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Die vorliegende Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Präparat, insbesondere zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, enthaltend Prothrombin.
Haemophilie A entsteht durch einen X-chromosomal-rezessiv-erblichen Mangel an Faktor VIII und manifestiert sich in schweren Blutgerinnungsstörungen. Zur aktuellen Blutstillung werden meist gerinnungsaktive Plasmakonzentrate eingesetzt, vorwiegend Faktor VIII-Konzentrate. Bel der klassischen Behandlung von Haemophilie A-Patienten mit Faktor VIII-Präparaten kommt es in rund 20 % der Fälle jedoch zur Bildung von Antikörpern gegen Faktor VIII, welche zu einer Inhibierung der Wirkung der verabreichten Faktor VIII-Präparate führen. Man spricht dann davon, dass ein Patient einen funktionellen Inhibitor gegen Faktor Vill gebildet und eine sogenannte Faktor VIII-Hemm- körperhaemophilie entwickelt hat.
Für die Therapie von Haemophilie A-Patienten mit einer Faktor Vlil-Hemmkörperhaemophilie werden gegenwärtig mehrere Methoden angewendet :
1. ) Behandlung mit hohen Dosen eines Faktor VIII-Präparates :
Damit wird der gegen Faktor VIII gerichtete Antikörper in vivo neutralisiert und der überschüssige Faktor VIII kann seine haemostatische Cofaktoraktivität entfalten. Durch wiederholte Verabreichung über einen längeren Zeitraum wird der betroffene Patient gegen Faktor VIII desensibilisiert und kann anschliessend in vielen Fällen der üblichen Faktor VIII-Konzentrattherapie unterzogen werden. Diese Vorgangsweise benötigt ausserordentlich grosse Mengen Faktor VIII, ist zeitaufwendig und kann zu Beginn der Behandlung mit massiven anaphylaktischen Nebenwirkungen behaftet sein.
2. ) Behandlung von Faktor VIlI-lnhibitorpatienten mit Immunglobulinpräparaten, antiidiotypi- sche Faktor Vil-Antikörper enthalten
Dieser Therapteweg ist derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Für die Effizienz einer solchen Behandlung besteht heute noch keine abschliessende Beurteilungsmöglichkeit.
3. ) Immunadsorption :
Eine weitere aufwendige Methode zur Entfernung der Faktor VIII-Inhibitoren ist die extrakorporale Immunabsorption an entweder Lektine, die Immunglobuline binden (Protein A, Protein G), oder immobilisierten Faktor Vil, an welchem der gegen Faktor VIII gebildete Antikörper gebunden wird. Diese Methode ist für den Patienten aufwendig, weil er dabei an eine Apheresemaschine gebunden ist, kann so wie die vorangegangenen zu keiner Stillung einer akuten Blutung führen und ist ausserdem teuer.
4. ) APCC und Derivate :
Therapie der Wahl ist derzeit die Gabe von aktivierten Prothrombinkomplexkonzentraten (APCC), FEIBA, AUTOPLEX, die bei Patienten auch mit hohem Hemmkörpertiter zur Stillung akuter Blutungen eingesetzt werden können (siehe z. B. DE 31 27318 C (2)).
Basierend auf den aktivierten Prothrombinkomplexfaktoren-Konzentraten wurde ein Bestandteil, welcher in diesen u. a. auch enthalten ist, nämlich aktivierter Faktor Vlla, als therapeutisches Prinzip für Faktor VIlI-lnhibitorpatienten über den Weg der extrinsische Gerinnung vorgeschlagen. Ein entsprechendes Präparat, nämlich rekombinanter Faktor Vlla, Ist derzeit in klinischer Erprobung (Hedner et al., Transfusion Medicine Reviews 7 (2) : 78-83 (1993)). Praklinische Untersuchungen, z. B. an Hunden mit Haemophilie A, haben jedoch gezeigt, dass die Behandlung mit rekombinantem Faktor Vlla ineffektiv ist. Ähnlich ist auch die Erfolgsrate in der Humananwendung nur schwankend.
Ein weiterer Nachteil des rekombinanten Faktor Vlla besteht darin, dass dieser aufgrund seiner kurzen in vivo-Halbwertszeit oftmalig in hohen Dosen pro Tag gegeben werden muss, um schwere Blutungen, wenn überhaupt, beherrschen zu können. In solchen Fällen wird versucht, Faktor Vlla gemeinsam mit Antifibrinolytika zu verabreichen, um die Wirkung zu unterstützen.
In der Literatur (z. B. DE 44 16 180 A1) wurde auch vorgeschlagen, eine Kombination von
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Faktor Xa und Phospholipid therapeutisch zur Behandlung von Haemophilie A-Inhibitorpatienten einzusetzen. In vivo-Versuche an Faktor VIII-defizienten Hunden mit Inhibitor zeigen, dass eine derartige Kombination in einer geeigneten Dosierung in der Lage ist, eine akute Blutung zu stillen.
Die therapeutische Breite eines solchen Präparates ist jedoch verhältnismässig gering, weil die effektive und die thrombogene Dosis, was z. B. im Wessler-Modell im Kaninchen gezeigt werden kann, eng beieinander liegen, da insbesondere Phospholipide ein erhöhtes ThrombogenizitätsRisiko darstellen.
Ein Präparat enthaltend Prothrombin und Faktor Xa zeigt eine FEIBA-vergleichbare biologische Wirksamkeit in Tiermodellen und ist in der Lage, die Gerinnungszeit eines Faktor VIII-lnhibitorplas- mas deutlich zu verringern. Es kann die verlängerte Blutungszeit und Blutungsneigung von Faktor VIlI-lnhibitorkaninchen und von von Willebrand-Faktor-Inhibitorkaninchen gänzlich normalisieren.
Durch das Bereitstellen von gereinigtem Prothrombin und gereinigtem Faktor Xa ist die Toxizität dieses Präparates im Vergleich zu FEIBA deutlich reduziert. Die effektive Kombination von Faktor Xa und Prothrombin ist im Wess ! er-Thrombose-tv) odeii (J. Appi. Phys. 14 (1959), 943-946) negativ, d. h., es können für diese Kombination auch bei sehr hohen Dosen keine thrombogenen Effekte im Wessler-Modell nachgewiesen werden.
Bei diesem Thrombogenitätsmodell werden Kaninchen mit Pentobarbital narkotisiert, dann wird unter zusätzlicher Lokalanästhesie die Vena jugulars freipräpariert und mit losen Ligaturen im Abstand von 2 cm versehen. Schliesslich wird die zu testende Substanz, in die der Vena jugulars gegenüberliegende Ohrvene innerhalb von 15 s injiziert. Nach weiteren 25 sek werden die Ligaturen zugezogen, und es wird 10 min gewartet bis das abgebundene Venenstück entnommen und in einer mit Citratpuffer gefüllten Petrischale aufgeschnitten und bewertet werden kann. Die Bewertungskriterien, modifiziert nach Wessier, sind : keine Thrombenbildung = 0, wenige kleine Thromben =0, 5-1, wenige mittelgrosse und viele kleine Thromben = 2, viele mittelgrosse Thromben = 3, wenige grosse Thromben = 3, 5, ein zusammenhängender Thrombus = 4.
Die Komponenten dieses Präparates sind vorzugsweise bis zu einer derartigen Reinheit aufgereinigt, dass es sogar bei einer Dosis von mindestens 150 E Prothrombin/kg frei an thromboembohschen Nebenwirkungen, ausgedrückt durch einen Score im Wessler-Thrombosemodell von höch- stens 3, vorzugsweise höchstens 2, insbesondere weniger als 2 Punkten, ist. Prothrombin ist in diesem Kombinationspräparat, vorzugsweise in einer spezifischen Aktivität von mindestens 5 E/mg Protein, noch bevorzugter mindestens 6, insbesondere mindestens 7, entsprechend 50,60 oder 70 % der theoretischen Reinheit, enthalten. Die eingesetzte Faktor Xa-Präparation sollte vorzugsweise eine spezifische Aktivität von mindestens 100 E/mg Protein aufweisen, wobei Faktor Xa vorzugsweise vorwiegend als Faktor Xass enthalten ist.
Dieses Präparat sollte möglichst frei an Thrombin sein, wobei die Freiheit an Thrombin durch
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genen Substrat TH-1 der IMMUNO AG. ).
Es zeigte sich, dass, wenn Prothrombin und Faktor Xa in diesem Präparat als Komplex vorliegen, das Präparat eine erhöhte Stabilität gegenüber herkömmlichen Präparaten aufweist und der Komplex darüberhinaus noch einer weiteren Behandlung zur Reinigung und/oder Inaktivierung von Viren unterzogen werden kann. Bei einer bevorzugten Ausführungsform dieses Präparates umfasst dieses weiters Antithrombin 111 in stabilisierenden Mengen, gegebenenfalls gemeinsam mit Heparin, wobei jedoch auch bei einem solchen Präparat die Freiheit an thromboembolischen Nebenwirkungen gemäss dem Wessler-Test in Abwesenheit bzw. auch nach Demaskierung des Heparins, d. h. Neutralisation und/oder Abtrennung des Heparins, nachgewiesen werden kann, in dem Sinne, dass der Wert von 3 Punkten nicht erreicht wird.
