JP5225294B2 - 核酸増幅のための装置および方法 - Google Patents

Description

本発明は、核酸増幅のための、特に逐次的な核酸増幅を行うための方法および装置に関する。但し、本発明がこの特定の使用分野に限定されないことは理解される。

以下における先行技術の考察は、本発明を適切な技術状況に置くと共に、本発明の利点を更に十分に理解可能とすべく提供される。但し、本明細書を通しての先行技術の一切の考察は、斯かる先行技術が広く知られていることまたは当該分野における一般的な概略的知見の一部を構成することの明示的もしくは暗示的な是認であると考慮されるべきでないことを理解すべきである。

PCRは、サイクルが完了する毎に一定のポリヌクレオチド配列の指数的増幅に帰着するという複数回のサイクルを伴う技術である。PCRの技術は公知であると共に、非特許文献１、非特許文献２、および、非特許文献３などの多くの文献に記述されている。PCRはまた、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、および特許文献１１などの多くの米国特許にも記述されている。

PCR技術は典型的に、ポリヌクレオチドを変性させる段階を伴い、且つ、変性されたポリヌクレオチドに対して少なくとも一対のプライマ・オリゴヌクレオチドをアニーリングする段階、すなわち上記プライマを変性済みポリヌクレオチド・テンプレートに対してハイブリッド形成させる段階が追随する。上記アニーリング段階の後、ポリメラーゼ活性を有する酵素は、上記プライマ・オリゴヌクレオチドを取入れた新たなポリヌクレオチド鎖であって、元の変性済みポリヌクレオチドを合成テンプレートとして使用するという新たなポリヌクレオチド鎖の合成を触媒する。この一連の段階(変性、プライマ・アニーリングおよびプライマ伸長)は、ひとつのPCRサイクルを構成する。

各サイクルが反復されるにつれ、新たに合成されるポリヌクレオチドの量は指数的に増大する、と言うのも、先のサイクルから新たに合成されたポリヌクレオチドは、次続的なサイクルにおける合成のためのテンプレートの役割を果たし得るからである。プライマ・オリゴヌクレオチドは典型的に、２つのアニーリング部位間の領域が増幅される様に、与えられた二重鎖のポリヌクレオチド配列の夫々の鎖にアニーリングし得る複数の対で選択される。

DNAの変性は典型的には約90〜95℃にて行われ、変性済みDNAに対するプライマのアニーリングは典型的には約40〜60℃にて実施され、且つ、アニーリングされたプライマをポリメラーゼにより伸長させる段階は典型的に約70〜75℃にて実施される。故に、一回のPCRサイクルの間において反応混合物の温度は変化されねばならず、且つ、複数サイクルのPCR実験の間には多数回に亙り変化されねばならない。

PCR技術は、たとえば、DNA配列の解析、プローブの生成、核酸配列のクローン化、部位特異的な突然変異誘発、遺伝子変異の検出、ウィルス感染の診断、分子の“フィンガープリント化”、および、生物学的流体および他の供給源における汚染微生物の監視などの、多様な生物学的用途を有している。

米国特許第4,683,195号 米国特許第4,683,202号 米国特許第4,800,159号 米国特許第4,965,188号 米国特許第4,889,818号 米国特許第5,075,216号 米国特許第5,079,352号 米国特許第5,104,792号 米国特許第5,023,171号 米国特許第5,091,310号 米国特許第5,066,584号 米国特許第4,988,617号 国際公開公報WO2003/093407号 国際公開公報WO2003/102226号 国際特許出願第PCT/AU98/00277号 国際公開公報WO2003/102522号(国際特許出願第PCT/AU03/00673号)

"PCR：実用的手法"、エム・ジェー・マクファーソン等、IRLプレス("PCR: Practical Approach", M. J. McPherson, et al., IRL Press)(1991) "PCRプロトコル：方法および応用への手引き"、イニス等、アカデミック・プレス("PCR Protocols: Guide to Methods and Applications", Innis, et al., Academic Press)(1990) "PCR技術：DNA増幅のための原理および応用"、エイチ・エー・エルリッチ、ストックトン・プレス("PCR Technolgy: Principals and Applications for DNA Amplification", H. A. Erlich, Stockton Press)(1989)

PCRに加え、先行技術においては、特許文献１２に開示された如きリガーゼ連鎖反応などの他の試験管内増幅処置が公知であると共に、好適に使用されている。更に概略的には、核酸のハイブリッド形成および配列決定の如きバイオテクノロジ分野において知られた幾つかの重要な方法は、サンプル分子を含む溶液の温度を制御様式で変化させる段階に依存している。従来の技術は、異なる温度区域を通して循環される個別的なウエルもしくは管材の使用に依存している。但し、連続流方法も提案されている。しかしこれらのデバイスは、狭幅な内孔を通して流体を移動させるために高圧ポンプの使用を必要とするので、PCRを小型化および自動化するこれらのデバイスの有用性が制限される。それでもなお、これらの方法の実施の自動化および小型化は、特に、相当に多数のサンプルが同時に分析されるべきであるか、または、分析されるべき少量のサンプルが在るという条件下では、依然として当業界において望まれる目標である。更に、サンプルの取扱い操作を減ずることにより特にDNAサンプルの汚染の可能性を低減する一方、比較的に安価な実験室機器を使用し得るというデバイスおよび方法を提供することが好適であろう。

本発明の目的は、上述の先行技術の複数の不都合の内の少なくともひとつを克服もしくは解消し、または、有用な代替策を提供するに在る。

第１の側面によれば、
本発明は、逐次的な核酸増幅反応を行う装置であって、
該装置は、流体サンプルを受容して第1増幅反応を行い得るサンプル区画と、複数の反応区画とを含むプラットフォームを含み、上記プラットフォームは、上記流体サンプルを第2増幅反応を行う上記複数の反応区画へと実質的に均一に配分し得る装置を提供する。

第２の側面によれば、本発明は、
サンプル区画と複数の反応区画とを含むプラットフォームを配備する段階と、
上記サンプル区画に対して流体サンプルを装填し且つ第1増幅反応を行う段階と、
上記流体サンプルを第2増幅反応を行う上記複数の反応区画に対して実質的に均一に配分する段階とを含む、
逐次的な核酸増幅反応を行う方法を提供する。

第３の側面によれば、本発明は、
上記第１の側面に係る装置を配備する段階と、
上記サンプル区画に対して流体サンプルを装填し且つ第1増幅反応を行う段階と、
上記流体サンプルを第2増幅反応を行う上記複数の反応区画に対して実質的に均一に配分する段階とを含む、
逐次的な核酸増幅反応を行う方法を提供する。

