JP2020517916A - 流体検査用カセット - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年4月21日出願の「Fluidic Test Cassette」と題した米国仮特許出願第62/488,453号に対する優先権、及びこの仮特許出願の利益を主張するものであり、この仮特許出願の明細書及び特許請求の範囲を参照により本明細書に援用する。
検出チャンバ230の実施形態は、好ましくは、増幅チャンバ内で生成された増幅した標的核酸の特異的標識化を提供する。図2Aに示すように、検出チャンバ230は、毛細管プールまたは空間93及び検出ストリップ235を含むのが好ましい。毛細管プール93中に、染料ポリスチレンミクロスフェア、ラテックス、コロイド金、コロイドセルロース、金ナノ粒子、または半導体ナノ結晶を含む検出粒子が存在するのが好ましい。上記の検出粒子は、標的分析物に相補的なオリゴヌクレオチドを含み得るか、またはビオチン、ストレプトアビジン、ハプテン、または標的増幅核酸上に存在するハプテンなどの標識に対する抗体に結合し得るリガンドを含み得る。検出チャンバ230は、乾燥した検出粒子、凍結乾燥した検出粒子、または多糖類、界面活性剤、タンパク質、もしくは検出粒子の再懸濁を促進するための当業者に知られている他の化合物などの担体中の検出粒子の乾燥混合物として内面の少なくとも一部に存在する検出粒子を含むことができる。いくつかの実施形態では、ラテラルフロー検出ストリップは検出粒子を含み得る。他の実施形態では、検出チャンバに通じる試薬凹部チャネル135が、検出粒子を含み得る。検出チャンバは、加熱及び/または冷却することができてもよい。
流体構成要素の実施形態は、好ましくは、アクリル、ポリカーボネート、PETG、ポリスチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、及び/またはその他の同様の材料などのプラスチックを含む。これらの材料は容易に入手可能であり、標準的な方法で製造することができる。流体構成要素は、チャンバ及びチャネルの両方を備える。流体チャンバは、壁、2つの面を備え、入口、出口、凹部、またはベントなどの1つ以上のチャネルに接続する。チャネルは、2つの流体チャンバまたは流体チャンバ及び凹部を接続することができ、壁と2つの面とで構成されている。流体チャンバの設計は、体積に対する表面積の比を最大化して、加熱及び冷却を促進することが好ましい。チャンバの内容積は、約1μL〜約200μLであることが好ましい。溶液と接触するチャンバ面の面積は、加熱中に均一な流体温度を確保するために、加熱要素が接続される面積に対応していることが好ましい。流体チャンバの形状は、加熱要素と結合し、溶液の出入りに好ましい形状を提供するように選択することができる。いくつかの実施形態では、チャンバの容積は、デバイスの動作中に現れる気泡のための空間を提供するために、流体体積よりも大きくてもよい。流体チャンバは、毛細管現象によって流体がチャネルに侵入したり、通気機構を塞いだりしないことが確かとなるように、ベントチャネルにつながる拡大された延長部を備えてもよい。
上記のように、いくつかの追加の構成要素が、好ましくは最終的な結合の前に、本発明の流体構成要素内に組み込まれる。デバイスの組立て前に、緩衝剤、塩、dNTP、NTP、オリゴヌクレオチドプライマ、及びDNAポリメラーゼや逆転写酵素などの酵素を含む試薬を、凍結乾燥またはフリーズドライして、ペレット、球体、またはケーキにすることができる。試薬の凍結乾燥は、当技術分野で周知であり、適用された真空下での昇華による凍結試薬アリコートの脱水を伴う。凍結する前に、糖(二糖類及び多糖類)や多価アルコールなどの凍結保護剤の特定の製剤を試薬に添加することにより、酵素の活性が保持され、再水和速度が増加する場合がある。凍結乾燥試薬のペレット、球体、またはケーキは、標準的な方法で製造され、一度形成されると適度に耐久性があり、最終面をラミネートする前に流体構成要素の特定のチャンバに簡単に設置できる。