方法予以切割。例如，可激活的引发寡核苷酸的引发区的可切割部分可以采用酶(例如，内切核酸酶，其包括本文别处所述的实例内切核酸酶，如核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII、核糖核酸酶HIII、切口限制性内切核酸酶、Nb、BbvCI、NtAlwI、NbBsmI、BsaI、SapI、NbBsrDI)、采用光以及采用大于7的溶液pH(例如，碱性溶液)中的一种或多种来切割。在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸可以是如本文别处所述的环形可激活的引发寡核苷酸。
图9B示意性地描绘了可激活的引发寡核苷酸的实例、激活这种可激活的引发寡核苷酸以及采用该可激活的引发寡核苷酸实例扩增单链靶核酸分子的示例方法。如图9B所示，可激活的引发寡核苷酸950从5’到3’包含核酸序列950A、可切割部分(例如，核糖R)、核酸序列950A’和核酸序列950B。核酸序列950A和950A’以及可切割部分R被包含在该引发寡核苷酸的引发区951中。核酸序列950A’不与单链靶核酸分子954互补。核酸序列950B互补于引发区951且不与单链靶核酸分子954互补。核酸序列950B的解链温度低于引发区951的解链温度。
如图9B所示，在等于或高于核酸序列950B的解链温度的温度952下，核酸950B从引发区951变性，并且引发区951的核酸序列950A可引发其在单链靶核酸分子954上的互补序列。然而，由于核酸序列950A’和950B不与单链靶核酸分子954互补，因此引发区的3’端不能在经由聚合酶作用的引物延伸反应中被延伸。因此，在没有激活的情况下，可激活的引发寡核苷酸950不能参与扩增单链靶核酸分子954的扩增反应。
如图9B所示，在等于或低于核酸序列950B的解链温度的温度955下，核酸序列950B与引发区951杂交，从而产生了采用环形寡核苷酸结构的引发寡核苷酸960。环形寡核苷酸960的可切割部分R可被切割953，并且核酸序列950A从环形寡核苷酸960得以释放。切割可经由任何合适的路径实现，例如，经由酶(例如，具有内切核酸酶活性的热稳定的酶和/或可激活的酶，如核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII)的作用。可切割部分R的切割通过释放核酸序列950A激活引发寡核苷酸。如图9B所示，在等于或低于其解链温度的温度下，游离核酸序列950A可引发956单链靶核酸分子954。退火的核酸序列950A随后可在引物延伸反应中延伸957，以生成核酸产物958。
本公开内容的附加方面提供了包含可激活的和可钝化的引发寡核苷酸二者的反应混合物，以及在一系列扩增反应中使用可激活的和可钝化的引发寡核苷酸二者的方法。这样的扩增反应可通过在时间过程中调节反应混合物中的条件和/或试剂而在单一反应混合物中发生。在一些实施方案中，在可激活和可钝化的引发寡核苷酸的存在下靶核酸分子的扩增可允许实现巢式扩增反应。这种巢式扩增反应可以在单一扩增反应混合物中进行，或可以在多个扩增反应混合物中进行。
本公开内容的附加方面提供了包含可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的反应混合物。该可激活的引发寡核苷酸可包含具有可与靶核酸分子杂交的核酸序列A’以及至少一个第一可切割部分的引发区。该可激活的引发寡核苷酸可仅在切割第一可切割部分时被激活，使得核酸序列A’的3’端在引物延伸反应中可延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链。该可钝化的引发寡核苷酸可包含具有可与靶核酸分子杂交的核酸序列A以及至少一个第二可切割部分的引发区。该可钝化的引发寡核苷酸可在切割第二可切割部分时被钝化，使得核酸序列A不与靶核酸分子形成稳定的复合体以促进基于靶核酸分子序列的引物延伸反应。
在一些实施方案中，可激活的引发寡核苷酸可进一步包含核酸序列B’，核酸序列B’位于可激活的引发寡核苷酸的引发区的3'侧并且与可激活的引发寡核苷酸的引发区显示出序列互补性。类似地，在一些实施方案中，该可钝化的引发寡核苷酸可进一步包含与可钝化的引发寡核苷酸的引发区相邻的核酸序列B，核酸序列B与可钝化的引发寡核苷酸的引发区显示出序列互补性。
所述反应混合物还可以包含靶核酸分子，并且可以包含扩增该靶核酸分子所需的任何其他试剂(例如，聚合酶、内切核酸酶、辅因子、dNTP、合适的缓冲液、附加引物等)。而且，该反应混合物还可以包含可用来检测该反应混合物中的扩增产物的可检测部分。在一些实施方案中，第一可切割部分和/或第二可切割部分可以是可酶切的。在一些实施方案中，第一可切割部分和第二可切割部分可被相同的酶切割。这样的酶可以是任何合适的酶(例如，内切核酸酶，包括本文别处所述的示例内切核酸酶，可激活的酶(例如，可激活的内切核酸酶))并且因此也可以被包含在该反应混合物中。在酶是可激活的酶的情况下，该酶可最初提供于该反应混合物中，并随后被激活以切割第一和/或第二可切割部分。而且，第一和第二可切割部分可以是任何合适的可切割部分，包括本文别处所述的可切割部分的示例类型。例如，第一和/或第二可切割部分可以是核糖。
可钝化的引发寡核苷酸可以在切割可激活的引发寡核苷酸的第一可切割部分时是可钝化的。类似地，可激活的引发寡核苷酸可以在切割可钝化的引发寡核苷酸的第二可切割部分时是可激活的。例如，该可激活的引发寡核苷酸的第一可切割部分和该可钝化的引发寡核苷酸的第二可切割部分可经由相同的切割方法(例如，经由相同的酶)而切割。在切割可激活的引发寡核苷酸的第一可切割部分时，可钝化的引发寡核苷酸的第二可切割部分也可以被切割。如本文别处所述，该第二可切割部分的切割可以钝化该可钝化的引发寡核苷酸。此外，在切割可钝化的引发寡核苷酸的第二可切割部分时，可激活的引发寡核苷酸的第一可切割部分也可以被切割。如本文别处所述，第一可切割部分的切割可以激活该可激活的引发寡核苷酸。在一些实施方案中，第一和第二可切割部分的切割可以是同时的或可以是按顺序进行的。在一些实施方案中，酶(可激活的内切核酸酶)可以被激活或钝化以钝化可钝化的引物以及激活可激活的引物。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法包括提供包含靶核酸分子、可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的溶液，以及进行连续的核酸扩增反应以产生该靶核酸分子的扩增产物。该连续的核酸扩增反应可至少包含第一阶段以及随后的第二阶段，其中第一阶段可包括使用可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分作为引物进行靶核酸分子的扩增，并且其中第二阶段可包括使用可激活的引发寡核苷酸的至少一部分作为另一引物进行靶核酸分子或其区域的扩增。而且，在第一阶段后，可激活的引发寡核苷酸可被激活且可钝化的引发寡核苷酸可被钝化。
在一些实施方案中，该可激活的引发寡核苷酸可包含具有可与靶核酸分子杂交的核酸序列A’以及至少一个可切割部分的引发区。该可激活的引发寡核苷酸还可以包含核酸序列B’，它位于可激活的寡核苷酸的引发区的3’侧且显示出与该引发区的序列互补性。核酸序列A’可具有适合于仅在切割可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链的3’端。
在一些实施方案中，该可钝化的引发寡核苷酸可包含具有可与靶核酸分子杂交的核酸序列A以及至少一个可切割部分的引发区。该可钝化的引发寡核苷酸还可以包含与引发区显示出序列互补性的与可钝化的引发寡核苷酸的引发区相邻的核酸序列B。核酸序列A可具有适合于在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子的互补核酸链的3’端。此外，在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸可以在切割如本文别处所述的可激活的引发寡核苷酸的第一可切割部分时是可钝化的。类似地，该可激活的引发寡核苷酸可以在切割如本文别处所述的可钝化的引发寡核苷酸的第二可切割部分时是可激活的。在一些实施方案中，可钝化的引发寡核苷酸可以在可激活的引发寡核苷酸激活的同时是可钝化的。
在一些实施方案中，连续的核酸扩增反应可在单一反应混合物中发生。或者，连续的核酸扩增反应可在多于一种反应混合物中发生。而且，该溶液可以包含扩增靶核酸分子所需的任何其他试剂(例如，聚合酶、内切核酸酶、辅因子、dNTP、合适的缓冲液、附加引物等)。而且，该溶液还可以包含可用来检测扩增产物的可检测部分。在一些实施方案中，该溶液包含至少一种反向引物。此外，可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸可分别被酶激活和钝化。这样的酶可包含在该溶液中(或随后提供)，并且可以是例如热稳定的酶和/或具有内切核酸酶活性的酶。本文别处描述了具有内切核酸酶活性的酶的实例(例如，核糖核酸酶，如核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测靶核酸分子的扩增产物。扩增产物的检测可以经由任何合适的路径，包括本文别处所述的检测方法。例如，扩增产物的检测可以经由光学检测、静电检测或电化学检测。在一些实施方案中，可检测部分可以帮助检测扩增产物。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法包括提供包含靶核酸分子、可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的反应混合物。可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸中的每一个均可与靶核酸分子的不同区域可杂交。该方法进一步包括在该反应混合物中采用可激活的引发寡核苷酸的至少一部分或可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发靶核酸分子。该方法进一步包括使用经可激活的引发寡核苷酸的至少一部分或可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分选择性引发的靶核酸分子进行核酸扩增反应，以产生靶核酸分子的扩增产物。
在一些实施方案中，靶核酸分子可在反应混合物中被选择性地引发而无需去除其内含物。在一些实施方案中，采用可激活的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发靶核酸分子可通过酶来实现，所述酶激活可激活的引发寡核苷酸以允许引物延伸反应产生扩增产物。这样的酶可以是任何合适的酶，例如如本文别处所述的具有内切核酸酶活性的酶。而且，在一些实施方案中，采用可激活的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发靶核酸可通过酶来实现，所述酶钝化可钝化的引发寡核苷酸，使得其不与该靶核酸分子形成稳定的复合体。这样的酶可以是任何合适的酶，例如如本文别处所述的具有内切核酸酶活性的酶。
在一些实施方案中，采用可钝化的引发寡核苷酸选择性地引发靶核酸分子可在不存在酶，例如如本文别处所述具有内切核酸酶活性的酶的情况下实现。在一些实施方案中，采用可钝化的引发寡核苷酸选择性地引发靶核酸分子可在不存在活性酶，例如如本文别处所述具有内切核酸酶活性的活性(例如，激活的)酶的情况下实现。这样的条件可以防止可钝化的引发寡核苷酸的钝化。
图10A-图10C示意性地描绘了可激活和可钝化的引发寡核苷酸的实例以及它们在单一反应混合物、巢式扩增反应中的示例应用。图10A示意性地描绘了从3’到5’包含核酸序列1000A、可切割部分1002(例如，核糖部分“rC”)、核酸序列1000A’和核酸序列1000B的可钝化的引发寡核苷酸1000。可钝化的引发寡核苷酸1000的引发区包含核酸序列1000A、可切割部分1002和核酸序列1000A’。核酸序列1000B包含间隔区并且不与靶核酸分子1005互补。核苷酸序列1000B的间隔区不与自身或引发区互补。而且，核苷酸序列1000B至少部分互补于引发区。
在等于或高于核酸序列1000B的解链温度(例如，对于图10A所示的核酸序列1000B为约60℃)的温度1008下，可钝化的引发寡核苷酸1000可采取线性构型。在合适的温度条件下，线性可钝化的引发寡核苷酸可以引发单链靶核酸分子1005并参与引物延伸反应。引物延伸反应可以生成单链靶核酸分子1005的扩增产物。扩增产物包含对应于核酸序列1000B的5’端处的单链区。这样的单链区可作为“粘性末端”用于下游杂交事件(例如，固定于阵列，等)1010。或者，可通过切割1009可切割部分1002进一步处理该扩增产物，以生成3’端处的单链区，该单链区也可作为“粘性末端”用于下游杂交事件1010。在一些实施方案中，切割可以经由酶，如具有内切核酸酶活性的酶(例如，核糖核酸酶如核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII)来进行。
