FI77048C - Foerfarande foer framstaellning av en blodkoagulationsbefraemjande preparation pao basis av humanproteiner. - Google Patents

Description

77048

Menetelmä ihmisproteiinipohjäisen, veren hyytymistä edistävän tuotteen valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää ihmisproteiinipohjäisen, 5 veren hyytymistä edistävän tuotteen valmistamiseksi, joka tuote sisältää hyytymistekijöitä II, VII, IX ja X sekä tekijä VIII-inhibiittori-bypass-aktiivisuutta.

Veren hyytymistä edistäviä tuotteita, joilla on tekijä VIII-inhibiittori-bypass-aktiivisuutta, lyhennetään 10 "FEIBA" (Factor Eight Jnhibitor-Bypassing Activity), tunnetaan. AT-patenttijulkaisussa 350 726 (vastaa FI-patentti-julkaisua 57421 ja DE-hakemusjulkaisua 27 34 821) kuvataan tällaisen tuotteen valmistus. Sitä käytetään menestyksellä sellaisten potilaiden hoidossa, jotka sairastavat hemofilia 15 A:ta ja joiden veri sisältää tekijä VIII:aa vastaan suunnattua estoainetta (inhibiittoria). FEIBA-tekijän kemiallinen rakenne on toistaiseksi tuntematon. Tiedetään ainoastaan, että on kyseessä proteiini, jonka molekyylipaino on suuruusluokkaa 100 000. Tuotteen valmistus yllä mainittujen patentti-20 julkaisujen mukaan tapahtuu ihmisestä saadusta, sitraatti-ioneja sisältävästä plasmasta ilman vapaiden kalsiumionien läsnäoloa käsittelemällä plasmaa veteen liukenemattomilla epäorgaanisilla hyytymisfysiologisilla pinta-aktiivisilla aineilla, kuten silikageelilla tai kaoliinilla, minkä jäl-25 keen adsorboidaan ja eluoidaan, jolloin saadaan tekijöiden II, VII, IX ja X, FEIBA-tekijöiden ja muiden proteiinien seos, jonka koostumusta ei toistaiseksi ole kuvattu.

Vaikka, kuten mainittiin, DE-hakemusjulkaisun 27 34 821 mukainen tuote on osoittautunut arvokkaaksi tekijä 30 VIII-inhibiittoripotilaiden hoidossa, on tehtävänä ollut laajentaa käyttöaluetta ja parantaa edelleen FEIBA-tuottei-den sopivuutta, varsinkin alentaa ei-toivotut sivureaktiot, kuten trombogeeniset ja vasoaktiiviset vaikutukset minimiin.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti siten, 35 että saadaan aikaan menetelmä veren hyytymistä edistävän, ihmisproteiinipohjäisen tuotteen valmistamiseksi, joka tuote sisältää hyytymistekijöitä II, VII, IX ja X sekä tekijä VIII- 2 77048 inhibiittori-bypass-aktiivisuutta. Tuotteelle on ominaista, että - siltä puuttuu trombogeeninen aktiivisuus vähintään sellaiseen arvoon asti, joka vastaa kaksi 5 yksikköä FEIBA:aa/kg kaniinia tromboosi-indusoi- vassa Wesslerin aktiivisuuskokeessa, - sillä ei ole kallikreiini-aktiivisuutta eikä esi-kallikreiini-aktivaattori-aktiivisuutta - mitattuna tuotteen vesiliuoksessa FEIBA-konsentraati- 10 olla, joka on vähintään kymmenen yksikköä milli- litraa kohti, - se voidaan erottaa affiniteettikromatograafisesti dekstraanisulfaatti-agaroosista NaCl-gradientin avulla siten, että proteiini, jolla on tekijä IX- 15 aktiivisuutta, eluoituu alemmassa NaCl-konsentraa- tiossa kuin proteiini, jolla on FEIB-aktiivisuutta ja - sen eluaatit, jotka sisältävät proteiinia, jolla on tekijä IX-aktiivisuutta, ja proteiinia, jolla 20 on FEIB-aktiivisuutta, sisältävät elektroforeetti- sessa erotuksessa a- ja β-globuliinia, jolloin erotuskäyrässä näkyy a-vyöhykkeellä päähuippu, joka vastaa 60...80 % kokonaisproteiinista, siihen liittyvä olkapää 10...20 % kokonaisproteii-25 nista, kuten myös erotuskäyrän olkapäänmuotoiseen kohtaan liittyvä loiva huippu 8-globuliinivyöhykkeellä, joka vastaa 10...20 t kokonaisproteiini-pitoisuudesta.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista 30 se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 ja vastaavasti 2 tunnusmerkkiosissa.

Edellä määritelly ominaispiirteet, ja etenkin se, että tuotteella ei ole trombogeenistä aktiivisuutta eikä kallikreiini-aktiivisuutta tai esikallikreiini-aktivaattori-35 aktiivisuutta - jälkimmäiset aiheuttavat vasoaktiivisia vaikutuksia -, merkitsevät sitä, että tuotteella on erittäin hyvä sopivuus. FI-patenttijulkaisun 57M21 mukaan valmistetut 3 77048 FEIBA-valmisteet eivät tyydyttävällä tavalla vastanneet niitä trombogeenistä aktiivisuutta (Wesslerin kokeen mukaan määritettynä) ja kallikreiini- tai esikallikreiini-aktivaat-tori-aktiivisuutta koskevia vaatimuksia, jotka asetettiin 5 keksinnön mukaiselle uudelle, parannetulle FEIBA-valmisteelle. Alan ammattimies tuntee tromboosi-indusoivan aktiivisuus-kokeen sekä kallikreiini-aktiivisuuskokeen ja esikallikreiini-aktivaattori-aktiivisuuskokeen. Nämä selitetään yksitelleen esimerkkien yhteydessä vielä tarkemmin. ' 10 Keksinnön mukaan valmistetun tuotteen kolmas ominaispiirre, erottuvuus affiniteettikromatografisesti dekstraani-sulfaatti-agaroosista NaCl-gradientin avulla on havainnollistettu piiroksen kuviossa 1 esimerkin avulla. Alan ammattimies tuntee dekstraanisulfaattiagarosista suoritetun 15 afiniteettikromatografiamenetelmän [D.S. Pepper ja C. Prowse,

Thrombosis Research J_1. (1977), 687-692]. Siinä liitetään dekstraanisulfaatti (molekyylipaino 500 000) CNBr-aktivoituun Sepharoosiin 4 B (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Ruotsi). Näin saatu dekstraanisulfaattl-sepharoosi 20 tasapainotetaan 0,4 i trinatriumsitraatti*2H20-liuoksessa (pH 7,4) ja laitetaan kolonniin. Tutkittava näyte lisätään kolonniin ja eluoidaan fraktioituna NaCl-liuksela 0,4 % trinatriumsitraatti·2H20:ssa (pH 7,4) kasvavalla NaCl-konsentraatiolla.

