WO1991007484A1

WO1991007484A1 - Protein having activity like that of human protein c and/or activated human protein c

Info

Publication number: WO1991007484A1
Application number: PCT/JP1990/001471
Authority: WO
Inventors: Masahiko Suzuki; Kenji Wakabayashi; Yoshihiko Sumi; Yataro Ichikawa
Original assignee: Teijin Limited
Priority date: 1989-11-14
Filing date: 1990-11-13
Publication date: 1991-05-30
Also published as: JPH03155782A; JP2774163B2

Description

明糸田発明の名称

ヒトプロテイン Cおよび Zまたは活性化ヒトプロティン c様活性を有する蛋白

技術の背景

産業上の利用分野

本発明は、ヒトァ口ティン cまたは活性化ヒトァロティン c様活性を有する蛋白に鬨するものである .:. さらに詳しくは抗凝固剤または線溶促進剤として使用し得るヒトプロティン Cまたは活性化ヒトプロティン C様活性を有する蛋白に閬するものである。

ここで、本明細書において、ァミノ酸配列は I U P A C一 I U B生化学委員会（ C B N ) で採用された方法により略記するものとし、たとえば下記の略号を用いる。

Ala L—ァラニン

Arg L一アルギニン

Asn L—ァスパラギン

Asp L―ァスパラギン酸

Cys し一システン

Gin L一グルタミン

Glu L―グルタミン酸

Gly グリシン

His L—ヒスチジン lie し一イソロイシン

Leu し一口イシン

Ly s L―リジン

Met L一メチォニン

Phe L—フヱ二ルァラニン

Pro L一プロリン

Ser Lーセリン'

Thr L一スレ才ニン

Trp L一トリプトファン

Tyr Lーチロシン

Val L-バリン

また、 D N Aの配列はそれを構成する各デォキシリボヌクレオチドに舍まれる塩基の種類で略記するものとし . たとえば下記の略号を用いる。

A アデニン（デォキシァデュル酸を示す。〉

C シトシン（デォキシシチジル酸を示す。）

G グァニン（デォキシグァニル酸を示す。〉

T チミン（デォキシチミジル酸を示す。）

従来技術

ァロティン Cは血漿セリンプロテア一ゼ前駆体の一種であって、血小板や血管内皮細胞の表面で、トロンビンとそのレセァターであるトロンボモジユリンとの複合体による限定分解を受けて活性化され、セリンァロテア一ゼである活性化プロテイン C (以下 AP Cという）に変換される： A P Cは血液凝固系の活性化第 5因子および活性化第 8因子を選択的に分解することによって抗凝固活性を発揮する . この活性はァロティン Sによって増強されることが知られているまた、 A P Cは組織アラスミノーゲンァクチベータの阻害剤である PAI-1 を切断することにより、線溶促進活性をもっと考えられている。

ヒトァ口ティン Cのアミノ酸配列については既に、 Proc, Nat l. Acad. Sci. USA, 82, 467.3-4677 ( 1985)等で明らかなように、 Gla ドメインおよびェピダ一マルグロースファクター（ E G F ) 様ドメインをアミノ末端側に有する軽鎖（分子量約 21, 000) と活性化ペプチドおよび触媒ドメィンからなる重鎖（分子量 41, 000 ) とがジスルフィド結合したもの（ 2本鎖型〉である。

具体的にはヒトァロティン Cは第 1図に示すように軽鎖は、ァミノ末端 Ala からカルボキシル末端の Leu まで 155 個のアミノ酸からなり、重鎖はァミノ末端の Asp からカルボキシル末端の Pro まで 262 個のアミノ酸からなつており、軽鎖と重鎖は細胞中で（¾N—〉軽鎖- Lys- Arg-重緙（一 C O O H ) の形で生合成され、細胞から分泌される過程で Lys-Arg が切断され、 2本鎖化される。軽鎖と重鎖とは、軽鎖のアミノ末端から 141 番目の Cys と重鎖のアミノ末端から 120 番目の Cys との間でジスルフィド結合で結合している。

ヒトプロテイン Cから A P Cへの変換は、ヒトァロティン Cの重鎖のァミノ末端（以下、 N末という〉から 1 2 番目のアミノ酸から重鎖の N末のアミノ酸までの活性化ポリペアチドが除去されることによって行われる：従つて、 A P Cのアミノ酸配列はヒトァ口ティン Cのァミノ酸配列において、ヒトプロテイン Cのアミノ酸配列から、重鎖の N末から 1 2番目のアミノ酸から重鎖の N末のアミノ酸までのすべてを除いたものである：

