LU83499A1 - Blutgerinnungsfoerdernde praeparation auf basis von humanproteinen sowie verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

J.

Blutgerinnungsfördernde Präparation auf Basis von Humanproteinen sowie Verfahren zur ihrer Herstellung

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Die Erfindung betrifft eine blutgerinnungsfördernde Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität.

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Blutgerinnungsfördernde Präparationen mit Faktor* VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität, abgekürzt "FEIBA" (Factor •Eight Inhibitor-Bypassing Activity), sind bekannt. In der AT-PS 350 726 (entsprechend der US-PS 4,160,025 bzw.

10 der DE-OS 27 34 821) ist die Herstellung einer solchen

Präparation beschrieben. Sie wird bei der Behandlung von Patienten, die an Hämophilie A leiden und deren Blut einen gegen Faktor VIII gerichteten Hemmstoff (Inhibitor) enthält, mit Erfolg angewandt. Die - chemische Struktur des 15 FEIBA-Faktors ist bisher unbekannt. Man weiß nur, daß es sich um ein Protein mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 100.000 handelt. Die Herstellung der Präparation nach den oben genannten Patentschriften erfolgte durch Generierung aus menschlichem, Zitrat—Ionen enthal-20 tendem Plasma in Abwesenheit von freien Calciumionen durch Behandlung mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffen, wie , Kieselgel oder Kaolin, und anschließende Adsorption und

Eluierung, wobei ein Gemisch der Faktoren II, VII, IX und 25 X, des Faktors FEIBA und anderer Proteine erhalten wird, dessen Zusammensetzung bisher nicht beschrieben ist.

* - 2 - .Obwohl, wie erwähnt, die Präparation nach der DE-OS 27 34 821 sich bei der Behandlung von Faktor VIII-Inhibi-tor-Patienten als wertvoll erwiesen hat, besteht die Aufgabe, den Anwendungsbereich zu erweitern und die Ver-5 träglichkeit von FEIBA-Präparationen weiter zu.verbessern, insbesondere unerwünschte Nebenreaktionen, wie thrombogene und vasoaktive Wirkungen, auf ein Minimum herabzusetzen.

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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einer blutge-10 rinnungsfördernden Präparation auf Basis von Humanpro-r teinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität gelöst, welche Präparation dadurch gekennzeichnet ist, - daß sie frei ist von thrombogener Aktivität bis zu 15 mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Kaninchen im

Thrombose-induzierenden Aktivitätstest nach Wessler, - daß sie frei ist von Kallikrein-Aktivität und frei von Präkallikrein-Aktivator-Aktivität - gemessen in einer wässerigen Lösung der Präparation mit einer FEIBA- 20 Konzentration bis zu mindestens 10 Einheiten pro ml, - daß sie affinitätschromatographisch an Dextransulfat--Agarose mittels eines NaCl-Gradienten derart auftrennbar ist, daß das Protein mit Faktor IX-Aktivität bei niedrigerer NaClrKonzentration eluiert als das Protein 25 mit FEIB-Aktivität, - daß die das Protein mit Faktor IX-Aktivität und.das Protein mit FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate bei elektrophoretischer Auftrennung oo- und ß-Globuline enthalten, wobei die Auf trennungskurve im d&-Bereich einen- Haupt- * 30 gipfel entsprechend 60 bis 80 % des Gesamtproteins, eine * daran anschließende Schulter von 10 bis 20 % des Ge samtproteins sowie einen an -den schulterförmigen Verlauf der Auftrennungskurve anschließenden schwach ausgeprägten Gipfel im /^-Globulinbereich entsprechend einem 35 Gehalt von 10 bis 20 % des Gesamtproteins aufweist.

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Die vorstehend definierten Merkmale, nämlich das Freisein der Präparation von thrombogener Aktivität und von Kallikrein-Aktivität bzw. von Präkallikrein-Aktivator-Aktivität .- letztere sind für die vasoaktiven Wirkungen 5 verantwortlich -, bedeuten, daß die Präparation eine hervorragende Verträglichkeit besitzt. Der Thrombose-• induzierende Aktivitätstest und die Tests auf Kallikrein-

Aktivität und Präkallikrein-Aktivator-Aktivität sind > - dem Fachmann bekannt. Im einzelnen werden diese im An-10 Schluß an die Beispiele noch genauer angegeben.