25 Kuviossa 1 on abskissalle merkitty eluaattien frak- tioluvut. Vasemmalle ordinaatalle on merkitty hyytymistekijöiden aktiivisuudet yksiköissä yksikköä/ml ja oikealle ordinaatalle NaCl-gradientin konsentraatio yksikössä mol/1. Gradientin lineaarinen kulku on esitetty suoralla G. Kuten 30 kuviosta 1 näkyy, eluoituu proteiini, jolla on tekijä IX- aktiivisuutta, alueella 0,1...0,5 (molaarisuus) maksimin ollessa 0,3:n (molaarisuus) kohdalla, proteiini, jolla on FEIB-aktiivisuutta, NaCl-konsentraation ollessa alueella 0,3 ...0,5 (molaarisuus) maksimin ollessa 0,4:ssä (molaarisuus).

35 Kasvava NaCl-konsentraatio on todettavissa NaCl-gradientista, joka ulottuu O-molaarisesta 0,65-molaariseen NaCl:iin.

11 77048

Lopuksi on keksinnön mukaan valmistettavalle tuotteelle neljäntenä ominaispiirteenä myös luonteenomaista globu-liinipitoisuus elektroforeettisessa erotuksessa, mikä selitetään piirustuksen kuviossa 2. Kuvion 2 ylempi osa 5 havainnollistaa esimerkin avulla eroituskäyrää keksinnön mukaisille dekstraanisulfaatti-sepharoosi-kromatografia·: eluaateille, jotka sisältävät proteiinia, jolla on tekijä-IX-aktiivisuutta, ja FEIB-aktiivisuutta, kuvion 2 alempi osa taas esittää luonnollisen ihmisplasman 10 elektroforeettis en erotuskäyrän. Voidaan huomata, että tässä esimerkissä päähuippu a-globuliinivyöhykkeellä nousee JO #:iin kokonaisproteiinista. Päähuippuun liittyy α-globuliinialueella olkapää, joka muodostaa 1 h % kokonaisproteiinipitoisuudesta. Tähän olka-15 päähän liittyy β-globuliinivyöhykkeellä loiva huippu, joka vastaa 16 % kokonaisproteiinista.

Keksinnön mukaan valmistetun tuotteen seuraava ominaispiirre on edullinen siten, että tekijä VIII-inhibiittori-plasman FEIB-aktiivisuus säilyy vähintään 50 %:ssa.

20 yhden tunnin inkuboinnin jälkeen. Tämä ominaisuus merkitsee pitempiaikaista vaikutusta sovellutuksissa tekijä VIII-inhibiittori-potilaisiin.

Keksinnön mukaan valmistetun tuotteen seuraava ominaisuus on edullinen siten, että tekijä IX-aktiivisuus 25 säilyy tekijä IX-puutosplasmassa vähintään 50 $:ssa yhden tunnin inkuboinnin jälkeen. Tämä merkitsee, että tuote sisältää vähän tai erittäin pienen määrän aktivoitua tekijä IX:ää. On tunnettua, että aktivoitu tekijä IX inaktivoituu ihmisplasmassa. Aktivoitu 30 tekijä IX aiheuttaisi haitallisia trombogeenis ia vaikutuksia. Kirjallisuudesta (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Voi. Jk, No. 7, 3028-2032, Juli 1977, "In vitro and in vivo correlation of clotting protease activity:

Effect of heparin" ,tekijät S.N. Gitel, R.C. Stephenson 35 ja S. Wessler) on tunnettua, että juuri tekijällä IXa vastoin muita aktivoituja hyytymistekijöitä, kuten Xa 5 77048 ja Ha (trombiini) on suurin trombogeeninen vaikutus.

Lopuksi keksinnön mukaan valmistetulla, veren hyytymistä edistävällä tuotteella on edullinen ominaisuus siinä, että se sisältää inter-alfa-trypsiini-inhibiittoria 5 (Tl) 0,05...5 mg/FEIBA-yksikköä.

ITI-pitoisuus saa aikaan sen, että keksinnön mukaisen tuotteen trombogeenisuus on alhainen Wessler-kokeessa.

Keksintö käsittää siten menetelmän uuden, 10 ihmisproteiinipohjäisen verenhyytymistä edistävän tuotteen valmistamiseksi, joka sisältää hyytymistekijöitä II, VII, IX ja X ja tekijä VIII-inhibiittori-bypass-aktiivisuutta. Tälle' menetelmälle on tunnusomaista, että ihmisplasmaa käsitellään sulfatoiduilla suurpoly-15 meerisilla hiilihydraateilla ja/tai emäksisillä ioninvaihtajilla , ja tuotetun FEIB-aktiivisuuden omaava proteiiniseos absorboidaan, minkä jälkeen se saadaan eluoimalla ja konsentroimalla.

Menetelmää käytettäessä on otettava huomioon, 20 että plasma tai reaktioon osallistujat pidetään vapaina aineista, jotka kykenevät nostamaan antitrom-biini III-aktiivisuutta, kuten hepariini tai hepa-rinoidit.

Keksinnön erään toteutusmuodon mukaan plasmaa 25 käsitellään ensin lyhytaikaisesti sulfatoiduilla suurpolymeerisillä hiilihydraateilla, tuotetun FEIB-aktiivisuuden omaava proteiiniseos absorboidaan dekstraanipohjaiseen ioninvaihtajaan ja eluoidaan siitä välittömästi ja konsentroidaan.