Ein Komplex, bestehend aus Prothrombin und Faktor Xa, insbesondere in hochgereinigter Form, hat als "partieller Prothrombinase-Komplex" grundlegende Bedeutung. Die Aktivität eines Präparates auf Basis dieses Komplexes kann durch die Gegenwart von Calciumionen, wie Calciumchlorid, um ein Vielfaches beschleunigt werden. Auch hat sich herausgestellt, dass ein Präparat, enthaltend diesen Komplex und weiters Caiciumionen, zur Herstellung eines Reagens für diagnostische Zwecke verwendet werden kann. Ein Reagens, welches weiters Thrombinaktivität und gegebenenfalls Phospholipide enthält, ist beispielsweise zur Bestimmung der Faktor VCofaktoraktivität geeignet.
Ein diagnostisches Verfahren unter Verwendung dieses Reagens mit bzw. ohne aktiviertem Protein C, einem proteolytischen Inaktivator von Faktor V, ermöglicht darü-
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berhinaus noch die Abschätzung eines Ausmasses einer Inaktivierung von Faktor V bzw. eine mutationsbedingte Resistenz gegenüber aktiviertem Protein C.
In der EP 0 286 198 A2 werden Blutgerinnungsenzym-Zusammensetzungen beschrieben, die Prothrombin (Faktor 11) oder Faktor VII oder Faktor IX oder Faktor X oder Faktor XI, oder den Hageman-Faktor enthalten. Beschrieben werden insbesondere Prothrombinkomplexkonzentrate (enthaltend die Faktoren 11, VII, IX, und X) und Faktor IX-Konzentrate. Die gemäss der EP 0 286 198 A2 erhaltenen Zusammensetzungen enthalten gemäss der offenbarten und zum damaligen Zeitpunkt für derartige Präparate bekannten Herstellungsmethoden zwingend Phospholipide und weisen daher ein teilweise beträchtliches thrombogenes Potential auf.
Die vorliegende Erfindung stellt sich daher zur Aufgabe, die Nachteile der im Stand der Technik geschilderten Methoden zu vermeiden und ein Therapieprinzip für die Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, insbesondere für die Behandlung von Faktor VIII-Hemmkörperhaemophilie, zur Verfügung zu stellen, welches - analog zum beschriebenen Prothrombin/Faktor Xa-Kombinationspräparat-u. a. eine einfache Anwendung, einen effektiven Wirkungseintritt, eine verlängerte Halbwertszeit sowie eine Vermeidung von thrombogenen Nebenwirkungen ermöglicht.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss mit einer pharmazeutischen Präparation zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen enthaltend gereinigtes Prothrombin als aktive Komponente gelöst Prothrombin ist dabei zumindest so weit gereinigt, dass es von endogenen, d. h. aus dem Ausgangsmaterial stammenden, Phospholipiden befreit ist.
Überraschenderweise wurde im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch festgestellt, dass ein pharmazeutisches Präparat, enthaltend gereinigtes Prothrombin als einzige aktive Komponente eine dem beschriebenen Kombinationspräparat vergleichbare Wirkung bei der Behandlung von Gerinnungsstörungen aufweist und dies, obwohl mit Prothrombin alleine in vitro keine Verkürzung der Gerinnungszeit eines Faktor VIII-lnhibitorplasmas erzielt werden konnte.
Damit wird erstmals eine medizinische Indikation für eine pharmazeutische Präparation, die Prothrombin als einzige Wirkstoffkomponente beinhaltet, aufgezeigt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein pharmazeutisches Präparat, insbesondere zur Behandlung von Gerinnungsstörungen, enthaltend gereinigtes Prothrombin, weiches frei von Phospholipiden ist, als einzige aktive Komponente.
Vorzugsweise Ist das Prothrombin bis zu einem Grad aufgereinigt, dass es sogar bei einer Dosis von mindestens 150 E Prothrombin/kg frei an thromboembolischen Nebenwirkungen, ausgedrückt durch einen Score im Wessler-Thrombosemodell von höchstens 3, vorzugsweise höchstens 2, insbesondere weniger als 2 Punkten ist.
Das erfindungsgemässe Prothrombinpräparat enthält bevorzugterweise weniger als 0, 1 E Faktor VIII : C oder Faktor VIII : Ag/E Prothrombin bzw. weniger als 0, 1 E Faktor IX/E Prothrombin bzw. weniger als 0, 1 E Faktor X/E Prothrombin. Dadurch kann die unerwünschte Bildung von bzw Reaktion mit Antikörpern gegen diese Proteine effizienter hintangehalten und das Risiko von Nebenwirkungen verringert werden.
Das erfindungsgemässe Präparat enthält vorzugsweise weniger als 0, 01 mg Phospholipide/E Prothrombin, was aufgrund der möglichen thrombogenen Wirkung von Phospholipiden zu einer erheblichen Verringerung des Thrombogenizitätsrisikos führt. Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemässe Präparat frei von nachweisbarem Phospholipid.
Die Dosierung des erfindungsgemässen Präparates orientiert sich an der Dosierung der äquivalenten Komponente in FEIBA. Die Factor Eight Inhibitor Bypassing-Aktivität (FEIBA) wird definiert als jene Aktivität einer derartigen Präparation, die die Gerinnungszeit eines Faktor VIt-inhibitorplasmas in einem Gerinnungstest, wie er in der AT 350 726 B beschrieben wird, auf 50 % des Leerwertes reduziert. Die Vorteile des erfindungsgemässen Präparates im Vergleich zu FEIBA liegen bedingt durch die hohe Reinheit des Prothrombins in einer reduzierten Belastung des Patienten mit Plasmaproteinen, die zur Therapie der Faktor VIlI-lnhibitorhaemophilie nicht immer oder unbedingt erforderlich sind. Insbesondere ist durch das Fehlen von Faktor V ! t) : Ag die anaphylaktische Nebenwirkung ausgeschlossen.
Es ist daher möglich, das erfindungsgemässe Präparat In einer Dosis zu verabreichen, welche mindestens 50 E Prothrombin/kg Körpergewicht umfasst, wobei diese Dosis auf Grund der Nebenwirkungsfreiheit erstmalig bei dieser Art von Präparat sogar in einer Bolusinjektion verabreicht werden kann, womit die ansonsten langwierige Verabreichung derart hoher Dosen vermieden werden kann.
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Üblicherweise wird das erfindungsgemässe Präparat in einer Dosis von 50 bis 150 E Prothrombin/kg Körpergewicht verabreicht, wobei die maximalen Dosen jedoch auch weit über den 150 E/kg Körpergewicht liegen können (z. B. bis 300 bzw. bis 500), ohne dass es zu thromboembolischen Nebenwirkungen kommen kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Darreihungsformen des erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparates, welche eine Dosis von mindestens 50 E Prothrombin/kg Körpergewicht, vorzugsweise zwischen 50 und 500 E/kg Körpergewicht, umfassen.
Diese Darreichungsformen können bereits zur direkten Verabreichung vorgesehene Ampullen, Spritzen, oder ähnliche direkt oder indirekt applizierbare Formen sein. Dazu zählen Behälter geeignet zur Infusion, intramuskulären bzw. subkutanen Anwendung oder Sets, bestehend aus Behälter mit den Wirkstoffen als Lyophilisat und einem Behälter mit einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung, geeignet zur Rekonstitution des Lyophilisas. Üblicherweise enthält die pharmazeutisch akzeptable Lösung bzw. das pharmazeutische Präparat Salze, Konservierungsstoffe, Puffer und dgl. in einer wässerigen Lösung (siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Aufl., Easton : Mack Publishing Co., S. 1405-1412 und 1461-1487 (1975) und The National Formulary XIV., 14.
Aufl., Washington : American Pharmaceutical Association (1975)). Beispielhaft für nicht-wässerige Lösungen sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle und injizierbare organische Ester, wie Ethyloleat. Wässerige Träger sind beispielsweise Wasser, gegebenenfalls mit Alkohol gemischt, Salzlösungen (NaCI), Ringer's Dextrose, etc.. Als Konservierungsstoffe können antimikrobielle Substanzen, Antioxidantien, Chelatbildner oder Inertgase verwendet werden.
Prothrombin kann sowohl plasmatische Ursprungs als auch durch rekombinante DNATechnologie hergestellte Proteine sein. Wesentlich ist in beiden Fällen, dass sie in gereinigter Form, insbesondere in einer von endogenen und exogenen Phospholipiden befreiter Form im pharmazeutischen Präparat vorliegen.