より好ましくは、流体構成要素を支持体材料に結合する前に、凹部を流体ネットワークに組み込んで、凍結乾燥試薬のペレット、球体、またはケーキを流体構成要素に設置できるようにする。流体ネットワークの配置と凹部の位置及び順序とを選択することにより、試料を目的の時間に目的の凍結乾燥試薬と反応させて、性能を最適化できる。例えば、凍結乾燥(または乾燥)逆転写(RT)及び増幅の試薬球を、RT反応チャンバ及び増幅チャンバの流路の2つの別々の凹部に堆積することにより、増幅酵素の干渉なしに最適な逆転写反応が可能になる。さらに、その後の増幅反応に対するRT酵素の干渉を最小限に抑えるために、RT反応中に含まれるRT反応後のRT酵素は、増幅試薬への導入前に熱不活性化して、増幅への干渉を最小限に抑えることができる。任意選択で、他の塩、界面活性剤、及び他の増強化学物質を個別の凹部に添加して、アッセイの性能を調整することができる。さらに、これらの凹部は、凍結乾燥試薬が凹部を通過する際に液体と混ざりやすくし、また、超音波溶接中に凍結乾燥材料を超音波エネルギーから隔離し、可溶化前の検査の加熱ステップ中に極端な温度から凍結乾燥試薬を隔離するのにも役立つ。さらに、凹部は、製造中に凍結乾燥ペレットが圧縮または粉砕されないようにし、多孔質のままにして再水和時間を最小限に抑えるようにする。
本発明のいくつかの実施形態では、乾燥試薬または凍結乾燥試薬のための追加の反応チャンバ、及び/または追加の凹部を組み込んでもよい。いくつかの実施形態では、そのような設計は、逆転写及び増幅の前に、最初に別個の溶解反応を提供することが望ましい検査を容易にする。図37A、37B、及び38に示すように、カセット5000は、膨張チャンバ5021を封止するカバー5020、好ましくは流体構成要素5023と密接に接触して配置されるフレキシブルヒータ回路5022、及びユーザから回路を隠す後部カバー5024を備える。核酸を含む試料は、試料口5001を通して試料カップ5002に導入される。試料は凹部5003に自由に流入し、ここで第1の凍結乾燥ビーズ5004を再構成し、好ましくは溶解試薬を含めて、その後にチャネル5005を流れ下り、第1の反応チャンバ5006に流入する。この自由な流れは、試料カップ5002の頂部に接続するベントチャネル5007によって促進される。ベントチャネル5007は、さらに、孔5008を介して膨張チャンバ5021に接続してもよい。第1の反応チャンバ5006の下の封止された空気の空間は、流体の流れのためにわずかに加圧され、流れを第1の反応チャンバ5006の真下で停止させる。次に、第1の反応チャンバ5006は、好ましくは、溶解試薬との適切な反応を促進し、試料中の生物学的粒子及び/または細胞を溶解し、その中に存在する任意の核酸を露出させる温度まで加熱される。次に、第2の反応チャンバ5011の頂部に接続されたベントバルブ5009を開くと、好ましくは逆転写用の試薬を含む第2の凍結乾燥ビーズ5010が再構成される第2の凹部への試料の流れが促進される。次いで、流体は、第2の反応チャンバ5011に入り、そこで流動下の閉じられた空気体積内の空気圧が増加した結果として、流体の流れが停止する。次いで、その後、第2の反応チャンバ5011が、好ましくは適切な温度に加熱されて、逆転写プロセスを促進させる。
流体構成要素の設計は、任意選択で、反応チャンバ内または反応チャンバの出口に流量制御フィーチャを備えてもよい。これらのフィーチャは、チャンバに入る流れを、流れが出口に流入する前に、出口とは反対側のチャンバの側に偏向させる。その結果、流れはより遅い速度で出口チャネルに入り、流体が停止するまでに流体がチャネルを流れ落ちる距離を減少させる。さらに、流路の水平成分は、チャンバ間に垂直方向の間隔を追加せずにチャネルに長さを追加して、流路の有効な長さを増加させるため、減少した流速に基づいて所望の位置で流れを停止するのに十分である。これにより、必要な垂直チャネルが少なくて済むので、カセットのチャンバ間の垂直間隔を近づけることができる。さらに、反応チャンバを横切る流れの方向を変えることにより、チャンバ内の流れに旋回作用が生じて、試薬と試料流体との混合が改善される。フロー制御フィーチャは、任意の形状を備えてもよい。
