CH646061A5

CH646061A5 - Blutgerinnungsfoerdernde praeparation auf basis von humanproteinen sowie verfahren zu ihrer herstellung.

Info

Publication number: CH646061A5
Application number: CH476881A
Authority: CH
Inventors: Johann Dr Eibl; Otto Dr Schwarz; Fritz Dr Elsinger; Anton Philapitsch
Original assignee: Immuno Ag
Priority date: 1980-07-22
Filing date: 1981-07-21
Publication date: 1984-11-15
Also published as: FR2487199B1; SE8103759L; DK155500B; AT368883B; FR2487199A1; NO157245C; NO157245B; GB2080312A; NL190268B; HU188298B; ES8203610A1; NL190268C; DK318581A; ATA378180A; SE460174B; ES504000A0; DE3127318A1; FI77048C; AR227194A1; FI812295L

Description

Die Erfindung betrifft eine blutgerinnungsfördernde Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität.

Blutgerinnungsfördernde Präparationen mit Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität, abgekürzt «FEIBA» (Faktor Eight Inhibitor-Bypassing Activity), sind bekannt. In der AT-PS 350 726 (entsprechend der US-PS 4 160 025 bzw. der DE-OS 2 734 821) ist die Herstellung einer solchen Präparation beschrieben. Sie wird bei der Behandlung von Patienten, die an Hämophilie A leiden und deren Blut einen gegen Faktor VIII gerichteten Hemmstoff (Inhibitor) enthält, mit Erfolg angewandt. Die chemische Struktur des FEIBA-Faktors ist bisher unbekannt. Man weiss nur, dass es sich um ein Protein mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 000 handelt. Die Herstellung der Präparation nach den oben genannten Patentschriften erfolgte durch Generierung aus menschlichem, Zitrat-Ionen enthaltendem Plasma in Abwesenheit von freien Calciumionen durch Behandlung mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsphysiologisch-oberflächenaktiven Stoffen, wie Kieselgel oder Kaolin, und anschliessende Adsorption und Eluierung, wobei ein Gemisch der Faktoren II, VII, IX und X, des Faktors FEIBA und anderer Proteine erhalten wird, dessen Zusammensetzung bisher nicht beschrieben ist. Obwohl, wie erwähnt, die Präparation nach der DE-OS 2 734 821 sich bei der Behandlung von Faktor Vlll-Inhibitor-Patienten als wertvoll erwiesen hat, besteht die Aufgabe, den Anwendungsbereich zu erweitern und die Verträglichkeit von FEIBA-Präparationen weiter zu verbessern, insbesondere unerwünschte Nebenreaktionen, wie thrombogene und vasoaktive Wirkungen, auf 40 ein Minimum herabzusetzen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss mit einer blutge-rinnungsfördernden Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität 45 gelöst, welche Präparation dadurch gekennzeichnet ist,

- dass sie frei ist von thrombogener Aktivität bis zu mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Kaninchen im Thrombo-se-induzierenden Aktivitätstest nach Wessler,

so - dass sie frei ist von Kallikrein-Aktivität und frei von Prä-kallikrein-Aktivator-Aktivität - gemessen in einer wässerigen Lösung von Präparation mit einer FEIBA-Konzen-tration bis zu mindestens 10 Einheiten pro ml,

- dass sie affinitätschromatographisch an Dextransulfat-55 Agarose mittels eines NaCl-Gradienten derart auftrenn-

bar ist, dass das Protein mit Faktor IX-Aktivität bei niedrigerer NaCl-Konzentration eluiert als das Protein mit FEIB-Aktivität,

- dass die das Protein mit Faktor IX-Aktivität und das Pro-60 tein mit FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate bei elektro-

phoretischer Auftrennung a- und ß-Globuline enthalten, wobei die Auftrennungskurve im a-Bereich einen Hauptgipfel entsprechend 60 bis 80% des Gesamtproteins, eine daran anschliessende Schulter von 10 bis 20% des Ge-65 samtproteins sowie einen an den schulterförmigen Verlauf der Auftrennungskurve anschliessenden schwach ausgeprägten Gipfel im ß-Globulinbereich entsprechend einem Gehalt von 10 bis 20% des Gesamtproteins aufweist.

Die vorstehend definierten Merkmale, nämlich das Freisein der Präparation von thrombogener Aktivität und von Kallikrein-Aktivität bzw. von Präkallikrein-Aktivator-Akti-vität - letztere sind für die vasoaktiven Wirkungen verantwortlich -, bedeuten, dass die Präparation eine hervorragende Verträglichkeit besitzt. Der Thrombose-induzierende Aktivitätstest und die Tests auf Kallikrein-Aktivität und Prä-kallikrein-Aktivator-Aktivität sind dem Fachmann bekannt. Im einzelnen werden diese im Anschluss an die Beispiele noch genauer angegeben.