Bevorzugterweise wird das erfindungsgemässe pharmazeutische Präparat in Iyophilisierter Form zur Verfügung gestellt, was die bekannten Transport-, Lagerungs- und Applikationsvorteile mit sich bringt. Als Rekonstitutionslösung bietet sich eine pharmazeutisch akzeptable Lösung an, die gegebenen ATIII bzw. Heparin enthält. Durch den hohen Reinheitsgrad des erfindungsgemä- ssen Präparates kann dieses nach geringer Lösungszeit, vorzugsweise unter 5 min, insbesondere unter 1 min, zu einer optisch klaren Lösung mit mindestens 10 E Prothrombin/mi rekonstituiert werden, wobei sogar Konzentrationen von bis zu 200 E Prothrombin/ml Lösung erreicht werden können.
Eine optisch klare Lösung ist dabei definiert durch ein Maximum der Extinktion bei 600 nm von 0, 1 (für eine Lösung mit mindestens 5 Gew. % Proteingehalt, bei einer Schichtdicke von 1 cm), bezogen auf die reine (Puffer-) Lösung als Referenz. Alternativ dazu gilt auch eine Lösung mit weniger als 70 Light Scattering Units (LSU), ermittelt durch Messung im Nephelometer bei 340 nm und einer Schichtdicke von 1 cm als klar.
Das erfindungsgemässe Präparat ist im Gegensatz zu den bisher bekannten Präparaten zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen ausserordentlich stabil, d. h., es kann für eine längere Zeitperiode vor der Verabreichung stehen gelassen werden. Beispielsweise sollte FEIBA im verabreichungsfertigen Zustand gemäss der Produktinformation nicht länger als 1 Stunde stehen gelassen werden, wohingegen das erfindungsgemässe Präparat als gebrauchsfertige Lösung auch während eines Zeitraums von 3 Stunden oder länger bei Raumtemperatur keinerlei Thrombogeniziät bzw. Gerinnungsaktivierung zeigt, weshalb das erfindungsgemässe Präparat auch als Infusionslösung zur Verfügung gestellt werden kann, das auch über einen Zeitraum von mehreren Stunden verabreicht werden kann.
Aus den gleichen Gründen ist es auch möglich, das erfindungsgemässe Präparat über einen längeren Zeitraum als Infusionslösung zu verabreichen, wobei es sich gezeigt hat, dass in Bezug auf die thromboembolischen Nebenwirkungen kein wesentlicher Unterschied zwischen einer Bolusinjektion und einer langsamen Infusion mit dem erfindungsgemässen Präparat auftritt.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das pharmazeutische Präparat in geeigneten Applikationsvorrichtungen vorgegeben, vorzugsweise als Lyophilisat in Spritzen, welche eine in situ-Rekonstitution mit einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung erlauben. Beim beschriebenen Kombinationspräparat empfiehlt sich eine Applikationsvorrichtung, wie in
Fig. 1 gezeigt, worin die Lyophilisat von Prothrombin und Faktor Xa vorzugsweise getrennt auf- bewahrt werden und bei Bedarf nach einer in situ-Rekonstitution mittels einer Doppelkammer-
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spritze verabreicht werden können.
Beim reinen Prothrombinpräparat reicht es aus, Prothrombin in einer einfachen Spritze, vorzugsweise In Iyophilisierter Form, gegebenenfalls mit einer pharmazeutisch akzeptablen Lösung für die Rekonstitution, vorzugeben (siehe Fig. 2).
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Form zur Verfügung gestellt werden.
Das pharmazeutische Präparat gemäss der vorliegenden Erfindung kann, insbesondere wenn es aus plasmatischen Proteinen oder Zellkulturen gewonnen werden, einer oder mehreren VirusInaktivierungsbehandlungen bzw. Behandlungen zur Virus-Abreicherung unterzogen werden, beispielsweise einer chemischen oder chemisch-physikalischen Behandlung, einer Hitze-und/oder Detergensbehandlung gemäss der EP 0 159 311, der EP 0 519 901 oder der EP 0 674 531 oder einer physikalischen Behandlung, wie die der Nanofiltration.
Das erfindungsgemässe Präparat ermöglicht eine sichere und einfache Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, bei welcher ein effektiver Wirkungseintritt innerhalb kürzester Zeit beobachtet werden kann.
Es zeigt sich, dass der effektive Wirkungseintritt bei der Gabe des Komplexes von Faktor 11 und Faktor Xa schneller erfolgt, als für ein Präparat, welches ausschliesslich Faktor 11 enthält. Zur Behandlung einer Blutungskomplikation bei einem Patienten mit Hemmkörperhaemophilie ist es daher vorteilhaft, das Blutungsereignis initial durch die Gabe des Faktor it/Xa-Kompiexes zu behandeln und somit zu einer schnellen Blutstillung zu kommen und die Therapie zur Vermeidung weiterer Blutungen mit Erhaltungsdosen eines Präparates, weiches ausschliesslich Faktor 11 enthält, fortzusetzen.
Darüberhinaus ermöglichen die lange Halbwertszeit des erfindungsgemässen Präparates und dessen Freiheit an thrombogenen Nebenwirkungen bzw. das Ausbleiben einer anaphylaktischen Reaktion, welche zur Verstärkung des Inhibitortiters führt, eine gegenüber bekannten Verfahren erheblich verbesserte Behandlung des Patienten mit Blutgerinnungsstörungen. Der Patient kann durch die hohe Konzentration bzw. Dosis des erfindungsgemässen Präparates ein Wirkstoffdepot erhalten, was den Bedarf an oftmaligen Behandlungen herabsetzt. Der Patient kann also auch über einen längeren Zeitraum von mehreren Tagen ohne Behandlung bleiben und sich gegebenenfalls durch Selbstinjektion, eventuell subkutan, ambulant behandeln.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiters ein Verfahren zur Herstellung einer gereinigten pharmazeutischen Prothrombin-Präparation, weiches dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Prothrombinkomplexkonzentrat einer chromatographischen Reinigung unterzogen wird bis die Aktivität der Prothrombin-Präparation eine spezifische Aktivität von mindestens 5 E Prothrombin/mg Protein aufweist und die Fraktion, enthaltend Prothrombin, zu einer pharmazeutischen Präparation verarbeitet wird. Mit dem erfindungsgemässen Verfahren wird eine Prothrombin-Präparation zur Verfügung gestellt, die die Anforderungen an die Reinheit für die erfindungsgemässen pharmazeutischen Präparate, insbesondere was die mit dem Wessler-Test ermittelte Nebenwirkungsfreiheit anbelangt, voll erfüllt.
Insbesondere ist das erfindungsgemässe Verfahren gekennzeichnet durch die Kombination der folgenden Schritte : - Bereitstellen eines Prothrombinkomplexpräparates In festem Zustand oder als Prothrom- bin-hältige Lösung, - Virusinaktivierungsbehandlung, vorzugsweise durch Hitzebehandlung, insbesondere in fe- stem Zustand, - gegebenenfalls Lösen des Prothrombinkomplexpräparates, wobei eine Prothrombin-hältige
Lösung erhalten wird, - gegebenenfalls Behandeln der Prothrombin-hältigen Lösung mit einem Erdalkalisalz als fe- stem Träger, wobei Prothrombin adsorbiert und anschliessend desorbiert wird, - gegebenenfalls ein- oder mehrmaliges Konzentrieren, vorzugsweise durch Präzipitation oder Ultra-/Diafiltration, und Gelfiltrieren der Prothrombin-hältigen Lösung,
- Behandeln der Prothrombin-hältigen Lösung mit einem Anionenaustauscher, wobei Pro- thrombin adsorbiert und anschliessend selektiv desorbiert wird, - Behandeln der Prothrombin-hältigen Lösung mit einem hydrophoben Chromatographiema- terial, und
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- Fertigstellen der Prothrombin-haltigen Lösung zu einem pharmazeutischen Präparat.