一例において上記第1増幅反応は、複数のプライマ(多重プライマ対)を使用して、所定数の目標物を、競合が生じなかった箇所まで同時に増幅する。この第1増幅反応からの生成物は次に、(以下において更に論じられるように)選択的に希釈されると共に、第2増幅反応のために上記反応区画へと配分される。上記反応区画の各々は好適には、単一対のプライマを収容する。理解される様に、本発明に係る上記装置および方法は、上記第1増幅反応の生成物を選択的に希釈かつ配分するときに手動的な介在を低減することにより汚染の可能性を低減するという相当の利点を提供する。当業者であれば、本発明の装置および方法の使用に伴う他の多くの利点を理解し得よう。

好適には、上記プラットフォームは回転可能であり、且つ、遠心力の付与時に流体サンプルは上記サンプル区画から上記複数の反応区画内へと実質的に均一に配分される。但し、流体サンプルは他の手段により上記サンプル区画から上記複数の反応区画内へと実質的に均一に配分され得ることは理解される。好適には、上記複数の反応区画は上記サンプル区画の径方向外側に位置決めされる。好適には、上記複数の反応区画は、上記回転可能プラットフォームの周縁部にて一列に分布された２個以上の反応区画を含む。

一実施態様において上記流体サンプルは、複数の径方向外側反応区画と上記サンプル区画との中間に位置された計量マニフォルドを通しまたは該計量マニフォルドにより、上記各反応区画に対して実質的に均一に配分される。好適には、上記サンプル区画はチャネルにより上記計量マニフォルドと流体連通する一方、該計量マニフォルドは、複数の夫々のチャネルにより上記複数の径方向外側反応区画と流体連通する。“流体連通”および“流体接続”という語句は互換可能であり、且つ、各区画(またはマニフォルド)間の通路として解釈されるべきことは理解される。

上記径方向内側サンプル区画においては第1増幅反応が行われ得ると共に、次に上記複数の径方向外側反応区画に対して配分もしくは計量されたときに第2増幅反応が行われ得ることは理解される。更に、上記第2増幅反応の結果である流体サンプルは、選択的に、希釈され且つ第3増幅反応を行う一連の補助的反応区画へと計量されるか、または、更なる化学反応を受け得ることも理解される。

別実施態様において、上記反応区画の各々は、当該チャネルを通る流体流を選択的に許容するバルブの形態の選択的流動手段を有するチャネルにより上記計量マニフォルドに対して流体接続される。更なる実施態様において上記サンプル区画もまた、当該チャネルを通る流体流を選択的に許容する選択的流動手段を有するチャネルにより上記計量マニフォルドに対して流体接続される。

一実施態様において上記計量マニフォルドは、反応済み流体サンプルを希釈する希釈区画として同時に作用し得る。この実施態様において、上記計量マニフォルドは希釈流体を収容し得ると共に、該計量マニフォルドへと導入された流体サンプルは希釈されてから、上記複数の径方向外側反応区画に対して実質的に均一に計量され得る。但し代替実施態様においては、流体的に上記サンプル区画と上記計量マニフォルドとの中間に別体的な希釈区画が配備される。この実施態様において、上記径方向内側サンプル区画は希釈区画と流体連通する一方、該希釈区画は上記計量マニフォルドと流体連通し、該計量マニフォルドは上記一連の径方向外側反応区画と流体連通する。

更なる実施態様において本発明は、逐次的な核酸増幅を行う装置であって、該装置は、各々が複数の流体サンプルの内のひとつの流体サンプルを受容して第1増幅反応を行う複数の径方向内側サンプル区画を有する回転可能プラットフォームを含み、上記各サンプル区画は夫々の希釈区画と流体連通し、上記各希釈区画は複数の第2増幅反応を行う夫々の一連の径方向外側反応区画内へと上記各希釈済み流体サンプルを実質的に均一に配分する夫々の計量マニフォルドと流体連通し、上記各反応区画は当該チャネルを通る流体流を選択的に許容する選択的流動手段を有するチャネルにより夫々の計量マニフォルドに対して流体接続され、十分な遠心力が付与されると上記流体はひとつの区画から次の区画へと搬送されるという装置を提供する。

本発明はまた、先行実施態様に係る装置を配備する段階と、上記サンプル区画に流体サンプルを装填する段階と、第1増幅反応を行う段階と、上記希釈区画に希釈液体を充填する段階と、十分な遠心力を付与し、上記流体サンプルを該サンプルの希釈のために上記希釈区画へと搬送する段階と、十分な遠心力を付与し、上記希釈済み流体サンプルを上記計量マニフォルドへと搬送する段階と、上記選択的流動手段を起動する段階と、十分な遠心力を付与し、上記希釈済み流体サンプルを上記各反応区画に対して実質的に均一に配分する段階と、第2増幅反応を行う段階とを含む、核酸増幅を行う方法にも及んでいる。

好適実施態様において上記回転可能プラットフォームは、概略的に平面的で円形もしくは環状のディスクである。但し代替実施態様において、上記回転可能プラットフォームは、(以下において更に論じられるように)(それらの夫々の希釈／計量区画と共に)１個または２個のみのサンプル区画を好適に有する円形／環状のディスクのセクタもしくはセグメント(すなわち楔状部材)である。上記で論じられた如き環状プラットフォームもしくは楔形状プラットフォームは、流体を搬送する遠心力を提供すると共に、核酸増幅を行うべく種々の区画を選択的に加熱／冷却するという相補的な回転可能基部内に受容され得ることは理解される。代替的に、上記各区画およびチャネルはキット形態で別体的に提供されると共に、それらは相補的な保持受容器により回転可能基部内に着脱自在に捕捉的に保持され得る。

一実施態様においては、上記サンプル区画を上記希釈区画に対し、該希釈区画を上記計量マニフォルドに対し、且つ、該計量マニフォルドを上記複数の反応区画に対して流体接続する実質的に径方向に延在するチャネルが配備される。直列の複数のチャネルが上記サンプル区画、希釈区画および計量マニフォルドを流体接続する一方、並列の複数のチャネルが上記反応区画の各々を上記計量マニフォルドに対して流体接続する。但し、同様の効果に対し、各区画を流体接続する他の構成が可能であることは理解される。代替実施態様において、上記複数の反応区画は直列に流体接続され、すなわち、上記複数の反応区画の第1反応区画は該複数の反応区画の第2反応区画に流体接続される一方、該第2反応区画は上記複数の反応区画の第3反応区画に流体接続されるなどである。この実施態様においては、計量マニフォルドを配備する必要が無く、且つ、上記複数の反応区画の内の第1の反応区画が上記希釈区画に対して流体接続される。更に幾分か類似した代替実施態様において、上記複数の反応区画は、上記希釈区画に対して流体接続された主要チャネルに対して並列に流体接続される。これらの最後の２つの実施態様において、希釈済み流体サンプルは遠心操作下で上記複数の反応区画の内の最後の反応区画へと搬送されてから、先行する各反応区画を“埋め戻す”。