Das dritte Merkmal der erfindungsgemäßen Präparation, die Auftrennbarkeit auf affinitätschromatographischem Weg an Dextransulfat-Agarose mittels eines NaCl-Gradienten ist .15 in Fig. 1 der Zeichnung anhand eines Beispieles veranschaulicht. Die Methode der Affinitätschromatographie an Dextransulfat-Agarose ist dem Fachmann bekannt (D.S. Peppef and C. Prowse, Thrombosis Research _1_1_ (1977) , 687-692). Hierbei wird Dextransulfat (Molekulargewicht • 20 500.000) an CNBr-aktivierte Sepharose 4 B (Pharmacia Fine

Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gekoppelt. Die so gewonnene Dextransulfat-Sepharose wird in 0,4 % Trinatrium-citrat·2H20-Lösung (pH 7,4) äquilibriert und in eine Säule gefüllt. Die zu untersuchende Probe wird auf die Säule 25 aufgetragen und anschließend mit einer NaCl-Lösung in 0,4 % Trinatriumcitrat·2H2O (pH 7,4) mit steigender NaCl-Konzentration fraktioniert eluiert.

In Fig. 1 sind auf der Abszisse die Fraktionsnummern dèr 30 Eluate aufgetragen. Auf der linken Ordinate sind die , Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren in Einheiten pro ml aufgetragen und auf der rechten Ordinate die Konzentration des NatriumChlorid-Gradienten in mol/1. Der lineare Verlauf des Gradienten ist als Linie G einge-35 tragen. Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, eluiert das Protein mit Faktor IX-Aktivität im Bereich von 0,1 bis 0,5 .-4- (molar), mit einem Maximum bei 0,3 (molar), das Protein mit FEIB-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration im Bereich von 0,3 bis 0,5 (molar), mit einem Maximum bei 0,4 (molar). Die steigende NaCl-Konzentration ist an dem NaCl-5 Gradienten G zu erkennen, der'von 0 molar bis 0,65 molar NaCl reicht.

Schließlich ist für die erfindungsgemäße Präparation als viertes Merkmal auch der Gehalt an Globulinen bei elektro-10 phoretischer Auftrennung charakteristisch, was in Fig. 2 der Zeichnung erläutert wird. Der obere Teil der Fig. 2 veranschaulicht die Auftrennungskurve der erfindungsgemäßen, die Proteine mit Faktor IX-Aktivität und FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate der Dextransulfat-Sepharose-15 Chromatographie anhand eines Beispieles, wogegen der untere Teil der Fig. 2 die elektrophoretische Auftrennungskurve eines nativen Humanplasmas wiedergibt. Es ist zu erkennen, daß bei ..diesem Beispiel der Hauptgipfel im oc-Globulinbereich 70 % des Gesamtproteins beträgt. An den Hauptgipfel schließt 20 sich im oi-Globulinbereich eine Schulter an, die 14 % des

Gesamtproteingehaltes ausmacht, worauf anschließend an die Schulter im f>-Globulinbereich ein schwach ausgeprägter Gipfel folgt, der 16 % des Gesamtproteins beträgt.

25 Vorteilhaft besteht ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Präparation darin, daß die FEIB-Aktivität nach ein-stündiger- Inkubation in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma mindestens zu 50 % erhalten bleibt. Diese Eigenschaft deutet auf eine länger anhaltende Wirksamkeit bei Applikation an „ 30 Faktor VIII-Inhibitor-Patienten hin.

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Vorteilhaft besteht eine weitere Eigenschaft der erfindungsgemäßen Präparation darin, daß die Faktor IX-Aktivität nach einstündiger Inkubation in Faktor IX-Mangelplasma min-35 destens zu 50 % erhalten bleibt. Dies bedeutet, daß die

Präparation wenig oder einen sehr geringen Anteil an aktiviertem Faktor IX enthält. Es ist bekannt, daß aktivierter Faktor IX in Humanplasma inaktiviert wird. Aktivierter » - 5 -

Faktor IX würde nachteilige thrombogene Wirkungen verursachen. Aus der Literatur (Proc. Natl. Acad. Sei. USA,

Vol. 74, No. 7, 3028-3032, Juli 1977, "In vitro and in vivo corrélation of clotting protease activity: Effect of '5 heparin" von S.N. Gitel, R.C. Stephenson und S. Wessler) ist bekannt, daß gerade der Faktor IXa gegenüber anderen aktivierten Gerinnungsfaktoren, wie Xa und Ha (Thrombin), * die höchste thrombogene Wirksamkeit besitzt.

10 Schließlich besteht vorteilhaft eine Eigenschaft der blut- » gerinnungsfördernden Präparation gemäß der Erfindung darin, daß sie einen Gehalt an Inter-Alpha-Trypsin-Inhibi-tor (ITI) von 0,05 bis 5 mg pro FEIBA-Einheit besitzt.