Als Erdalkalisalz können dabei vorzugsweise Calciumphosphat, Bariumsulfat oder Aluminiumhydroxid eingesetzt werden. Als Anionenaustauscher kommen im Prinzip alle Anionenaustauscher
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B.lymerisation von N-acryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und einem anionischen Acrylderivat mit Diethylaminoethyl-Gruppen als funktionellem Anionenaustauscher (DEAE-Tris-Acryi ), nicht kompressible Silica-Dextran-Matrizes, bei welchen poröses Silicagel in einer quervernetzten Dextranmatrix eingebettet ist, mit reaktiven Diethylaminoethylanionenaustauschergruppen (DEAE- Spherodex), Gele aus rigiden Polystyrolpartikeln, deren Poren mit einem Hydrogel gefüllt sind, welches quarternäre Amingruppen mit starker Anionenaustauscherwirkung trägt (Q-Hyper-D) (alle Fa. Sepracor) ;
rigide macroporöse hydrophile Oberflächen mit N+ (C2Hs) 2 oder N+ (CH3h -Gruppen (Macroprep DEAR, Macroprep C (alle Fa. BioRad) ;
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aminoethylhaas) ; Anionenaustauscherharze bestehend aus porösem Polymethacrylat/Polyacrylat-Gel (Protein PAK DEAEO, Fa. Waters) ;
Anionenaustauscher auf Basis von Copolymeren bestehend aus Oligoethylenglycol-dimethyl- acrylat, Glycidylmethacrylat und Pentaerythrit-dimethylacrylat mit einer hydrophoben Oberfläche (Fractogel EMD-TMAE Fractogel EMD-DEAE , Fractogel EMD-DMAE), Anionenaustauscher auf Kieselgelbasis mit porösen kugelförmigen druckstabilen Chromatographiepartikeln (Licrospher 1000 Tâte, Licrospher 1000 DEAEQ ! ! und Licrospher 4000 DMAC) (alle Fa. MERCK).
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Gel für(alle Fa.
Pharmacia) ;
Copolymere bestehend aus Oligoethylenglycol-dimethylacrylat, Glycidylmethacrylat und Pentaerythrit-dimethylacrylat mit einer hydrophilen Oberfläche (Fractogel TSK-Butyl#, Fa. MERCK) ; Gele auf Basis von Methacrylat (Macroprep-Methyl-HIC-Support#, Macroprep t-Butyl-HIC-Supporto (alle Fa. BioRad; TSK-Gel Butyl Toyopearl#, TSK-Gel Phenyl Toyopearl# und TSK-Gel Ether Toyopeart (alle Fa. Tosohaas), eingesetzt.
Eine mögliche Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist in Fig. 3 dargestellt.
Die Prothrombin-Präparation, welche mit dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt werden kann, zeichnet sich nicht nur durch eine äusserst hohe Reinheit, weiche nahe der theoretisch möglichen Reinheit von 10 E/mg liegt, sondern auch dadurch, dass es sogar bei einer Dosis von mindestens 150 E Prothrombin/kg frei an thromboembolischen Nebenwirkungen, ausgedrückt durch einen Score im Wessler-Thrombosemodell von höchstens 3 Punkten, vorzugsweise höchstens 2 Punkten, insbesondere weniger als 2 Punkten ist, und darüberhinaus als Lyophilisat mit einer Lösezeit von höchstens 1 min zu einer klaren Lösung mit einer Aktivität von zumindest 10 E Prothrombin/ml bis zu 200 E Prothrombin/ml rekonstituierbar ist.
Die biologische Aktivität des Prothrombin-Präparates wird verstanden als die enzymatische Aktivität, welche nach Aktivierung des Prothrombins erhalten wird.
Gemäss einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von gereinigtem Prothrombin zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Etablierung von Supranormalen Prothrombin-KIonzentrationen im Blut eines Patienten. bzw. zur Etablierung von norma-
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len Prothrombin-Konzentrationen im Blut bei Zuständen mit erniedrigtem Prothrombin-Level.
Es zeigte sich, dass mit dem erfindungsgemässen Präparat solche Supranormalen Faktor li-Levels sogar permanent, d. h. über längere Zeiträume erhalten werden können, was einesteils darauf zurückzuführen ist, dass Prothrombin eine für Blutgerinnungsfaktoren sehr hohe Halbwertszeit als Medikament aufweist und andererseits auch in der Nebenwirkungsfreiheit der erfindungsgemässen Präparation besteht, so dass sogar eine subkutane Verabreichung etwa durch Depotverabreichung möglich ist. Die Supranormalen Konzentrationen von Prothrombin, die im Blut durch Gabe von gereinigtem Prothrombin und gegebenenfalls gereinigtem Faktor Xa möglich sind, betragen zumindest 150 %, vorzugsweise sogar mindestens 200 %, entsprechend einer Aktivität von mindestens 1, 5 E Prothrombin/ml Blut, vorzugsweise mindestens 2, 0 bis zu 10 E/ml.
Schliesslich betrifft die Erfindung auch die Verwendung von gereinigtem Prothrombin zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung von Faktor VIi-lnhibitorzuständen, Haemophilie A oder B und von Willebrand-Krankheit. Es hat sich gezeigt, dass in Tiermodellen für alle diese Indikationen mit dem erfindungsgemässen Präparat eine rasche, effiziente und Nebenwirkungs-freie Behandlung möglich ist.
Das erfindungsgemässe Präparat wird bevorzugt in einer Lösung mit physiologischem pH zur Verfügung gestellt, welche vorzugsweise keine freien Caiciumionen enthalten. Es ist aber auch möglich, einen sauren Puffer zu verwenden, mit welchem die Stabilität des Präparates nochmals gesteigert werden kann. Es versteht sich, dass sämtliche für Faktor 11 geeignete pharmazeutische Zusatzstoffe und Lösungen zur verabreichungsfertigen Herstellung des erfindungsgemässen Präparates verwendet werden können.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der dazugehörigen Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt sein soll, näher erläutert.
Es zeigen'
Fig. 1 und Fig. 2 mögliche Darreichungsformen des erfindungsgemässen Präparates ;
Fig. 3 das Flussdiagramm einer Ausführungsform des Herstellungsverfahrens ;
Fig. 4 den Nachweis des partiellen Prothrombinasekomplexes ;
Fig. 5 die spektroskopische Analyse eines Beispieles des erfindungsgemässen Präparates (A) Im Vergleich zu Standardpräparaten [aktivierter Prothrombinkomplex (B), Prothrombinkomplex (C)],
Fig. 6 die in vivo-Wirkung einer Faktor H-Präparation auf Faktor VIlI-lnhibitorkaninchen ;
Fig. 7 und Fig. 8 die in vivo-Wirkung des erfindungsgemässen Präparates im von Willebrand Faktor/Faktor VIlI-lnhibitormodell.
BEISPIEL 1 :
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Eine Iyophilisierte Prothrombinkomplexfaktorenpräparation, welche die Faktoren 11, IX, X sowie Protein C und Protein S enthielt, wurde nach der Methode von Brummelhuis, H. G. J., Preparation of the Prothrombincomplex. In : Methods of Plasma Protein Fractionation, Curling, J. M. ed., 117-128, Academic Press, New York, (1980), hergestellt und zur Virusinaktivierung nach EP 159 311 hitzebehandelt. Entsprechend wurde das Lyophilisat (1000 E Faktor X/g, 1200 E Faktor t/g) in destilliertem Wasser gelöst, sodass dieses 50 000 E Faktor Xll enthielt, und auf pH 7, 0 eingestellt. Nach Zusatz von 12 % (v/v) Polyethoxysorbitanoleat (TWEEN 80) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Anschliessend wurde mit einem 20 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7, 0, 1 : 5 verdünnt und die Prothrombinkomplexproteinfraktion an Calciumphosphat [Ca3 (P04h] in einer Konzentration von 30 g Ca3 (P04h pro I Prothrombinkomplexlösung durch einstündiges Rühren bei Raumtemperatur adsorbiert. Anschliessend wurde die feste Phase durch Zentrifugation, 20 Minuten bei 5000 rpm, abgetrennt und der Niederschlag zweimal mit 20 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7, 0, enthaltend 10 % Ammoniumsulfat, durch Resuspension und erneute Zentrifugation gewaschen. Eine dritte Waschung wurde mit 20 mM Tris-HCI-Puffer, pH 7, 0, enthaltend 150 mM NaCI in analoger Weise durchgeführt.
Die Elution der Prothrombinkomplexfraktion erfolgte mit 1 M Natriumphosphatlösung, pH 7, 0, wobei 25 ml dieser Lösung pro g Calciumphosphat 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschliessend der verbleibende Niederschlag durch Zentrifugation wie oben abgetrennt wurde.
Der Oberstand wurde anschliessend einer Ammoniumsulfatfällung mit 366 g Ammoniumsulfat pro I
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15 h bei 40C unter Rühren unterogen. Das Präzipitat, enthaltend die Prothrombinkomplexfraktion, wurde wie oben abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde in einem 25 mM TrinatriumcitratdihydratPuffer, enthaltend 100 mM NaCI, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6, 0, aufgenommen und auf einer Säule, gefüllt mit Sephadex G-25 (Gelchromatographiematerial auf Basis eines dreidimensionalvernetzten Polysacharids Dextran), bei 4 C mit einem linearen Fluss von 1 cm/min gegen 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCI und 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6, 0, umgepuffert, um das Ammoniumsulfat abzutrennen.