たとえば各図に示されたように、好適実施態様において上記プラットフォームは円形もしくは環状のディスクであり、その場合に上記サンプル区画、希釈区画、計量マニフォルド、各反応区画および各チャネルは、上記ディスクの表面に埋設される。但し、他の構成が可能であることは理解される。たとえば、上記各区画、マニフォルドおよびチャネルが上記ディスクの上側表面もしくは下側表面からそれほど突出しないように、該各区画、マニフォルドおよびチャネルは比較的に平面的とされて上記ディスク内に埋設され得る。

上記サンプル区画は好適には径方向内側位置に配設されると共に、上記複数の反応区画は好適には上記ディスクの周縁部の回りで実質的に均一に円周方向に離間され；上記希釈区画および計量マニフォルドは、それらの間に配設されている。この複数の区画の配置は概略的に、複数のセクタから成り得るディスクのひとつのセクタを画成する。たとえば上記ディスクは、合計で約72個の反応区画を有する約2〜20個のセクタを含み得る。但し上記ディスクは、18個という少なさの、および、144個という多さの反応区画を含み得る。一例において、3個のセクタおよび72個の反応区画を有するディスクに対しては、24回の遺伝子測定が行われ得る。別の例において、6個のセクタおよび72個の反応区画を有するディスクに対しては、12回の遺伝子測定が行われ得る。但し、当業者であれば理解し得るように、区画の個数は特定の用途／分析評価に適応すべく適合調整され得る。更に、当業者であれば、セクタの個数はディスクの物理的寸法に比例することを理解し得よう。故に、セクタの個数は、種々の区画の相対的サイズおよびディスクの物理的寸法の関数である。

上記で論じられたように、代替実施態様において上記プラットフォームは、円形ディスクのひとつのセクタ／セグメント(すなわち楔状部材)であって、サンプル区画、希釈区画、計量マニフォルドおよび反応区画が埋設されたひとつのセクタ／セグメント(すなわち楔状部材)のみから成り得る。このモジュール式配置構成は、たとえば１個または２個などの少ない個数のサンプルの増幅のみを必要とする用途に対して有用であることから、多くのセクタを有するディスク全体の使用が回避される。但し更なる実施態様においては(以下において更に論じられるように)、上記サンプル区画、希釈区画、計量マニフォルド、反応区画、および、相互接続するチャネルは、それらが適切なロータ機器における受容器内へと装着もしくは掛止され得るように、別体的に配備される。

上記サンプル区画の容積は、約5μL〜約20μLであり、且つ、上記希釈区画は約100μL〜約500μLである。上記計量マニフォルドの総体積は好適には約1,200μLであり、且つ、上記計量マニフォルドの径方向外側壁部上に配設されて軸心方向に延在する複数の計量“漏斗”の組み合わせ体積は合計で約100μL〜約600μLである。上記反応区画の各々は、約20μL〜約250μLの容積を有する。上記各反応区画の合計の組み合わせ体積は、上記サンプル区画の体積と上記希釈区画の体積との和より大きいことは理解される。更に、上記計量マニフォルドの径方向外側壁部上に配設されて軸心方向に延在する計量“漏斗”の組み合わせ体積は先行するサンプル区画及び希釈区画の総体積よりも大きいことで、流体サンプルは各反応区画に対して実質的に均一に配分されることが確実とされることは理解される。

好適実施態様において、上記サンプル区画および上記各反応区画は、実質的に軸心方向に延在して実質的に円筒形状とされたウエルとして形成される。但し、上記希釈区画および上記計量マニフォルドは好適には、(軸心方向で見たときに)実質的に弧状の谷部として形成される。付加的に、加速下での遠心操作の間に上記流体サンプルは(回転方向に依存して)上記希釈区画の一端へと移動する傾向があることから、上記希釈区画と計量マニフォルドとを流体接続する上記チャネルは好適には、実質的に中央に配設されるのではなく、これらの区画の共通端部に配設される。この構成によれば好適に、回転方向に依存して、これらの区画間の選択的な流れが許容される。更に、上記サンプル区画および／または計量マニフォルドは、遠心力が付与されたときに、次続的な区画に至るチャネルへと流体が排出される傾向であるように、傾斜された壁部を有し得る。

上記計量マニフォルドから上記複数の反応区画に対する流体流を選択的に許容する選択的流動手段が配備される。上記選択的流動手段は好適には、約95℃の所定溶融温度を有するワックス・バルブである。故に、上記ワックス・バルブを囲繞する領域における局所的温度を上記所定溶融温度まで上昇させると、ワックスが溶融して上記チャネルが開かれることで、それを通した流体流が許容される。他の実施態様において上記犠牲的バルブは、(上記サンプル／希釈区画、および、上記希釈区画／計量マニフォルドを接続する)他のチャネル内にも取入れられ得る。好適には、上記ワックスを溶融させると流体サンプル上には表面シールが提供される、と言うのも、上記ワックスは典型的には流体サンプルよりも低密度だからである。

ワックス・バルブが採用される実施態様において、PCR反応を行うべく上記装置全体が加熱されるなら、該ワックス・バルブの完全性は影響され得る。故に、たとえば特許文献１３および特許文献１４に開示された如きマイクロ波もしくは赤外線による加熱により、各サンプル区画に対する局所的な熱の供与が必要とされ得る。