在等于或低于核酸序列1000B的解链温度的温度1006下，可钝化的引发寡核苷酸1000采取环形寡核苷酸构型。在其环形寡核苷酸构型中，可钝化的引发寡核苷酸的可切割部分1002可被切割1007以释放核酸序列1000A，并使可钝化的引发寡核苷酸1000钝化。在一些实施方案中，切割可以经由酶，如具有内切核酸酶活性的酶(例如，核糖核酸酶如核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII，可激活的内切核酸酶)来进行。释放的核酸序列1000A在等于或高于其解链温度的温度下不与单链靶核酸分子1000稳定杂交。
扩增反应混合物可包含可钝化的引发寡核苷酸1000，并且可以经受合适的条件，使得可钝化的引发寡核苷酸1000的引物功能活化。经由可钝化的引发寡核苷酸的扩增可进行所需的循环数和/或进行到生成所需量的扩增产物的程度。在该程度下，可通过使反应混合物处于合适的温度条件(例如，在处于或低于核酸序列1000B的解链温度的温度)和切割条件(例如，可激活的内切核酸酶的激活)来钝化可钝化的引发寡核苷酸1000，以阻止可钝化的引发寡核苷酸1000参与其他轮次的扩增。
图10B示意性地描绘了从5’到3’包含核酸序列1050A、可切割部分1052(例如，核糖部分“rA”)、核酸序列1050A’和核酸序列1050B的可激活的引发寡核苷酸1050。可激活的引发寡核苷酸1050的引发区包含核酸序列1050A、可切割部分1052和核酸序列1050A’。核酸序列1050A’和1050B不与靶核酸分子(未示出)互补并且被间隔区隔开。间隔区不与自身互补。而且，核苷酸序列1050B至少部分互补于引发区。
在等于或高于核酸序列1050B的解链温度(例如，对于图10B所示的核酸序列1050B为约70℃)的温度下，可激活的引发寡核苷酸1050可采取线性构型。线性可激活的引发寡核苷酸可经由其核酸序列1050A引发单链靶核酸分子。然而，由于在引发区的3’端存在非互补的核酸序列1050B和核酸序列1050A’，因此引发区不能在引物延伸反应中延伸。因此，可激活的引发寡核苷酸是钝化的。
在等于或低于核酸序列1050B的解链温度的温度1053下，可激活的引发寡核苷酸1050采取环形寡核苷酸构型。在其环形寡核苷酸构型中，可激活的引发寡核苷酸的可切割部分1052可被切割1054以释放核酸序列1050A，并激活可激活的引发寡核苷酸1050。在一些实施方案中，切割可以经由酶，如具有内切核酸酶活性的酶(例如，核糖核酸酶如核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII，可激活的内切核酸酶)来进行。在等于或低于其解链温度的温度下，释放的核酸序列1050A可与单链靶核酸分子(未示出)杂交并在引物延伸反应中用作引物。引物延伸反应中杂交的核酸序列1050A的3’端的延伸1055可生成单链靶核酸分子的扩增产物1056。
扩增反应混合物可包含可激活的引发寡核苷酸1050，并且可以经受合适的条件，使得可激活的引发寡核苷酸1050的引物功能被激活。经由可激活的引发寡核苷酸的扩增可进行所需的循环数和/或进行到生成所需量的扩增产物的程度。
图10C示意性地描绘了示例巢式扩增反应，其使用可钝化的引发寡核苷酸1000和可激活的引发寡核苷酸1050在单一反应混合物中扩增靶核酸分子。图10C的表格中显示了可钝化的引发寡核苷酸1000和可激活的引发寡核苷酸1050的线性序列。该表格中还显示了与两种引发寡核苷酸一起使用的示例反向引物1060的序列。可钝化的引发寡核苷酸1000的引发区互补于靶核酸分子的区域，该区域位于可激活的引发寡核苷酸1050的核酸序列1050A所互补的靶核酸分子区域的5’侧。因此，可钝化的引发寡核苷酸1000的引发区可以被认为是正向“外”引物，而可激活的引发寡核苷酸1050的核酸序列1050A则可以被认为是正向“内”引物。
除了扩增靶核酸分子所需的任何其他试剂(例如，聚合酶、内切核酸酶、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)以外，可钝化的引发寡核苷酸1000、可激活的引发寡核苷酸1050、反向引物1060和靶核酸分子也可提供于反应混合物中。靶核酸分子可以在连续的扩增反应中进行扩增。在该连续的扩增反应的第一阶段，可钝化的引发寡核苷酸1000是活化的并且可选择性地引发其在靶核酸分子链上的靶序列。连同反向引物1060一起，靶核酸分子可以在一个或多个扩增循环中经由可钝化的引发寡核苷酸1000(如图10A所示)扩增1062，以生成第一扩增产物1070。
在所需次数的扩增循环之后并且/或者当生成所需量的第一扩增产物1070时，酶(例如，具有内切核酸酶活性的酶，例如核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII，具有内切核酸酶活性的可激活的酶)可添加1065至反应混合物或在反应混合物中激活(在它被包含在最初的反应混合物中的情况下)，以切割可钝化的引发寡核苷酸1000的可切割部分1002以及切割可激活的引发寡核苷酸1050的可切割部分1052。可切割部分1002的切割使引发寡核苷酸1000钝化，使得它可能不再参与如图10A所示的靶核酸分子的扩增。而且，可切割部分1052的切割使可激活的引发寡核苷酸1050激活，使得其核酸序列1050A可以扩增如图10B所示的靶核酸分子。连同反向引物1060一起，靶核酸分子可以在一个或多个扩增循环中经由激活的可激活的引发寡核苷酸1050(如图10B所示)扩增1065，以生成第二扩增产物1080。由于可激活的引发寡核苷酸的核酸序列1050A用作“内”引物，所以第二扩增产物1080的长度要短于第一扩增产物1070。在一些实施方案中，该反应混合物还可以包含可用来检测第一扩增产物1070和/或第二扩增产物1080的可检测部分。在一些实施方案中，例如，第一扩增产物1070和第二扩增产物1080的检测可以经由凝胶电泳或本文所述的其他合适的检测方式来实现。
通常，核酸扩增可在反应混合物中进行，其中待扩增的核酸分子与扩增核酸分子所需的任何附加试剂(例如，正向引物、反向引物、聚合酶、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)一起提供。该反应混合物随后可经受适合于扩增该核酸分子的条件(例如，合适的温度、热的添加/移除、缓冲液浓度等)。例如，可在反应混合物中提供单链或双链核酸分子，该反应混合物还包含附加试剂(例如，本文别处所述的正向引物和反向引物，聚合酶、dNTP、辅因子、缓冲液、扩增单链或双链核酸分子所需的任何其他酶(例如，用于由RNA生成cDNA的逆转录酶、连接酶等))。在一些实施方案中，反应混合物的温度可经过变性温度(例如，以使双链核酸分子变性、分离或解链为组分核酸链)、退火温度(例如，以使引物与组分核酸链中的每一个退火或杂交)和延伸温度(例如，以在引物延伸反应中经由聚合酶的作用延伸或将核苷酸添加至退火的引物)重复循环，以便扩增该单链或双链核酸分子。
反应混合物的温度循环可以例如借助于任何合适的热循环仪仪器或其他类型的能够循环加热的装置(包括，例如，基于对流的加热装置)来实现。在一些实施方案中，双链核酸分子的变性可以经由变性剂例如碱剂(例如，氢氧化钠(NaOH))来实现。
在一些情况下，核酸的扩增可以等温地，例如在没有反应混合物的温度变化的情况下实现。在一些实施方案中，本文所述的核酸扩增方法可以无需对扩增反应混合物的温度进行循环而完成。例如，可以进行多个扩增循环而无需对反应混合物的温度进行循环。
核酸扩增反应可以包括聚合酶的使用和作用。在引物延伸反应期间，聚合酶可通常以模板指导的方式将核苷酸添加至与单链核酸分子退火的引物的3’端。任何合适的聚合酶可以用于引物延伸反应，包括商购可得的聚合酶。聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、Phusion聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶，及其变体、经修饰的产物和衍生物。
在一些实施方案中，合适的变性温度可以为，例如，约60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃或更高。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适的变性时间可以为，例如约0.1秒(“s”)、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或更长。
在一些实施方案中，合适的退火温度可以为，例如约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些实施方案中，退火温度可以为环境温度(例如，室温)。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适的退火时间可以为，例如约0.1s、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或更长。
在一些实施方案中，合适的延伸温度可以为，例如约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些实施方案中，单个扩增循环的合适的延伸时间可以为，例如约0.1s、0.5s、1s、2s、3s、4s、5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s、36s、37s、38s、39s、40s、41s、42s、43s、44s、45s、46s、47s、48s、49s、50s、51s、52s、53s、54s、55s、56s、57s、58s、59s、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟或更长。
任何合适类型的核酸扩增反应可以用来扩增核酸分子。核酸扩增反应的一个实例是聚合酶链反应(PCR)，它依赖于如上所述的引物退火、引物延伸和扩增的核酸分子的变性的重复循环。核酸扩增反应类型的附加非限制性实例包括逆转录、连接酶链反应、巢式扩增、多重扩增、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增、多重置换扩增(MDA)；以及PCR的变化形式，其包括实时PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、不对称PCR、微引物PCR、多重PCR、巢式PCR、重叠延伸PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR、解旋酶依赖性PCR、巢式PCR、热不对称交错PCR和降落PCR。
在本文所述的各个方面，方法可包括检测本文所述的一种或多种核酸分子，例如靶核酸分子的扩增产物、双链核酸分子、单链核酸分子、靶核酸分子、可钝化的引发寡核苷酸以及可激活的引发寡核苷酸。本文所述的任何类型的核酸分子的检测可经由任何合适的检测方法或方式来实现。所使用的检测方法或方式的具体类型可依赖于例如被检测的具体物质、检测期间存在的其他物质、可检测的部分是否存在、待使用的可检测部分的具体类型和/或具体应用。
检测方法的非限制性实例包括光学检测、光谱检测、静电检测和电化学检测。因此，可通过检测指示存在或不存在核酸分子的信号(例如，指示核酸分子或相关的可检测部分的光学性质、光谱性质、静电性质或电化学性质的信号)检测本文所述的核酸分子。光学检测方法包括但不限于目视检查(例如，经由眼睛的检测、未借助于光学检测器观察光学性质或光学事件)、荧光测定法和UV-可见光吸光度。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(NMR)光谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳。电化学检测方法包括但不限于安培滴定法。
在一些实施方案中，本文所述的核酸分子的检测可借助于可检测部分来实现。可检测部分可与核酸分子连接或偶联，包括共价地和非共价地(例如，包括双链核酸分子的嵌入)。此外，如本文别处所述，可检测部分可被包含在用于核酸扩增的反应混合物中。在一些实施方案中，本文所述的核酸扩增方法可包括实时核酸扩增反应(例如，实时PCR反应)，借此在核酸分子扩增期间或之后检测扩增产物。可检测部分的非限制性实例包括光学响应性物质(例如，光学响应性染料、光学响应性寡核苷酸探针(例如，TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针、Lion探针、分子信标))和放射性标记(例如，14C、123I、124I、125I、131I、99mTc、35S或3H)。