Dabei wurde im Eluatstrom die UV-Absorption bei 280 nm und die elektrische Leitfähigkeit gemessen. Die Protein enthaltenden
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Auftrag der Proteine war die Säule mit einem 25 mM Trinatriumcitratdihydrat-Puffer, enthaltend 100 mM NaCI, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, pH 6, 0, äquilibriert worden. Die Elution der Proteinfraktionen erfolgte in mehreren Stufen mit einem Puffer 1 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 245 mM NaCI, pH 6, 0), Puffer 2 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 270 mM NaCI, pH 6, 0) und einem Puffer 3 (25 mM Trinatriumcitratdihydrat, 1 mM Benzamidinhydrochlorid, 400 mM NaCI, pH 6, 0). Die Elution mit Puffer 1 wurde mit 2, 4 Saulenvolumen durchgeführt, dabei wurde Inertprotein abgetrennt.
Die Elution wurde mit 5, 6 Säulenvolumen mit Puffer 2 durchgeführt, wobei hier Fraktionen gesammelt wurden, die auf Gehalt von Faktor 11, Faktor X, Protein C und Faktor IX analysiert wurden. Die Faktor X enthaltenden Fraktionen, die frei von Faktor 11, IX und Protein C wurden vereinigt. Durch Elution mit Puffer 3 (1, 9 Säulenvolumen) wurde Faktor 11 desorbiert, wobei wieder Fraktionen gesammelt und auf den Gehalt an Faktor X, Faktor IX und Faktor 11 untersucht wurde. Die Faktor 11 enthaltenden Fraktionen wurden gepoot. Sowohl der Faktor 11, als auch der Faktor X enthaltende Pool konnten gegebenenfalls durch Zusatz von 1 M KSCN und Inkubation bei 220C für mehrere Stunden einer zusätzlichen Behandlung zur Inaktivierung pathogener Verunreinigungen unterworfen werden.
BEISPIEL 2 :
Reinigung von Faktor 11 mittles hydrophober Interaktionschromatographie
Der in Beispiel 1 gewonnene Faktor li-Pool wurde durch Zugabe von Natriumchlorid auf 1, 8 M NaCI eingestellt und der pH-Wert auf pH 7, 0 korrigiert. Diese Lösung wurde anschliessend durch hydrophobe Interaktion an ein Gel, Phenylsepharose High Performance (s. o.), Fa. Pharmacia, adsorbiert, wobei 3 g Protein/l Gel gebunden wurden. In einer Säule mit einem Verhältnis innendurchmesser : Geibetthöhe = 1 : 1, 9 wurde bei einem linearen Fluss von 0, 25 cm/min die
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4)eluiert, wobei jene Fraktionen gepoolt wurden, die Faktor li-Aktivität enthielten, aber frei von Faktor X und Faktor IX waren.
Die gesammelten Faktor 11-Fraktionen wurden anschliessend durch Ult- ra-/Diafiltration über eine Ultrafiltrationsmembran mit einem cut-off von 30 kD zehnfach aufkonzentriert und gegen einen Puffer enthaltend 4 g Trinatriumcitratdihydrat/I, 8 g NaCI/l, pH 7, 0, umgepuffert. Eine so hergestellte Faktor it-Präparation wies eine spezifische Aktivität von 6, 9 E/mg Protein auf. Die Bestimmung der Faktor H-Aktivität erfolgte mit der 1-Stufen-Methode, basierend auf der Thromboplastinzeit, unter Verwendung eines Faktor li-Mangelplasmas gegen den Internationalen Faktor it-Standard unter Verwendung der Reagenskombination von IMMUNO, Wien.
Andere Gerinnungsfaktoren waren in Gerinnungsanalysen in Spuren oder gar nicht mehr nachweisbar (Faktor VII < 0, 00002 E/E Faktor 11, Faktor IX 0, 0002 E/E Faktor 11, Faktor X 0, 004 E/E Faktor 11, Protein C 0, 003 E/E Faktor 11 und Faktor VIII < 0, 0002 E/E Faktor 11).
BEISPIEL 3 :
Reinigung von Faktor 11 mittels hydrophober Interaktionschromatographie und Hydroxylapatitch romatographie
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Als alternatives Herstellungsverfahren für einen hochgereinigten Faktor 11 wurde auch ein Verfahren verwendet, bei dem aus einem Iyophilisierten Prothrombinkomplexfaktorenpräparat (siehe Beispiel 1) durch hydrophobe Chromatographie zuerst Faktor IX abgetrennt, anschliessend Faktor II isoliert und dieser dann durch Chromatographie an Hydroxylapatit hochgereinigt wurde.
Die Prothrombinkomplexfaktorenpräparation wurde wie in Beispiel 1 gelöst und mit Detergens 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschliessend wurde durch Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sepharose FF# (s. o.), Fa. Pharmacia, wie in Beispiel 1, eine Faktor 11, IX und X-hältige Fraktion isoliert. Aus dieser wurde anschliessend durch Interaktion mit Butyl-Toyopearli (s. o.), Fa.
Toso Haas, die Faktor IX-enthaltende Fraktion entfernt Der Adsorptionsüberstand wurde anschlie- ssend an Phenyl-Sepharose High Performance (s. o.), Fa. Pharmacia, durch eine weitere hydrophobe Interaktionschromatographie gereinigt, wobei ca. 4 g Protein/l Gel adsorbiert werden konnten. In einer Säule mit einem Verhältnis Innendurchmesser : Geibetthöhe = 1 : 1, 9 wurde bei einem linearen Fluss von 0, 25 cm/min die Proteinfraktion adsorbiert, anschliessend durch Waschen mit 20 mM Tris-HCI, 3 M NaCl, pH 7, 4, das Inertprotein entfernt und schliesslich durch stufenweise Elution die Faktor 11 enthaltende Fraktion isoliert, die bei fallender Leitfähigkeit bei 1, 9 M NaCI vom Gel desorbierte.
Die Faktor 11 enthaltende Fraktion wurde anschliessend direkt an Ceramik-Hydroxyapatite (Adsorptionsmaterial auf Basis von Cas[OH/ (P04h)), Fa. Biorad, adsorbiert. Dies erfolgte auf einer Säule mit einem Verhältnis nnendurchmesser: Gelbetthöhe = 1 : 4, 8. Die Elution erfolgte bei einem linearen Fluss von 3 cm/min. Durch Elution mit einem Salzgradienten konnte Faktor 11 von der Säule desorbiert werden. Die Faktor 11 enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und über Ultra-/Diafiltration über Polysulfonmembranen mit einem cut-off von 30 kD aufkonzentriert bis die Faktor fi-Konzentration 50 - 100 E/ml betrug. Eine so hergestellte Faktor H-Präparation wies eine spezifische Aktivität von mindestens 7 E/mg Protein auf.
Andere Gerinnungsfaktoren, insbesondere Faktor IX und Faktor VIII, waren nur mehr in Spuren oder gar nicht mehr, wie im Präparat aus Beispiel 2, nachweisbar. Durch Wahl eines geeigneten Diafiltrationspuffers wurde die Faktor lu-präparation in einem pharmazeutisch verträglichen Puffer (z. B. 4 g Trinatriumcitratdihydratll, 8 g NaCl/l, pH 7, 0) übergeführt.
BEISPIEL 4 :
Gewinnung von Faktor Xa
Die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte Faktor X-Fraktion wurde anschliessend wie In DE 43 25 872 beschrieben zu Faktor Xab weiterverarbeitet, wobei die so gewonnene hochgereinigte Faktor Xa-Präparation in Gegenwart von 1 g/100 ml Humanalbumin Iyophilisiert wurde. Ein solches Präparat war frei von anderen Gerinnungsfaktoren ; der enthaltene Faktor Xa wies eine spezifische Aktivität von 120 E/mg Protein vor Zugabe zum Albumin auf.
BEISPIEL 5 :
Gefriertrocknung von Faktor 11
Die in Beispiel 3 beschriebene, hochgereinigten Faktor 11 enthaltende Präparation wurde ohne Zusatz von Stabilisatoren gefriergetrocknet, wobei nach Lyophilisierung mehr als 80 % der Ausgangsaktivität erhalten blieben.
BEISPIEL 6 :
Colyophilisierung von Faktor 11 und Faktor Xa
Eine gemäss Beispiel 3 hergestellte Faktor tt-Präparation wurde in einer Konzentration von 100 E/ml zu 20 ml in ein 50 mi-Fläschchen abgefüllt und bei-80 C schockgefroren. Anschliessend wurde eine Lösung eines hochgereinigten Faktor Xa, der gemäss DE 43 25 872 hergestellt worden war und eine Konzentration von 500 E/ml aufwies, in einer Menge von 30 111 auf die gefrorene Faktor II-Lösung dosiert. Durch das sofortige Einfrieren des geringen Volumens wurde eine Mischung von Faktor 11- und Faktor Xa-Phase verhindert. Anschliessend wurde gefriergetrocknet.