Das dritte Merkmal der erfmdungsgemässen Präparation, die Auftrennbarkeit auf affinitätschromatographi-schem Weg an Dextransulfat-Agarose mittels eines NaCl-Gradienten ist in Fig. 1 der Zeichnung anhand eines Beispieles veranschaulicht. Die Methode der Affinitätschromatographie an Dextransulfat-Agarose ist dem Fachmann bekannt (D. S. Pepper and C. Prowse, Thrombosis Research 11 [1977], 687-692). Hierbei wird Dextransulfat (Molekulargewicht 500 000) an CNBr-aktivierte Sepharose 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) gekoppelt. Die so gewonnene Dextransulfat-Sepharose wird in 0,4% Trina-triumcitrat • 2H20-Lösung (pH 7,4) äquilibriert und in eine Säule gefüllt. Die zu untersuchende Probe wird auf die Säule aufgetragen und anschliessend mit einer NaCl-Lösung in 0,4% Trinatriumcitrat • 2HzO (pH 7,4) mit steigender NaCl-Konzentration fraktioniert eluiert.

. In Fig. 1 sind auf der Abszisse die Fraktionsnummern der Eluate aufgetragen. Auf der linken Ordinate sind die Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren in Einheiten pro ml aufgetragen und auf der rechten Ordinate die Konzentration des Natriumchlorid-Gradienten in mol/1. Der lineare Verlauf des Gradienten ist als Linie G eingetragen. Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, eluiert das Protein mit Faktor IX-Aktivität im Bereich von 0,1 bis 0,5 (molar), mit einem Maximum bei 0,3 (molar), das Protein mit FEIB-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration im Bereich von 0,3 bis 0,5 (molar), mit einem Maximum bei 0,4 (molar). Die steigende NaCl-Konzentration ist an dem NaCl-Gradienten G zu erkennen, der von 0 molar bis 0,65 molar NaCl reicht.

Schliesslich ist für die erfindungsgemässe Präparation als viertes Merkmal auch der Gehalt an Globulinen bei elektro-phoretischer Auftrennung charakteristisch, was in Fig. 2 der Zeichnung erläutert wird. Der obere Teil der Fig. 2 veranschaulicht die Auftrennungskurve der erfmdungsgemässen, die Proteine mit Faktor IX-Aktivität und FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate der Dextransulfat-Sepharose-Chroma-tographie anhand eines Beispieles, wogegen der untere Teil der Fig. 2 die elektrophoretische Auftrennungskurve eines nativen Humanplasmas wiedergibt. Es ist zu erkennen, dass bei diesem Beispiel der Hauptgipfel im a-Globulinbereich 70% des Gesamtproteins beträgt. An den Hauptgipfel schliesst sich im a-Globulinbereich eine Schulter an, die 14% des Gesamtproteingehaltes ausmacht, worauf anschliessend an die Schulter im ß-Globulinbereich ein schwach ausgeprägter Gipfel folgt, der 16% des Gesamtproteins beträgt.

Vorteilhaft besteht ein weiteres Merkmal der erfmdungsgemässen Präparation darin, dass die FEIB-Aktivität nach einstündiger Inkubation in Faktor VHI-Inhibitor-Plasma mindestens zu 50% erhalten bleibt. Diese Eigenschaft deutet auf eine länger anhaltende Wirksamkeit bei Applikation an Faktor Vlll-Inhibitor-Patienten hin.

Vorteilhaft besteht eine weitere Eigenschaft der erfmdungsgemässen Präparation darin, dass die Faktor IX-Aktivität nach einstündiger Inkubation in Faktor IX-Mangel-plasma mindestens zu 50% erhalten bleibt. Dies bedeutet, dass die Präparation wenig oder einen sehr geringen Anteil an aktiviertem Faktor IX enthält. Es ist bekannt, dass aktivierter Faktor IX in Humanplasma inaktiviert wird. Akti646061

vierter Faktor IX würde nachteilige thrombogene Wirkungen verursachen. Aus der Literatur (Proc. Nati. Acad. Sei. USA, Vol. 74, No. 7, 3028-3032, Juli 1977, «In vitro and in vivo corrélation of clotting protease activity: Effect of hepa-rin» von S.N. Gitel, R.C. Stephenson und S. Wessler) ist bekannt, dass gerade der Faktor IXa gegenüber anderen aktivierten Gerinnungsfaktoren, wie Xa und IIa (Thrombin), die höchste thrombogene Wirksamkeit besitzt.

Schliesslich besteht vorteilhaft eine Eigenschaft der blut-gerinnungsfördernden Präparation gemäss der Erfindung darin, dass sie einen Gehalt an Inter-Alpha-Trypsin-Inhibi-tor (ITI) von 0,05 bis 5 mg pro FEIBA-Einheit besitzt.