在一些实施方案中，可检测部分可以是当经受适当条件时生成(或不能生成)信号的光学响应性染料(例如，荧光染料)。染料的非限制性实例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoeste、SYBR金、EvaGreen、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄素、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶、光神霉素、聚吡啶钌、氨茴霉素、菲啶和吖啶、溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭(hexidium iodide)、二氢乙锭、乙锭同型二聚体-1和-2、单叠氮化乙锭和ACMA、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst34580、DAPI、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、羟芪巴脒、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、德克萨斯红、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、SYBR Green、Sybr Green I、Sybr Green II、Sybr Gold、CellTracker绿、7-AAD、乙锭同源二聚体I、乙锭同源二聚体II、乙锭同源二聚体III、溴化乙锭、伞形酮、曙红、绿色荧光蛋白、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、荧光黄、级联蓝、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯、诸如包含铕和铽的那些的荧光镧系元素络合体、羧基四氯荧光素、5和/或6-羧基荧光素(FAM)、5-(或6-)碘乙酰胺荧光素、5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5和/或6羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸盐-4-氨基-萘酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料、DyLight350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料或其他荧光团。
本文所述的方法可借助于计算机处理器来完成。在一些实施方案中，该计算机处理器可以作为计算机系统的一部分被包含在内。例如，如图12所示，计算机处理器1205(例如，中央处理单元(CPU))可以作为计算机系统1201的一部分被包含在内，并且可以是单核或多核处理器以及用于并行处理的多个处理器。计算机系统1201还可以包含存储器或存储器位置1210(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)，电子存储单元1215(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1220(例如，网络适配器)，以及外围设备1225，如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1210、存储单元1215、接口1220和外围设备1225(例如，键盘、鼠标、语音系统、麦克风、打印机或其他输入或输出设备)可以通过通信总线(实线)如主板与计算机处理器1205进行通信。存储单元1215可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1201可以借助于通信接口1220与计算机网络(“网络”)1230可操作地耦合。网络1230可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些实施方案中，网络1230可以是电信和/或数据网络。网络1230可以包括可以实现分布式计算如云计算的一个或多个计算机服务器。在一些实施方案中，网络1230可以借助于计算机系统1201实现对等网络，该对等网络可以使与计算机系统1201耦合的设备能够起到客户端或服务器的作用。
计算机处理器1205可以执行可在程序或软件中体现的一系列机器可读指令。该指令可以存储在存储器位置如存储器1210中。计算机处理器1205进行的操作的实例可以包括读取、解码、执行和回写。存储单元1215可以存储文件，如驱动程序、程序库和保存的程序。存储单元1215可以存储由用户生成的程序以及记录的会话，以及与该程序相关的输出。存储单元1215可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些实施方案中，计算机系统1201可以包括计算机系统1201外部的一个或多个附加数据存储单元，如位于通过内联网或因特网与计算机系统1201进行通信的远程服务器上的附加存储单元。
计算机系统1201可以通过网络1230与一个或多个远程计算机系统进行通信。例如，计算机系统1201可以与用户的远程计算机系统进行通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(便携式个人计算机)、平板或平板个人计算机(例如，iPad、Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，iPhone、支持Android的设备、)或个人数字助理。用户可以经由网络1230访问计算机系统1201。在一些实施方案中，远程计算机系统可以由可无线充电的电池来运行。与远程计算机系统的通信可以例如无线地(例如，经由Wi-Fi、WiMAX、蓝牙、光或微波)来实现。
本文所述的方法以及用于操作检测池、检测器和系统的任何其他组件(例如，泵)的指令可以通过存储在计算机系统1201的电子存储位置如存储器1210或电子存储单元1215上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用过程中，该代码可由处理器1205执行。在一些实施方案中，可以从存储单元1215检索该代码并将其存储在存储器1210中，以备处理器1205存取。在一些情况下，可以不包括电子存储单元1215，而将机器可执行指令存储在存储器1210上。该代码可以被预编译和配置为与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行过程中编译。该代码可以以编程语言提供，可以选择该编程语言以使该代码能够以预编译或编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的方面，如计算机系统1201，可以体现在编程中。所述技术的各个方面可以被认为是通常以机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品”，所述可执行代码和/或相关数据在一种类型的机器可读介质中携带或体现。机器可执行代码可以存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关的模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在软件编程的任何时间提供非暂时性存储。有时可以通过因特网或各种其他电信网络来传送软件的全部或部分。例如，这样的通信可以使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一个，例如从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可承载软件元素的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，如跨过在本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆路网络以及沿着各种空中链路使用的。携带这类波的物理元件如有线或无线链路、光学链路等也可以被认为是承载该软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性、有形“存储”介质，否则术语如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质如计算机可执行代码可以采用许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，如任何计算机中的任何存储设备等，如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括在计算机系统内构成总线的导线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或筒匣、载波传输数据或指令、传输这类载波的电缆或链路，或计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多种可以参与将一个或多个顺序的一个或多个指令携带到处理器以供执行。
实施例
实施例1：示例探针的测试
针对四种靶核酸分子评估单链测试探针。图1A示意性地描绘了该测试探针。如图1A所示，该测试探针从5’到3’包含可检测部分101(例如，FAM荧光染料)、核苷酸序列100A、可切割部分(例如，核糖部分“rC”)102、核酸序列100B以及猝灭剂103(例如，ABkFQ猝灭剂)。图1B示意性地描绘了四种靶核酸分子PM、rM、r3M和5Mr。靶核酸分子PM包含与该测试探针完全互补的序列；靶核酸分子rM在其对应于该探针的可切割部分102的位点上包含单个错配；靶核酸分子r3M包含两个错配——一个在其对应于该探针的可切割部分102的位点上，而一个位于第一错配的3’侧；而靶核酸分子5Mr包含两个错配——一个在其对应于该探针的可切割部分102的位点上，而一个在第一错配序列的5’侧。
在第一组八个实验中，在不同浓度的EDTA中针对各种靶核酸分子(“DS”)以及无模板对照(“SS”)来评估探针。将各种反应混合物的总结列表显示于图2A中。每一种反应混合物均为20μL的体积，并且包含测试探针(0.1μM)、合适的靶核酸分子(0.1μM)、合适浓度的EDTA(1x EDTA＝1.25mM)连同共同的试剂混合物。该共同的试剂混合物含有来自NewEngland Biolabs(NEB)的1x Thermopol缓冲液(包含2mM MgCl2，pH 8.8)和50mM K2SO4。该反应混合物不包含聚合酶或任何其他类型的酶。该反应混合物经受98℃下1秒(“s”)变性、60℃下30s退火以及72℃下5s延伸的10个循环的热循环程序。在每个循环之后，测量每一种反应混合物的荧光。
第一组八个实验的结果示于图2B中。如图2B所示，当反应混合物包含靶核酸分子并且当采用了完全匹配的靶核酸分子时，荧光信号较强。图2B所示的结果提示，探针与其靶核酸分子杂交形成双链复合体可以产生较强的信号。而且，图2B中的结果还提示，结合以下靶核酸分子的探针可产生较强信号，该靶核酸分子在其对应于探针的可切割部分的位点之中及附近不包含错配。
在第二组八个实验中，在不同浓度、不同pH、存在或不存在MgCl2的情况下以及在将反应混合物加热至不同温度时，针对不同浓度的PM靶核酸分子来评估探针。将各种反应混合物(1-8)的总结列表显示于图3B中。每一种反应混合物均为20μL的体积，并且包含测试探针(0.1μM)、PM靶核酸分子(1x＝0.1μM)和MgCl2(当包含MgCl2时为2mM)连同共同的试剂混合物。该共同的试剂混合物含有20mM TrisHCl(在pH7或pH 9下)和50mM K2SO4。该反应混合物不包含聚合酶或任何其他类型的酶。将反应混合物在热循环仪中加热至温度为60℃或70℃。在加热期间的多个温度点处测量每一种反应混合物的荧光。
第二组实验的结果示于图3B中。如图3B所示，在pH条件较高为9(其中不存在MgCl2)以及在较低的加热温度下，当测试较大浓度的靶核酸分子时，信号较强。图3B中的数据提示，信号可以是靶核酸分子浓度依赖性的，较强的信号可在碱性条件下达到，以及反应混合物中的二价阳离子可能是抑制性的。