30 Keksinnön toisen toteutusmuodon mukaan plasmaa käsitellään dekstraanipohjai s elia ioninvaihtajalla, ja vähintään kahden tunnin vaikutusajan jälkeen ioninvaihtajaan absorboitu, tuotetun FEIB-aktiivisuuden omaava proteiiniseos eluoidaan ja sitten konsentroidaan. 35 Tässä toteutusmuodossa FEIB-aktiivisuuden tuottaminen riippuu vaikutusalasta. Se voi nousta ^8 tuntiin asti.

6 77048 Käytetyt menetelmätoimenpiteet eivät ole kriittisiä ja ne voivat vaihdella laajoissa rajoissa; pH-arvo voi nousta 6:n ja 9:n välille, lämpötila voi olla 0...h0°C, käytetyt dekstraanisulfaattimäärät 5 voivat nousta arvoon 0,1...500 mg/1 plasmaa ja DEAE-Sephadexia voidaan käyttää 0,01...10 g/l plasmaa.

Keksinnön mukaisen menetelmän lähtöaineena ei tule kysymykseen ainoastaan luonnollinen ihmisplasma vaan myös plasmafraktiot, esim. kryoylimäärä (kryo-Uberstand) 10 ja Cohn-I-ylimäärä (Cohn-I-CJberstand) (8% alkoholi).

Keksinnön mukaista menetelmää selitetään seuraavissa esimerkeissä lähemmin, jolloin esimerkkien yhteydessä selitetään käytetyn määritysmenetelmät ja tulokset käsitellään 15 taulukoituna.

E s imerkki 1: 10Ö0 1 tuoreena jäädytettyä ihmisestä saatua sitraattiplasmaa sulatetaan 0...+U°C:ssa ja täten laskeutuva kryosaostuma erotetaan sentrifugöimalla 20 +2°C:ssa. Tuloksena saatuun "kryoylimäärään" lisätään luonnollisessa pH:ssa 7>7 10 g dekstraanisulfaattia (molekyylipaino 500.Ö00) ja sekoitetaan 15 minuuttia +U°C:ssa, jolloin saadaan FEIBA-aine.

Tämän jälkeen lisätään 500 g anioninvaihtajaa 25 DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala,

Ruotsi) ja sekoitetaan +U°C:ssa puoli tuntia, jolloin tuotettu FEIBA-aine yhdessä protrombiinikompleksiteki-jöiden (II, VII, IX, X) ja inerttien proteiinien kanssa absorboidaan liukenemattomaan DEAE-Sephadexiin.

30 DEAE-Sephadex erotetaan välittömästi absorptio- vaiheen jälkeen sentrifugoimalla tai suodattamalla; jäljelle jäävää plasmaa voidaan käyttää gamma-globu-liinin ja albumiinin valmistukseen.

DEAE-Sephadexin pesu suoritetaan kahdessa vaihees-35 sa; DE AE-Sepha.dexia sekoitetaan ensin 15 minuuttia +U°C:ssa 50 1:ssa liuosta, joka sisältää Ug/l trinatrium- 7 77048 sitraatti·2Η,,0: a , 7g/l natriumkloridia ja 18 g/l dinatriumvetyfosfaatti*12H20:a tislatussa vedessä, pH 7,5. Suodatuserotuks en jälkeen DEAE-Sephadexia sekoitetaan 15 minuuttia +^°C:ssa ja 50 1:ssa liuosta.

5 joka sisältää U g/l trinatriumsitraatti·2H20:a ja 7 g/1 natriumkloridia tislatussa vedessä, pH 7,5, ja tämän jälkeen se erotetaan jälleen suodattamalla.

Eluoimiseksi DEAE-Sephadexia sekoitetaan 20 minuuttia +U°C:ssa 25 l:ssa liuosta, joka sisältää 10 30 g/l natriumkloridia ja 1 g/l trinatriumsitraatti·2H20:a tislatussa vedessä, pH 7,0. Eluaatti, joka sisältää tuotettua FEIBA-ainetta, protrombiinikompleksiteki-jöitä (II, VII, IX, X) kuten myös inerttiä proteiinia, saadaan suodattamalla, DEAE-Sephadex hylätään. Eluaattia 15 dialysoidaan 1000 1: aa tislattua vettä vastaan +U°C:ssa yli yön, sen:jälkeen jäädytetään ja lyofilisoidaan ensimmäisen kerran. Tuloksena saatavan bulk-materiaalin FEIB-aktiivisuus määritetään, nimittäin DE-hakemus-julkaisussa 27 3*+ 821 kuvatun menetelmän mukaan.

20 Lääketieteellisesti käyttökelpoisen, FEIB- aktiivisuutta omaavan tuotteen valmistamiseksi bulk-materiaali liuotetaan niin suureen määrään tislattua, pyrogeenivapaata vettä, että FEIB-aktiivisuus on 10...50 FEIBA-yksikköä/ml (tässä tapauksessa 25 25 FEIBA-yksikköä/ml) . Sen jälkeen kun isotonian (Isotonie) valmistamiseksi tarpeelliset suolat on lisätty ja pH on säädetty välille 7,0...7,5 luos siivilöidään membraani-suodattimen läpi ja viimeiseksi steriilisuodatetaan 0,2. m:n membraanisuodattimen läpi. Liuos täytetään 30 mitta-astiassa (Endbehälter) steriileissä olosuhteissa . . . 20 m :aan, syväjäähdytetään ja lyofilisoidaan.

Es imerkki : 2: 1000 1 tuoreena jäädytettyä ihmisestä saatua sitraattiplasmaa sulatetaan 0 . . . +1+°C : s sa ja täten . Λο„ 35 laskeutuva kryosaostuma erotetaan sentnfugoimalla +2 C:ssa. Tuloksena saatuun "kryoylimäärään" lisätään luonnollisessa 8 77048 pH:ssa 7>7 500 g anioninvaihtajaa DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Ruotsi) ja sekoitetaan puoli tuntia +H°C:ssa, jolloin protrombiini-kompleksitekijät (il, VII, IX, X) ja inertit proteiinit 5 absorboituvat DEAE-Sephadexiin.