15 Der.Gehalt an ITI bewirkt, daß die Thrombogenität der erfindungsgemäßen Präparation im Wessler-Test niedrig ist.

Die Erfindung umfaßt des weiteren ein Verfahren zur Her-. Stellung der neuen blutgerinnungsfördernden Präparation 20 auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß Humanplasma mit sulfatierten hoch-.polymeren Kohlehydraten und/öder mit basischen Ionenaus-25 tauschern behandelt und das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität adsorbiert wird, worauf es durch Eluieren und Konzentrieren gewonnen wird.

Bei der Durchführung des Verfahrens ist darauf zu achten, 30 daß das' Plasma bzw. die Reaktionsteilnehmer frei gehalten * werden von Substanzen, die die Antithrombin III-Aktivität zu steigern imstande sind, wie Heparin oder Heparinoiden.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird das Plasma 35 zuerst mit sulfatierten hochpolymeren Kohlehydraten kurzzeitig behandelt, das Proteingemisch mit generierter FEI.B-Aktivität hierauf an einem 'Ionenaustauscher auf Dextran- * - 6 - \ basis adsorbiert und unmittelbar darauf eluiert und konzentriert.

Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das 5 Plasma mit einem Ionenaustauscher auf Dextranbasis behandelt und nach mindestens zweistündiger Einwirkung das an dem Ionenaustauscher adsorbierte Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität eluiert und sodann konzentriert. Bei dieser Ausführungsform ist die Generierung der FE1B-10 Aktivität von der Einwirkungsdauer abhängig. Diese kann bis zu 48 Stunden betragen.

Die angewendeten Verfahrensmaßnahmen sind nicht kritisch und können in weiten Grenzen schwanken; so kann der pH-15 Wert zwischen 6 und 9 betragen, die Temperatur zwischen 0 und·40°C liegen, die angewendeten Mengen an Dextransulfat können 0,1 bis 500 mg/1 Plasma betragen, und an DEAE-Sephadex können 0,01 bis 10 g/1 Plasma eingesetzt werden. Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren 20 kommt nicht nur natives Humanplasma, sondern auch Plasmafraktionen, z.B. Kryoüberstand und der Cohn-I-überstand (8 % Alkohol) in Frage.

Die Präparation gemäß der Erfindung und das Verfahren zu 25 ihrer Herstellung werden in den folgenden Beispielen näher erläutert, wobei im Anschluß an die Beispiele die angewendeten Bestimmungsmethoden erläutert und die Ergebnisse tabellarisch erfaßt sind.

30 Beispiel 1 : , 1000 1 frisch gefrorenes, menschliches Citratplasma werden bei 0 bis +4°C aufgetaut und das dabei anfallende Kryo-präzipitat durch Zentrifugation bei +2°C abgetrennt. Dem resultierenden. "Kryoüberstand" werden bei einem nativen 35 pH-Wert von 7,7 10 g Dextransulfat (Molekulargewicht 500.000) zugesetzt und 15 Minuten bei +4°C gerührt, wobei - 7 - i die Substanz FEIBA generiert wird.

Hiërauf werden 500 g des Anionenäustaüschers DEAE-Sepha-dex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) 5 zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4°c gerührt,· wobei die generierte Substanz FEIBA zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) und inerten » Proteinen an das unlösliche DEAE-Sephadex adsorbiert wird.

. · . 10 Das DEAE-Sephadex wird unmittelbar nach dem Adsorptians- vorgang durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin verwendet werden.

15 Das DEAE-Sephadex wird einem zweifachen Waschprozeß unterworfen; dabei wird das DEAE-Sephadex zuerst mit 50 1 einer Lösung, bestehend aus 4 g/1 Trinatriumcitrat·21^0, 7 g/1 Natriumchlorid und 18 g/1 Dinatriumhydrogenphos-phat*12H20 in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,5, während 20 15 Minuten bei +4°C gerührt. Nach Abtrennung durch Fil tration wird das DEAE-Sephadex mit 50 1 einer Lösung, bestehend aus 4 g/1 Trinatriumcitrat.· 2H'20 und 7 g/1 Natriumchlorid in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,5, während 15 Minuten bei+4°C gerührt und hierauf wieder durch 25 Filtration abgetrennt.

Zur Elution wird das DEAE-Sephadex mit 25 1 einer Lösung, bestehend aus 30 g/1 Natriumchlorid und 1 g/1 Trinatriumcitrat· 2H20 in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,0, während • 30 20 Minuten bei +4°C gerührt. Das Eluat, enthaltend die generierte Substanz FEIBA, die Faktoren des Prothrombin-komplexes (II, VII, IX, X) sowie inertes Protein, wird durch Filtration gewonnen, das DEAE-Sephadex wird verworfen. , Das Eluat wird über Nacht gegen 1000 1 destilliertes Wasser 35 bei +4°C dialysiert, hierauf eingefroren und einem ersten Lyophilisationsvorgang unterworfen. In dem resultierenden - 8 -

Bulk-Material wird die FEIB-Aktivität bestimmt, u.zw. nach der in der DE-OS 27 34 821 beschriebenen Methode.