本発明のいくつかの実施形態では、入力流体試料を、デバイスを通る2つ以上の平行な流体経路に分割することを可能にする流体設計を採用することによって、複数の独立したアッセイを並行して実施できる。図10は、例えば80uLの流体容積を2つの連続的なステップで最初に2つの別個の40uL容積に、続いて4つの20uL容積に分割する概略図である。例示されるスキームは、生化学反応などの独立した別個の操作を分割体積に対して実行できるようにするのに役立つ。このような構成は、多重化された核酸の逆転写及び/または増幅反応における核酸配列などの複数の標的の多重検出を容易にすることによって、単一のデバイスで検出できる分析物の数を増やすのに役立つ。同様に、独立した流体経路の末端での複数の検出ストリップの使用は、複数の標的の検出、または核酸分析物における配列差異もしくは突然変異の識別のためのストリップの可読性を高めることができるさらに、複数の増幅反応産物の独立した照合のための追加の検出ストリップを提供することで、検査の検出ステップ中のクロスハイブリダイゼーションなどの偽交差反応の可能性を低減することによって特異性を高めることができる。図11は、単一の検査用カセット内に2つの流体経路を含む検査用カセットを示す。各流体経路は、タイミング、反応タイプなどに関して独立して制御することができる。ここで図12を参照すると、試料カップ1000に導入された試料が、ほぼ等しい体積に分割され、体積分割チャンバ1001及び1002に流れ込み、内部への流れがベントバルブ1003及び1004によって調整される。分割チャンバ1001及び1002は、各チャンバ内の試料の量を受動的に平衡化することによって、各検査経路内の試料の体積を制御する。体積分割後に、ベント1005及び1006の開放によって、溶液が試薬凹部1007及び1008を通って流れることができるようになる。凍結乾燥試薬などの試薬は、凹部1007、1008に配置され、試料が凹部を通って好ましくは温度制御された第1のセットのチャンバ1009及び1010に流入するときに試料と混じり合う。熱溶解、逆転写、及び/または核酸増幅などの反応は、試薬凹部1007、1008に設けられた試薬によって促進される第1のセットの加熱チャンバのそれぞれで実施される。このような試薬には、それだけに限らないが、凍結乾燥陽性対照薬剤(例えば、核酸、ウイルス、細菌細胞等)、凍結乾燥逆転写酵素、及びRNAからDNAへの逆転写に必要な関連する付属試薬(ヌクレオチド、緩衝剤、DTT、塩等)、及び/または凍結乾燥DNAポリメラーゼまたは熱安定性凍結乾燥DNAポリメラーゼを使用したDNA増幅及び必要な付属試薬(ヌクレオチド、緩衝剤、及び塩など)が含まれる。
本発明のいくつかの実施形態では、試料調製システムをカセットに組み込むことが望ましい場合がある。核酸精製システムなどの試料調製システムは、試料調製と、精製DNA、RNAまたはタンパク質などの精製分子の検査用カセットへの溶出を達成するためのカプセル化溶液を含んでもよい。図13は、検査用カセットとの統合のために設計された核酸試料調製サブシステム1300を示す。試料調製サブシステムは、サブシステムの構成要素を収容するための主容器1302と容器蓋1301とを含む。溶液区画化構成要素1303は、好ましくは上面が開いているが、下部シール1305によって下側が封止されている粗試料リザーバ1312を含む。溶液区画化構成要素1303はまた、好ましくは、第1の洗浄緩衝剤を含むリザーバ1314と、第2の洗浄緩衝剤を含むリザーバ1315とを含み、両方とも好ましくは上部シール1304及び下部シール1305によって封止される。核酸結合マトリックス1306は、吸収材料1307及び1308によって提供される溶液毛細管流路に配置される。