Zur Bereitung der Infusionslösung wurde das Lyophilisat mit 20 ml A. dest. rekonstituiert, gemischt und sofort zur Verabreichung vorbereitet.
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BEISPIEL 7 :
Pharmazeutische Formulierung von Faktor 11, Faktor Xa und Antithrombin 111 und/oder Antithrombin III-Heparinkomplex
Der hochgereinigte Faktor 11 in Kombination mit Faktor Xa und Antithrombin 111 oder Antithrombin III-Heparinkomplex wurden in einem Puffer, enthaltend 4 g Trinatrium-citratdihydrat/t und 8 g NaCI/I, pH 7, 0, auf die Anwendungskonzentration verdünnt.
Diese Lösungen konnten gefriergetrocknet werden, wobei eine Aktivität von zumindest 80 % der jeweiligen Komponenten erhalten blieb
BEISPIEL 8 :
Nachweis der partiellen Prothrombinase
Die Bildung eines Komplexes aus Faktor 11 und Faktor Xa zur "partiellen Prothrombinase" wurde durch folgendes Experiment nachgewiesen :
57 E Faktor 11 aus Beispiel 3 und 1, 2 E Faktor Xa aus Beispiel 4 wurden in 20 mM Tris-HCI- Puffer, enthaltend 150 mM NaCI, pH 7, 4, gelöst und 15 min bei Raumtemperatur zur Bildung des Komplexes inkubiert.
Anschliessend wurde ein Aliquot der Lösung durch Gelpermeationschromatographie über Superose 12 (HR10/30) (quervernetzte Agaroseperlen) (Pharmacia) mit einer Flussrate von 0, 25 mllmin chromatographiert. Das Auftragsvolumen betrug 200 !. Der Durchfluss durch die Säule wurde bei 280 nm UV-spektrophotometrisch gemessen und in Fraktionen zu 0, 5 ml gesammelt. Anschliessend wurde in den Fraktionen Faktor Xa, der mit der in der DE 43 25 872 beschriebenen Methode in einem photometrischen Test mit chromogenem Substrat bestimmt wurde, quantitativ gemessen. Ebenso wurde die Faktor ! !-Aktivität wie in Beispiel 2 in den einzelnen Fraktionen bestimmt. Das Resultat ist Fig. 4 zu entnehmen.
Faktor Xa [Fig. 4 : -... - Akt. Xa (FII/Xa)] und Faktor 11 [Fig. 4 :----Akt.)l x 10 (FII/Xa) ] eluierten gemeinsam mit der Proteinfraktion [Fig. 4 : - A280nm (FII/Xa) ]. Unter identen Bedingungen wurde nun Faktor Xa alleine auf die Säule aufgetragen, das Elutionsprofil nach der Gelpassage durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm bestimmt [Fig. 4 :"""A280nm (FXa)] und Faktor Xa-Aktivität [Fig. 4 :----Akt. Xa x10 (FXa)] in den Fraktionen nachgewiesen. Der dem Faktor Xa entsprechende Protein-Peak lag deutlich abgesetzt vom Faktor Xa im Komplex mit Faktor 11.
Durch Reduktion der Retentionszeit des Faktor Xa im Komplex auf der Säule und damit verbunden zur Verschiebung zu einer scheinbar höheren Molmasse, konnte der Nachweis einer Komplexbildung von Faktor 11 und Faktor Xa (partielle Prothrombinase) erbracht werden.
BEISPIEL 9 :
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werden. Bei der klinischen Anwendung von Iyophilisierten Mehrkomponentensystemen müssten diese sonst jeweils rekonstituiert werden und in einem definierten Verhältnis miteinander gemischt werden, bevor sie dem Patienten verabreicht werden können. Die Verfüllung der entsprechenden Lyophilisat in einem Doppelkammerspritzensystem ermöglicht eine exakte Dosierung auf eine vorherbestimmbare Aktivität des Präparates zur Behandlung von Inhibitorhaemophilie, z. B. auf konventionelle FEIBA-Einheiten, die gemäss der AT 350 726 B ermittelt werden können. Unter Verwendung eines solchen Systemes wird die wirksame Mischung in situ bei der Injektion hergestellt.
In einer Ausführungsform liegen in den beiden Doppelkammerspritzenkörpern jeweils Lyophilisate der Wirkstoffe, Faktor 11 und Faktor Xa, vor, die durch Zugabe des Lösungsmittels, A. dest., aufgrund der leichten Löslichkeit der hochgereinigten Proteine sofort in Lösung treten und unmittelbar durch Weiterdrücken der Spritzenkolben nach Mischung im Mischkopf dem Patienten infundiert werden (siehe Fig. 1).
Aufgrund der hohen Stabilität des Faktor 11 in Lösung, eignet sich diese auch als Lösungsmittel für den Faktor Xa in der Darreichungsform einer Doppelkammerspritze. Eine Lösung von hochge-
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Faktor 11, z. B. hergestelltPulver eines hochgereinigten Faktor Xa verwendet.
BEISPIEL 10 :
Stabilität des hochgereinigten Faktor 11
Faktor 11 wurde wie in Beispiel 2 beschrieben gereinigt und als Lösung in einer Konzentration von 60 E/ml in einem Puffer, enthaltend 4 g/t Trinatriumcitratdihydrat, 8 g/t NaCl, pH 7, 0, bei 5OC, bei 22 C, bei 37 C und bei 500C gelagert. Bei den Lagerungstemperaturen 5 C und 22 C wurden Proben jeweils alle 24 h gezogen, bei der Lagerung bel 370C und bei 500C erfolgten die Probenentnahmen über 24 h zum Zeitpunkt 1 h, 2 h, 4 h, 8 h und 24 h. In den Proben wurde jeweils Faktor -Aktivität bestimmt.
Bei 50C konnten auch noch 86 Tage nach Lagerungsbeginn mehr als 80 % der Ausgangsaktivität festgestellt werden. Bei 220C wurde über 14 Tage mehr als 80 % der Ausgangsaktivität gefunden ; bei 370C konnten 24 h nach Lagerungsbeginn 95 % der Ausgangsaktivität wiedergefunden werden. Sogar bei 500C wurden 8 h nach Beginn der Lagerung noch 94 % der ursprünglichen Aktivität gefunden.
BEISPIEL 11 :
Autoaktivierung und Stabilität der erfindungsgemässen Präparate
Erfindungsgemässe Präparate gemäss Beispiel 5 (Faktor 11) und ein Kombinationspräparat gemäss Beispiel 6 (Faktor tt/Xa-Komptex) wurden im Vergleich zu zwei handelsüblichen Prothrombinkomplexkonzentraten in einem in vitro-Test auf ihre prothrombotischen Eigenschaften insbesondere des extrinsischen Gerinnungssystems untersucht. Vor Einsatz im Test wurde das Im Prothrombinkomplexkonzentrat vorhandene Heparin entsprechend der Konzentration mit Protaminsulfat neutralisiert, um thrombogene Bestandteile, die durch das Heparin maskiert wurden, darzustellen.
Der Analysenansatz bestand aus 250 ! Thrombotest (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norwegen), einem Präparat enthaltend Thromboplastin aus Rinderhirn und adsorbiertem Rinderplasma, weiches 3 min bei 37 C vorinkubiert wurde. Anschliessend wurden 50 ii einer Probe zugesetzt und die Gerinnungszeit mit einem Kugelkoagulometer (KC4, Amelung) bestimmt. Rinderthromboplastine gelten als besonders sensitiv für aktivierte Gerinnungsfaktoren. Entsprechend kann das Testsystem eine Aussage über die in vitro-Thrombogenität der untersuchten Präparate geben. In diesem Testansatz wurde humanes Normalplasma als Kontrolle unverdünnt eingesetzt. Dieses zeigt eine Gerinnungszeit von 74 s.
Die beiden untersuchten Präparate zeigten unverdünnt eingesetzt Gerinnungszeiten von mehr als 100 sek, wobei die Konzentration einer möglichen Anwendungskonzentration von 30 E Faktor !/mi entsprach. Ein handelsübliches Prothrombinkomplexkonzentrat, ebenfalls gelöst in der Anwendungskonzentration und verdünnt auf 30 E/ml, musste mit Puffer 1. 32 weiterverdünnt werden, um auf die Gerinnungszeit des Normalplasmas (74 s) zu kommen. Ein anderes handelsübliches, aktiviertes Prothrombinkomplexkonzentrat musste sogar 1 : 216 mit Puffer verdünnt werden, um auf die Gerinnungszeit eines Normalplasmas von 74 s zu kommen.