Für die Herstellung der pharmazeutisch anwendbaren Präpa-5 ration mit FEIB-Aktivität wird das Bulk-Material in so viel destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst, daß die FEIB-> Aktivität zwischen 10 und 50 FEIBA-Einheiten pro ml be-. trägt (vorliegendenfalls 25 FEIBA-Einheiten pro ml). Nach

Zusatz der nötigen Salze zur Herstellung der Isotonie und 10· Einstellung des pH-Wertes zwischen 7,0 und’ 7,5 wird die Lösung durch Membranfilter geklärt und zuletzt durch ein 0,2 ^im Membranfilter sterilfiltriert. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen zu 20 ml in die Endbehälter verfüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.

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Beispiel 2: 1000 1 frisch gefrorenes menschliches Citratplasma werden bei 0 bis +4°C aufgetaut und das dabei anfallende Kryo-präzipitat durch Zentrifugation bei +2°C abgetrennt. Dem 20 resultierenden "Kryoüberstand" werden bei einem nativen pH-Wert von 7,7 500 g des Anionenaustauschers DEAE-Sepha-dex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4°C gerührt, wobei die Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) 25 und inerte Proteine an das DEAE-Sephadex adsorbier-t werden.

Hierauf wird das Gemisch 12 Stunden bei +4°C stehen gelassen; während dieser "Kontaktzeit" wird die Substanz • 30 FEIBA generiert.

Das DEAE-Sephadex wird nach der 12-stündigen "Kontaktzeit" durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globuliri 35 und Albumin verwendet werden.

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Die weitere Verarbeitung des DEAE-Sephadex (zweimalige Waschung, Elution etc.) erfolgt'in gleicher,Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben.

5 Der Thrombose-induzierende Aktivitätstest nach Wessler, welcher in der Literatur, u.zw. in J. Appl. Physiol.

14 (1959), 943-946, "Biologie assay of a thrombosis-in-, ducing activity in human serum" von Stanford Wessler,

Stanley M. Reimer und Mindel C. Sheps, beschrieben ist, 10 wird folgendermaßen ausgeführt: Pro Test werden 3 Kanin-' chen verwendet. Die Tiere werden mit Nembutal narkoti-.siert; nach zusätzlicher lokaler Anästhesie wird die herzseitige vena jugularis freigelegt, im Abstand von 1 bis 2 cm werden zwei Ligaturen .vorbereitet.

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Das zu untersuchende Präparat wird,nun in èr gewünschten Dosis in die der freigelegten vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene innerhalb von 15 Sekunden injiziert. Innerhalb von 10 bis 25 Sekunden nach Beendigung der Injektion 20 des Präparates werden die vorbereiteten Ligaturen zugezogen. Das isolierte Venensegment bleibt nun 10 Minuten in situ im Kaninchen. Hierauf wird das Venenstück aus dem Tier entfernt und in einer Petrischale in einer 5 % Natriumcitrat-Lösung aufgeschnitten und der Inhalt nach folgendem 25 Schema bewertet.

0 = kein Gerinnsel 1 = wenige makroskopisch sichtbare Fibrinpartikel 2 = einige kleine Thromben 30 3 = zwei oder mehr große Thromben , 4 = ein einziger, das ganze isolierte Venensegment aus- - füllender Thrombus

Der Test wird im Falle einer 4-Reaktion als positiv ge-35 wertet. Für die erfindungsgemäße Präparation ist wesentlich, daß bei Injektion der Präparation, enthaltend bis

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' - 10 - zu mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Versuchstier, keine 4-Reaktion auftritt.

Die Bestimmung der Kallikrein-Aktivität und der Präkalli-5 krein-Aktivator-Aktivität wird in folgender Weise' durchgeführt·.

KALLIKREIN: TO 1. Methode: . Kallikrein spaltet amidolytisch para-Nitroanilin (pNA) von einem spezifischen chromogenen Substrat ab. Die Konzentration von pNA wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

15 2. Reagenzien:

Puffer:· Lösung A: 3,03 g "TRIS" und 1,7 g Imidazol werden in 500 ml 0,1n Salzsäure gelöst und mit Wasser auf 1000 ml 20 aufgefüllt.