在第三组八个实验中，在不同浓度和不同温度下针对各种靶核酸分子来评估探针。将各种反应混合物的总结列表显示于图4A中。每一种反应混合物均为20μL的体积，并且包含测试探针(0.1μM)、合适的靶核酸分子(1x＝0.1μM)连同共同的试剂混合物。该共同的试剂混合物含有来自New England Biolabs(NEB)的1x Thermopol缓冲液(包含2mM MgCl2，pH 8.8)和50mM K2SO4。该反应混合物不包含聚合酶或任何其他类型的酶。在热循环仪中90℃下加热该反应混合物10s，并测量每一种反应混合物的荧光。然后，以阶梯降温的方式将反应混合物的温度降至70℃、60℃、45℃、35℃和25℃的温度。在每一次温度降低之后，测量每一种反应混合物的荧光。
第三组实验的结果示于图4B中。如图4B所示，荧光信号随着温度且也随着靶核酸分子的浓度而变化。图4B中的数据提示，信号可以是靶核酸分子浓度和温度依赖性的。
实施例2：示例探针的测试
针对靶核酸分子评估两种单链测试探针。图5A示意性地描绘了第一测试探针(“r探针”)。如图5A所示，该测试探针从5’到3’包含可检测部分501(例如，FAM荧光染料)、核苷酸序列500A、可切割部分(例如，核糖部分“rC”)502、核酸序列500B以及猝灭剂503(例如，IABkFQ猝灭剂)。第二测试探针(“脱氧探针(deoxyProbe)”)除了不包含可切割部分502而是在与第一测试探针的可切割部分502相同的位置处具有标准脱氧碱基以外，它在结构上与第一测试探针相同。图5C示意性地描绘了靶核酸分子，并且它完全互补于两种测试探针。
在第一组24个实验中，在不采用靶核酸分子、采用靶核酸分子以及在无效探针(如图5B示意性地所描绘的，不具有可检测部分或猝灭剂的与“脱氧探针”相同的探针)的存在下采用靶核酸分子的情况下，针对不同的酶条件(无酶(仅缓冲液)、Pfu聚合酶、Phusion聚合酶、2x Phusion主混合物、核糖核酸酶HII、Pfu聚合酶+核糖核酸酶HII、Phusion聚合酶+核糖核酸酶HII、2x Phusion主混合物+核糖核酸酶HII)来评估第一测试探针。每一种反应混合物均为20μL的体积，并且包含第一测试探针(0.2μM)、靶核酸分子(如果存在的话)(0.22μM)、无效探针(如果存在的话)(0.22μM)、合适浓度的酶以及缓冲液。在适当的情况下，酶的浓度如下：Pfu＝0.02个单位/μL，Phusion＝0.02个单位/μL，核糖核酸酶HII＝0.1个单位/μL。该缓冲液含有pH 8.8的20mM Tris-HCl、10mM(NH4)SO4、10mM KCl、50mM K2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton-X-100。将反应混合物在37℃下温育15min，随后在65℃下温育15min，然后经历95℃下1min且58℃下1min的5个热循环程序。对于包含模板核酸分子的反应混合物，第一测试探针和靶核酸分子经历55℃下5min的初步温育并随后冷却至4℃。在循环的58℃阶段中，测量每一种反应混合物的荧光。
第一组实验的结果示于图6A中。图6A所示的数据显示了在参考染料(ROX 1X)的校正/归一化下跨越5个循环所测的平均荧光信号(任意荧光单位)。仅包含测试探针的实验的结果(没有靶核酸分子)在图6A所示的条形图中用“R”表示。包含测试探针和靶核酸分子的实验的结果(没有无效探针)在图6A的条形图中用“R+T”表示。包含测试探针、靶核酸分子和无效探针的实验的结果在图6A的条形图中用“R+T+N”表示。如图6A所示，当反应混合物中包含靶核酸分子时，信号明显较强。而且，无效探针(作为竞争剂)的存在似乎未减弱所观测到的信号。图6A中的数据表明，当与靶核酸分子杂交时第一测试探针可产生信号，并且因为无效探针似乎并未影响观测到的信号，所以探针与靶核酸分子的结合可以是不可逆的。
在第二组12个实验中，采用靶核酸分子针对不同的酶条件(无酶(仅缓冲液)、Phusion聚合酶、核糖核酸酶HII、Phusion 2X主混合物、Taq聚合酶和Phusion 2X混合物+核糖核酸酶HII)评估第一测试探针和第二测试探针。每一种反应混合物均为20μL的体积，并且包含合适的测试探针(0.2μM)、靶核酸分子(0.22μM)、合适浓度的酶以及缓冲液。酶的浓度如下：Taq聚合酶＝0.075个单位/μL，Phusion聚合酶＝0.02个单位/μL，核糖核酸酶HII＝0.10个单位/μL。用于Phusion聚合酶和核糖核酸酶HII反应的缓冲液含有pH 8.8的20mMTris-HCl、10mM(NH4)SO4、10mM KCl、50mM K2SO4、2mM MgSO4、0.1％Triton-X-100。用于Taq聚合酶反应的缓冲液含有来自New England Biolabs的1X Taq缓冲液。将反应混合物在37℃下温育1min，随后在65℃下温育1min，随后在95℃下温育30s，并在60℃下测量每一种反应混合物的荧光。在温育之前，测试探针和靶核酸分子经历55℃下5min的初步温育并随后冷却至4℃。
第一组实验的结果示于图6B中。图6B所示的数据显示了对于针对参考染料(ROX1X)校正/归一化的每一种反应混合物在60℃下所测的荧光信号(任意荧光单位)。如图6B所示，当与含有第二测试探针的反应混合物相比时，含有第一测试探针的反应混合物的信号明显较强。而且，尽管使用了具有不同性质的酶或甚至在不存在酶(例如，仅缓冲液的条件)的情况下，但对于所测试的每一个探针，信号没有显著不同。图6B中的数据提示，第一测试探针可以在不存在酶的情况下产生可检测信号，并且第一测试探针的功能可不依赖于特定类型的酶(例如，具有3’或5’外切核酸酶活性的酶)的功能。
实施例3：示例探针的测试
针对靶核酸分子评估三种测试探针。图7A示意性地描绘了这三种测试探针：“r探针”、“脱氧探针1”和“脱氧探针2”。如图7A所示，r探针测试探针从5’到3’包含可检测部分701(例如，FAM荧光染料)、核苷酸序列700A、可切割部分(例如，核糖部分“rC”)702、核酸序列700B以及猝灭剂703(例如，IABkFQ猝灭剂)。脱氧探针1除了不包含可切割部分702而是在与r探针的可切割部分702相同的位置处具有标准脱氧碱基以外，在结构上与r探针测试探针相同。脱氧探针2除了具有BHQ_13猝灭剂而非IABkFQ猝灭剂以外，在结构上与脱氧探针1相同。
将这三种测试探针各自提供给20μL反应混合物，并在靶核酸分子的扩增反应中进行评估。该反应混合物包含该靶核酸分子的约1000个拷贝；0.3μM的正向引物(5’-GCA GTCCCA AAT CTC CAG TCA CTC A-3’)和0.3μM的反向引物(5’-GGG CAA CAT ACC TTG ATA GTCCAG-3’)；0.15μM的脱氧探针1或2或0.1μM的r探针、10mM Tris-HCl，pH 8.3；50mM KCl；1.5mM MgCl2；0.2mM dNTP混合物；1X参考Rox染料；以及0.0375U/μL Taq聚合酶。扩增反应在实时热循环仪中进行，其中该反应混合物在98℃下预热20s，然后进行包含95℃下7s、59℃下35s和72℃下15s的循环的温度循环程序的45个循环。在温度循环程序的每一个循环的59℃阶段中监测该反应混合物中的信号。
实验的结果示于图7B中。图7B描绘了扩增曲线图，其显示在对数尺度下信号相对于循环数的变化(ΔRn)。如图7B所示，r探针测试探针在信号强度和信号转换效率方面显示出与脱氧探针2类似的性能。由于扩增反应在Taq聚合酶的存在下进行，因此图7B中的数据表明r探针测试探针可以在具有5’外切核酸酶活性的聚合酶的存在下以类似于脱氧探针2的效率起作用。
实施例4：示例探针的测试
针对靶核酸分子评估两种双链测试探针和包含可切割部分的r探针。这两种双链探针包含如图8A描绘的与两条猝灭链“猝灭链1”或“猝灭链2”之一杂交的“荧光链”。如图8A所示，该荧光链从5’到3’包含核酸序列和可检测部分801(例如，FAM荧光染料)。猝灭链1从5’到3’包含猝灭剂803(例如，IABkFQ猝灭剂)和与荧光链的序列互补的序列。猝灭链2除了还在其3’端处包含终止子(例如，双脱氧胞苷(ddC))核苷酸804以外，在结构上与猝灭链1相同。当作为单链提供给反应混合物时，双链测试探针中的每一种的两条组成链杂交在一起形成它们各自的双链测试探针。
将所述双链测试探针中的每一种或r探针的链提供给20μL反应混合物，并在靶核酸分子的扩增反应中评估这三种测试探针中的每一种。该反应混合物包含该靶核酸分子的约1000个拷贝；0.4μM的正向引物(5’-TCC CAA ATC TCC AGT CAC TCdUdU-3’)和0.4μM的反向引物(5’-CAA CAT ACC TTG ATA GTC CAGdUdU-3’)；0.15μM的荧光链和猝灭链1或猝灭链2，或0.1μM的r探针；以及1X Phusion主混合物(Thermo)。扩增反应在实时热循环仪中进行，其中该反应混合物在98℃下预热20s，然后进行包含96℃下10s、60℃下35s和72℃下15s的循环的温度循环程序的45个循环。在温度循环程序的每一个循环的60℃阶段中监测该反应混合物中的信号。
实验的结果示于图8B中。在图8B中，包含荧光链和猝灭链1的双链测试探针用“DD对1”表示，并且包含荧光链和猝灭链2的双链测试探针用“DD对2”表示。r探针测试探针在图8B中表示为“r探针”。图8B描绘了扩增曲线图，其显示在对数尺度下信号相对于循环数的变化(ΔRn)。如图8B所示，两种双链测试探针显示出类似的性能并且是定量的。而且，r探针在不存在5’外切核酸酶活性的情况下也似乎定量地起作用。因此，图8B中显示的结果提示，双链探针可在不存在5’外切核酸酶活性的情况下定量地用来检测扩增产物。
实施例5：检测单核苷酸多态性(SNP)
研究了包含SNP位点的靶核酸分子并示于图14A中。SNP位点的核苷酸位点由图14A所示的框中的“N”核苷酸表示。如图14B所示，在其3’端包含序列“IUU”的正向引物(“A-正向”)用来检测SNP位点N处的“A/T”SNP。肌苷核苷酸是可用来检测SNP位点上的嘌呤碱基的嘌呤衍生物。图14B还显示了用来检测SNP位点处的A/T SNP且在其3’端包含序列“UU”的相应反向引物(“A-反向”)。
而且，如图14B所示，在其3’端包含序列“UUU”的反向引物(“G-反向”)用来检测SNP位点N处的“C/G”SNP。3个U核苷酸的最5’侧是可用来检测SNP位点上的嘧啶碱基的嘧啶衍生物。图14B还显示了用来检测SNP位点处的C/G SNP且在其3’端包含序列“UU”的相应正向引物(“G-正向”)。
在一系列六种反应混合物(A-F)中，每一个引物组(A-正向/A-反向或G-正向/G-反向)在区分其靶SNP(A/T与C/G)方面进行评估。六种反应混合物中的两种包含图14A中的靶核酸分子的100或1000个拷贝，其中在SNP位点上测试引物组的靶SNP(例如，对于A-正向/A-反向引物组，在SNP位点上“A”替换N，对于G-正向/G-反向引物组，在SNP位点上“G”替换N)。每一组的其他四种反应混合物包含图14A中的靶核酸分子的1000、10000、100000或1000000个拷贝，其中在SNP位点上测试引物组的非靶SNP(例如，对于A-正向/A-反向引物组，在SNP位点上“G”替换N，对于G-正向/G-反向引物组，在SNP位点上“A”替换N)。
每一种反应混合物均为20μL的总体积。每一种反应混合物包含合适的靶核酸分子(SNP位点上的A或SNP位点上的G)的合适数目的拷贝、0.25μM的各自的正向和反向引物、200μM dNTP、0.02个单位/μL Phusion DNA聚合酶和来自New England Biolabs的缓冲液，以及从Life Technologies获得的SYBR绿(浓度为0.3x)和ROX(浓度为1x)荧光染料。为了完成靶核酸分子的扩增，每一种反应混合物经历热循环程序，该热循环程序包括98℃下10s的初始变性步骤，然后是98℃下1s、60℃下30s和72℃下10s的45个循环。
在完成该热循环程序之后，完成每一种反应混合物的解链曲线分析。描绘每一组反应混合物的解链曲线分析的结果的曲线图示于图14C(对于评估A-正向/A-反向的反应混合物)和图14D(对于评估G-正向/G-反向的反应混合物)。在图14C和图14D的每一幅图中均显示了表格，该表格指出哪一个靶核苷酸在靶核酸分子的SNP位点上，以及每一种反应混合物(A-F)中合适的靶核酸分子的拷贝数。在图14C和图14D中，每一种反应混合物的解链曲线分析示于曲线图中，其中每一个标记的曲线的字母对应于该表格中合适的反应混合物。
如图14C所示，当正向-A和反向-A引物用于扩增时，在SNP位点上包含A的靶核酸分子的解链曲线分析期间，在靶核酸分子的基本上较低的拷贝数下观察到类似的荧光变化。例如，对于包含在SNP位点上具有A的靶核酸分子的100个拷贝的反应混合物(A)观察到的荧光变化类似于对于包含在SNP位点上具有G的靶核酸分子的100000个拷贝的反应混合物(E)观察到的荧光变化。此外，对于包含在SNP位点上具有A的靶核酸分子的1000个拷贝的反应混合物(B)观察到的荧光变化类似于对于包含在SNP位点上具有G的靶核酸分子的1000000个拷贝的反应混合物(F)观察到的荧光变化。在两个比较中，根据两种反应混合物中每一个靶核酸分子的拷贝数，观察到在检测靶SNP时约1000倍的区别。