Tämän jälkeen seos jätetään 12 tunniksi +U°C:een; tämän kontaktiajan aikana saadaan aikaan FEIBA-aine.

DEAE-Sephadex erotetaan sentrifugoimalla tai suodattamalla 12-tuntisen kontaktiajan jälkeen; jäl-10 jelle jäävää plasmaa voidaan käyttää gamma-globuliinin ja albumiinin valmistukseen.

DEAE-Sephadexin käsittely edelleen (kaksinkertainen pesu, eluointi jne.) seuraa samalla tavoin kuin esimerkissä 1 on kuvattu.

15 Messierin tromboosi-indusoiva aktiivisuuskoe, jota on kuvattu kirjallisuudessa, nimittäin J. Appi. Physiol. _1_^ ( 1959 )» 9^3-9^6,"Biologic assay of a t thrombosis-inducing activity in human serum" tekijät Stanford Messier, Stanley M. Reimer ja Mindel C Sheps, 20 suoritetaan seuraavalla tavalla: Yhtä koetta varten käytetään kolme kaniinia. Eläimet nukutetaan . nembu-talilla; ylimääräisen paikallisen anestesian jälkeen sydämenpuoleinen·vena jugularis paljastetaan, 1...2 cm:n etäisyydelle valmistaan kaksi ligatuuria.

25 Tutkittava valmiste injektiodaan nyt haluttuina annoksina 15 sekunnin aikana paljastettua vena jugula-rista vastapäätä olevaan korvalaskimoon. 10...25 sekun nin aikana valmisteen injektionnin jälkeen valmistetut ligatuurit suljetaan. Eristetty laskimoleike on nyt 10 30 minuuttia in situ kaniinissa. Sen jälkeen laskimopala poistetaan eläimestä ja leikellään petrimaljassa 5 % natriumsitraattiliuokse s s a ja sisältö arvioidaan seu-raavan kaavan mukaan.

0 = ei koagulaatteja 35 1 = pieniä makroskooppisesti näkyviä fib- riinipartikkeleitä 9 77048 2 = muutamia pieniä trombeja 3 = kaksi tai useampia suuria trombeja U = yksi, koko eristetyn laskimoleikkeen täyttävä trombus 5 Tapauksessa U koe arvioidaan positiiviseksi.

Keksinnön mukaiselle tuotteelle on olennaista, että ei tapahdu ^-reaktiota injektoitaessa tuote, joka sisältää vähintään 2 yksikköä FEIBA:aa/kg koe-eläintä.

Kaliikrein-aktiivisuus- ja e sikallikrein-10 aktivaattori-aktiivisuusmääritykset suoritetaan seuraa-valla tavalla.

KALLIKREIN: 1. Menetelmä

Kallikrein lohkaisee amidolyyttisesti para-nitroanoliinia (pna) spesifisestä kromogeenisesta aineesta. Pna:n konsentraatio mitataan fotometrisesti aallonpituudella U05 nm.

2. Reagenssit:

Puskuri: 20 liuos A: 3,03 g "TRIS":a ja 1,7 g imidatsolia liuotetaan 500 ml:aan 0,1 n suolahappoa ja lisätään vettä 1000 ml:aan asti.

Liuos B: ^,04 g "TRIS":a ja 2,27 g imidatsolia liuotetaan 500 ml:aan 0,1 n suolahappoa ja lisätään 25 vettä 1000 ml:aan asti.

Liuos C: 11,69 g natriumkloridia liuotetaan 1000 ml:aan vettä.

Liuoksia A ja B sekoitetaan, kunnes saavutetaan pH 7,9. Tämä seos sekoitetaan yhtä suureen tilavuuteen 30 liuosta C.

Kromogeeninen aine S-2302 (Firma Kabi, Tukholma): H-D-ptolyyli-L-fenyylalanyyli-L-arginiini-p-nitroanilidi-dihydrokloridi 1-millimolaarinen liuos S-2302:sta: 25 mg 41 ml:ssa vettä. 35 Näyte: Näyte liuotetaan alkuperäistilavuuteen ja käytetään laimentamattomana kokeeseen.

10 77048 3. Koe:

Vesihauteessa 37°C:n lämpötilassa pipetoidaan muoviputkiloon 1,0 ml puskuria, temperoitu etukäteen 37°C:een 5 0,1 ml näytettä 0,2 ml kromogeenista ainetta S-2302.

Tämä seos asetetaan 37°C:een teraperoituun foto-metriin ja mitataan optisen tiheyden kasvu minuuttia kohti (ΔΟΤ/min) aallonpituudella ^05 nm kerroksen pak-10 suuden ollessa 10 mm. Näytteen aktiivisuus ilmaistaan yksikössä ΔΟΤ/min.

ESIKALLIKREINAKTIVAATTORI: 1 . Menetelmä:

Puhdistetusta esikallikreintuotteesta (PKK) 15 tuotetaan e sikallikreinaktivaattorin (PKKA) avulla Kallikreinia (KK). Kallikrein lohkaisee amidolyyttise sti paran itroaniliinia (pna) spesifisestä kromogeenis esta aineesta. Pna:n kon sentraatio mitataan fotometrisesti aallonpituudella k03 nm.

20 2. Reagenssit:

Puskuri ja kromogeeninen aine vastaavat Kallikrein-määrityksessä kuvat tu j a reagensseja.

Esikallikreintuote:

Tuotteen valmistus tapahtuu Harpelin ohjeen 25 mukaan, jota on muuntanut M.S. Horowitz (New York Blood

Center). Siinä käsitellään ihmissitraattiplasmaa DEAE-selluloosan avulla. DEAE-s elluloos aan sitoutumaton fraktio sisältää e sikallikre in in.