Lösung B: 4,04 g "TRIS" und 2,27 g Imidazol werden in 500 ml 0,1n Salzsäure gelöst und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

Lösung C: 11,69 g Natriumchlorid werden mit Wasser auf 25 1000 ml gelöst.

Lösung A und B werden solange gemischt, bis ein pH-Wert von 7,9 erreicht ist. Diese Mischung wird mit dem gleichen Volumen von Lösung C versetzt.

30 Chromogenes Substrat S-2302 (Firma Kabi, Stockholm): ‘ H-D-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-p-nitroanilid-dihydro- chlorid 1 millimolare Lösung von S-2302: 25 mg in 41 ml Wasser.

35 Probe:

Die Probe wird im Originalvolumen gelost und unverdünnt - 11 -

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in den Test eingesetzt.

3. Test:

In einem Wasserbad bei einer Temperatur von 37°C werden 5 in einPlastikröhrchen ''

1,0 ml Puffer, vortemperiert auf 37°C

0. 1 ml Probe „ 0,2 m-1 chromogenes Substrat S-2302 pipettiert. Diese Mischung wird in ein auf 37°C temperier-10 tes Fotometer eingebracht und die Zunahme der optischen Dichte pro Minute (ΔΟϋ/Μΐη) bei einer Wellenlänge von 405 nm, bei einer Schichtdicke von 10 mm, gemessen. Die Aktivität einer Probe wird in AOD/Min ausgedrückt.

15 PRÄKALLIKREIN-AKTIVATOR: 1. Methode:

Aus einer gereinigten Präkallikreinpräparation (PKK) wird mittels eines Präkallikreinaktivators (PKKA) Kallikrein 20 (KK) generiert. Das Kallikrein spaltet amidolytisch para-Nitroanilin (pNA) von einem spezifischen chromogenen Substrat ab. Die Konzentration von pNA wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

25 2. Reagenzien: .Puffer und chromogenes Substrat entsprechen den bei der Kallikrein-Bestimmung beschriebenen Reagenzien.

Präkallikreinpräparation: 30 Die Herstellung der Präparation erfolgt nach einer Vorschrift von Harpel, modifiziert von M.S. Horowitz (New York Blood Center). Dabei wird humanes Citratplasma mit Hilfe einer DEAE-Cellulose behandelt. Die nicht an DEAE-Cellulo.se gebundene Fraktion enthält das Präkallikrein.

Positive Kontrolle (Standard): 35 i - 12 -

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Als Standard (= Bezugswert) wird eine Albuminpräparation des Bureau of Biologics (BoB) der Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland 20205, USA, verwendet. Diese Präparation enthält einen Präkallikreinaktivator. Die 5 Kallikreingeneration mit diesem BoB-Standard stellt den Bezugswert 1 dar bzw. wird gleich 100 % gesetzt.

Probe:

Die Probe wird im Or.iginalvolumen gelöst und unverdünnt .10 in den Test eingesetzt.

3. Test:

In einem Wasserbad bei einer' Temperatur von 37°C werden in ein Plastikröhrchen 15 0,05 ml Präkallikreinpräparation 0,05 ml Probe a) BoB-Standard für den Bezugswert b) Testprobe (in einem zweiten Testansatz) pipettiert. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei 37°C wird 20 0,7 ml Pufferlösung 0,1 ml chromogenes Substrat S-2302 pipettiert. Diese Mischung wird in ein auf 37°C temperiertes Fotometer eingebracht und die Zunahme der optischen Dichte pro Minute (AOD/Min) bei einer Wellenlänge von 25 405 nm, bei einer Schichtdicke von 10 mm, gemessen. Die

Aktivität einer Probe (AOD/Min) wird faktoriell - gegenüber dem BoB-Standard mit der Zahl 1 - bzw. in % vom BoB-Standard ausgedrückt, , 30 Die Charakterisierung der erfindungsgemäßen Präparation durch affinitätschromatographische Auftrennung der Präparation an Dextransulfat-Sepharose wurde bereits in . Verbindung mit Fig. 1 beschrieben.

35 Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine mit Faktor IX-Aktivität und mit FEIB-Aktivität, auf die in Ver-

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- 13 - bindung mit Fig. 2 hingewiesen wird, kann in folgender Weise durchgeführt werden.