类似地，如图14D所示，当正向-G和反向-G引物用于扩增时，在SNP位点上包含G的靶核酸分子的解链曲线分析期间，在靶核酸分子的基本上较低的拷贝数下观察到类似的荧光变化。例如，对于包含在SNP位点上具有G的靶核酸分子的100个拷贝的反应混合物(A)观察到的荧光变化高于对于包含在SNP位点上具有A的靶核酸分子的100000个拷贝的反应混合物(E)观察到的荧光变化。此外，对于包含在SNP位点上具有G的靶核酸分子的1000个拷贝的反应混合物(B)观察到的荧光变化类似于对于包含在SNP位点上具有A的靶核酸分子的1000000个拷贝的反应混合物(F)观察到的荧光变化。在两个比较中，根据两种反应混合物中每一个靶核酸分子的拷贝数，观察到在检测靶SNP时至少1000倍的区别。
实施例6：采用可激活和可钝化的引发寡核苷酸的巢式扩增反应
使用如本文别处所述且描绘于图10A-图10C的可钝化的引发寡核苷酸1000、可激活的引发寡核苷酸1050和反向引物1060在一系列三组反应混合物中扩增靶核酸分子。每组反应混合物经历特定的处理程序(A、B或C)并且包括包含反向引物1060和可钝化的引发寡核苷酸1000的反应混合物；包含反向引物1060和可激活的引发寡核苷酸1050的反应混合物；以及包含反向引物1060、可钝化的引发寡核苷酸1000和可激活的引发寡核苷酸1050的反应混合物。因此，评估总计九种反应混合物(3组x每组3种反应混合物)。一组反应混合物中的每种反应混合物的总结示于图11A的表格中。
每一种反应混合物均具有20μL的总体积，其含有1x Phusion快速PCR试剂(由来自New England Biolabs的2x主混合物制成)、作为背景的约100皮克(“pg”)人DNA、靶核酸分子的约1000个拷贝。在反应混合物包含可钝化的引发寡核苷酸1000的情况下，该可钝化的引发寡核苷酸1000以0.1μM的浓度被包含在内。在反应混合物包含可激活的引发寡核苷酸1050的情况下，可激活的引发寡核苷酸1050以0.5μM的浓度被包含于其中。反向引物1060以0.5μM的浓度包含在反应混合物中。在反应混合物包含核糖核酸酶HII的情况下或在加入核糖核酸酶HII的情况下，核糖核酸酶以0.125个单位/μL的浓度存在。
每一组三种反应混合物经历特定的处理程序A、B或C。处理程序A、B和C的总结以图形方式描绘在图11B中。如图11B所示，提供了初始温度为98℃(持续10s)且不具有核糖核酸酶HII的程序A反应混合物。在这样的反应条件下，可钝化的引发寡核苷酸1000是活化的且可以参与扩增反应以扩增靶核酸分子。而且，在这样的条件下，可激活的引发寡核苷酸1050不是活化的且不能参与扩增反应以扩增靶核酸分子。反应混合物随后经历两个系列的扩增循环1110和1120。系列1110包括98℃下1s、60℃下5s和72℃下10秒的15个循环。系列1120包括98℃下1s、60℃下5s和72℃下10秒的30个循环。由于可钝化的引发寡核苷酸1000是活化的且可激活的引发寡核苷酸1050是钝化的，类似于图10C中那些扩增产物1070(例如，约100bp)的扩增产物预计在包含可钝化的引发寡核苷酸1000的反应混合物中。
如图11B所示，程序B反应混合物与核糖核酸酶HII一起提供并在37℃下温育30min。在这样的反应条件下，可钝化的引发寡核苷酸1000被钝化且不能参与扩增反应以扩增靶核酸分子。而且，在这样的条件下，可激活的引发寡核苷酸1050被激活且其核酸序列1050A’可以参与扩增反应以扩增靶核酸分子。反应混合物随后经历系列1110和1120扩增循环。由于可钝化的引发寡核苷酸1000是钝化的且可激活的引发寡核苷酸1050是活化的，类似于图10C中那些扩增产物1080(例如，约70bp)的扩增产物预计在包含可激活的引发寡核苷酸1050的反应混合物中。
如图11B所示，以初始温度98℃(持续10s)提供程序C反应混合物，并经历调节的条件使得靶核酸分子的扩增经由可钝化的引发寡核苷酸1000和可激活的引发寡核苷酸1050二者来实现。在初始条件下，如上所述，可钝化的引发寡核苷酸1000是活化的且可激活的引发寡核苷酸1050不是活化的。对于反应混合物，在开始时加入核糖核酸酶HII。在反应混合物1(仅具有可钝化的引发寡核苷酸1000)中，核糖核酸酶最初是活化的，并因此可钝化的引发寡核苷酸是钝化的且预计不会进行扩增。反应混合物随后经历系列1110扩增循环以生成扩增产物1070。随后将反应混合物在37℃下温育30分钟并激活核糖核酸酶HII(或者，添加至反应混合物)以激活可激活的引发寡核苷酸1050和钝化可钝化的引发寡核苷酸1000。反应混合物随后经历系列1120扩增循环以生成扩增产物。由于引发寡核苷酸1050在反应混合物2(仅包含可激活的引发寡核苷酸1050)和3(包含可钝化的引发寡核苷酸1000和可激活的引发寡核苷酸1050二者)中是活化的，因此预期产生类似于图10C中那些扩增产物1080的扩增产物。由于可钝化的引发寡核苷酸1000在反应混合物1(仅具有可钝化的引发寡核苷酸1000)中是钝化的，因此预期不产生扩增产物。
在完成扩增反应之后，在溴化乙锭的存在下通过4％琼脂糖凝胶电泳分析10μL的每一种反应混合物。如上所述，扩增产物1070的预期产物大小为约100bp且扩增产物1080的预期产物大小为约75bp。凝胶电泳分析的结果示于图11C中。如图11C所示，在存在可钝化的引发寡核苷酸1000的情况下，在程序A反应混合物(例如，反应混合物1和3)中观察到约100bp的扩增产物1070。在不存在可钝化的引发寡核苷酸1000的情况下(例如，反应混合物2)，未观察到100bp的扩增产物1070。在一些反应混合物中，观察到较短的产物1090，并且该产物可能是引物二聚体副产物。
如图11C所示，在存在可激活的引发寡核苷酸1050的情况下，在程序B反应混合物(例如，反应混合物2和3)中观察到约75bp的扩增产物1080。在不存在可激活的引发寡核苷酸1050的情况下(例如，反应混合物1)，未观察到75bp的扩增产物1080。而且，如图11C所示，当不存在可钝化的引发寡核苷酸1000的情况下，可激活的引发寡核苷酸1050存在且活化(例如，反应混合物2)时，对于程序C反应混合物，在第二反应混合物中观察到约75bp的扩增产物1080。在可钝化的引发寡核苷酸1000也存在且活化的情况下(例如，反应混合物3)，观察到100bp的扩增产物1070。在可激活的引发寡核苷酸1050不存在时可钝化的引发寡核苷酸1000存在且被钝化的情况下(例如，反应混合物1)，未观察到扩增产物。
虽然本文已显示并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅通过举例的方式来提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在由以下权利要求来限定本发明的范围，以及旨在由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (234)

1.一种具有互补于单链靶核酸分子的核酸序列的探针，其中所述核酸序列具有(i)至少一个可切割部分、(ii)可检测部分和(iii)猝灭剂，其中当所述探针不与所述单链靶核酸分子杂交时，所述猝灭剂猝灭所述可检测部分。
2.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针为单链的。
3.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针不能进行分子内杂交。
4.根据权利要求1所述的探针，其中所述可检测部分为荧光团。
5.根据权利要求1所述的探针，其中所述至少一个可切割部分为核糖部分。
6.一种含有如权利要求1所述的探针的溶液。
7.根据权利要求6所述的溶液，其中所述溶液包含碱性缓冲液。
8.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针包含多个可切割部分。
9.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针包含位于所述至少一个可切割部分侧翼的核苷酸序列A和核苷酸序列B，并且其中所述核苷酸序列A和核苷酸序列B各自互补于所述单链靶核酸分子的一部分。
10.根据权利要求1所述的探针，其中所述可切割部分在所述探针与所述单链靶核酸分子杂交时是可切割的。
11.根据权利要求10所述的探针，其中所述可切割部分在碱性条件下是可切割的。
12.根据权利要求10所述的探针，其中所述可切割部分在不借助于酶的情况下是可切割的。
13.根据权利要求1所述的探针，其中所述可检测部分适合于在所述探针与所述单链靶核酸分子杂交时提供可检测信号。
14.根据权利要求1所述的探针，其中所述探针适合于与所述单链靶核酸分子杂交，使得所述至少一个可切割部分位于所述单链靶核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)位点处。
15.根据权利要求14所述的探针，其中所述至少一个可切割部分相对于所述SNP位点处的核苷酸是互补的。
16.一种阵列，其包含如权利要求1所述的探针固定于其上的基底。
17.根据权利要求16所述的阵列，其中所述基底为固体基底。
18.根据权利要求17所述的阵列，其中所述固体基底包含选自金属、半金属、玻璃、聚合物、金属氧化物、氧化硅和氮化硅的材料。
19.根据权利要求16所述的阵列，其中所述探针固定在所述阵列的孔中。
20.一种用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法，其包括
(a)提供包含单链靶核酸分子和探针的反应混合物，其中所述探针具有核酸序列，该核酸序列具有(i)至少一个可切割部分、(ii)可检测部分和(iii)猝灭剂，其中所述探针互补于所述单链靶核酸分子，并且其中当所述探针不与所述单链靶核酸分子杂交时，所述猝灭剂猝灭所述可检测部分；
(b)使所述探针与所述单链靶核酸分子杂交，其中在杂交时，所述可切割部分被设置为与所述单链靶核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)位点上的核苷酸相邻；以及
(c)检测来自所述探针的信号，该信号指示在所述SNP位点上存在所述核苷酸。
21.根据权利要求20所述的方法，其中(b)和(c)在不借助于酶的情况下进行。
22.根据权利要求20所述的方法，其中(b)和(c)在不对所述反应混合物的温度进行循环的情况下进行。
23.根据权利要求20所述的方法，其进一步包括将所述反应混合物的pH维持在7以上。
24.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括将所述pH维持在8到11。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述单链靶核酸分子不含有可检测部分。
26.根据权利要求20所述的方法，其中在所述探针与所述单链靶核酸分子杂交时切割所述可切割部分。
27.根据权利要求20所述的方法，其中所述可检测部分适合于在所述探针与所述单链靶核酸分子杂交时提供所述信号。
28.根据权利要求20所述的方法，其中所述信号为光信号、静电信号或电化学信号。
29.根据权利要求20所述的方法，其中所述探针包含多个可切割部分。
30.根据权利要求20所述的方法，其中所述探针包含位于所述至少一个可切割部分侧翼的核苷酸序列A和核苷酸序列B，并且其中所述核苷酸序列A和核苷酸序列B各自互补于所述单链靶核酸分子的一部分。
31.根据权利要求20所述的方法，其中所述可切割部分相对于所述SNP位点上的所述核苷酸是互补的。
32.根据权利要求20所述的方法，其中所述探针固定在阵列的基底上。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述探针固定在所述阵列的孔中。
34.一种用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法，其包括：
(a)提供第一反应混合物，其包含(i)靶核酸分子的第一链和(ii)第一引物，所述第一引物在其核苷酸位点处具有嘌呤衍生物，该核苷酸位点对应于怀疑包含单核苷酸多态性(SNP)的第一核苷酸位点的所述第一链的核苷酸位点，其中相比于所述第一链的其他类型的碱基，所述嘌呤衍生物优先与所述第一链的嘧啶碱基杂交；
(b)提供第二反应混合物，其包含(i)所述靶核酸分子的所述第一链的互补链和(ii)第二引物，所述第二引物在其核苷酸位点处具有嘧啶衍生物，该核苷酸位点对应于怀疑包含所述SNP的第二核苷酸位点的所述互补链的核苷酸位点，其中相比于所述互补链的其他类型的碱基，所述嘧啶衍生物优先与所述互补链的嘌呤碱基杂交；