Der Gehalt an ITI bewirkt, dass die Thrombogenität der erfmdungsgemässen Präparation im Wessler-Test niedrig ist.

Die Erfindung umfasst des weiteren ein Verfahren zur Herstellung der neuen blutgerinnungsfördernden Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VIII-Inhibitor-Bypass-Aktivität, welches Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass Humanplasma mit sulfatierten hochpolymeren Kohlehydraten und/oder mit basischen Ionenaustauschern behandelt und das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität adsorbiert wird, worauf es durch Eluieren und Konzentrieren gewonnen wird.

Bei der Durchführung des Verfahrens ist darauf zu achten, dass das Plasma bzw. die Reaktionsteilnehmer frei gehalten werden von Substanzen, die die Antithrombin III-Aktivität zu steigern imstande sind, wie Heparin oder Hepa-rinoiden.

Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird das Plasma zuerst mit sulfatierten hochpolymeren Kohlehydraten kurzzeitig behandelt, das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität hierauf an einem Ionenaustauscher auf Dex-tranbasis adsorbiert und unmittelbar darauf eluiert und konzentriert.

Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird das Plasma mit einem Ionenaustauscher auf Dextran-basis behandelt und nach mindestens zweistündiger Einwirkung das an dem Ionenaustauscher adsorbierte Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität eluiert und sodann konzentriert. Bei dieser Ausführungsform ist die Generierung der FEIB-Aktivität von der Einwirkungsdauer abhängig. Diese kann bis zu 48 Stunden betragen.

Die angewendeten Verfahrensmassnahmen sind nicht kritisch und können in weiten Grenzen schwanken; so kann der pH-Wert zwischen 6 und 9 betragen, die Temperatur zwischen 0 und 40 C liegen, die angewendeten Mengen an Dextransulfat können 0,1 bis 500 mg/1 Plasma betragen, und an DEAE-Sephadex können 0,01 bis 10 g/1 Plasma eingesetzt werden. Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren kommt nicht nur natives Humanplasma, sondern auch Plasmafraktionen, z.B. Kryoüberstand und der Cohn-I-Überstand (8% Alkohol) in Frage.

Die Präparation gemäss der Erfindung und das Verfahren zu ihrer Herstellung werden in den folgenden Beispielen näher erläutert, wobei im Anschluss an die Beispiele die angewendeten Bestimmungsmethoden erläutert und die Ergebnisse tabellarisch erfasst sind.

Beispiel 1

10001 frisch gefrorenes menschliches Citratplasma werden bei 0 bis +4 °C aufgetaut und das dabei anfallende Kryo-präzipitat durch Zentrifugation bei +2 °C abgetrennt. Dem resultierenden «Kryoüberstand» werden bei einem nativen pH-Wert von 7,7 10 g Dextransulfat (Molekulargewicht 500 000) zugesetzt und 15 Minuten bei +4°C gerührt, wobei die Substanz FEIBA generiert wird.

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Hierauf werden 500 g des Anionenaustauschers DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4 °C gerührt, wobei die generierte Substanz FEIBA zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) und inerten Proteinen an das unlösliche DEAE-Sephadex adsorbiert wird.

Das DEAE-Sephadex wird unmittelbar nach dem Adsorptionsvorgang durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin verwendet werden.

Das DEAE-Sephadex wird einem zweifachen Waschpro-zess unterworfen; dabei wird das DEAE-Sephadex zuerst mit 501 einer Lösung, bestehend aus 4 g/1 Trinatriumci-trat • 2H20,7 g/1 Natriumchlorid und 18 g/1 Dinatriumhy-drogenphosphat • 12HzO in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,5, während 15 Minuten bei +4°C gerührt. Nach Abtrennung durch Filtration wird das DEAE-Sephadex mit 501 einer Lösung, bestehend aus 4 g/1 Trinatriumcitrat • 2H20 und 7 g/1 Natriumchlorid in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,5, während 15 Minuten bei 4- 4 °C gerührt und hierauf wieder durch Filtration abgetrennt.

Zur Elution wird das DEAE-Sephadex mit 251 einer Lösung, bestehend aus 30 g/1 Natriumchlorid und 1 g/1 Trinatriumcitrat • 2H20 in destilliertem Wasser, pH-Wert 7,0, während 20 Minuten bei +4 °C gerührt. Das Eluat, enthaltend die generierte Substanz FEIBA, die Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) sowie intertes Protein, wird durch Filtration gewonnen, das DEAE-Sephadex wird verworfen. Das Eluat wird über Nacht gegen 10001 destilliertes Wasser bei + 4 °C dialysiert, hierauf eingefroren und einem ersten Lyophilisationsvorgang unterworfen. In dem resultierenden Bulk-Material wird die FEIB-Aktivität bestimmt, und zwar nach der in der DE-OS 2 734 821 beschriebenen Methode.