上述のように、最初の流体サンプルは連続的に上記サンプル区画から上記希釈区画へ、次に上記計量マニフォルドへ、且つ、最終的には上記各反応区画へと搬送される。上記流体を区画から区画へと搬送する好適な駆動力は、たとえばコーベット・リサーチ社(Corbett Research)により販売されているRotor-Gene(登録商標)機器による上記プラットフォームの回転による遠心力の付与である（特許文献１５を参照）。上記プラットフォームは、最初は上記サンプル区画から上記希釈区画へと流体サンプルを移動させるために“低”速で回転され得ると共に、次に、上記希釈区画から上記計量マニフォルドへと希釈済み流体サンプルを移動させるべく“高”速で回転され得る。上記“低”速は約200〜約750rpmであり、且つ、上記“高”速は約800rpm超である。但し当業者であれば、同様の効果に対して他の回転速度が採用され得ることは理解される。たとえば上記低速は、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、もしくは750rpm、または、約200〜約220、220〜約240、240〜約260、260〜約280、280〜約300、300〜約320、320〜約340、340〜約360、360〜約380、380〜約400、400〜約420、420〜約440、440〜約460、460〜約480、480〜約500、500〜約520、520〜約540、540〜約560、560〜約580、580〜約600、600〜約620、620〜約640、640〜約660、660〜約680、680〜約700、700〜約720、720〜約740、もしくは約740〜約750rpmの範囲とされ得る。上記高速は、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、もしくは1200rpm、または、約800〜約820、820〜約840、840〜約860、860〜約880、880〜約900、900〜約920、920〜約940、940〜約960、960〜約980、980〜約1000、1000〜約1020、1020〜約1040、1040〜約1060、1060〜約1080、1080〜約1100、1100〜約1120、1120〜約1140、1140〜約1160、1160〜約1180、もしくは1180〜約1200rpmの範囲とされ得る。

上記回転可能プラットフォームは好適には、好適に射出成形されたポリプロピレンもしくはポリエチレンの如き熱安定的な熱可塑性材料から形成される。但し、本発明の上記装置は、たとえばガラス、または、業界公知の他の適切な材料から作製され得ることは理解される。好適には上記熱可塑性材料は所定波長にて透明であることにより、所定区画において行われている反応を光源／検出器機構が監視することが許容され得る。更に、上記各区画、マニフォルドおよび各チャネルはカバーシートに対してシール係合する隆起上縁部を含み得、該カバーシートは好適には、該シートが各上縁部に対して融着されたときに当該一対の開孔が、サンプルの装填のために上記サンプル区画に対するアクセスおよび希釈流体の充填のために上記希釈区画に対するアクセスを提供するように、一対の開孔を有する透明で熱的に融着可能なプラスチック・シートである。上記各反応区画は、増幅用試薬が事前装填されると共に、上記カバーシートによりシールされ得る(と言うのも、各反応区画に至るチャネルは上記選択的流動手段により閉じられるからである)。

好適には上記各開孔は、たとえば、1.5mmの先端直径を有する標準的な200μLプラスチック・ピペット先端などのマイクロ分注器；1mmの直径のマイクロピペット先端；圧電式もしくはセラミック式の落下供与システム；および、インクジェット式の流体供与システム；の如き自動装填デバイスに適合した寸法を有する。

代替的構成において、上記希釈区画および計量マニフォルドは組み合わせて単一の希釈／計量マニフォルドとされ得る。説明すると、最初に流体サンプルがサンプル区画へと装填されると共に、第1増幅反応が行われる。上記希釈／計量マニフォルド内へと希釈流体が充填されると共に、十分な遠心力が付与されて上記流体サンプルは希釈のために上記希釈／計量マニフォルドへと搬送される。次に上記選択的流動手段が起動されて希釈済み流体サンプルは遠心力を介し、複数の第2増幅反応を行う複数の反応区画へと搬送され得る。当業者であれば理解される様に、上記希釈／計量マニフォルド内の流体を混合するために、上記装置に対しては往復的な“攪拌”動作が付与され得る。代替的に、上記装置は混合を行うべく振動され得る。

上記サンプル区画および反応区画は夫々、第1および第2増幅反応を行うべく、熱交換器と熱的に連通し得る。一実施態様においては、本発明の上記装置を受容すべく先在するRotor-Gene(登録商標)熱サイクル機器が改変され得る。この実施態様において、区画から区画へと流体を搬送するために必要とされる回転は、コンピュータ制御される。たとえば、第４の側面によれば本発明は、上記第１の側面に係る装置を受容し得る基部と、所定シーケンスに従い上記装置を回転させ、上記流体サンプルをひとつの区画から次の区画へと選択的に搬送する回転手段と、上記反応区画およびサンプル区画と温度連通し、上記第1および第2の増幅反応を夫々行うための熱的変化特性シーケンスを提供する温度制御要素と、上記各シーケンスを記憶かつ制御するプログラム可能コントローラとを含む、核酸増幅を行うデバイスを提供する。

本発明に対し、他の機器が適合され得ることは理解される。たとえば、本明細書中に記述された如き装置を受容すべく市販のもしくは先在する機器が適合され得る。この機器は上記装置の回転を提供し得ると共に、核酸増幅を行う適切な熱交換器が事後設置され得る。代替的に、上記機器は核酸増幅を行うべく既に適合されると共に、本明細書中に記述されたように上記装置の回転を提供すべく改造され得る。

たとえば、Rotor-Gene(登録商標)機器は核酸増幅のためにサンプルの熱サイクル操作に適合した回転可能基部を含む一方、サンプルの熱サイクル操作の他の手段が予期される。たとえば、特許文献１６に開示された温度検知手段などと組み合わせて、赤外線ヒータが使用され得る。

第５の側面によれば本発明は、第１の側面に係る装置と、上記第2増幅反応を行うために必要な試薬であって上記反応区画内に収容された試薬とを含む、逐次的な核酸増幅を行うためのキットを提供する。代替的にもしくは付加的に、希釈区画を有する本発明の上記装置の実施態様において、上記希釈区画は、上記第1増幅反応の生成物を希釈するために必要な試薬を収容する。

第６の側面によれば、好適に上記第1増幅反応は多重PCR反応から成り、且つ、上記第2増幅反応はネスト式もしくは半ネスト式のPCR反応を含む。

他の実施態様において上記プラットフォームは、該プラットフォームの表面上に位置され得る反射的もしくは吸収的なストライプであって、該プラットフォームが旋回されるときに発光体／フォトダイオード対により検知されることで、上記機器に関する該プラットフォームの配向の決定を許容するというストライプとされ得る“ホームフラグ”を含む。代替的に、上記ホームフラグはタグである。

一実施態様において上記複数の反応区画は上記計量マニフォルドから並列に接続されるが、他の実施態様において上記複数の反応区画は上記計量マニフォルドから直列に接続される。

別様に状況が明確に要求するのでなければ、本記述および請求項の全体に亙り、“を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”、“を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”などの語句は、排他的もしくは網羅的ではなく包含的な意味、すなわち、“限定的なものとしてで無く、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）”という意味に解釈されるものとする。

定義：
本発明を記述かつ権利請求する上で、以下の用語は下記に示される定義に従い使用される。また本明細書中で使用される用語は、本発明の特定実施態様を記述することのみを目的としており、限定を意図しないことも理解すべきである。別様に定義されなければ、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が関連する分野の当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。