Positiivinen kontrolli (standardi): 30 Standardina (=tarkistusarvo) käytetään albumiini- tuotetta, jota on saatu Food and Drug Administration'in Bureau of Biologic s'sta (BoB), Bethesda , Maryland 20205 , USA. Tämä tuote sisältää erään e sikallikreinaktivaatto-rin. Kaliikreintuotanto tällä BoB-standardilla esittää 35 tarkistusarvoa 1 tai asetetaan 100 #:ksi.

n 77048 Näyte: Näyte liuotetaan alkuperäistilavuuteen ja käytetään laimentaraattoraana kokeeseen.

Koe: 5 Vesihauteessa 37°C:n lämpötilassa pipetoidaan muoviputkiloon 0,05 ml e sikallikreintuotetta 0,05 ml näytettä a) BoB-standardia tarkistusarvoa varten 10 b) koenäytettä (toiseen koe- annokseen) 10 minuutin inkuboinnin 37°C:ssa jälkeen pipetoidaan 0,7 ml puskuriliuosta 0,1 ml kromogeenista ainetta S-2302.

15 Tämä seos asetetaan 37°C:een temperoituun fotometriin ja mitataan optisen tiheyden kasvu minuuttia kohti (ΔΟΤ/rain) aallonpituudella U05 nm kerroksen paksuuden ollessa 10 mm. Näytteen aktiivisuus (ΔΟΤ/min) ilmaistaan kertoimella - suhteessa BoB-standardi in, jonka 20 arvo on 1 - tai prosentteina BoB-standardista.

Keksinnön mukaan valmistetun tuotteen karakterisointi tuotteen affiniteetti-kromatografisella erotuksella dekstraanisulfaatti-sepharoosista kuvattiin jo kuvion 1 yhteydessä.

25 Tekijä IX-aktiivisuutta ja FEIB-aktiivisuutta omaavien proteiinien elektroforeettinen erotus, johon viitataan kuvion 2 yhteydessä, voidaan suorittaa seuraavalla tavalla.

Erilaisten proteiinien elektroforeettisessa 30 erotuksessa kantajana toimii selluloosa-asetaatti-membraa-ni, joka on kostutettu elektroforeesipuskurilla (pH 8,6, ionivahvuus 0,075). Tälle membraanille levitetään tutkittavat näytteet yhdessä standardina toimivan tavallisen ihmisplasman kanssa ja tämän jälkeen erote-35 taan sähköisessä kentässä; erotus tapahtuu siten, että eri tavalla varatut proteiinit kulkevat eri nopeuksilla 12 77048 sähkökentässä. Tämän vuoksi näytteillä varustettuja membraaneja käsitellään erityisessä, elektroforeesi-puskurilla täytetyssä kennossa 16...18 minuuttia 250 voltin jännitteellä virran alkuvoimakkuuden ollessa 5 U...6 milliampeeria.

Erotusvaiheen suorittamisen jälkeen eri proteiinit tehdään näkyviksi asettamalla membraani kiinnitys- tai väriliuokseen. Muutamien huuhtelujen jälkeen membraani tehdään seuraavassa huuhteessa 10 läpinäkyväksi, levitetään lasilevylle ja kuivataan lämpökaapissa 100°C:ssa.

Kuivattu membraani analysoidaan nyt automaattisesti rekisteröivässä ja integroivassa densitometrissa ja valmistetaan erotuskäyrät, kuten kuviossa 2 esitetään.

15 Eri proteiinit näkyvät siinä eri vahvuisina käyräalueina, joiden pinta-alat ovat verrannollisia vastaavien proteiinien suhteellisuusprosenttiarvoihin, jolloin nämä pinta-alat määritetään densitometrin automaattisen integroinnin avulla.

20 Eri käyräalueiden tai koenäytteen proteiinien rinnastus määriteltyihin proteiineihin tai proteiini-ryhmiin tapahtuu vertaamalla standardina käytetyn tavallisen ihmisplasman käyräalueisiin. Viimeksi mainittu erotetaan elektroforeettisella analyysilla viiteen 25 protei iniryhmään, jotka määritelmän mukaan merkitään - alenevassa kulkunopeusjärjestyks e ssä sähkökentässä - seuraavasti: albumiini, a-globul i in i , (3-globul i in i , fibrogeeni j a "f -globuliini .

FEIBA-yksikön määritelmä kuten myös sen 30 määritys (vaikutuskoe) on kuvattu kirjallisuudessa, ni mittäin AT-patenttijulkaisussa 350 726 (US-patentti-julkaisu U 160 025, DE-hakemusjulkaisu 27 3*+ 821), Hyytymistekijöiden II, VII, IX ja X aktiivisuuden määritys on myös kuvattu edellä mainitussa kirjalli-35 suudessa.

FEIBA:n jäämäaktiivisuuden määritys inkuboinnin 13 77048 jälkeen tekijä VIII-inhibiittori-plasmassa suoritetaan seuraavalla tavalla.

1. Reagenssit: Käytetyt reagenssit on kuvattu FEIBA-yksiköiden 5 määrityksen (vaikutuskoe) yhteydessä AT-patenttijulkaisussa 350 726 (US-patentt i julkai su 1+ 160 025» DE-hakemus- julkaisu 27 3¾ 821).

2. Koe:

Tuotteesta, joka on säädetty 50 FEIBA-yksikköön/ml, 10 valmistetaan seuraavat laimennokset liuoksen avulla, joka sisältää 7 g/1 natriumkloridia ja 7 g/l natrium-sitraatti*2H20ta : 1 : 2, 1 : U, 1:8, 1 : 16, 1 : 32 ja 1 : 6k. Näistä kuudesta laimennoksesta valmistetaan kustakin 1 : 10 -laimennos tekijä VIII- 15 inhibiittoriplasmassa (0,05 ml etukäteen laimennettua näytettä + 0,^5 ml tekijä VIII-inhibiittoriplasmaa).

Nämä 1 : 10 -laimennokset tekijä VIII-inhibiit- toriplasmassa (inkubointiseokset) analysoidaan nyt heti ja yhden tunnin inkuboinnin 37°C:ssa jälkeen seuraavan 20 koesuunnitelman mukaan: 0,1 ml "inkubointiseosta" 0,1 ml fosfolipidi-kaoliini-suspensiota inkuboidaan 1 minuutti 37°C:ssa 0,1 ml m/ko kalsiumkloridia.