Für die Herstellung der pharmazeutisch anwendbaren Präparation mit FEIB-Aktivität wird das Bulk-Material in so viel destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst, dass die FEIB-Aktivität zwischen 10 und 50 FEIBA-Einheiten pro ml beträgt (vorliegendenfalls 25 FEIBA-Einheiten pro ml). Nach Zusatz der nötigen Salze zur Herstellung der Isotonie und Einstellung des pH-Wertes zwischen 7,0 und 7,5 wird die Lösung durch Membranfilter geklärt und zuletzt durch ein 0,2 um Membranfilter sterilfiltriert. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen zu 20 ml in die Endbehälter verfüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.

Beispiel 2

10001 frisch gefrorenes menschliches Citratplasma werden bei 0 bis +4 °C aufgetaut und das dabei anfallende Kryo-präzipitat durch Zentrifugation bei +2 °C abgetrennt. Dem resultierenden «Kryoüberstand» werden bei einem nativen pH-Wert von 7,7 500 g des Anionenaustauschers DEAE-Sephadex A-5 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4 °C gerührt, wobei die Faktoren des Prothrombinkomplexes (II, VII, IX, X) und inerte Proteine an das DEAE-Sephadex adsorbiert werden.

Herauf wird das Gemisch 12 Stunden bei +4 °C stehen gelassen; während dieser «Kontaktzeit» wird die Substanz FEIBA generiert.

Das DEAE-Sephadex wird nach der 12stündigen «Kontaktzeit» durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin versendet werden.

Die weitere Verarbeitung des DEAE-Sephadex (zweimalige Waschung, Elution usw.) erfolgt in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Der Thrombose-induzierende Aktivitätstest nach Wessler, welcher in der Literatur, und zwar in J. Appi. Physiol. 14 (1959), 943-946, «Biologie assay of a thrombosis-inducing activity in human serum» von Stanford Wessler, Stanley M. Reimerund Mindel C. Sheps, beschrieben ist, wird folgen-dermassen ausgeführt: Pro Test werden 3 Kaninchen verwendet. Die Tiere werden mit Nembutal narkotisiert; nach zusätzlicher lokaler Anästhesie wird die herzseitige vena ju-gularis freigelegt, im Abstand von 1 bis 2 cm werden zwei Ligaturen vorbereitet.

Das zu untersuchende Präparat wird nun in der gewünschten Dosis in die der freigelegten vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene innerhalb von 15 Sekunden injiziert. Innerhalb von 10 bis 25 Sekunden nach Beendigung der Injektion des Präparates werden die vorbereiteten Ligaturen zugezogen. Das isolierte Venensegment bleibt nun 10 Minuten in situ im Kaninchen. Hierauf wird das Venenstück aus dem Tier entfernt und in einer Petrischale in einer 5% Na-triumcitrat-Lösung aufgeschnitten und der Inhalt nach folgendem Schema bewertet.

0 = kein Gerinnsel

1 = wenige makroskopisch sichtbare Fibrinpartikel

2 = einige kleine Thromben

3 = zwei oder mehr grosse Thromben

4 = ein einziger, das ganze isolierte Venensegment ausfüllender Thrombus

Der Test wird im Falle einer 4-Reaktion als positiv gewertet. Für die erfmdungsgemässe Präparation ist wesentlich, dass bei Injektion der Präparation, enthaltend bis zu mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Versuchstier, keine 4-Reaktion auftritt.

Die Bestimmung der Kallikrein-Aktivität und der Prä-kallikrein-Aktivator-Aktivität wird in folgender Weise durchgeführt.

Kallikrein

1. Methode:

Kallikrein spaltet amidolytisch para-Nitroanilin (pNA) von einem spezifischen chromogénen Substrat ab. Die Konzentration von pNA wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

2. Reagenzein

Puffer:

Lösung A: 3,03 g «TRIS» und 1,7 g Imidazol werden in

500 ml 0,ln Salzsäure gelöst und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

Lösung b: 4,04 g «TRIS» und 2,27 g Imidazol werden in

500 ml 0,ln Salzsäure gelöst und mit Wasser auf 1000 ml aufgefüllt.

Lösung C: 11,69 g Natriumchlorid werden mit Wasser auf 1000 ml gelöst.

Lösung A und B werden solange gemischt, bis ein pH-Wert von 7,9 erreicht ist. Diese Mischung wird mit dem gleichen Volumen von Lösung C versetzt.

Chromogenes Substrat S-2302 (Firma Kabi, Stockholm): H-D-Prolyl-L-phenylalanyl-L-arginin-p-nitroanilid-di-hydrochlorid 1 millimolare Lösung von S-2302:25 mg in 41 ml Wasser.

Probe:

Die Probe wird im Originalvolumen gelöst und unverdünnt in den Test eingesetzt.