本発明の目的に対して“サンプル”という語句は、更に複雑な混合物の成分として分離もしくは検出されるか、または、前駆種から合成された一切の流体、溶液もしくは混合物を包含すると理解される。特に、“流体サンプル”という語句は、問題となる任意の生物学的種を包含すると理解される。また“生物学的サンプル”もしくは“生物学的流体サンプル”という語句は、限定的なものとしてで無く、血液、血漿、血清、リンパ液、唾液、涙液、脳脊髄液、尿、汗、植物および野菜の抽出物、精液、および、腹水液などの任意の生物由来サンプルを意味すると理解される。“流体サンプル”および“反応混合物”という語句が同義語であることは理解される。

本発明の目的に対し、“選択的流動手段”という語句は、流体流路から選択的に除去され得る代替可能な材料で好適に作成されたバルブを意味すると理解される。好適実施態様において上記選択的流動手段は、赤外線照射などの種々の加熱手段の内の任意の手段を使用して加熱することにより、且つ、最も好適には加熱要素の起動により流体流路から除去されるワックス・バルブである。本発明に適したひとつの典型的なワックスは、パラフィン・ワックスである。好適なワックスは、生物学的汚染物質が無く、且つ、サンプルより低い密度を有している。

本発明の目的に対し“流体連通している”または“流体接続された”という語句は、互換的に使用されると共に、当該区画／マニフォルド間の流体流を許容すべく作用可能に相互接続された区画／マニフォルドを定義することが意図される。

本明細書における目的に対して“遠心力”とは、回転体を回転中心から離間して引っ張る見かけの力である。遠心力は、求心力と等しく且つ逆向きである。

“直列な複数のチャネル”という語句は順序付けされた複数のチャネルの直線状配置を指すことが意図され、且つ、“並列な複数のチャネル”という語句は複数の直線状配置とされた複数のチャネルの配列を指すことが意図される。

次に、添付図面を参照して本発明の好適実施態様が例示的にのみ記述される。

【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】回転可能プラットフォームが８個のサンプル区画(および、各区画の夫々の希釈／計量区画)を有する環状ディスクであるという本発明の一実施態様に係る装置の平面図である。
【図１ｂ】回転可能プラットフォームが単一のサンプル区画のみを(対応する希釈／計量区画と共に)有する環状ディスクのセグメントのみであるという本発明の別実施態様に係る装置の平面図である。
【図２】図１に示された装置の下面図である。
【図３】図１に示された装置のひとつのセクタの拡大平面図である。
【図４】図３に示された拡大セクタの斜視図である。
【図５】図４に示されたデバイスの斜視下面図である。

次に、全体に亙り同様の参照番号は同様の部材を指すという図面が参照される。各図を参照すると本発明は、逐次的な核酸増幅を行う装置1であって、概略的に平面的で円形もしくは環状のディスク3の形態の回転可能プラットフォーム2を含むという装置1を提供する。図１ｂに最適に示されるように、一実施態様において、回転可能プラットフォーム2は円形／環状ディスクのひとつのセクタもしくはセグメント、すなわち楔状部材4である。図１ａに示された上記実施態様において回転可能プラットフォーム2は、第1回目の多重増幅反応を行う複数の流体サンプル／反応混合物を受容する複数の径方向内側サンプル区画5を含んでいる。サンプル区画5の各々はチャネル7により夫々の希釈区画6に対して流体接続される一方、該希釈区画は、第2回目のネスト式もしくは半ネスト式の複数の増幅反応を行う夫々の一連の径方向外側反応区画10内へと希釈済みの各流体サンプルを実質的に均一に配分する夫々の計量マニフォルド8に対し、チャネル9により流体接続される。反応区画10の各々は、当該チャネル11を通る流体流を選択的に許容する(不図示の)選択的流動手段を有するというチャネル11により、夫々の計量マニフォルド8に対して流体接続される。

実質的に径方向に延在するチャネル7、9および11は夫々、サンプル区画5を希釈区画6に対し、希釈区画6を計量マニフォルド8に対し、且つ、計量マニフォルド8を反応区画10に対して流体接続するために配備される。チャネル7、9はサンプル区画5、希釈区画6および計量マニフォルド8を直列に流体接続する一方、チャネル11は反応区画10の各々を計量マニフォルド8に対して並列に流体接続する。但し、同様の効果に対し、上記各区画を流体接続する他の構成が可能であることは理解される。

サンプル区画5は好適には径方向内側位置に配設されると共に、複数の反応区画10は好適にはディスク3の周縁部の回りで実質的に均一に円周方向に離間され；希釈区画6および計量マニフォルド8は、それらの間に配設されている。この複数の区画の配置は概略的に、ディスク3のひとつのセクタを画成する。ディスク3は複数のセクタを含み得る。たとえば上記ディスクは、合計で約72個の反応区画10を有する約2〜20個のセクタを含み得る。但し上記ディスクは、18個という少なさの、および、144個という多さの反応区画10を含み得る。当業者であれば理解し得るように、区画の個数は特定の用途／分析評価に適応すべく適合調整され得る。

サンプル区画5の容積は約5μL〜約20μLであり、且つ、希釈区画6は約100μL〜約500μLである。計量マニフォルド8の総体積は好適には約1,200μLであり、且つ、計量マニフォルド8の径方向外側壁部上に配設されて軸心方向に延在する“漏斗”12の組み合わせ体積は合計で約100μL〜約600μLである。反応区画10の各々は、約20μL〜約250μLの容積を有する。サンプル区画5および反応区画10は、実質的に軸心方向に延在する円筒状のウエルとして形成される。但し希釈区画6および計量マニフォルド8は好適には、(軸心方向で見たときに)実質的に弧状の谷部として形成される。

最初の流体サンプルは、サンプル区画5から希釈区画6に対し、次に計量マニフォルド8に対し、最後に反応区画10に対し、連続的に搬送され得る。区画から区画へと流体を搬送する駆動力は、プラットフォーム2の回転による遠心力の付与である。上記プラットフォームは、最初はサンプル区画5から希釈区画6へと流体サンプルを移動させるために“低”速で回転され得ると共に、次に、希釈区画6から計量マニフォルド8へと希釈済み流体サンプルを移動させるべく“高”速で回転され得る。上記“低”速は約200〜約600rpm、且つ、上記“高”速は約1,000rpm超とされ得る。但し当業者であれば、同様の効果に対して他の回転速度が採用され得ることを理解し得よう。付加的に、加速下での遠心操作の間に上記流体サンプルは(回転方向に依存して)希釈区画6の一端へと移動する傾向があることから、希釈区画6と計量マニフォルド8とを流体接続するチャネル7は好適には、実質的に中央に配設されるのではなく、これらの区画の共通端部に配設される。この構成によれば好適に、回転方向に依存して、これらの区画間の選択的な流動が許容される。