25 Aika kalsiumkloridilisäyksestä koagulaatin muodostukseen mitataan sekuntikellolla kuten vaikutuskokeessa.

3. Jäämäaktiivisuuden laskeminen:

Jo määrättyjen laimennosten hyytymisajoista muodostetaan kalibrointikäyrä samalla tavalla kuin 30 vaikutuskokeessa (laimentamaton näyte = 50 FEIBA-yksik- köä/ml). Yhden tunnin ajan inkuboitujen eri laimennosten aktiivisuudet (FEIBA-yksikköä/ml) lasketaan nyt käyttämällä kalibrointikäyrää ja ilmaistaan prosentteina vastaavista inkuboimattomista laimennoksista.

35 Näin laskettujen aktiivisuuksien keskiarvot antavat tulokseksi näytteen keskimääräisen jäämäaktiivisuuden iu 77048 yhden tunnin inkuboinnin jälkeen ilmaistuna prosentteina alkuaktiivisuudesta ennen inkubointia.

Tekijä IX:n jäämäaktiivisuuden määritys inkuboinnin jälkeen tekijä IX-puutosplasmassa suori-5 tetaan seuraavalla tavalla: 1. Reagenssit:

Tekijä IX-puutosplasma: Sellaisen potilaan sitraattiplasmaa, jolla on vaikea hemofilia B (tekijä IX alle 1 %) .

10 Fosfoiipidi/kaoliini-suspensio: PTT-reagenssi' yhtiöstä Immuno Diagnostica Ges. m.b.H. Koetta varten sekoitetaan tarpeellinen määrä tekijä IX-puutosplasmaa samaan tilavuuteen fosfolipidi/kaoliini-suspensiota, inkuboidaan 5 minuuttia 3T°C:ssa ja säilytetään jää-15 hauteessa koeajanjaksolla.

Sitraatti-/keittosuolaliuos näytteiden laimennosta varten: 7 g/1 trinatriumsitraatti·21^0;a, 7 g/l natriumkloridia kalsiumkloridia m/20 (0,05 molaarista): säilytetään 37°C:ssa koeajanjaksolia.

20 2. Koe:

Tuotteesta, joka on säädetty arvoon 50 tekijä IX-yksikköä/ml, valmistetaan 7 geometrista laimennosta (1 : 2, 1 : h, ...1 : 128) sitraatti-/keittosuola- liuokseen. Laimentamattomasta näytteestä kuten myös 25 7 geometrisesta laimennoksesta valmistetaan kustakin 1 : 10-laimennos tekijä IX-puutosplasmaan (0,05 ml etukäteen laimennettua näytettä + 0,1+5 ml tekijä IX-puutosplasmaa).

Nämä 1 : 10 -laimennokset tekijä IX-puutos- 30 plasmassa ("inkubointiseokset") analysoidaan nyt heti ja yhden tunnin inkuboinnin 37°C:ssa jälkeen seuraavan koesuunnitelman mukaan, jolloin jokainen inkubointi-seos laimennetaan ennen määritystä 1 : 10 sitraatti-/ keittosuolaliuoksella: 35 15 77048 0,2 ml tekijä IX-puutosplasman ja fosfolipidi/ kaoliinin seosta 0. 1 ml "inkubointiseosta", laimennettuna 1:10 sitraatti-/keittosuolaliuok sella 5 inkuboidaan 1 minuutti 37°C:ssa 0,1 ml m/20 kaisiumkloridia .

Aika kai siumkloridin lisäyksestä koagulaattien muodostumiseen mitataan sekuntikellolla.

3. Jäämäaktiivisuuden laskeminen: 10 Jo määrättyjen laimennosten hyytyrnisajoista muo dostetaan kalibrointikäyrä (laimentamaton näyte = 50 tekijä IX-yksikköä/ml), jossa hyytyrnisajat sijoitetaan vastaavia laimennoksia vastaan logaritmipaperille.

Yhden tunnin ajan inkuboitujen eri laimennosten aktii-15 visuudet lasketaan nyt käyttämällä kalibrointikäyrää ja ilmaistaan prosentteina vastaavien inkuboimattomien laimennosten aktiivisuuksista. Näin laskettujen aktiivisuuksien keskiarvot antavat tulokseksi näytteen keskimääräisen jäämäaktiivisuuden yhden tunnin inku-20 boinnin jälkeen ilmaistuna prosentteina inkuboinnin alkuaktiivisuudesta.

Inter-alfa-trypsiini-inhibiittorin (ITI) immunologinen määritys: 1. Menetelmä: 25 Määritys tapahtuu Ouchteriony-tekniikalla , jossa agarväliaineessa diffundoituu spesifinen vasta-aine antigeeniä sisältävää näytettä vastaan. Antigeeni reagoi spesifisesti vasta-aineen kanssa ja muodostaa immuuni-saostuma juovan, mikä arvioidaan positiiviseksi reaktioksi. 30 Reagenssit:

Antiseerumi kaniinin ITI:tä vastaan, Behringwerke AG, Marburg(Lahn , BRD).

Agar: Liuos, joka sisältää 1,25 g agaria, 0 ,9 g natriumkloridia ja 100 mg natriumatsidia 100 ml:ssa 35 vettä, keitetään hetken ja kuuma, homogeeninen liuos valetaan noin 2 mm:n paksuisiksi levyiksi. Jäähty- '6 77048 neeseen, kovettuneeseen geeliin tehdään noin 2 mm:n kokoisia reikiä 5 mm:n etäisyyksille kahteen riviin.

Standardi tai näyte:

Kaiibrointlaineena toimii Behringwerke'n 5 proteiini-standardiseerumi, jolla on määrätty ITI-pitoisuus. Tästä referens siseerumi sta valmistetaan geometrinen laimennossarja fysiologiseen natrium-kloridiliuokseen (9 g NaCl/l).

Tutkittavan näytteen suhteen menetellään 10 samalla tavoin kuin standardin kanssa.