Als Träger für die elektrophoretische Auftrennung der 5 verschiedenen Proteine dient eine Celluloseacetat-Membran, welche mit dem Elektrophoresepuffer (pH 8,6, Ionenstärke , 0,075) befeuchtet ist. Auf dieser Membran werden die zu analysierenden Proben - zusammen mit einem normalen Humanplasma als Standard - aufgetragen und hierauf im elek-10 frischen Feld aufgetrennt; die Trennung erfolgt dadurch, daß verschieden geladene Proteine im elektrischen Feld verschieden rasch wandern. Zu diesem Zweck wird die mit den Proben versehene Membran in einer speziellen, mit Elektrophoresepuffer gefüllten Zelle 16 bis 18 Minuten 15 bei einer Spannung von 250 Volt und 4 bis 6 Milliampere anfänglicher Stromstärke behandelt.

Nach Beendigung des Trennvorganges werden die verschiedenen Proteine durch Einlegen der Membran in eine Fixier- bzw.

20 Färbelösung sichtbar gemacht. Nach einigen Spülbädern wird die Membran in einem weiteren Bad transparent gemacht, auf eine Glasplatte aufgetragen und in einem Trockenschrank bei 100°C getrocknet.

25 Die getrocknete Membran wird nun in einem automatisch registrierenden und integrierenden Densitometer analysiert und ergibt Auftrennungskurven, wie in Fig. 2 dargestellt. Die verschiedenen Proteine erscheinen dabei als verschieden starke Banden, deren Flächen den Relativprozent-. 30 werten der entsprechenden Proteine proportional sind, wo- * bei diese Flächen durch die automatische Integration des

Densitometers bestimmt werden.

Die Zuordnung der verschiedenen Banden bzw. Proteine der 35 Testprobe zu definierten Proteinen bzw. Proteingruppen erfolgt durch Vergleich mit den Banden des als Standard * - 14 - mitanalysierten normalen Humanplasmas. Letzteres wird bei der elektrophoretischen Analyse in 5 Proteingruppen auf-getrennt, welche definitionsgemäß - in der Reihenfolge abnehmender Wanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen 5 Feld - wie folgt bezeichnet werden: Albumin, ot-Globuline, /^-Globulin, Fibrinogen und jr-Globulin.

Die Definition der.FEIBA-Einheit sowie ihre Bestimmung (Wirksamkeitstest) ist in der Literatur, u.zw. in der 10 AT-PS 350 726 (US-PS 4,160,025, DE-OS 27 34 821) beschrieben. Die Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X ist ebenfalls in der vorgenannten Literatur beschrieben.

15 ' Die Bestimmung der Restaktivitä-t von FEIBA nach Inkubation in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma wird in folgender Weise durchgeführt.

1. Reagenzien: 20 Die zu verwendenden Reagenzien sind in Verbindung mit der Bestimmung der FEIBA-Einheiten (Wirksamkeitstest) in der AT-PS 350 726 (US-PS 4,160,025, DE-OS 27 34 821) beschrieben.

25 2. Test: , Von einer auf 50 FEIBA-Einheiten/ml eingestellten Prä paration werden mit einer Lösung von 7 g/1 Natriumchlorid und 7 g/1 Natriumcitrat·2H20 als Verdünnungsmittel folgende Verdünnungen hergestellt: 1 : 2, 1:4, 1:8, ». 30 1 : 16, 1 : 32 und 1 : 64. Von diesen 6 Verdünnungen wird jeweils eine 1 : 10-Verdünnung in Faktor VHI-inhibi-tor-Plasma hergestellt (0,05 ml vorverdünnte Probe + 0,45 ml Faktor VIII-Inhibitor-Plasma).

t .

- 15 - . Diese 1 : 1O-Verdünnungen in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma ("Inkubationsgemische") werden nun sofort und nach einer Stunde Inkubation bei 37°C nach folgendem Testschema analysiert: 5 0,1 ml "Inkubationsgemisch" 0,1 ml Phospholipid-Kaolin-Suspension 1 Minute bei 37°C inkubieren . 0,1 ml m/40 Calciumchlorid

Die-Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zur Gerinnsel-• 10 bildung wird mit .einer Stoppuhr wie im Wirksamkeitstest gemessen.

3. Berechnung der Restaktivität:

Analog zur Beschreibung im Wirksamkeitstest wird nun mit 15 den Gerinnungszeiten der sofort bestimmten Verdünnungen eine Eichkurve erstellt (unverdünnte Probe = 50 FEIBA-Einheiten/ml). Die Aktivitäten (FEIBA-Eiiiheiten/ml) der eine Stunde inkubierten verschiedenen Verdünnungen werden nun unter Verwendung der Eichkurve berechnet und in Pro-20 zent der jeweiligen Aktivitäten der nicht inkubierten Verdünnungen ausgedrückt. Die Mittelwerte der so berechneten Aktivitäten ergeben dann die durchschnittliche Restaktivität der Probe nach einer Stunde Inkubation, ausgedrückt in Prozent der Ausgangsaktivität vor Inkubation.