3. Test:

In einem Wasserbad bei einer Temperatur von 37 °C werden in ein Plastikröhrchen

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1,0 ml Puffer, vortemperiert auf 37 °C

0,1 ml Probe

0.2.ml chromogenes Substrat S-2302

pipettiert. Diese Mischung wird in ein auf 37 °C temperiertes Fotometer eingebracht und die Zunahme der optischen Dichte pro Minute (AOD/Min.) bei einer Wellenlänge von 405 nm, bei einer Schichtdicke von 10 mm, gemessen. Die Aktivität einer Probe wird in AOD/Min. ausgedrückt.

Präkallikrein-Aktivator

1. Methode:

Aus einer gereinigten Präkallikreinpräparation (PKK) wird mittels eines Präkallikreinaktivators (PKKA) Kallikrein (KK) generiert. Das Kallikrein spaltet amidolytisch para-Nitroanilin (pNA) von einem spezifischen chromogenen Substrat ab. Die Konzentration von pNA wird photometrisch bei einer Wellenlänge von 405 nm gemessen.

2. Reagenzien:

Puffer und chromogenes Substrat entsprechen den bei der Kallikrein-Bestimmung beschriebenen Reagenzien.

Präkallikreinpräparation:

Die Herstellung der Präparation erfolgt nach einer Vorschrift von Harpel, modifiziert von M.S. Horowitz (New York Blood Center). Dabei wird humanes Citratplasma mit Hilfe einer DEAE-Cellulose behandelt. Die nicht an DEAE-Cellulose gebundene Fraktion enthält das Präkallikrein.

Positive Kontrolle (Standard):

Als Standard (= Bezugswert) wird eine Albuminpräparation des Bureau of Biologics (BoB) der Food and Drug Administration, Bethesda, Maryland 20205, USA, verwendet. Diese Präparation enthält einen Präkallikreinaktivator. Die Kallikreingeneration mit diesem BoB-Standard stellt den Bezugswert 1 dar bzw. wird gleich 100% gesetzt.

Probe:

Die Probe wird im Originalvolumen gelöst und unver-dünne in den Test eingesetzt.

3. Test:

0,05 ml Präkallikreinpräparation

0,05 ml Probe a) BoB-Standard für den Bezugswert b) Testprobe (in einem zweiten Testansatz)

pipettiert. Nach einer Inkubation von 10 Minuten bei 37 °C wird

0,7 ml Pufferlösung

0,1 ml chromogenes Substrat S-2302 pipettiert. Diese Mischung wird in ein auf 38 °C temperiertes Fotometer eingebracht und die Zunahme der optischen Dichte pro Minute (AOD/Min.) bei einer Wellenlänge von 405 nm, bei einer Schichtdicke von 10 mm, gemessen. Die Aktivität einer Probe (AOD/Min.) wird faktoriell - gegenüber dem BoB-Standard mit der Zahl 1 - bzw. in % vom BoB-Standard ausgedrückt.

Die Charakterisierung der erfmdungsgemässen Präparation durch affinitätschromatographische Auftrennung der Präparation an Dextransulfat-Sepharose wurde bereits in Verbindung mit Fig. 1 beschrieben.

Die elektrophoretische Auftrennung der Proteine mit Faktor IX-Aktivität und mit FEIB-Aktivität, auf die in Verbindung mit Fig. 2 hingewiesen wird, kann in folgender Weise durchgeführt werden.

Als Träger für die elektrophoretische Auftrennung der verschiedenen Proteine dient eine Celluloseacetat-Membran, welche mit dem Elektrophoresepuffer (pH 8,6, Ionenstärke

0,075) befeuchtet ist. Auf dieser Membran werden die zu analysierenden Proben - zusammen mit einem normalen Humanplasma als Standard - aufgetragen und hierauf im elektrischen Feld aufgetrennt; Die Trennung erfolgt da-s durch, dass verschieden geladene Proteine im elektrischen Feld verschieden rasch wandern. Zu diesem Zweck wird die mit den Proben versehene Membran in einer speziellen, mit Elektrophoresepuffer gefüllten Zelle 16 bis 18 Minuten bei einer Spannung von 250 Volt und 4 bis 6 Milliampere an-lo fänglicher Stromstärke behandelt.

Nach Beendigung des Trennvorganges werden die verschiedenen Proteine durch Einlegen der Membran in eine Fixier* bzw. Färbelösung sichtbar gemacht. Nach einigen Spülbädern wird die Membran in einem weiteren Bad transis parent gemacht, auf eine Glasplatte aufgetragen und in einem Trockenschrank bei 100 °C getrocknet.

Die getrocknete Membran wird nun in einem automatisch registrierenden und integrierenden Densitometer analysiert und ergibt Auftrennungskurven, wie in Fig. 2 darge-20 stellt. Die verschiedenen Proteine erscheinen dabei als verschieden starke Banden, deren Flächen den Relativprozentwerten der entsprechenden Proteine proportional sind, wobei diese Flächen durch die automatische Integration des Densitometers bestimmt werden.