いくつかの実施形態では、ヒータ、センサ及び他の電子機器が、これらがインタフェース接続しなければならない使い捨て検査用カセットの上にある要素と電子機器の好ましい熱インタフェース及び正確な整合を確立することができる手段によって使い捨て検査用カセットにインタフェース接続されるように、電子部品を再使用可能な部品に配置することが望ましい。他の実施形態では、温度制御のために再利用可能な構成要素と使い捨ての構成要素との組合せを使用することが望ましい。例えば、スタンドオフ温度モニタリングは、再利用可能なドッキングユニットに配置された赤外線センサで実現することができ、一方、温度制御及び流体制御用の抵抗ヒータは、使い捨て検査用カセットに組み込まれたフレキシブル回路に配置される。
再利用可能なドッキングユニットは、検査用カセット機能を実現するために必要な電子部品を備えている。検査用カセット設計の対応する変形形態とインタフェース接続するように、様々なドッキングユニット実施形態が発明されている。一実施形態では、図18及び図19に示すドッキングユニットは、検査の実行に必要な全ての電子部品を備え、検査用カセット内の電子部品の必要性を排除する。ここで図18を参照すると、試料を加える前に、カセット2500がドッキングユニット2501に挿入される。ドッキングユニット2501は、検査プロトコルや検査状態などの情報をユーザに伝達するためのLCDディスプレイ2502などのディスプレイを備える。カセットをドッキングユニット2501に挿入した後、試料をカセット2500の試料口20に導入し、ドッキングユニット蓋2503を閉じて検査を開始する。検査用カセットが挿入されたドッキングユニットを図19に示し、蓋が閉位置にあるドッキングユニット2501を図18Bに示す。
インフルエンザA及びB検査用カセットをドッキングユニットに設置した。試料口に40μLの試料液を添加した。試料液は、5000TCID50/mLに相当する濃度の精製A/プエルトリコインフルエンザRNA、500TCID50/mLに相当する濃度の精製B/ブリスベンインフルエンザRNA、または分子等級水(鋳型対照なし試料)のいずれかで構成した。試料口に入ると、40μLの試料が凍結乾燥ビーズと混じり合い、検査用カセットの最初のチャンバに流れた。凍結乾燥ビーズは、ポジティブ内部コントロールとしてのMS2ファージウイルス粒子とDTTで構成した。カセットの最初のチャンバでは、試料を1分間90℃に加熱してウイルス溶解を促進し、その後、2番目のチャンバに接続した通気口を開く前に50℃に冷却した。第2のチャンバに接続されるベントを開くと、試料が第2のチャンバ内の空気を膨張チャンバに移動できるようにすることで、試料が第2のチャンバに流れ込んだ。試料が第2のチャンバに移動すると、インフルエンザA、インフルエンザB、MS2ファージに対するオリゴヌクレオチド増幅プライマが混じり合い、逆転写及び核酸増幅試薬及び酵素は、第1及び第2のチャンバ間の流路の凹部に凍結乾燥ペレットとして存在した。
インフルエンザA及びB検査用カセットをドッキングユニットに設置した。試料口に40μLの試料液を添加した。試料液は、5000TCID50/mLに相当する濃度のA/プエルトリコインフルエンザウイルス、500TCID50/mLに相当する濃度のB/ブリスベンインフルエンザウイルス、または分子等級水(鋳型対照なし試料)のいずれかを含んだ。試料口に入ると、40μLの試料が凍結乾燥ビーズと混じり合い、検査用カセットの最初のチャンバに流れた。凍結乾燥ビーズは、ポジティブ内部コントロールとしてのMS2ファージウイルス粒子とDTTで構成した。カセットの最初のチャンバでは、試料を1分間90℃に加熱してウイルス溶解を促進し、その後、2番目のチャンバに接続した通気口を開く前に50℃に冷却した。第2のチャンバに接続されるベントを開くと、試料が第2のチャンバ内の空気を膨張チャンバに移動できるようにすることで、試料が第2のチャンバに流れ込んだ。試料が第2のチャンバに移動すると、インフルエンザA、インフルエンザB、MS2ファージに対するオリゴヌクレオチド増幅プライマが混じり合い、逆転写及び核酸増幅試薬及び酵素は、第1及び第2のチャンバ間の流路の凹部に凍結乾燥ペレットとして存在した。増幅チャンバを47℃に6分間加熱し、その間にRNAテンプレートをcDNAに逆転写した。