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Die Bestimmung der Restaktivität von Faktor IX nach Inkubation in Faktor IX-Mangelplasma wird in folgender Weise durchgeführt: ,30 1. Reagenzien:

Faktor IX-Mangelplasma: Citratplasma eines Patienten mit schwerer Hämophilie B (Faktor IX unter 1 %).

Phospholipid/Kaolin-Suspension: PTT-Reagenz der Firma 35 Immuno Diagnostica Ges.m.b.H. Für die Testung wird die erforderliche Menge Faktor IX-Mangelplasma mit einem glei- * - 16 - chen Volumen Phospholipid/Kaolin-Suspension gemischt, 5 - Minuten bei 37°C inkubiert un.d dann während der Testperiode in einem Eisbad aufbewahrt.

Citrat-/Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für Proben: 5 7 g/1 Trinatriumcitrat*2H20, 7 g/1 Natriumchlorid

Calciumchlorid m/20 (0,05 molar): während der Testperiode bei 37°C aufbewahren.

2. Test: 10 Von einer auf 50 Faktor IX-Einheiten/ml eingèstellten Präparation werden 7 geometrische Verdünnungen (1:2, 1 : 4 etc. bis 1 128) mit Citrat-/Kochsalzlösung her gestellt. -Von der unverdünnten Probe sowie von den 7 geometrischen Verdünnungen wird jeweils eine 1 : 10-Ver-.15 dünnung in Faktor IX-Mangelplasma hergestellt (0,05 ml vorverdünnte Probe + 0,45 ml Faktor IX-Mangelplasma).

Diese 1 : 1O-Verdünnungen in Faktor IX-Mangelplasma ("Inkubationsgemische") werden nun sofort und nach einer 20 Stunde Inkubation bei 37°C nach folgendem Testschema analysiert, wobei jedes Inkubationsgemisch vor der Bestimmung T : 10 mit Citrat-/Kochsalzlösung verdünnt wird: 0,2 ml Gemisch von Faktor IX-Mangelplasma -und Phospholi-25 pid/Kaolin 0,1 ml "Inkubationsgemisch", 1 : 10 verdünnt mit Citrat-/ Kochsalzlösung 1 Minute bei 37°C inkubieren '0,1 ml m/20 Calciumchlorid 30

Die Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

3. Berechnung der Restaktivität: 35 Mit den Gerinnungszeiten der sofort bestimmten Verdünnungen wird eine Eichkurve erstellt (unverdünnte Probe = - 17 - 50 Faktor IX-Einheiten/ml), indem man die Gerinnungszeiten gegen die entsprechenden Verdünnungen auf doppelt i . logarithmischem Millimeterpapier aufträgt. Die Aktivitäten (Faktor IX-Einheiten/ml) der eine Stunde inkubierten ver-5 schiedenen Verdünnungen werden nun unter Verwendung der Eichkurve berechnet und in Prozent der jeweiligen Aktivi-. täten der nicht inkubierten Verdünnungen ausgedrückt. Die , Mittelwerte der so berechneten Aktivitäten ergeben dann · die durchschnittliche Restaktivität der Probe nach einer 10 Stunde Inkubation, ausgedrückt in Prozent der Ausgangsaktivität vor Inkubation.

Immunologische Bestimmung des Inter-Alpha-Trypsin-Inhibi-tors (ITI): 15 1. Methode :

Die Bestimmung erfolgt mit der Ouchterlony-Technik, wobei ein spezifischer Antikörper gegen eine antigenhältige Probe in einem Agarmedium diffundiert. Das Antigen reagiert 20 spezifisch mit dem Antikörper und bildet eine Immunpräzipitationsbande, die als positive Reaktion gewertet wird.

2. Reagenzien:

Antiserum gegen ITI vom Kaninchen, Behringwerke AG, Mar-25 burg/Lahn, BRD

Agar: Eine Lösung von 1,25 g Agar, 0,9 g Natriumchlörid und 100 mg Natriumazid in 100 ml Wasser wird kurz aufgekocht und die heiße, homogene Lösung in einer Schichtdicke von ca.2 mm in Platten gegossen. In das abgekühlte, ver-. 30 festigte Gel' werden im Abstand von 5 mm ca. 2 mm große Löcher in 2 Reihen gestanzt.

Standard bzw. Probe:

Als Eichsubstanz dient ein Protein-Standardserum der Behringwerke mit einem definierten Gehalt an ITI. Von 35 diesem Referenzserum wird eine geometrische Verdünnungsreihe in physiologischer Natriumchlorid-Lösung (9 g .-18- ».

NaCl/1) hergestellt.