計量マニフォルド8から複数の反応区画10に対する流体流を選択的に許容すべく、(不図示の)選択的流動手段が配備される。該選択的流動手段は好適には、約95℃の所定溶融温度を有するワックス・バルブである。故に、上記ワックス・バルブを囲繞する領域における局所的温度を上記所定溶融温度まで上昇させると、ワックスが溶融して上記チャネルが開かれることで、それを通した流体流が許容される。好適には、上記ワックスを溶融させると流体サンプルの頂部上には表面シールが提供される、と言うのも、上記ワックスは典型的には流体サンプルよりも低密度だからである。

本発明はまた、上述のように装置1を配備する段階と、サンプル区画5に流体サンプルを装填する段階と、希釈区画6に希釈液体を充填する段階と、次に第1回目の多重増幅反応を行う段階とを含みた、核酸増幅を行う方法も提供する。次に十分な遠心力が付与され、業界公知の緩衝液、添加剤などを含むが第2回目のプライマは含まないという第2回目の反応成分などにより上記流体サンプルを希釈する希釈区画6へと該サンプルは搬送される。次に付加的な遠心力が付与され、希釈済み流体サンプルは計量マニフォルド8へと搬送される。次に上記選択的流動手段が起動され、且つ、更なる遠心力が付与されることで、希釈済み流体サンプルは反応区画10へと配分される。次に、同時的な第2回目のネスト式もしくは半ネスト式の複数の増幅反応が行われる。

上記で論じられた如き環状プラットフォーム2もしくは楔形状プラットフォーム4は、たとえば、コーベット・リサーチ社により販売されているRotor-Gene(登録商標)機器により、流体を搬送する遠心力を提供すると共に、核酸増幅を行うべく種々の区画を選択的に加熱／冷却するという(不図示の)相補的な回転可能基部内に受容され得ることは理解される(特許文献１５を参照)。代替的に、サンプル区画5、希釈区画6、計量マニフォルド8、反応区画10、および、相互接続するチャネル7、9および11は、それらが適切なロータ機器における受容器内へと装着もしくは掛止され得るように、別体的に配備される。

上記Rotor-Gene(登録商標)機器は、装置1を受容し得る基部と、所定のシーケンスに従い装置1を回転させることでひとつの区画から次の区画へと流体を選択的に搬送する回転手段と、サンプル区画5および反応区画10と熱的に連通することで、第1回目の複数のおよび次続的な第2回目のネスト式もしくは半ネスト式の増幅反応を夫々行う熱的変化特性シーケンスを提供する温度制御要素と、上記各シーケンスを記憶かつ制御するプログラム可能コントローラとを含み得る。但し、本発明に対しては他の機器が適合され得ることは理解される。

回転可能プラットフォーム2は好適には、好適に射出成形されたポリプロピレンもしくはポリエチレンの如き熱安定的な熱可塑性材料から形成される。好適には上記熱可塑性材料は所定波長にて透明であることにより、区画5もしくは10において行われている反応を光源／検出器機構が監視することが許容され得る。

次に本発明は、全ての側面において例示的で非限定的と見做されるべき以下の実施例に関して記述される。

一例において、サンプル区画5にては多重プライマ対が凍結乾燥される。個々の第2回目の増幅プライマ対もまた、反応区画10の各々内へと凍結乾燥される。プライマ対を有する各反応区画10は、サンプル区画5において使用されたプライマ対の内側にネストもしくは半ネストされることで、MT-PCR反応を構成する。プライマの凍結乾燥の後、装置1は(不図示の)プラスチック・シートによりシールされ、上記反応を開始する成分を付加すべくサンプル区画５の上方と、単一種類もしくは複数種類の希釈液の導入を許容すべく希釈区画6の上方とにおいて、開孔を残置する。

サンプル区画5内には、油表面層と共に核酸サンプルおよびマスタ混合物が導入される。希釈区画6内には第2回目のマスタ混合物(MMX2)が導入され、且つ、装置1は改変されたRotor-Gene(登録商標)機器の内側に載置される。このRotor-Gene(登録商標)機器は、各反応区画5の基部と接触する円周方向ヒータを有している。上記円周方向ヒータの各セクタは、電気抵抗ヒータおよび／またはペルチェ素子を用いて異なる温度に維持され得る。

上記円周方向ヒータはまた、介在蛍光染料またはUV吸収を使用して反応の進展を監視することにより生成DNAの量を測定する光源および検出器も含み得る。これは、多重PCR反応の間における目標物の過剰な増幅を阻止すべく使用され得る。

装置1は、ステッパ・モータを用いて(毎分１回転などの)低速にて回転される。これにより、反応区画5内の流体は異なる温度区域を通して移動されることで、多重化された内側プライマのPCR増幅が達成される。必要とされるサイクル回数の後、装置1は中間速度にて回転されることで、反応区画5の内容物を希釈区画6へと移動する。ワックス・シールは必要でない、と言うのも、サンプル区画5から希釈区画6へと流体を付勢するためには小さな遠心力が必要だからである。好適には、比較的に小さな力、すなわち200〜600rpmでサンプルが希釈区画6内へと流動することを確実とすべく、反応区画5は傾斜壁部を有する。希釈された反応流体を完全に混合すべく交互的な時計方向および反時計方向の回転が使用され得るか、または、ステッパ・モータが振動され得る。

装置1を高速(すなわち1,000rpm超)で回転すると、希釈済み反応流体は計量マニフォルド8内へと搬送される。計量マニフォルド8を反応区画10に対して流体接続している上記各チャネル11をワックスが中断しているので、希釈済み反応流体は反応区画10に進入し得ないことを銘記されたい。希釈区画6と反応区画10との間におけるチャネル11を95℃まで加熱すると上記ワックスは溶融し、且つ、この温度にて装置1を高速で回転すると反応流体は反応区画10内へと搬送される。此処で、希釈されたマスタ混合物は、反応区画10の各々内へと凍結乾燥された個々のプライマ対と接触することから、凍結乾燥されたプライマは第2回目のPCR反応混合物内へと溶解し得ると共に、第2のネスト式もしくは半ネスト式のPCR反応が進展し得る。この反応は、介在色素、蛍光プローブを用いて、または、高解像度の溶融物分析を用いてリアルタイムで監視され得る。

装置1の上記設計態様は、希釈区画6内に収容されたMMX2は低RPM(200〜600rpm)では計量マニフォルド8に進入しないことを前提とすることは理解される。同様に、上記ワックスは、物理的障壁を形成することにより高い信頼性で分量決定を確実とすると共に、第2回目のPCRの間における蒸発を排除する様にも作用することは理解される。更に上記ワックスは、反応区画10における反応体積の頂部上に着座する。