2s Die Zuordnung der verschiedenen Banden bzw. Proteine der Testprobe zu definierten Proteinen bzw. Proteingruppen erfolgt durch Vergleich mit den Banden des als Standard mit- > analysierten normalen Humanplasmas. Letzteres wird bei der elektrophoretischen Analyse in 5 Proteingruppen aufge-30 trennt, welche definitionsgemäss - in der Reihenfolge abnehmender Wanderungsgeschwindigkeiten im elektrischen Feld - wie folgt bezeichnet werden: Albumin, a-Globuline, ß-Globulin, Fibrinogen und y-Globulin.

Die Definition der FEIBA-Einheit sowie ihre Bestim-35 mung (Wirksamkeitstest) ist in der Literatur, und zwar in der AT-PS 350 726 (US-PS 4 160 025, DE-OS 2 734 821) beschrieben. Die Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X ist ebenfalls in der vorgenannten Literatur beschrieben.

40 Die Bestimmung der Restaktivität von FEIBA nach Inkubation in Faktor Vlll-Inhibitor-Plasma wird in folgender Weise durchgeführt.

1. Reagenzien:

Die zu verwendenden Reagenzien sind in Verbindung 45 mit der Bestimmung der FEIBA-Einheiten (Wirksamkeitstest) in der AT-PS 350 726 (US-PS 4 160 025, DE-OS 2 734 821) beschrieben.

2. Test:

so Von einer auf 50 FEIBA-Einheiten/ml eingestellten Präparation werden mit einer Lösung von 7 g/1 Natriumchlorid und 7 g/1 Natriumeitrat • 2HzO als Verdünnungsmittel folgende Verdünnungen hergestellt: 1:2,1:4,1:8,1:16,1:32 und 1:64. Von diesen 6 Verdünnungen wird jeweils eine 55 10-Verdünnung in Faktor Vlll-Inhibitor-Plasma hergestellt (0,05 ml vorverdünnte Probe + 0,45 ml Faktor VIII-Inhibitor-Plasma).

Diese 1:10-Verdünnungen in Faktor Vlll-Inhibitor-Plas-ma («Inkubationsgemische») werden nun sofort und nach 60 einer Stunde Inkubation bei 37 °C nach folgendem Testschema analysiert:

0,1 ml «Inkubationsgemisch»

0,1 ml Phospholipid-Kaolin-Suspension 1 Minute bie 37 °C inkubieren ss 0,1 ml m/40 Calciumchlorid

Die Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr wie im Wirksamkeitstest gemessen.

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3. Berechnung der Restaktivität:

Analog zur Beschreibung im Wirksamkeitstest wird nun mit den Gerinnungszeiten der sofort bestimmten Verdünnungen eine Eichkurve erstellt (unverdünnte Probe = 50 FEIBA-Einheiten/ml). Die Aktivitäten (FEIBA-Einheiten/ ml) der eine Stunde inkubierten verschiedenen Verdünnungen werden nun unter Verwendung der Eichkurve berechnet und in Prozent der jeweiligen Aktivitäten der nicht inkubierten Verdünnungen ausgedrückt. Die Mittelwerte der so berechneten Aktivitäten ergeben dann die durchschnittliche Restaktivität der Probe nach einer Stunde Inkubation, ausgedrückt in Prozent der Ausgangsaktivität vor Inkubation.

Die Bestimmung der Restaktivität von Faktor IX nach Inkubation in Faktor IX-Mangelplasma wird in folgender Weise durchgeführt:

1. Reagenzien:

Faktor IX-Mangelplasma: Citratplasma eines Patienten mit schwerer Hämophilie B (Faktor IX unter 1%),

Phospholipid/Kaolin-Suspension: PTT-Reagenz der Firme Immuno Diagnostica Ges.m.b.H. Für die Testung wird die erforderliche Menge Faktor IX-Mangelplasma mit einem gleichen Volumen Phospholipid/Kaolin-Suspension gemischt, 5 Minuten bei 37 °C inkubiert und dann während der Testperiode in einem Eisbad aufbewahrt.

Citrat-/Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für Proben: 7 g/1 Trinatriumcitrat • 2H20,7 g/1 Natriumchlorid Cal-ciumchlorid m/20 (0,05 molar): während der Testperiode bei 37 °C aufbewahren.

2. Test:

Von einer auf 50 Faktor IX-Einheiten/ml eingestellten Präparation werden 7 geometrische Verdünnungen (1:2,1:4 usw. bis 1:128) mit Citrat-/KochsaIzlösung hergestellt. Von der unverdünnten Probe sowie von den 7 geometrischen Verdünnungen wird jeweils eine 1:10-Verdünnung in Faktor IX-Mangelplasma hergestellt (0,05 ml vorverdünnte Probe + 0,45 ml Faktor IX-Mangelplasma).