Anschliessend wurden die erfindungsgemässen Präparate bis zu 4 h bei Raumtemperatur gelöst gelagert und ein mal pro Stunde Proben gezogen und neuerlich die Gerinnungszeit mit Thrombotest (s. o.) bestimmt Dabei kam es zu keiner Veränderung, d. h. auch nach 4 h zeigten die unverdünnt eingesetzten Proben immer noch Gerinnungszeiten über 100 s. Aus diesen Versuchen war zu ersehen, dass die erfindungsgemässen Präparate gegenüber handelsüblichen Prothrombinkomplexkonzentraten ein deutlich geringeres Thrombogenitätspotential aufweisen.
BEISPIEL 12 :
Lösungsverhalten des erfindungsgemässen Präparates
Eine hochgereinigten Faktor 11 enthaltende Präparation wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben,
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hergestellt und gefriergetrocknet. Das Lyophilisat war so eingestellt, dass die Volumsaktivität nach Rekonstitution mit destilliertem Wasser 50 E/ml war. Dies war eine typische Anwendungskonzentration. Aufgrund der hohen Reinheit des Präparates konnten jedoch auch Volumskonzentrationen von 100 und mehr Einheiten Faktor 11 pro ml erzielt werden. Die Lösezeit des Präparates, definiert als jene Zeit die von der Zugabe des Lösungsmittels (destilliertes Wasser) bis zum vollständigen Auflösen des Pulvers, wurde bestimmt.
Im Vergleich dazu wurden die Lyophilisat zweier handels- üblicher Präparate, nämlich Prothrombinkomplex und aktivierter Prothrombinkomplex, nach Angabe des Herstellers jeweils in der Anwendungskonzentration durch Zugabe von destilliertem Wasser rekonstituiert und ebenso die Lösezeit bestimmt. Die Lösezeit der untersuchten Präparate ist der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen :
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<tb>
<tb> erfindungsgemässes <SEP> APCC1 <SEP> pCC2
<tb> Präparat
<tb> Lösezeit <SEP> (s) <SEP> < 30 <SEP> 240 <SEP> 300
<tb>
1APCC = aktiviertes Prothrombinkomplexkonzentrat
2pCC = Prothrombinkomplexkonzentrat
Nach erfolgter Lösung der jeweiligen Präparate wurde von diesen jeweils ein UVNIS-Spektrum zwischen 280 und 750 nm gegen einen Citrat-Kochsalzpuffer gemessen.
Die Spektren sind Fig. 5a, b und c zu entnehmen (a ; erfindungsgemässes Präparat, b : aktivierter Prothrombinkomplex, c : Prothrombinkomplex). Der Vergleich der Spektren zeigte, dass das erfindungsgemässe Präparat im sichtbaren Bereich bis 700 nm eine deutlich niedrigere Lichtabsorption aufwies als die Vergleichspräparate. Das erfindungsgemässe Präparat zeichnete sich also durch eine hervorragende Löslichkeit aus und war in gelöster Form als klare, ungefärbte Lösung, wie für ein verbessertes pharmazeutisches Präparat charakteristisch, vorliegend.
BEISPIEL 13 :
Wirkung des Präparates im Faktor VIII-Inhibitorplasma
Ein hochtitriges Faktor Viii-Inhibitorplasma (55 BU/ml) wurde im Eisbad vorgekühlt und mit PTT-Reagens (IMMUN, Wien) und der zu testenden Probe, beide ebenfalls im Eisbad vorgekühlt, in einem Verhältnis von 1 + 1 + 1 bei 37 C 1 min inkubiert. Anschliessend wurde 1 Teil einer 0, 05 M CaCtz-Lösung zugesetzt und die Gerinnungszeit des Testansatzes mit einem Kugelkoagulometer der Fa. Amelung, Modell KC-4, bestimmt. Die zu testenden Präparationen wurden in einem Puffer, enthaltend 7 g NaCl/1 und 6 g Trinatriumcitratdihydratll, 1 : 10 weiterverdünnt und mit dieser Konzentration im Test eingesetzt.
Unter diesen Bedingungen wurde hochgereinigter Faktor 11, alleine und in Kombination mit hochgereinigtem Faktor Xa, in Kombination mit Antithrombin 111 und Heparin getestet. Die Gerinnungszeiten sind nachfolgender Tabelle zu entnehmen.
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<tb>
<tb>
Testsubstanzen <SEP> Gerinnungszeit
<tb> (Konzentration)
<tb> Faktor <SEP> 11 <SEP> Faktor <SEP> Xa <SEP> Antithrombin <SEP> 11\ <SEP> Heparin <SEP>
<tb> 10 <SEP> E/ml <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 147 <SEP>
<tb> 10 <SEP> E/ml <SEP> 0,1 <SEP> E/ml <SEP> - <SEP> - <SEP> 63
<tb> 10 <SEP> E/ml <SEP> 0,1 <SEP> E/ml <SEP> 1 <SEP> E/ml <SEP> - <SEP> 55
<tb> 10 <SEP> E/ml <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> E/ml <SEP> 1 <SEP> E/ml <SEP> 6 <SEP> E/ml <SEP> 49
<tb>
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citrat-Puffer bestimmt. Diese betrug 148 s. Somit konnte nur durch den Zusatz von Faktor H/Xa mit oder ohne Antithrombin 111 oder Heparin die Gerinnungszeit des Inhibitorplasmas deutlich reduziert werden.
Durch Messung einer FEIBA-Standardpräparation (FEIBA STIM 4, Immuno), weiche das
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konventionelle Präparat zur Behandlung von Faktor Vlil-lnhibitorpatienten darstellt, in verschiedenen Konzentrationen im selben Testansatz konnte ermittelt werden, dass die FEIB-Aktivität des Präparates, enthaltend 10 E/ml Faktor 11 und 0, 1 E Faktor Xalml, ca. 25 E FEIBA/ml entspricht.
BEISPIEL 14 :
In vivo-Wirkung bei Faktor VIII-Inhibitorhaemophilie
Zur Testung der in vivo-Wirksamkeit des erfindungsgemässen Präparates wurde ein Faktor Vlil-lnhibitorhaemophilie Kaninchenmodell verwendet. Ca. 2 kg schwere, weisse Neuseelandkaninchen wurden narkotisiert. Nach Eintritt der Narkose wurde jeweils die rechte Vena femoralis präpariert und ein permanenter venöser Zugang geschaffen. Durch diesen wurden 0, 5 ml/kg Körpergewicht eines human Faktor VIII-lnhibitorplasmas (1500 BU/ml) über 10 min infundiert. 30 min nach Abschluss der Infusion wurde die Blutungscharakteristik unter Verwendung einer modifizierten Methode nach Giles et al., Blood 60 : 727-730 (1982), bestimmt.
Dazu wurde das Fell um eine Kralle der Hinterpfote des Kaninchens rasiert, um zu verhindern, dass bei der späteren Blutung austretendes Blut vom Fell absorbiert wird. Die Nagelhaut wurde mittels einer Krallenzange verletzt ; unmittelbar danach wurden Filter darunter so etabliert, dass das Blut direkt auf den Filter tropfen konnte, ohne von diesem durch Kapillarwirkung aufgesogen zu werden, um zu verhindern, dass ein sich formierendes Blutgerinnsel zerstört würde. Die Filtereinheiten wurden alle 2 min gewechselt, das austretende Blut in Fraktionen gesammelt. Die Blutsammlung wurde 30 min fortgesetzt, danach wurde, sofern die Blutung nicht zum Stillstand gekommen war, die Wunde verödet.
Zur Quantifizierung der Blutungscharakteristik wurden die Filter mit jeweils 0, 04 %-iger Ammoniumhydroxidlösung über 5 h extrahiert, dabei Iysierten die Erythrozyten, die mit dem Blut im Filter gesammelt wurden.
Durch eine 10-minütige Ultraschallbehandlung wurde das Haemoglobin extrahiert und quantitativ, photometrisch bei 416 nm gegen eine Eichkurve bestimmt. Diese wurde so erstellt, indem Kaninchenblut in Volumina zwischen 10 111 und 1 ml auf Filter pipettiert wurden, diese wie oben extrahiert und das Haemoglobin photometrisch bei 416 nm bestimmt wurde. Die Blutungscharakteristik des Nagelschnittes wurde ermittelt, indem graphisch die Blutmengen pro 2 Minuten-Fraktion gegen die Zeit aufgetragen wurden. Zur Beurteilung wurde der kumulierte Blutverlust ermittelt, indem das Volumen der einzelnen Blutfraktionen graphisch gegen die Zeit eingetragen wurde. Als für die Blutung relevantes Kriterium wurde die Steigung der kumulierten Blutung zwischen 10 und 20 min herangezogen.