別の例においてRotor-Gene(登録商標)機器は、当該環状加熱要素が各反応区画の下方に配設されるように環状加熱要素を含むように改変された。上記環状加熱要素は、電気ヒータが埋設されたアルミニウムから形成された。加熱するためには上記環状加熱要素に対して電流が付与され、且つ、冷却するためには、RG冷却システムが採用され、すなわち、上記環状加熱要素の下方に配設された熱シンク・フィンを通して空気を通過させるために冷却用送風機が使用された。装置1はたとえば毎分１回転などの低いrpmにて旋回されることで、各サンプル区画5が同時的に局所的に加熱されると共に、第1回目のPCR富化が完了される。

第1回目のPCR富化が一旦完了したなら、上記環状加熱要素は降下離間されることから、ヒータ表面はRGチャンバの底部に対して面一に移動されてから、上記RGは通常的に機能する。

装置1は時計方向の加速を以て旋回されることで、流体サンプルは希釈区画6へと搬送された。装置1は次に揺動されると共に、加速(反時計方向の加速)を以て再び旋回されることで、希釈済み流体サンプルは計量マニフォルド8へと搬送された。希釈済み流体サンプルが分量決定漏斗の各々において一旦均等化したなら、Rotor-Gene(登録商標)機器が使用されることで、(空気加熱および冷却の通常的な対流プロセスを用いて)装置1が加熱されて上記ワックスが溶融されると共に、該装置1は旋回されることで流体サンプルは各反応区画10へと搬送された。次にRotor-Gene(登録商標)機器が使用されることで、第2回目のネスト式もしくは半ネスト式のPCRが行われた。

本発明は特定例に関して記述されてきたが、当業者であれば、本発明は多くの他の形態で具現され得ることは理解される。

1 装置
2 回転可能プラットフォーム／環状プラットフォーム
3 概略的に平面的で円形もしくは環状のディスク
4 楔状部材／楔形状プラットフォーム
5 径方向内側サンプル区画
6 希釈区画
7 チャネル
8 計量マニフォルド
9 チャネル
10 径方向外側反応区画
11 チャネル
12 漏斗

Claims (33)