軽鎖については、ァミノ末端側の構造は G i a ドメインおよび E G F様ドメインが存在しているので重要であるが、そのカルボキシル末端側、特に重鎖と結合している 14 1 番目の C y s 以降カルボキシル末端側のアミノ酸の活性に及ぼす影響等に鬨して明らかではない。

ヒトァ口ティン Cが活性化される際には、活性化ぺプチドのカルボキシ末端側に位置する切断部位が、活性化酵素（生体内にあっては前述のようにトロンビン一トロンボモジュリン複合体〉の活性中心の位置するくぽみに入り込む必要がある。このような酵素と基質（モトプロティン C ) との相互作用は、活性中心や切断部位周辺の立体構造に影響されると考えられる。こうしたことからヒトァロティン Cの 1 4 1 番目の C y s 残基以降カルボキシル末端側のアミノ酸の一部または全部を欠失した改変体においては、立体障害の緩和により、酵素の活性中心と基質中の切断部位とがより容易に接近できる結果、活性化される速度が増大することが期待できる。しかしながら、こうした検討の報告はなく、かかる改変体が活性を有するか否かも不明である。

発明の開示

すなわち本発明は、基本的に天然型のヒ卜プロテイン

Cまたは活性型ヒトァロティン Cの構造を有する蛋白であり、該蛋白の軽鎖におけるァミノ末端から 141 番目〜カルボキシル末端迄のアミノ酸配列が、下記表 1の（1)

〜（δ) のいずれかで示されるアミノ酸配列であることを特徴とする軽鎖を持ったヒトァロティン Cまたは活性化ヒトァロティン C様活性を有する蛋白に鬨するものである。

I ¾^ヒトァロティン cの

！アミノ匿列の謹の

Iァミノら C 号 141 142 143 144 145 146 147 148

(1) Cys-61 -Arg-Pro-Trp-Lys-Arg-Met アミノ醒列 (2) Cys-Gly-Arg-Pro-Trp-Lys-Arg

(3) Cys-Gly-Arg-Pro-Trp-Lys

(4) C s-Gly-Arg-Pro-Trp

(5) C s-Gly-Arg-Pro

(6) Cys-Gly-Arg

(7) Cys-Gly

(8) Cys 当該蛋白は、典型的には、軽鎖カルボキシ末端および重鎖ァミノ末端に一（ ¾〉 n 一 R2— ¾一を結合して互いに連結した形状、端的には上記記載の軽鎖と、天然型ヒトァロティン Cまたは活性化ヒトァロティン Cの重鎖とが下記表 3で示されるような構造で結合されて生合成されることができ、細胞から分泌される過程で 2本鎖化寸る

3

H_?N ( Rt ) R2-R3- 鎖一 COOH

Rt, , ¾は Arg または Lys

n -0, 1, 2, 3, または 4

重鎖；ヒ卜ァロティン Cまたは活性化ヒトァロティン Cの重鎖本発明の種々のアミノ酸配列を有する蛋白は、それぞれ天然型ヒトァロティンまたは活性化ヒトァロティン C と同様の性質、活性を有している

で天然型ヒトァロティン Cと同様の性質とし ϊ、例えば、本発明で得られた蛋白をプロティン c活性化酵素で処理することにより、抗凝固活性、線溶促進活性、ァミダ一ゼ活性等を有するようになること等が挙げられるすなわち、本発明で得られた天然型ヒトプロテイン C と同様の性質を有している蛋白は、天然型ヒトァロティン Cと同じくァロティン C活性化酵素で処理することにより天然型 A P Cと同様の性質を有する蛋白に変換される，ここでプロテイン C活性化酵素としては、トロンビン、トロンビン一トロンボモジユリ.ン複合体、蛇毒等が挙げられる。また重鎖ァミノ末端に存在する 12アミノ酸からなるァクティベーションぺプチドをあらかじめ欠失させておくことにより、直接活性化ヒトプロテイン Cと

Ml様の性質、活性を有した蛋白を発現させることもまた可能である。

また、 A P C活性としては、前述したとおり、凝固系の活性化第 5因子および活性化第 8因子を選択的に分解する抗凝固活性、並びに組織プラスミノ一ゲンァクチべ —ターの阻害剤である PAI-1 と反応して PAI-1 を失活させることに起因する線溶促進活性等が挙げられる。