Diese 1:10-Verdünnungen in Faktor IX-Mangelplasma («Inkubationsgemische») werden nun sofort und nach einer Stunde Inkubation bei 37 °C nach folgendem Testschema analysiert, wobei jedes Inkubationsgemisch vor der Bestimmung 1:10 mit Citrat-/Kochsalzlösung verdünnt wird:

0,2 ml Gemisch von Faktor IX-Mangelplasma und Phospholipid/Kaolin

0,1 ml «Inkubationsgemisch», 1:10 verdünnt mit Citrat-/Kochsalzlösung 1 Minute bei 37 °C inkubieren

0,1ml m/20 Calciumchlorid

Die Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

3. Berechnung der Restaktivität:

Mit den Gerinnungszeiten der sofort bestimmten Verdünnungen wird eine Eichkurve erstellt (unverdünnte Probe = 50 Faktor IX-Einheiten/ml), indem man die Gerinnungszeiten gegen die entsprechenden Verdünnungen auf doppelt logarithmischem Millimeterpapier aufträgt. Die Aktivitäten (Faktor IXrEinheiten/ml) der eine Stunde inkubierten verschiedenen Verdünnungen werden nun unter Verwendung der Eichkurve berechnet und in Prozent der jeweiligen Aktivitäten der nicht inkubierten Verdünnungen ausgedrückt. Die Mittelwerte der so berechneten Aktivitäten ergeben dann die durchschnittliche Restaktivität der Probe nach s einer Stunde Inkubation, ausgedrückt in Prozent der Ausgangsaktivität vor Inkubation.

Immunologische Bestimmung der Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitors (ITI)

io 1. Methode:

Die Bestimmung erfolgt mit der Ouchterlony-Technik, wobei ein spezifischer Antikörper gegen eine antigenhaltige Probe in einem Agarmedium diffundiert. Das Antigen reagiert spezifisch mit dem Antikörper und bildet eine Immun-ls präzipitationsbande, die als positive Reaktion gewertet wird.

2. Reagenzien:

Antiserum gegen ITI vom Kaninchen, Behringwerke AG, Marburg/Lah, BRD 20 Agar:

Eine Lösung von 1,25 g Agar, 0,9 g Natriumchlorid und 100 mg Natriumazid in 100 ml Wasser wird kurz aufgekocht und die heisse, homogene Lösung in einer Schichtdicke von ca. 2 mm in Platten gegossen. In das abgekühlte, verfestigte 25 Gel werden im Abstand von 5 mm ca. 2 mm grosse Löcher in 2 Reihen gestanzt.

Standard bzw. Probe:

Als Eichsubstanz dient ein Protein-Standardserum der Behringwerke mit einem definierten Gehalt an ITI. Von die-3o sem Referenzserum wird eine geometrische Verdünnungsreihe in physiologischer Natriumchlorid-Lösung (9 g NaCl/1) hergestellt.

Mit der zu testenden Probe wird wie mit dem Standard verfahren.

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3. Test:

In eine Lochreihe des Agars werden die Verdünnungen der Eichsubstanz bzw. der zu testenden Probe eingebracht, in der nebenanliegenden Lochreihe wird das unverdünnte 40 spezifische Antiserum pipettiert. Die so beschickte Agarplat-te wird 15 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschliessend erfolgt die Ablesung der Immunpräzipitationen.

4. Berechnung der ITI-Konzentration:

45 Als Massstab für die ITI-Konzentration einer Probe gilt jene Verdünnungsstufe, bei der gerade noch eine Präzipitation sichtbar ist («Titer» der Probe). Die ITI-Konzentration der zu testenden Probe errechnet sich wie folgt:

50

Titer der Testprobe Titer des Standards x ITI-Konzentration des Standards

Die ITI-Konzentration wird in mg % (mg/100 ml) angegeben.

Die nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Präparatio-55 nen hatten nach Durchführung der vorstehenden Bestimmungsmethoden die folgenden Kennwerte:

Die Darstellungen in den Fig. 1 und 2 der Zeichnung entsprechen hinsichtlich der affinitätschromatographischen und elektrophoretischen Auftrennung den nachstehenden Anga-6o ben des Beispieles 2.