3. Koe:

Agarin toiseen reikäriviin sijoitetaan kalibroin-tiaineen tai tutkittavan näytteen laimennokset, vieressä olevaan reikäriviin pipetoidaan laimentamaton spesifinen 15 antiseerumi. Täten täytettyä agarlevyä inkuboidaan 15 tuntia 3T°C:ssa. Samalla tulkitaan immuunisaostumat.

U. ITI-konsentraation laskeminen: Näytteen ITI-konsentraation mitta-asteikkona on se laimennusaste, jossa vielä saostuma juuri voidaan 20 nähdä (näytteen "titteri"). Tutkittavan näytteen ITI-konsentraatio lasketaan seuraavasti: ^oenäytteen fitteri χ standardin ITI-konsentraatio Standardin titteri 25 ITI-konsentraatio annetaan yksikössä mg % (mg/100 ml).

Esimerkkien 1 ja 2 mukaan valmistetuilla tuotteilla oli edellä mainittujen määritysmenetelmien suorituksen jälkeen seuraavat tunnusarvot:

Piirustuksen kuvioissa 1 ja 2 olevat esitykset 30 vastaavat affiniteettikromatografisen ja elektroforeetti-sen erotuksen suhteen jäljessä olevia esimerkin 2 ohj e itä.

it 77048 taO I—li—I pH I—1

C\j M OOOO

£ a "7 A £ A Ä +5 ·η x saas (1) X CM O ΙΛ4 >- I „

i ·> Lj rt f\ D λ a «i <£ O O O O

taajtöJ-mMDC—CM pq ^

•rlBcdCMCMCMCMCM M OOOO

β -H X H II

H W Cd fx, 00 Π cd <υ a ** o o n

OJ H H f—I H

-p bO OOOO

O X cd cd cd cd

Cd Β Β Β B

? *"" x a a a a

< Ö I

pq ·η <! <j\ r- a\ T- H X O CO O CM m x- en x- x· pr~] Jh β λ o r. * n |—j λλλλ

Cm OJ Cd \D lAJCOJ Cd OOOO

E Cd CM CM CM CM CM Pp I I

•H >i X CO

tn cd o T- oo cl) S *— ·> ·> __J_____Q_Q_

•H

·· Ö -P

cd cd -P

co cd cd tn > cd (U cd Vt Cd

<u cd H cd P

X U Cd -P Cd O cd en .h -p χ ω ·η o -h

: I en ö cd O

Ci cd H PJ

d) cd cd oj h : H -P Jh d> en en -p cd <n O en cd en cd cd cd en X <U -P X -μ p p p X CS cd (U ·Η en +> cd O X Td O ·Η ·Η ω PI en ·Η c< ί» Ο ·Η O Cdcd cd H ·η cd >

Cd t» -H OJ -rl H "H

E-e en V -P OJ ·η H ·η tri ·η cd tn X v ΗΘΗ !> -P -P in PJ cd en χ g -'-, B H -Henen tfl cd I cd cd

^ :cd --» B H -H cd O tn X cd I

sed :o :cd — -p G -p ·η h tn pq

H :0 X :0 :cd X OJ PJ eri > -H H

Β X X X '-O cdtUOJ Β ·Η · f» M

\ ΛΙ ·Η M bDOJ O H -p ·Η pp :cd ·η tn -h x pj O en p -p I ·η i :0 tn j< tn ·η u pi jij χ td X tn -P tn X X SM tn coacd -P eri Ή χ ή χ χ ι χχ ·η o -p -p tn i sed tri ;cd •n ι h ι X CPtn -p ·η χ g ι g

tn η H X | (Lt-po o; tn h a PQ B

X H p> M X <U C OJOHH-H

x ui ή p -ρ o · e ca e:

I ted ted :cd :cd O 0) cd ·η k -p eu Pm QJ

<d -το-το & fl tri pq ·Η -rl ·Η ·Η a ·Η χ H X X X X O V ft ω n tj ti u h voj

Pp -P -P -P -P -P d m 18 77048 —-----—κ— OJ < pq

3 S M

+J -H « XX ^9.¾¾¾¾ 6s9. ^9. « <u s β \ x Φ 3 o x vo oo t— l/v tnj cn S 3 t— i- ·— lo irv b •Η ·Η ,¾

B to 0 OJ

I—I Φ Β *

3 O

f»_______ φ Ρ >>

0 I

3 < -P *- pq

1 H

< S « pq -h x H X ¢9 69 K S5 6:5. ^

« 3 S bO

X J) oi t— VO C— O O er\ OB

B cd vo ί- *- vo vo

•H X VO

M 3 ·> Φ a o 3 cd Φ S ω h I -h ω i> cn o S 3

cd ω 3 -P 3 B

cd 3 3 3 -P 3 ω BO ω ·η ·ρ O 3

O O -h S -h H

3 !> 3 0 3 ft -H

cd O) -h 3 ·η 0) en 3

-P ·Η -p Ä ti O O

-p 3 O 3 O -P O

30 X S -H X 3 -P

3 3 3 3 0) I 3 *H

en «H ft I Td M 6s9. Pc ·Η

• H o Ph :cd ·Η OI M I I O

> X ·Η :3 3 >J M en X ·Η H il 3 P( o > 3 H ,3 •H Φ ,3 3 X 99. 3 3

X 3 :3 X en -p l en · -H

^ oi O :3 rH 33 CO X > X I

3 3 Ph B3 O 333 -H -H

3 IO en > 3 3 -H 33

Oi (q ^ « ·η·η cn Φ χ φ ·η -P Μ X ·Η ·Η ·>Η > +0 i> (D O! Φ ·Η 3 «04333 ·Η 04 ·Η Ο) 3 X ω Ό X φ »ri ·Η ·Η Ή 3 Ή ι—I :3 ι—I Ρη

Η ·Η ·Η ·Η -ρ I -Ρ :3 Β :3 >J

Ο 3 Φ ι—I Η Η X 3 04 Ό :3·ο 3 X ·π> 3 3 3 3 ·Η 3 3 :3 -Ρ

Ο! Β Ρ Ρ Ρ 10) :3SW -op I

3 ΙΦΟΟΟ S3 S-Hcn I *Η 3 rH Χ·ΗγΗγΗΗ ·Η Oi :3 Β 3 X 3 Ρη 3 H S Μ bO PD Φ·Η s3 3 S HS Η 3 ·Η I I I 3 r-Ι ·τΗ en ·Η 3