木発明にはまた、基本的に天然型のヒトプロテイン C の構造を有する蛋白であり、該蛋白のアミノ酸配列の重鎖のァ.ミノ末端から 12番目アミノ酸から重鎖のアミノ末端迄のアミノ酸が下記表 2で示されるアミノ酸から選ばれた組み合わせ〈ただし、一 3〜12までの組み合わせが欠失、欠失、欠失、 Asp, Thr, Glii， Asp, G , Gl¾， Asp, Gin, Val, Asp, Pro, Ar であることを除く。）であることを特徴とするヒ卜ァロティン Cおよび./または活性化ヒトプロティン C様活性を有する蛋白が含まれる

\ 天然型ヒトプ πティン cのアミノ酸

jァミノ酸配列の重鎖の

Iァミノ末端からの番号

一 3 Asp，欠失

― Thr,欠失

一 1 Gin，欠失

1 Asp,欠失

9 Th_r， Gln，欠失

3 Gin，欠失

4 Asp,欠失

5 Gin，欠失

6 G , Val，欠失

7 Asp,欠失

8 G , Pr。，欠失

9 Val, Arg,欠失

10 Asp, Arg, leu, Lys, His,欠失

11 Pro, Lys, Ar g，欠失

12 Arg

かかる本発明の蛋白のアミノ酸配列の重鎖の N末から 12番目のアミノ酸から、重鎖の N末のアミノ酸迄の組み合わせの具体例としては例えば、以下に示したものが挙げられる。

i ) Asp-T r-Glu-Asp-GIn-Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Lys

-Arg

i i } Asp-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Arg-Lys

-Arg

iii) Asp-Thr-G -Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Val-Leu-Lys

-Arg

i v) Asp - Thr - Glu - Asp - Gin - Glu - Asp - Gin - Vaト Asp - Pro

-Arg-Lys-Arg-Arg

v〉 Asp-Thr-Glu-Asp-Gl n-Glu-As -Gl n-Va 1 -Asp-Pro

- Arg - Hi s - Arg - Arg

v i ) Asp-Gln-Glti-Asp-Gln-Vai-Asp-Pro-Arg-Lys-Arg

-Arg

v i i ) Asp-Gl n-Va I -Asp-Pro -Arg-Lys-Arg-Arg

vi i i) Asp - Thr - G - Asp - Thr - Glu - Asp - Gin - Glu - Asp - Gin

-Va l - Asp - Pro - Arg

i x) Asp-Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-Asp-Gln-Gli] -Asp-Gin

-Va l - Asp - Pro - Arg

x) Thr-Glu-Asp-Gln-Glu-As -Gin-Val-Asp-Pro-Arg x i } Glu-Asp-Gln-Gli3-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg xi i) Asp-Gl n-Glu-Asp-Gl n-Va I -Asp-Pro-Arg

i i i } Asp-Gl n-Va l-Asp-Pro-Arg

x i v ) Asp - Pro - Arg v) ?r o-Ar g

xv i ) Ar g

木発明の上記種々の重鎖 N末ァミノ酸配列を有する蛋は、それぞれ天然型ヒトプロティン Cと同様の性質または AP C活性を有している。

ここで天然型ヒトァロティン Cと同様の性質としては、例えば、本発明で得られた蛋白をァロティン C活性化醇素で処理することにより、抗凝固活性、線溶促進活性、ァミダ一ゼ活性等を有する蛋白を生成させること等が挙げられる

すなわち、本発明で得られた天然型ヒトァ口ティン C と同様の性質を有している蛋白は、天然型ヒトァロティン Cと同じくァロティン C活性化酵素で処理することにより天然型 AP Cに変換されるこのような性質を有する蛋白のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、上記具体例のうち viii) 〜xiii) が好ましく挙げられる。ここでプロテイン C活性化酵素としては、トロンビン、トロンビン一トロンボモジュリン複合体、蛇毒等が挙げられる。

また、 A P C活性としては、前述したとおり、凝固系の活性化第 5因子および活性化第 8因子を選択的に分解する抗凝固活性、並びに組織アラスミノーゲンァクチべ一ターの阻害剤である PAI-1 を切断する線溶促進活性等が挙げられる .：このような性質を有する蛋白のアミノ酸配列の具体例としては、例えば上記具体例のうち、好ましくは i)〜vii)、 xiv}〜xvi〉をあげることができる。ここで i }〜 vi i }のァミノ酸配列をもつものは細胞から分泌された時点で、 A P C活性化酵素で処理されることなく、 AP C活性を有し、かつアミノ酸配列は天然型 A P Cと同じになる。