7

646 061

FEIBA-Präparation hergestellt nach Beispiel 1 Beispiel 2

FEIBA-Einheiten/ml

Faktor II-Einheiten/ml Faktor VII-Einheiten/ml Faktor IX-Einheiten/ml Faktor X-Einheiten/ml

Thrombogene Aktivität im Wessler-Test: frei von thrombogener Wirkung bis zu einer Dosierung von

Affinitätschromatographie an Dextransulfat-Sepharose F. IX-Aktivität eluiert bei Maximale F. IX-Aktivität eluiert bei FEIB-Aktivität eluiert bei Maximale FEIB-Aktivität eluiert bei

Elektrophoretische Auftrennung des Proteins mit F. IX-

und FEIB-Aktivität a-Globulin, Hauptgipfel a-Globulin, Schulter

ß-Globulin

Kallikrein-Aktivität Präkallikrein-Aktivator-Aktivität

% Restaktivität FEIBA nach 1 Stunde Inkubation in F. Vlll-Inhibitor-Plasma

%Restaktivität Faktor IX nach 1 Stunde Inkubation in F. IX-Mangelplasma

Inter- Alpha-T rypsininhibitor

26,0

25,8

24.0 28,2

24.1

10 FEIBA-E/kg

0,14-0,49 m NaCl 0,31 mNaCl 0,33-0,49 m NaCl 0,41 m NaCl

67% 16% 17%

0 0

65%

60%

0,6 mg/FEIBA-E

24,2

23.0 26,5 27,4

22.1

4 FEIBA-E/kg

0,13-0,50 m NaCl 0,30 m NaCl 0,31-0,50 m NaCl 0,40 m NaCl

70% 14% 16%

0 0

57%

55%

0,2 mg/FEIBA-E

35

40

45

50

55

60

65

1 Blatt Zeichnungen

Claims

646061

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Blutgerinnungsfördernde Präparation auf Basis von Humanproteinen mit einem Gehalt an den Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X und einer Faktor VHI-Inhibitor-Bypass-Aktivität, dadurch gekennzeichnet,

- dass sie frei ist von thrombogener Aktivität bis zu mindestens 2 Einheiten FEIBA pro kg Kaninchen im Thrombo-se-induzierenden Aktivitätstest nach Wessler,

dass sie frei ist von Kallikrein-Aktivität und frei von Prä-kallikrein-Aktivator-Aktivität- gemessen in einer wässerigen Lösung der Präparation mit einer FEIBA-Konzentra-tion bis zu mindestens 10 Einheiten pro ml,

- dass sie affinitätschromatographisch an Dextransulfat-Agarose mittels eines NaCl-Gradienten derart auftrennbar ist, dass das Protein mit Faktor IX-Aktivität bei niedrigerer NaCl-Konzentration eluiert als das Protein mit FEIB-Aktivität,

- dass die das Protein mit Faktor IX-Aktivität und das Protein mit FEIB-Aktivität enthaltenden Eluate bei elektro-phoretischer Auftrennung a- und ß-Blobuline enthalten, wobei die Auftrennungskurve im a-Bereich einen Hauptgipfel entsprechend 60 bis 80% des Gesamtproteins, eine daran anschliessende Schulter von 10 bis 20% des Gesamtproteins sowie einen an den schulterförmigen Verlauf der Auftrennungskurve anschliessenden schwach ausgeprägten Gipfel im ß-Globulinbereich entsprechend einem Gehalt von 10 bis 20% des Gesamtproteins aufweist.
2. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mit Faktor IX-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration von 0,1 bis 0,5 (molar) und das Protein mit FEIB-Aktivität bei einer NaCl-Konzentration von 0,3 bis 0,5 (molar) eluiert, wobei die maximale Faktor IX-Aktivität bei 0,3 (molar) und die maximale FEIB-Aktivität bei 0,4 (molar) eluiert.
3. Präparation nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die FEIB-Aktivität nach einstündiger s Inkubation in Faktor VHI-Inhibitor-Plasma mindestens zu 50% erhalten bleibt.
4. Präparation nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Faktor IX-Aktivität nach einstündiger Inkubation in Faktor IX-Mangelplasma mindestens zu io 50% erhalten bleibt.
5. Präparation nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Gehalt an Inter-Alpha-Trypsin-Inhibitor (ITI) von 0,05 bis 5 mg pro FEIBA-Einheit besitzt.
6. Verfahren zur Herstellung einer blutgerinnungsför-

i5 dernden Präparation nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Humanplasma mit sulfatierten hoch-polymeren Kohlehydraten und/oder mit basischen Ionenaustauschern behandelt und das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität adsorbiert wird, worauf es durch

20 Eluieren und Konzentrieren gewonnen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasma zuerst mit sulfatierten hochpolymeren Kohlehydraten kurzzeitig behandelt, das Proteingemisch mit generierter FEIB-Aktivität hierauf an einem Ionenaustauscher

25 auf Dextranbasis adsorbiert und unmittelbar darauf eluiert und konzentriert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasma mit einem Ionenaustauscher auf Dextranbasis behandelt und nach mindestens zweistündiger Einwir-

30 kung das an dem Ionenaustauscher adsorbierte Proteinge-misch mit generierter FEIB-Aktivität eluiert und sodann konzentriert wird.