Dieser Wert war unabhängig von der initialen Blutmenge, die von Kaninchen zu Kaninchen je nach Krallenschnitt Schwankungen unterworfen war. Die Steigung der Blutungscharakteristik in 10 bis 20 min Beobachtungsintervallen diente als Mass für die Intensität der Blutung. Eine Steigung gleich Null bedeutete, dass die Blutung zum Stillstand gekommen war, eine Steigung > 0 mit einem Korrelationskoeffizienten von > 0, 8, dass eine konstante Blutung vorlag. Gesunde Kaninchen wiesen unter den Testbedingungen eine Blutungsintensität von < 2 111 BluUmm auf. Faktor VIII-Inhibitorkaninchen zeigten eine Blutungsintensität von ca. 50 111 BluUmin (siehe Fig. 6).
Faktor VIII-Inhibitorkaninchen, die mit einer Faktor li-Präparation gemäss Beispiel 3 in einer Dosierung von 75 E/kg Körpergewicht als Infusion über 30 Minuten behandelt wurden, zeigten im Mittel (n = 6) eine Blutungsintensität von 9, 3 Ill/min und somit eine signifikante Reduktion gegen- über dem unbehandelten Inhibitortier.
BEISPIEL 15 :
In vivo-Wirkung bei von Willebrand Faktor/Faktor VIII-Inhibitor
Analog zu Beispiel 14 wurde ein von Willebrand Faktor/Faktor VIII-Inhibitormodell etabliert, indem Kaninchen ein anti-von Willebrand Faktor/Faktor Viil-Antiplasma aus der Ziege, welches
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i/von Wiitebrandbehandelte Tiere zeigten eine gesteigerte Blutungsneigung (siehe Fig. 7). Die Blutungscharakteristik wurde durch Krallenschnitte bei diesen Tieren gleichzeitig mit Infusion der Testsubstanz und 30 min nach Abschluss der Infusion der Testsubstanz gemessen. Durch Gabe von Faktor 11 als Bolus von 2, 5 ml in einer Dosierung von 75 E/kg konnte die initial gesteigerte Blutungsintensität
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Durch Kombination von Faktor 11 (75 E/kg) mit einem Faktor Xab (hergestellt gemäss Beispiel 4) in einer Dosierung von 0, 55 E/kg als Bolus mit einem Injektionsvolumen von 2, 5 ml konnte die Blutungsneigung vom Ausgangswert auf 18 l/min beim 1. Krallenschnitt und 5 l/min beim 2. Krallenschnitt reduziert werden. Damit wurde das abnorm gesteigerte Blutungsverhalten der Inhibitortiere auf das Niveau der gesunden Vergleichstiere normalisiert (4 i/min).
Zusätzlich wurde auch die Kombination von Faktor 11 (75 E/kg), Faktor Xa (0, 55 E/kg) und Antithrombin 111, Immuno Wien, (75 mE/kg) im selben Modell untersucht. Dabei konnte beim 1. Krallenschnitt eine Reduktion auf 35 l/min und beim 2. Krallenschnitt auf 7 !/min erreicht werden (siehe Fig. 8). Der Zusatz von Antithrombin 111 sollte eine Generierung von Thrombin aus Prothrombin durch das Enzym Faktor Xa in der verabreichten Lösung verhindern.
BEISPIEL 16 :
Thrombogenität des erfindungsgemässen Präparates
Die Einzelkomponenten und Mischungen derselben des erfindungsgemässen Präparates wurden auf ihre thrombogene Aktivität unter Verwendung der von Wessler beschriebenen Methode, J. AppI. Phys. 14 : 943-946 (1959), im stasierenden venösen Blut in Kaninchen getestet.
Kaninchen wurden in Pentobarbital-Narkose versetzt, die Vena jugularis der Tiere wurde freipräpariert und mit losen Ligaturen im Abstand von 1 - 2 cm versehen. Die zu testenden Substanzen wurden den Tieren in die der freipräparierten Vena jugularis gegenüberliegende Ohrvene injiziert. Die Injektion erfolgte innerhalb von 15 s. Nach einer Wartezeit von 10 - 15 s wurde das Venenstück abgeklemmt. Nach weiteren 10 min wurde das abgeklemmte Venenstück entnommen und in einem Citratpuffer in einer Petrischale aufgeschnitten und die erhaltenen Thromben mittels einer Skalierung zwischen 0 und 4 bewertet (siehe Tabelle).
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<tb>
<tb>
THROMBOSEGRAD <SEP> BEWERTUNG <SEP>
<tb> keine <SEP> Thrombenbildung <SEP> 0 <SEP>
<tb> wenige <SEP> kleine <SEP> Thromben <SEP> 0, <SEP> 5-1 <SEP>
<tb> wenige <SEP> mittelgrosse <SEP> und <SEP> viele <SEP> kleine <SEP> Thromben <SEP> 2 <SEP>
<tb> viele <SEP> mittelgrosse <SEP> Thromben <SEP> 3 <SEP>
<tb> wenige <SEP> grosse <SEP> Thromben <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP>
<tb> ein <SEP> zusammenhängender <SEP> Thrombus <SEP> 4 <SEP>
<tb>
Die Substanzen wurden an jeweils sechs Tieren untersucht, die je 75 E Faktor II/kg, 0,55 E Faktor Xa/kg und 75 mE Antithrombin III/kg entweder alleine oder in Kombination erhielten. Die nachfolgende Tabelle gibt den Mittelwert des Wessler-Scores von jeweils sechs untersuchten Tiere wieder. Als Kontrolle wurde reiner Citratpuffer, der auch als Verdünnungspuffer verwendet wurde, herangezogen.
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<tb>
<tb>
Testsubstanz
<tb> Faktor <SEP> II <SEP> Faktor <SEP> Xa <SEP> Antithrombin <SEP> III <SEP> Wessier <SEP> Score
<tb> + <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 17
<tb> - <SEP> + <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP>
<tb> - <SEP> - <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 08
<tb> + <SEP> + <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 25 <SEP>
<tb> + <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 08
<tb> + <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 17
<tb> + <SEP> + <SEP> + <SEP> 0, <SEP> 17 <SEP>
<tb> 0, <SEP> 2
<tb> (Puffer) <SEP> (Puffer) <SEP> (Puffer)
<tb>
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Es zeigte sich, dass keine der eingesetzten Komponenten, weder alleine noch in Kombinationen, eine thrombogene Aktivität im Kaninchen aufwies.
BEISPIEL 17 :
Wirkung des Kombinationsräparates in Abhängigkeit der Darreichungsform
Eine Faktor 11 und Faktor Xa enthaltende Präparation ge mass Beispiel 6 wurde in jeweils 6 Kaninchen mit induzierter Faktor VItI-lnhibitorhaemophilie (siehe Beispiel 14) auf seine Wirksamkeit getestet. Die untersuchte Dosis war wie in Beispiel 15 beschrieben. Als Kontrolle wurde den Tieren reiner Puffer infundiert.
Im ersten Versuch wurde eine Infusion der Testsubstanzen über 30 min, entsprechend ca.
15 min/kg Körpergewicht, mittels einer automatischen Infusionspumpe, bei einer Infusionsge- schwindigkeit von 1 mi/min durchgeführt. In einem zweiten Versuch wurde die selbe Dosis, jedoch als Bolus innerhalb von 30 s in einem kleinen Injektionsvolumen von 2, 5 ml/kg Körpergewicht den Tieren gegeben. Wie in Beispiel 14 wurde nun die Blutungsintensität während und nach erfolgter Substanzgabe gemessen. Es zeigte sich, dass sowohl bei langsamer Infusion mit einem grossen Infusionsvolumen, als auch bei der schnellen Injektion einer kleinen Volumsdosis, aber mit identen Dosen bezogen auf das Körpergewicht, die pathologisch verlängerte Blutungsintensität von 67 (it/min auf ca. 5 Ill/min, entsprechend dem Blutungsverhalten der gesunden Vergleichstiere, normalisiert werden konnte.
Durch Gabe von Puffer, ebenso mit beiden Infusionsmodalitäten, wurde keine Änderung der Blutungsintensität gefunden. Trotz der schnellen Injektion als Bolus wurde keine Unverträglichkeitsreaktion bei der Injektion, wie auch bei der langsamen Infusion beobachtet. Für handelsübliche Präparate mit vergleichbarer Indikation (aktivierte) Prothrombinkomplexpräparate werden Infusionsgeschwindigkeiten Im Bereich von < 0, 05 ml/min/kg Körpergewicht empfohlen, um akute thromboemolische Nebenwirkungen und Unverträglichkeitsreaktionen zu vermeiden. Wie der Versuch zeigte, konnte das erfindungsgemässe Präparat aufgrund seiner hohen Reinheit mit 5 ml/min/kg Körpergewicht, also mit der 100-fachen Injektionsgeschwindigkeit nebenwirkungsfrei verabreicht werden.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Pharmazeutisches Präparat enthaltend gereinigtes Prothrombin als einzige aktive Kompo- nente, insbesondere in flüssiger bzw. flüssig-tiefgefrorener Form, dadurch gekennzeichnet, dass es frei von Phospholipiden ist.