Mit der zu testenden Probe wird wie mit dem Standard verfahren.

5 3. Test:

In eine Lochreihe des Agars werden die Verdünnungen der Eichsubstanz bzw. der zu testenden Probe eingebracht, in der nebenanliegenden Lochreihe wird das unverdünnte spezifische Antiserum pipettiert. Die so beschickte Agar-10 platte wird 15 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgt die Ablesung der Immunpräzipitationen.

4. Berechnung der ITI-Konzentration:

Als Maßstab für die ITI-Konzentration einer Probe gilt 15 jene Verdünnungsstufe, bei der gerade noch eine Präzipitation sichtbar ist ("Titer” der Probe). Die ITI-Konzentration der zu testenden Probe errechnet sich wie folgt: l-iter.der.,Testprobe iTi-Konzentration des Standards 20 Titer des Standards

Die ITI-Konzentration wird in mg % (mg/100 ml) angegeben.

Die nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Präparationen hatten nach Durchführung der vorstehenden Bestimmungs-'25 methoden die folgenden Kennwerte:

Die Darstellungen in den Fig. 1 und 2 der‘Zeichnung entsprechen hinsichtlich der affinitätschromatographischen und elektrophoretischen Auftrennung den nachstehenden 30 Angaben des. Beispieles 2.

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Claims (8)

1. Blutgerinnungsfördernde Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren

2. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein mit Faktor IX-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration von 0,1 bis 0,5 (molar) und das 35' Protein mit FEIB-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration von 0,3 bis 0,5 (molar) eluiert; wobei die maximale Faktor IX-Aktivität bei 0,3 (molar) und die maximale v -22- * FEIB-Aktivität bei 0,4 (molar) eluiert.

3. Präparation.nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die FEIB-Aktivität nach einstündiger

4. Präparation nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch ge- * kennzeichnet, daß die Faktor IX-Aktivität nach ein- 10 stündiger Inkubation in Faktor IX-Mangelplasma min destens zu 50 % erhalten bleibt.

5. Präparation nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Gehalt an Inter-Alpha-

15 Trypsin-Inhibitor (ITI) von 0,05 bis 5 mg pro FEIBA- Einheit besitzt.

5 Inkubation in Faktor VIII-Inhibitor-Plasma mindestens zu 50 % erhalten bleibt. e

5 II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-By- pass-Aktivität, dadurch gekennzeichnet, - daß sie frei ist von thrombogener Aktivität bis zu • » mindestens 2 Einheiten FEIBA pro 'kg Kaninchen im Thrombose-induzierenden Aktivitätstest nach Wessler, 10. daß sie frei ist von Kallikrein-Aktivität und frei von Präkallikrein-Aktivator-Aktivität - gemessen in einer wässerigen Lösung der Präparation mit einer FEIBA-Konzentration bis zu mindestens 10 Einheiten pro ml, 15. daß sie affinitätschromatographisch an Dextransulfat- -Agarose mittels eines NaCl-Gradienten derart auftrennbar ist, daß das Protein mit Faktor iX-Aktivität bei niedrigerer NaCl-Konzentration eluiert als das Protein mit FEIB-Aktivität, 20. daß die das Protein mit Faktor IX-Aktivität und das Protein mit FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate bei elektrophoretischer Auftrennung a- und ^-Globuline enthalten, wobei die Auftrennungskurve im a-Bereich einen Hauptgipfel entsprechend 60 bis 80 % des Ge- 25 samtproteins, eine daran anschließende Schulter von 10 bis 20 % des Gesamtproteins sowie einen an den schulterförmigen Verlauf der Auftrennungskurve anschließenden schwach ausgeprägten Gipfel im ^-Globu-linbereich entsprechend einem Gehalt von 10 bis 20 % * 30 . des Gesamtproteins aufweist.

6. Verfahren zur Herstellung einer blutgerinnungsfördernden Präparation nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch < 20 gekennzeichnet, daß Humanplasma mit sulfatierten hoch polymeren Kohlehydraten und/oder mit basischen Ionenaustauschern behandelt und das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität adsorbiert wird, worauf es' durch Eluieren und Konzentrieren gewonnen wird. 25.

'7. Verfahren, nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasma zuerst mit sulfatierten hochpolymeren Kohlehydraten kurzzeitig behandelt, das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität hierauf an einem Ionenaus- 30 tauscher auf Dextranbasis adsorbiert und unmittelbar * darauf eluiert und konzentriert wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasma mit einem Ionenaustauscher auf Dextranbasis 35 behandelt und nach mindestens zweistündiger Einwirkung das an dem Ionenaustauscher adsorbierte Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität eluiert und sodann konzentriert wird.