(c)使所述第一和第二反应混合物经受这样的条件，该条件使得所述第一引物在与所述第一链杂交时可延伸以产生第一核酸产物，并且所述第二引物在与所述互补链杂交时可延伸以产生第二核酸产物；以及
(d)测定所述第一和第二核酸产物的相对量。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一链的所述嘧啶碱基为胞嘧啶碱基。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述互补链的所述嘌呤碱基为腺嘌呤碱基。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述嘌呤衍生物不是鸟嘌呤。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述嘌呤衍生物为次黄嘌呤或其衍生物。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述嘧啶衍生物不是胸腺嘧啶。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述嘧啶衍生物为尿嘧啶或其衍生物。
41.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一和第二反应混合物在单独的容器中。
42.根据权利要求34所述的方法，其中所述嘌呤衍生物借助于具有3’到5’外切核酸酶活性的酶可被腺嘌呤碱基代替。
43.根据权利要求34所述的方法，其中所述嘧啶衍生物借助于具有3’到5’外切核酸酶活性的酶可被胞嘧啶碱基代替。
44.根据权利要求34所述的方法，其中所述第一和第二反应混合物中的每一种均包含可检测部分。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述可检测部分为光学可检测部分。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述光学可检测部分为SYBR绿、EvaGeen、BEBO、BOXTO或嵌入染料。
47.根据权利要求34所述的方法，其中所述测定借助于解链曲线分析来进行。
48.根据权利要求34所述的方法，其中所述测定借助于循环阈值的变化(ΔCt)来进行。
49.根据权利要求34所述的方法，其中所述测定借助于凝胶电泳来进行。
50.根据权利要求34所述的方法，其中所述测定借助于被编程为比较所述第一和第二核酸产物的相对量的计算机处理器来进行。
51.根据权利要求34所述的方法，其中与所述第二核酸产物相比所述第一核酸产物的量较多表明在所述SNP的所述第一核苷酸位点处存在嘌呤碱基。
52.根据权利要求34所述的方法，其中与所述第一核酸产物相比所述第二核酸产物的量较多表明在所述SNP的所述第二核苷酸位点处存在嘧啶碱基。
53.一种可钝化的引发寡核苷酸，其包含：
(a)引发区，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中所述核酸序列A的3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链，和(ii)至少一个可切割部分；以及
(b)与所述引发区显示出序列互补性的与所述引发区相邻的核酸序列B。
54.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列A的所述3’端仅在等于或高于所述核酸序列B的解链温度的温度下是可延伸的。
55.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述引发区从3’到5’包含所述核酸序列A、所述可切割部分和互补于所述单链靶核酸分子的核酸序列A’。
56.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B不与所述单链靶核酸分子互补。
57.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B至少部分互补于所述单链靶核酸分子的互补体。
58.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B包含不与所述引发区和/或所述单链靶核酸分子互补的间隔区。
59.根据权利要求58所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述间隔区不能被聚合酶进行拷贝。
60.根据权利要求58所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述间隔区为一个或多个核苷酸的序列。
61.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述引发区具有第一解链温度并且所述核酸序列B具有低于所述第一解链温度的第二解链温度。
62.根据权利要求61所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第一解链温度为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
63.根据权利要求61所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
64.根据权利要求61所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度比第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
65.根据权利要求61所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述引发区进一步包含核酸序列A’。
66.根据权利要求65所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A具有低于所述第一解链温度的第三解链温度。
67.根据权利要求66所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第三解链温度低于所述第二解链温度。
68.根据权利要求67所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第三解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
69.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述至少一个可切割部分为核糖。
70.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可光解的。
71.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可酶切的。
72.根据权利要求71所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分可被具有内切核酸酶活性的酶切割。
73.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可化学切割的。
74.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可钝化的引发寡核苷酸包含多个可切割部分。
75.根据权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可钝化的引发寡核苷酸为环形可钝化的引发寡核苷酸。
76.一种含有如权利要求53所述的可钝化的引发寡核苷酸的溶液。
77.根据权利要求76所述的溶液，其中所述溶液包含碱性缓冲液。
78.一种可钝化的引发寡核苷酸，其包含：
(a)引发区，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中所述核酸序列A具有适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端，和(ii)至少一个可切割部分；以及
(b)与所述引发区相邻的核酸序列B，其中所述引发区具有第一解链温度并且所述核酸序列B具有低于所述第一解链温度的第二解链温度。
79.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列A的所述3’端仅在等于或高于所述第二解链温度的温度下是可延伸的。
80.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述引发区从3’到5’包含所述核酸序列A、与所述核酸序列A相邻的所述可切割部分以及与所述可切割部分相邻的核酸序列A’。
81.根据权利要求80所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列A’互补于所述单链靶核酸分子。
82.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B不与所述单链靶核酸分子互补。
83.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B至少部分互补于所述单链靶核酸分子的互补体。
84.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B包含不与所述引发区和/或所述单链靶核酸分子互补的间隔区。
85.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述间隔区为一个或多个核苷酸的序列。
86.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第一解链温度为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
87.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
88.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度低至少约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
89.根据权利要求80所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A具有低于所述第一解链温度的第三解链温度。
90.根据权利要求89所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中在切割所述可切割部分时，所述第三解链温度低于所述第二解链温度。
91.根据权利要求90所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述第三解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
92.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述至少一个可切割部分为核糖。
93.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可光解的。
94.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可酶切的。
95.根据权利要求94所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分可被具有内切核酸酶活性的酶切割。
96.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可化学切割的。
97.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可钝化的引发寡核苷酸包含多个可切割部分。
98.根据权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸，其中所述可钝化的引发寡核苷酸为环形可钝化的引发寡核苷酸。
99.一种含有如权利要求78所述的可钝化的引发寡核苷酸的溶液。
100.根据权利要求99所述的溶液，其中所述溶液包含碱性缓冲液。
101.一种用于钝化可钝化的引发寡核苷酸的方法，其包括：