X :3 ·Η Ö 3 CO 04 f—I 103 :3 0 I

•—- ·π> Φ ·Η 3 < Ρ Η Ό ΟΙ 3 η-p .XX ΡΡ 3 Ρη ·η 3 0> X Ο Η ·Η H X I χχχ φ 3 3 en « 3 ·Η Φ 3 3 χ pH X Φ X ·Η 3 χ ·Η ·Η

Claims (4)

19 7 704 8

1. Menetelmä uuden ihmisproteiinipohjäisen, veren hyytymistä edistävän tuotteen valmistamiseksi, joka tuote 5 sisältää hyytymistekijöitä II, VII, IX ja X sekä tekijä VIII-inhibiittori-bypass-aktiivisuutta (FEIBA), ja - jolta puuttuu trombogeeninen aktiivisuus vähintään sellaiseen arvoon asti, joka vastaa kaksi yksikköä FEIBA:aa/kg kaniinia tromboosi-indusoi- 10 vasaa Wesslerin aktiivisuuskokeessa, - jolla ei ole kallikreiini-aktiivisuutta eikä esi-kallikreiini-aktivaattori-aktiivisuutta - mitattuna tuotteen vesiliuoksessa FEIBA-konsentraati-olla, joka on vähintään kymmenen yksikköä milli- 15 litraa kohti, - joka voidaan erottaa affiniteettikromatograafi-sesti dekstraanisulfaatti-agaroosista NaCl-gradientin avulla siten, että proteiini, jolla on tekijä IX-aktiivisuutta, eluoituu alemmassa NaCl- 20 konsentraatiossa kuin proteiini, jolla on FEIB- aktiivisuutta, ja - jonka eluaatit, jotka sisältävät proteiinia, jolla on tekijä IX-aktiivisuutta, ja proteiinia, jolla on FEIB-aktiivisuutta, sisältävät elektro- 25 foreettisessa erotuksessa a- ja g-globuliinia, jolloin erotuskäyrässä näkyy a-vyöhykkeellä pää-huippu, joka vastaa 60...80 % kokonaisproteiinis-ta, siihen liittyvä olkapää, joka vastaa 10...20 % kokonaisproteiinistä, kuten myös erotuskäyrän 30 olkapään muotoiseen kohtaan liittyvä loiva huippu β-globuliinivyöhykkeellä, joka vastaa 10...20 ί kokonaisproteiinipitoisuudes ta, tunnettu siitä, että - ihmisplasmaa tai VHI-tekijän erotuksen jälkeen 35 saatua ihmisplasmafraktiota käsitellään emäksi sellä, dekstraanipohjäisellä ioninvaihtajalla, jolloin ioninvaihtajän ja sen päälle adsorboitu- 20 7 7048 neen proteiiniseoksen välinen kontaktiaika FEIB-aktiivisuuden tuottamiseksi on ainakin 2 tuntia, minkä jälkeen tuotetun FEIB-aktiivisuuden omaava proteiiniseos eluoidaan ja sitten konsentroidaan, 5 tai - ihmisplasmaa tai VHI-tekijän erotuksen jälkeen saatua ihmisplasmafraktiota käsitellään FEIB-aktiviteetin tuottamiseksi lyhyen aikaa sulfatoi-duilla korkeapolymeerisillä hiilihydraateilla, 10 tuotetun FEIB-aktiivisuuden omaava proteiiniseos adsorboidaan emäksiselle, dekstraanipohjäiselle ioninvaihtajalle, minkä jälkeen se välittömästi eluoidaan ja konsentroidaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että tekijä IX-aktiivisuuden omaava proteiini eluoidaan NaCl:n konsentraatiolla, joka on 0,1... 0,5 (molaarinen) ja että FEIB-aktiivisuuden omaava proteiini eluioidaan NaCl:n konsentraatiolla, joka on 0,1...0,5 (molaarinen), jolloin maksimaalinen tekijä IX-aktiivisuus 20 eluoituu arvossa 0,3 (molaarinen) ja maksimaalinen FEIB-aktiivisuus eluoituu arvossa 0,4 (molaarinen). 77048 21

1. Förfarande för framställning av en ny blodkoagula-tionsbefrämjande preparation pä basis av humanproteiner med 5 ett innehäll av koagulationsfaktorerna II, VII, IX och X ooh en faktor VIII-inhibitor-bypass-aktivitet (FEIBA), vilken preparation - saknar trombogen aktivitet upp tili minst 2 enhe-ter FEIBA per kg kanin i den trombosinduoerande 10 aktivitetstesten enligt Kessler, - saknar kallikreinaktivitet och prekallikrein-aktivator-aktivitet - mätt i en vattenhaltig lös-ning av preparationen med en FEIBA-koncentration pä minst 10 enheter per ml, 15. affinitetskromatografiskt pä dextransulfat-agaros medelst en NaCl-gradient kan uppdelas sä, att proteinet med faktor IX-aktivitet elueras vid lägre NaCl-koneentration än proteinet med FEIB-aktivitet, och 20. eluaten, som innehäller proteinet med faktor IX- aktivitet och proteinet med FEIB-aktivitet vid elektroforetisk separation innnehäller a- och β-globulin, varvid elueringskurvan i a-omrädet uppvisar en huvudtopp motsvarande 60...80 % av 25 det totala proteinet, en därtill anslutande an- sats motsvarande 10...20 % av den totala protein-mängden liksom en tili elueringskurvans ansats-formiga förlopp anslutande, svagt utpräglad topp i β-globulinomrädet motsvarande ett innehäll av 30 10...20 % av det totala proteinet, kännetecknad av att - humanplasma eller en efter avskiljning av faktor VIII utvunnen humanplasmafraktion behandlas med en basisk jonbytare pä dextranbas, varvid jon- 35 bytarens kontakttid med pä denna adsorberad pro- teinblandning uppgär tili ätminstone 2 timmar, varpä proteinblandingen med genererad FEIB-