ヒト被験者から採取した鼻腔スワブの試料を3mlの0.025%TritonX−100、10mMTris、pH8.3溶液に入れ、FDA承認のリアルタイムRT−PCR試験を実施して、インフルエンザA及びインフルエンザBの存在を検査した。この研究で使用する前に、試料がインフルエンザA及びインフルエンザBについて陰性であることを確認した。確認したインフルエンザ陰性鼻腔試料に、5000TCID50/mLに相当する濃度のA/プエルトリコインフルエンザウイルスをスパイクして使用し、または陰性対照としてウイルスを添加せずに使用した。得られたスパイク試料またはネガティブコントロール試料40μLを、インフルエンザA及びB検査用カセットの試料口に添加した。試料口に入ると、40μLの試料が凍結乾燥ビーズと混じり合い、検査用カセットの最初のチャンバに流れた。凍結乾燥ビーズは、ポジティブ内部コントロールとしてのMS2ファージウイルス粒子とDTTで構成した。カセットの最初のチャンバでは、試料を1分間90℃に加熱してウイルス溶解を促進し、その後、2番目のチャンバに接続した通気口を開く前に50℃に冷却した。第2のチャンバに接続されるベントを開くと、試料が第2のチャンバ内の空気を膨張チャンバに移動できるようにすることで、試料が第2のチャンバに流れ込んだ。試料が第2のチャンバに移動すると、インフルエンザA、インフルエンザB、MS2ファージに対するオリゴヌクレオチド増幅プライマが混じり合い、逆転写及び核酸増幅試薬及び酵素は、第1及び第2のチャンバ間の流路の凹部に凍結乾燥ペレットとして存在した。
Claims (12)
- 核酸を検出するためのカセットであって、前記カセットは少なくとも1つの反応チャンバを備え、
前記反応チャンバの頂部は、前記カセットが鉛直に配向されている場合に、前記反応チャンバの前記頂部を横切る毛細管流体流動を最小化または防止するように、入口と、前記反応チャンバの中に入って下方に延在する突出部とを備える、前記カセット。 - 前記突出部が、略三角形の形状である、請求項1に記載のカセット。
- 前記突出部の第1の側面が、前記入口に隣接して実質的に鉛直に延在する、請求項1に記載のカセット。
- 前記突出部の第2の側面が、鉛直から近似的に60度未満の角度で前記反応チャンバの前記頂部へ向けて上方に延在する、請求項3に記載のカセット。
- 前記角度が、鉛直から近似的に45度未満である、請求項4に記載のカセット。
- 前記角度が、鉛直から近似的に30度未満である、請求項5に記載のカセット。
- 前記突出部の前記第2の側面が、前記反応チャンバの前記頂部へ向けて鉛直に延在する、請求項6に記載のカセット。
- 少なくとも1つの凍結乾燥試薬または乾燥試薬を収容するための凹部を備え、前記凹部が、前記反応チャンバの前記入口に接続されたチャネルに配置されている、請求項1に記載のカセット。
- 前記突出部が、前記反応液体積の大部分から新規に再懸濁された試薬の隔離を低減または防止する、請求項8に記載のカセット。
- 前記凹部は、流体が前記少なくとも1つの乾燥試薬または凍結乾燥試薬の再水和を促進させるようにする1つ以上の構造を備える、請求項8に記載のカセット。
- 前記構造が、隆起、溝、ディンプル、またはそれらの組み合わせを備える、請求項10に記載のカセット。
- 前記反応チャンバが、少なくとも1つの凍結乾燥試薬または乾燥試薬を収容するための凹部を備える、請求項1に記載のカセット。
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