提供含有可钝化的引发寡核苷酸的溶液，所述可钝化的引发寡核苷酸包含：(a)引发区，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中所述核酸序列A的3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链，和(ii)至少一个可切割部分；和(b)与所述引发区显示出序列互补性的与所述引发区相邻的核酸序列B；以及
切割所述可切割部分，从而钝化所述可钝化的引发寡核苷酸的所述引发区。
102.根据权利要求101所述的方法，其中采用酶进行所述切割。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述酶为内切核酸酶。
104.根据权利要求101所述的方法，其中采用光进行所述切割。
105.根据权利要求101所述的方法，其中所述切割经由大于7的所述溶液的pH来进行。
106.一种用于钝化可钝化的引发寡核苷酸的方法，其包括：
提供含有可钝化的引发寡核苷酸的溶液，所述可钝化的引发寡核苷酸包含：(a)引发区，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，其中所述核酸序列A的3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链，和(ii)至少一个可切割部分；和(b)与所述引发区相邻的核酸序列B，其中所述引发区具有第一解链温度并且所述核酸序列B具有低于所述第一解链温度的第二解链温度；以及
切割所述可切割部分，从而钝化所述可钝化的引发寡核苷酸的所述引发区。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述引发区从3’到5’包含所述核酸序列A、与所述核酸序列A相邻的所述可切割部分以及与所述可切割部分相邻的核酸序列A’。
108.根据权利要求106所述的方法，其进一步包括使所述溶液的温度降至等于或低于所述第二解链温度。
109.根据权利要求106所述的方法，其中所述可切割部分在等于或低于所述第二解链温度的所述溶液的温度下切割。
110.根据权利要求106所述的方法，其进一步包括在切割所述可切割部分之后使所述溶液的所述温度升至等于或高于所述第二解链温度。
111.根据权利要求106所述的方法，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A在等于或高于其解链温度和/或所述第一解链温度的温度下不与所述单链靶核酸分子稳定地杂交。
112.根据权利要求106所述的方法，其中所述第一解链温度为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
113.根据权利要求106所述的方法，其中所述第二解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
114.根据权利要求106所述的方法，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
115.根据权利要求107所述的方法，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A具有低于所述第一解链温度的第三解链温度。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述第三解链温度低于所述第二解链温度。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述第三解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
118.根据权利要求115所述的方法，其进一步包括使所述溶液的所述温度升至等于或高于所述第三解链温度。
119.根据权利要求106所述的方法，其中采用酶进行所述切割。
120.根据权利要求106所述的方法，其中采用光进行所述切割。
121.根据权利要求106所述的方法，其中所述切割经由大于7的所述溶液的pH来进行。
122.一种可激活的引发寡核苷酸，其包含：
(a)引发区，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A和(ii)至少一个可切割部分，其中所述核酸序列A具有适合于仅在切割所述可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端；和
(b)核酸序列B，该核酸序列B位于所述引发区的3’侧并且显示出与所述引发区的序列互补性。
123.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述引发区从5’到3’包含所述核酸序列A、所述可切割部分和核酸序列A’。
124.根据权利要求123所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列A’不与所述单链靶核酸分子互补。
125.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B不与所述单链靶核酸分子互补。
126.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B至少部分互补于所述单链靶核酸分子的互补体。
127.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述引发区具有第一解链温度并且所述核酸序列B具有低于所述第一解链温度的第二解链温度。
128.根据权利要求127所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第一解链温度为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
129.根据权利要求127所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
130.根据权利要求127所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
131.根据权利要求127所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述引发区进一步包含核酸序列A’。
132.根据权利要求131所述的可激活的引发寡核苷酸，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A具有低于所述第一解链温度的第三解链温度。
133.根据权利要求132所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第三解链温度低于或高于所述第二解链温度。
134.根据权利要求132所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第三解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
135.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述至少一个可切割部分为核糖。
136.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可光解的。
137.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可酶切的。
138.根据权利要求137所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分可被内切核酸酶切割。
139.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可化学切割的。
140.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可激活的引发寡核苷酸包含多个可切割部分。
141.根据权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可激活的引发寡核苷酸为环形可激活的引发寡核苷酸。
142.一种含有如权利要求122所述的可激活的引发寡核苷酸的溶液。
143.根据权利要求142所述的溶液，其中所述溶液包含碱性缓冲液。
144.一种可激活的引发寡核苷酸，其包含：
(a)引发区，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A和(ii)至少一个可切割部分，其中所述核酸序列A具有适合于仅在切割所述可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端；和
(b)核酸序列B，所述核酸序列B位于所述引发区的3’侧，其中所述引发区具有第一解链温度并且所述核酸序列B具有低于所述第一解链温度的第二解链温度。
145.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述引发区从5’到3’包含所述核酸序列A、所述可切割部分和核酸序列A’。
146.根据权利要求145所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述引发区核酸序列A’不与所述单链靶核酸分子互补。
147.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B不与所述单链靶核酸分子互补。
148.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述核酸序列B至少部分互补于所述单链靶核酸分子的互补体。
149.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第一解链温度为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
150.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
151.根据权利要求134所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
152.根据权利要求145所述的可激活的引发寡核苷酸，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A具有低于所述第一解链温度的第三解链温度。
153.根据权利要求152所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第三解链温度低于或高于所述第二解链温度。
154.根据权利要求152所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述第三解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
155.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述至少一个可切割部分为核糖。
156.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可光解的。
157.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可酶切的。
158.根据权利要求157所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分可被内切核酸酶切割。
159.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可切割部分是可化学切割的。
160.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可激活的引发寡核苷酸包含多个可切割部分。
161.根据权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸，其中所述可激活的引发寡核苷酸为环形可激活的引发寡核苷酸。
162.一种含有如权利要求144所述的可激活的引发寡核苷酸的溶液。
163.根据权利要求162所述的溶液，其中所述溶液包含碱性缓冲液。
164.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
(a)提供含有可激活的引发寡核苷酸的溶液，所述可激活的引发寡核苷酸包含引发区和核酸序列B，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，(ii)至少一个可切割部分，所述核酸序列B位于所述引发区的3’侧并且显示出与所述引发区的序列互补性，其中所述核酸序列A具有适合于仅在切割所述可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端；