1. 逐次的な核酸増幅反応に用いるための装置であって、
   該装置は、
   流体サンプルを受容して第１増幅反応を行い得るサンプル区画と、
   上記流体サンプルの第２増幅反応を行い得る複数の反応区画と、
   上記サンプル区画において反応させた流体サンプルを希釈するための希釈区画と、
   上記希釈区画において希釈された流体サンプルを上記反応区画のそれぞれに実質的に均一に配分するための計量マニフォルドと、
   前記サンプル区画および前記希釈区画および前記計量マニフォルドの間における流体接続を提供すべく実質的に径方向に延在するチャネルと
   を含むプラットフォームを含み、
   上記プラットフォームは、前記流体サンプルが前記チャンネルを通過して流れるのに十分な遠心力を生成すべく回転可能である円形又は環状のディスクであり、
   上記サンプル区画、上記希釈区画、上記計量マニフォルド、及び上記反応区画は、この順にそれぞれ、上記プラットフォームの中心から外周方向に向けて該プラットフォームに設けられており、
   前記サンプル区画は上記希釈区画に対して流体接続され、上記希釈区画は上記計量マニフォルドに対して流体接続され、且つ、上記計量マニフォルドは前記複数の反応区画に対して流体接続されており、かつ
   前記各チャネルは、ひとつの区画／マニフォルドから次の区画／マニフォルドに対して前記流体を搬送するために更に大きな１分当たりの回転数が必要とされるように、内側区画から外側区画にかけて次第に小さくなる直径を有する、
   上記装置。
2. 前記サンプル区画、希釈区画および計量マニフォルドは直列に流体接続され、且つ、
   前記各反応区画は上記計量マニフォルドに対して並列に流体接続される、請求項１に記載の装置。
3. 前記サンプル区画、希釈区画、計量マニフォルドおよび反応区画は、上記円形もしくは環状のディスクの表面内に埋設されている、請求項１または２に記載の装置。
4. 前記複数の反応区画は前記ディスクの周縁部の回りに円周方向に離間される、請求項１から３の何れか１項に記載の装置。
5. 前記サンプル区画、希釈区画、計量マニフォルドおよび反応区画は前記ディスクのひとつのセクタを画成する、請求項１から４の何れか１項に記載の装置。
6. 前記ディスクは複数のセクタを含む、請求項５に記載の装置。
7. ３個〜１２個のセクタを含む、請求項６に記載の装置。
8. ひとつのセクタ毎に２個〜１２個の反応区画を含む、請求項６または７に記載の装置。
9. 前記サンプル区画の容積は5μL〜20μLであり、前記希釈区画の容積は100μL〜500μLであり、前記計量区画の容積は100μL〜1,200μLであり、且つ、前記反応区画の各々の容積は20μL〜250μLである、請求項１から８の何れか１項に記載の装置。
10. 前記１分当たりの回転数は200〜1,000rpmの間である、請求項１から９の何れか１項に記載の装置。
11. 前記各反応区画を前記計量マニフォルドに流体接続している前記チャネルは、該チャネルを通る流体流を選択的に許容し、かつ所定溶融温度を有するワックス・バルブを含む、請求項１から１０の何れか１項に記載の装置。
12. 前記ワックス・バルブの回りにおける局所的温度を前記所定溶融温度より高く上昇させると、前記チャネルは開かれることで該チャネルを通る流体流が許容される、請求項１１に記載の装置。
13. 前記所定溶融温度は95℃である、請求項１２に記載の装置。
14. 前記サンプル区画および前記反応区画は、上記プラットフォームの厚さ方向において実質的に円筒形状に形作られたウエルとしてそれぞれ形成され、且つ、前記希釈区画および前記計量マニフォルドは、上記プラットフォームの中心に対して同心円上に設けられた実質的に弧状の谷部として、それぞれ形成されている、請求項１から１３の何れか１項に記載の装置。
15. 前記希釈区画を前記計量マニフォルドに流体接続している前記チャネルは、前記各弧状谷部の共通端部に配設され、加速下における当該装置の回転方向に依存して、上記希釈区画から上記計量マニフォルドへの流体の選択的移動を許容する、請求項１４に記載の装置。
16. 前記ディスクは射出成形された熱可塑性材料から形成される、請求項１から１５の何れか１項に記載の装置。
17. 前記ディスクのひとつのセクタは、射出成形された熱可塑性材料から形成される、請求項５から１６の何れか１項に記載の装置。
18. 前記熱可塑性材料は所定波長にて透明であることにより、ひとつの区画において行われている反応を光源／検出器機構が監視することを許容する、請求項１６または１７に記載の装置。
19. 前記各区画または前記マニフォルドは、カバーシートに対してシール係合する隆起上側唇部を含む、請求項１から１８の何れか１項に記載の装置。
20. 前記カバーシートはプラスチックであり且つ前記シールは溶着物である、請求項１９に記載の装置。
21. 前記カバーシートは、希釈流体を加えるために前記希釈区画の上方に位置された開孔を含む、請求項１９または２０に記載の装置。
22. 前記流体サンプルは、核酸増幅を行うための試薬を含む反応混合物である、請求項１から２１の何れか１項に記載の装置。
23. 前記各ウエルは、前記ディスクの回転により遠心力が付与されたときに前記流体が前記チャネルへと排出されて次続的な区画／マニフォルドに至る傾向であるように傾斜された壁部を含む、請求項１４から２２の何れか１項に記載の装置。
24. 前記サンプル区画および反応区画は夫々、前記第1および第2の増幅反応を行うべく熱交換器と熱的に連通し得る、請求項１から２３の何れか１項に記載の装置。
25. 前記第1増幅反応は多重PCR反応から成り、且つ、前記第2増幅反応はネスト式もしくは半ネスト式のPCR反応を含む、請求項１から２４の何れか１項に記載の装置。
26. 上記サンプル区画、上記希釈区画、及び上記計量マニフォルドは、それぞれ、複数個存在し、
    上記複数の反応区画は、複数の配列を構成し、かつ該複数の配列群のそれぞれには複数の反応区画が存在し、
    上記サンプル区画のそれぞれは上記希釈区画のそれぞれに対して流体接続されており、
    上記希釈区画のそれぞれは、上記計量マニフォルドのそれぞれに対して流体接続されており、
    上記反応区画のそれぞれは、チャネルにより、夫々の計量マニフォルドに対して流体接続されており、かつ上記チャネルは該チャネルを通る流体流を選択的に許容し、かつ所定溶融温度を有するワックス・バルブを有する、
    請求項１から２５の何れか１項に記載の装置。
27. 上記プラットフォームに十分な遠心力が付与されると、前記流体は、区画から区画へ、または、区画からマニフォルドへ、または、マニフォルドから区画へと選択的に搬送される、請求項２６に記載の装置。
28. 請求項１１から２７の何れか１項に記載の装置を配備する段階と、
    前記サンプル区画に流体サンプルを装填する段階と、
    第１増幅反応を行う段階と、
    前記希釈区画に希釈液体を充填する段階と、
    上記プラットフォームに十分な遠心力を付与して、上記流体サンプルを該サンプルの希釈のために上記希釈区画へと搬送する段階と、
    上記プラットフォームに十分な遠心力を付与して、前記希釈済み流体サンプルを前記計量マニフォルドへと搬送する段階と、
    前記ワックス・バルブを起動する段階と、
    上記プラットフォームに十分な遠心力を付与して、上記希釈済み流体サンプルを前記各反応区画に対して実質的に均一に配分する段階と、
    第2増幅反応を行う段階とを含む、
    核酸増幅を行う方法。
29. 流体サンプルを受容して第１増幅反応を行い得るサンプル区画と、
    上記流体サンプルの第２増幅反応を行い得る複数の反応区画と、
    上記サンプル区画において反応させた流体サンプルを希釈するための希釈区画と、
    上記希釈区画において希釈された流体サンプルを上記反応区画のそれぞれに実質的に均一に配分するための計量マニフォルドと、
    前記サンプル区画および前記希釈区画および前記計量マニフォルドの間における流体接続を提供すべく実質的に径方向に延在するチャネルと
    を含むプラットフォームであって、
    上記プラットフォームは、前記流体サンプルが前記チャンネルを通過して流れるのに十分な遠心力を生成すべく回転可能である円形又は環状のディスクであり、
    上記サンプル区画、上記希釈区画、上記計量マニフォルド、及び上記反応区画は、この順にそれぞれ、上記プラットフォームの中心から外周方向に向けて該プラットフォームに設けられており、
    前記サンプル区画は上記希釈区画に対して流体接続され、上記希釈区画は上記計量マニフォルドに対して流体接続され、且つ、上記計量マニフォルドは前記複数の反応区画に対して流体接続されており、かつ
    前記各チャネルは、ひとつの区画／マニフォルドから次の区画／マニフォルドに対して前記流体を搬送するために更に大きな１分当たりの回転数が必要とされるように、内側区画から外側区画にかけて次第に小さくなる直径を有する、
    上記プラットフォームを配備する段階と、
    上記サンプル区画に対して流体サンプルを装填し且つ第１増幅反応を行う段階と、
    上記流体サンプルを第２増幅反応を行う上記複数の反応区画に対して実質的に均一に配分する段階と、
    上記第２増幅反応を実施する段階とを含む、
    逐次的な核酸増幅反応を行う方法。
30. 請求項１から２７の何れか１項に記載の装置と、
    上記装置を受容する基部と、
    所定シーケンスに従い上記装置を回転させ、前記流体サンプルをひとつの区画／マニフォルドから次の区画／マニフォルドへと選択的に搬送する回転手段と、
    前記反応区画およびサンプル区画と熱的に連通する温度制御要素であって、前記第１および第２の増幅反応のそれぞれを行うための熱的変化特性シーケンスに従って記前反応区画およびサンプル区画のそれぞれの温度を制御し得る、上記温度制御要素と、
    上記各シーケンスの情報が保存されたプログラム可能コントローラであって、該各シーケンスの情報に基づいて上記回転手段及び上記温度制御要素のそれぞれを制御する、上記プログラム可能コントローラとを含む、
    核酸増幅に用いるためのデバイスであって、
    上記装置が上記基部に装備されている、デバイス。
31. 前記第１増幅反応は多重PCR反応から成り、且つ、前記第２増幅反応はネスト式もしくは半ネスト式のPCR反応を含む、請求項３０に記載のデバイス。
32. 請求項１から２７の何れか１項に記載の装置又は請求項３０若しくは３１に記載のデバイスと、
    前記第2増幅反応を行うために必要な試薬であって前記反応区画内に収容された試薬とを含む、
    逐次的な核酸増幅に用いるためのキット。
33. 前記第１増幅反応の生成物を希釈するために必要な試薬であって前記希釈区画内に収容された試薬を更に含む、請求項３２に記載のキット。

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