(b)切割所述可切割部分；以及
(c)利用所述核酸序列A进行所述引物延伸反应以形成所述互补核酸链。
165.根据权利要求164所述的方法，其中采用酶进行所述切割。
166.根据权利要求165所述的方法，其中所述酶为内切核酸酶。
167.根据权利要求164所述的方法，其中采用光进行所述切割。
168.根据权利要求164所述的方法，其中所述切割经由大于7的所述溶液的pH来进行。
169.根据权利要求164所述的方法，其中所述引发区从5’到3’包含所述核酸序列A、所述可切割部分和核酸序列A’。
170.根据权利要求169所述的方法，其中所述核酸序列A’不与所述单链靶核酸分子互补。
171.根据权利要求164所述的方法，其中所述核酸序列B不与所述单链靶核酸分子互补。
172.根据权利要求164所述的方法，其中所述核酸序列B至少部分互补于所述单链靶核酸分子的互补体。
173.根据权利要求164所述的方法，其中所述引发区具有第一解链温度并且所述核酸序列B具有低于所述第一解链温度的第二解链温度。
174.根据权利要求173所述的方法，其中所述第一解链温度为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
175.根据权利要求173所述的方法，其中所述第二解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
176.根据权利要求173所述的方法，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
177.根据权利要求173所述的方法，其中所述引发区进一步包含核酸序列A’。
178.根据权利要求177所述的方法，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A具有低于所述第一解链温度的第三解链温度。
179.根据权利要求178所述的方法，其中所述第三解链温度低于或高于所述第二解链温度。
180.根据权利要求178所述的方法，其中所述第三解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
181.根据权利要求178所述的方法，其进一步包括在(c)之前使所述溶液的温度降至等于或低于所述第三解链温度。
182.根据权利要求164所述的方法，其中所述至少一个可切割部分为核糖。
183.根据权利要求164所述的方法，其中所述可激活的引发寡核苷酸包含多个可切割部分。
184.根据权利要求164所述的方法，其中所述可激活的引发寡核苷酸为环形可激活的引发寡核苷酸。
185.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
(a)提供含有可激活的引发寡核苷酸的溶液，所述可激活的引发寡核苷酸包含引发区和核酸序列B，所述引发区具有(i)可与单链靶核酸分子杂交的核酸序列A，(ii)至少一个可切割部分，所述核酸序列B位于所述引发区的3’侧，其中所述引发区具有第一解链温度并且所述核酸序列B具有低于所述第一解链温度的第二解链温度，并且其中所述核酸序列A具有适合于仅在切割所述可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述单链靶核酸分子的互补核酸链的3’端；
(b)切割所述可切割部分；以及
(c)利用所述核酸序列A进行所述引物延伸反应以形成所述互补核酸链。
186.根据权利要求185所述的方法，其中采用酶进行所述切割。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述酶为内切核酸酶。
188.根据权利要求185所述的方法，其中采用光进行所述切割。
189.根据权利要求185所述的方法，其中所述切割经由大于7的所述溶液的pH来进行。
190.根据权利要求185所述的方法，其中所述引发区从5’到3’包含所述核酸序列A、所述可切割部分和核酸序列A’。
191.根据权利要求190所述的方法，其中所述核酸序列A’不与所述单链靶核酸分子互补。
192.根据权利要求185所述的方法，其中所述核酸序列B不与所述单链靶核酸分子互补。
193.根据权利要求185所述的方法，其中所述核酸序列B至少部分互补于所述单链靶核酸分子的互补体。
194.根据权利要求185所述的方法，其中所述第一解链温度为至少约50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃。
195.根据权利要求185所述的方法，其中所述第二解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
196.根据权利要求185所述的方法，其中所述第二解链温度比所述第一解链温度低约1℃至80℃、5℃至30℃或10℃至20℃。
197.根据权利要求190所述的方法，其中在切割所述可切割部分时，所述核酸序列A具有低于所述第一解链温度的第三解链温度。
198.根据权利要求197所述的方法，其中所述第三解链温度低于或高于所述第二解链温度。
199.根据权利要求197所述的方法，其中所述第三解链温度低于或等于约80℃、75℃、70℃、65℃、60℃、55℃或50℃。
200.根据权利要求197所述的方法，其进一步包括在(c)之前使所述溶液的温度降至等于或低于所述第三解链温度。
201.根据权利要求185所述的方法，其中所述至少一个可切割部分为核糖。
202.根据权利要求185所述的方法，其中所述可激活的引发寡核苷酸包含多个可切割部分。
203.根据权利要求185所述的方法，其中所述可激活的引发寡核苷酸为环形可激活的引发寡核苷酸。
204.一种包含可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的反应混合物，其中：
(i)所述可激活的引发寡核苷酸包含第一引发区，所述第一引发区具有(a)可与靶核酸分子杂交的核酸序列A’和(b)至少一个第一可切割部分，其中所述可激活的引发寡核苷酸仅在切割所述第一可切割部分时被激活，使得所述核酸序列A’的3’端在引物延伸反应中可延伸以形成所述靶核酸分子的互补核酸链；并且
(ii)所述可钝化的引发寡核苷酸包含第二引发区，所述第二引发区具有(a)可与所述靶核酸分子杂交的核酸序列A和(b)至少一个第二可切割部分，其中所述可钝化的引发寡核苷酸在切割所述第二可切割部分时被钝化，使得所述核酸序列A不与所述靶核酸分子形成稳定的复合体以促进基于所述靶核酸分子序列的引物延伸反应。
205.根据权利要求204所述的反应混合物，其中所述反应混合物进一步包含所述靶核酸分子。
206.根据权利要求204所述的反应混合物，其中所述可激活的引发寡核苷酸进一步包含核酸序列B’，该核酸序列B’位于所述可激活的引发寡核苷酸的所述引发区的3'侧并且与所述可激活的引发寡核苷酸的所述引发区显示出序列互补性。
207.根据权利要求204所述的反应混合物，其中所述可钝化的引发寡核苷酸进一步包含与所述可钝化的引发寡核苷酸的所述引发区相邻的核酸序列B，该核酸序列B与所述可钝化的引发寡核苷酸的所述引发区显示出序列互补性。
208.根据权利要求204所述的反应混合物，其中所述第一可切割部分和/或所述第二可切割部分为核糖。
209.根据权利要求204所述的反应混合物，其中所述第一可切割部分和/或第二可切割部分可被酶切割。
210.根据权利要求204所述的反应混合物，其中所述酶为内切核酸酶。
211.根据权利要求204所述的反应混合物，其中所述第一可切割部分和所述第二可切割部分可被相同的酶切割。
212.根据权利要求204所述的方法，其中所述可钝化的寡核苷酸在切割所述可激活的寡核苷酸的所述第一可切割部分时是可钝化的。
213.根据权利要求204所述的方法，其中所述可激活的寡核苷酸在切割所述可钝化的寡核苷酸的所述第二可切割部分时是可激活的。
214.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
提供包含靶核酸分子、可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的溶液；以及
进行连续的核酸扩增反应，其中所述连续的核酸扩增反应至少包括第一阶段以及随后的第二阶段，其中所述第一阶段包括使用所述可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分作为引物进行靶核酸分子的扩增，其中所述第二阶段包括使用所述可激活的引发寡核苷酸的至少一部分作为另一引物进行所述靶核酸分子或其区域的扩增，其中在所述第一阶段之后所述可激活的引发寡核苷酸被激活且所述可钝化的引发寡核苷酸被钝化，并且其中所述连续的扩增反应产生所述靶核酸分子的扩增产物。
215.根据权利要求214所述的方法，其中所述可激活的引发寡核苷酸和所述可钝化的引发寡核苷酸分别被具有内切核酸酶活性的酶激活和钝化。
216.根据权利要求215所述的方法，其中所述酶为热稳定的和/或可激活的。
217.根据权利要求216所述的方法，其中所述酶为核糖核酸酶。
218.根据权利要求217所述的方法，其中所述核糖核酸酶为核糖核酸酶HI、核糖核酸酶HII或核糖核酸酶HIII。
219.根据权利要求214所述的方法，其中所述连续的核酸扩增反应在单一反应混合物中发生。
220.根据权利要求214所述的方法，其中所述连续的核酸扩增反应在多于一种反应混合物中发生。
221.根据权利要求214所述的方法，其中所述溶液进一步包含至少一种反向引物。
222.根据权利要求214所述的方法，其中所述可激活的引发寡核苷酸包含引发区和核酸序列B’，所述引发区具有(i)可与所述靶核酸分子杂交的核酸序列A’，(ii)至少一个可切割部分，所述核酸序列B’位于所述引发区的3’侧并且显示出与所述引发区的序列互补性，其中所述核酸序列A’具有适合于仅在切割所述可切割部分时在引物延伸反应中延伸以形成所述靶核酸分子的互补核酸链的3’端。
223.根据权利要求214所述的方法，其中所述可钝化的引发寡核苷酸包含引发区和与所述引发区相邻的核酸序列B，所述引发区具有(i)可与所述靶核酸分子杂交的核酸序列A，(ii)至少一个可切割部分，所述核酸序列B显示出与所述引发区的序列互补性，其中所述核酸序列A具有适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述靶核酸分子的互补核酸链的3’端。
224.根据权利要求214所述的方法，其中所述可钝化的引发寡核苷酸在切割所述可激活的引发寡核苷酸的所述可切割部分时是可钝化的。
225.根据权利要求214所述的方法，其中所述可激活的引发寡核苷酸在切割所述可钝化的引发寡核苷酸的所述可切割部分时是可激活的。
226.根据权利要求214所述的方法，其进一步包括检测所述靶核酸分子的所述扩增产物。
227.根据权利要求226所述的方法，其中所述检测经由光学检测、静电检测或电化学检测来进行。
228.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
提供包含靶核酸分子、可激活的引发寡核苷酸和可钝化的引发寡核苷酸的反应混合物，其中每一个均可与所述靶核酸分子的不同区域杂交；
在所述反应混合物中，采用所述可激活的引发寡核苷酸的至少一部分或所述可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发所述靶核酸分子；以及
使用经所述可激活的引发寡核苷酸的至少一部分或所述可钝化的引发寡核苷酸的至少一部分选择性引发的所述靶核酸分子进行核酸扩增反应，以产生所述靶核酸分子的扩增产物。
229.根据权利要求228所述的方法，其中所述靶核酸分子在所述反应混合物中被选择性地引发而无需去除其内含物。
230.根据权利要求228所述的方法，其中所述采用所述可激活的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发所述靶核酸分子通过酶来实现，所述酶激活所述可激活的引发寡核苷酸以允许引物延伸反应产生所述扩增产物。
231.根据权利要求230所述的方法，其中所述酶具有内切核酸酶活性。
232.根据权利要求228所述的方法，其中所述采用所述可激活的引发寡核苷酸的至少一部分选择性地引发所述靶核酸分子通过酶来实现，所述酶钝化所述可钝化的引发寡核苷酸，使得其不与所述靶核酸分子形成稳定的复合体。
233.根据权利要求232所述的方法，其中所述酶具有内切核酸酶活性。
234.根据权利要求228所述的方法，其中所述采用所述可钝化的引发寡核苷酸选择性地引发所述靶核酸分子在不存在具有内切核酸酶活性的活性酶的情况下实现。
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