また xiv}〜； i)のァミノ酸配列をもつものは細胞から分泌された後においても同様のアミノ酸配列を有し、かつ A P C活性化酵素で処理することなく A P C活性を有している。更に xiv)〜xvi〉のアミノ酸配列を有する蛋白はヒトァ口ティン Cインヒビター、アルファ 1アンチトリアシン等に阻害されにくく、天然 AP Cに比較して血中半滅期が長い

更に本発明で得られる蛋白は Gla を有していることが好ましい。

本発明において、本発明の蛋白をコ一ドする D N A配列とは、それを含有するアラスミドを宿主に導入し、培養せしめたときに、本発明の性質を有する蛋白が結果的に発 ¾される D N A配列であればよく、その中間に構造遺伝子以外の他の遺伝子（例えばィントロン）が介在していてもよい。

本発明の表 1の（1) 〜（δ) のいずれかで表わされるような軽鎖ァミノ末端部分を有する蛋白をコードする D N Α配列は、天然のヒトプロティン Cの c D N A配列から容易に組立てることができる：. 即ち Pro atl. Acad. Sci. USA, 82, 4674〜 1475にプロテイン Cをコードする遺伝子の D N A配列が記載され、その中にプレア口部分 (一 42アミノ酸〜一 1アミノ酸）をコードする D N A配列領域、軽鎖部分（ 1アミノ酸〜 155 アミノ酸〉をコードする D N A配列領域、開裂部位〈 156 ァミノ酸〜 157 アミノ酸）をコードする D N A配列領域、重鎖部分（ 15 8 アミノ酸〜 419 アミノ酸〉をコードする A配列領域および該重鎖部分におけるァクチべーションベアチド部分（ 158 アミノ酸〜 169 アミノ酸）をコードする領域が記載されているので、これをもとに軽鎖のアミノ末端側を単に削除するだけでも本発明の上記ァ口ティン Cに対応する蛋白をコ一ドする D N A配列を組立てることができる。 ·

また、活性化プロテイン Cに対応する蛋白をコードする D N A配列は、上記プロテイン Cに対応する蛋白をコ —ドする D N A配列から、上記ァクチべーションベアチド部分をコ一ドする D N A配列部分を削除すれば簡単に組立てることができる。

本発明における上記プロティン Cまたは活性化ァロテイン Cに対応する蛋白を発現せしめるには、開裂部位として天然の Lys-Arg を採用ォる必要はない：むしろこの部分を改変して最終的な蛋白の収率を高めることができる：かかる鬧裂部位は、軽鎖側に軽鎖 C末一（ ) „ 一 R₂— —の形で結合し、重鎖 N末に— （〉 _n - R2 - R3 一重鎖 N末の形で結合するものであり、一般的には

■ R .1 ) U 2 - R3 Q " Ri ) n — R₂— ト' ri， Ri, , ¾は前記定義の通りであり、 Qは任意のォリゴペアチド鎖を表わし、 Pは 0または 1であ

' る

で表わされる。これに対応する D N A配列は Lys, Argにそれぞれ対応する例えば AAA, CGAを用いて容易に決定することができる。

一方本発明における表 2に対応する蛋白をコードする D N A配列は、（天然型 A P Cの軽鎖 D N A ) 一 X - Y 一（天然型 A P Cの重鎖 D N A ) で表わすことができる : ここで Xは開裂部分の D N A配列を表わし、 LysLys,

LysArg, ArgLysまたは ArgArgをコードする D N A配列であり、 AAA と CGA との組合せ、またはそれ以外のいずれでもよい。また、 Yは活性化ペプチド部分の D N A配列を表わし、下記 U〜16) が例示される。

1) GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT AAG

CGG

2) GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA CGG AAG

CGG

) GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA CTG AAG CGG

4) GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG

CGG AAG CGC CGC

） GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG CAC CGC CGC

) GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG AAG CGC CGC

7) GAC CAA GTA GAT CCG CGG AAG CGC CGC

8) GAT ACG GAG GAC ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG

9) GAC ACA GAA GAC CAA GAG GAT CAG GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG

10} ACA GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG 11) GAA GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG

12) GAC CAA GAA GAC CAA GTA GAT CCG CGG

13) GAC CAA GTA GAT CCG CGG

14) GAT CCG CGG

15} CCG CGG

16) CGG

更に本発明における蛋白を発現させる場合、前記ァレプロ部分（一 42アミノ酸〜一 1アミノ酸）を改変するこ tもできる。かかる改変形としては、

『ヒトァロティン Cのプレープロ領域において、アミノ酸配列の一 15番めから一 12番めのアミノ酸が一 15番め Se r または Leu

一 14番め Ser または Aia

― 13番め Ser または Pro

— 12番め Git または Gin

から選ばれた組み合わせ（ただし一 15〜一 12までの組合せが Ser-Ser-Ser-G であることを除く。 ) であることを特徴とするアミノ酸配列』

が挙げられる。

かかる本発明のヒトプロティン Cのプレーア口領域におけるアミノ酸配列の一 15番めから— 12番めのアミノ酸の組み合わせの具体例としては、例えば

1) Lue-Al a-Pro-G

2) Leu-Al a-Pro-Gl n

等が挙げられる。

かかるァミノ酸配列をコードする D N A配列の具体例としては、例えば

)' ) -CTG-GCC-CCC-GAG-

2' ) -CTG-GCC-CCC-CAG- 等が挙げられる。

以上の説明から明らかな通り、本発明の蛋白を発現させる D N A配列の構造は、

(1) 必要に応じ、リボソームとの結合を容易ならしめる非コード領域（例えば

GGGGCTGTCGCGGCAGGACGGCGAACTTGCAGTATCTCCACGACCC GCCCCTGTGCCAGTGCCTCCAGA )

(2) 天然型または改変型プレーア口領域

(3ί 本発明の蛋白の軽鎖領域

(4) 開裂部分の領域

(5) 本発明の蛋白の重鎖領域

(6) 必要に応じ 3'側非コード領域にスプライスサイト

( 5'側の非コード領域中においてもよい）

(7；· 必要に応じポリ Α—付加シグナル

から構成される。

本発明の蛋白をコ一ドする部分を有する上記配列の L) N A断片は、宿主べクタ一系に応じて適当に選ばれた発現用べクタ一に組み込まれる。そのような発現ベクターの具体例としては、バクテリァ由来のプラスミド、バクテリオファージ由来の D N A、動物ウィルスの D N A等に適当な制御領域を組込んだベクタ一、例えばアデノウィルス主要後期ァロモータ一、 S V40初期ァロモ一ター S V40後期ァロモーター、マウスメタ口チォネイン 1 - ァロモーター、 MMTV (マウス乳頭腫ウィルス）のァ口モータ一、 R S V (ラウス肉腫ウィルス）のプロモ一ター等を組み込んだプラスミドベクターあるいは Bovine パピ口一マウィルス等のウィルス由来のべクタ一等が用いられる。

前記 D N A断片のかかるベクターへの組み込みはそれ自体既知の方法で行うことができ、例えば Miura 0. et al. , J. Clin. Invest. 83- 1598- 1604 (19δ9)等の文献に記載の方法によって行うことができる。

一方、宿主用の動物細胞としてはヒトまたはヒト以外の動物細胞のいずれであってもよく、例えば CH0， C127, BHK, Cosl, Cos7, LM, NIH3T3, 293, HeLa等があげられ、巾でも CH0， BHR, 293 が好ましい。

上記発現型ベクターのこれら細胞へのトランスフエクションも、また当該分野でよく知られたそれ自体公知の方法によって行うことができ、例えば Spandidos D. A. and Wi 1 k i e N. . , Expression of Exogenous DNA in Mamma 1 i an Cells, Ed. Hame s B. D. and Hi ggi ns S. J. Transcription and Translation, IRL Press, Oxford, PPl-48等の文献記載の方法によって行うことができる。

かくして得られる形質転換細胞を、それぞれの細胞に適合した条件下に常法で培養することにより、その培養液から目的とする本発明の蛋白を回収することができる。

本発明の蛋白の定量法は特開昭 61-283868 号公報によつて示された方法を用いることができるこの方法によれば、 Gla をもつヒトプロテイン Cおよび Zまたは活性化ヒトプロテイン C様活性を有する蛋白（以下、ヒトァロティン C誘導体という）のみを測定することもできる , 本発明のヒトァロティン C誘導体の精製には、バリゥム吸着法、イオン交換クロマトグラフィー法を含む天然型ヒトプロティン Cの精製法を応用することができるが、カルシウムイオンによる G l a ドメインのコンホメーション変化を認識する抗ヒトァロティン Cモノクロ一十ル抗休を使用したァフィ二ティカラムクロマトグラフィーを用いるのが特に好ましい（特開昭 64 -8509 1号公報参照〉 . この方法は、 G l a を有するヒトプロテイン C誘導体のみを精製できる点と、 E D T Aという温和な溶離剤が使える点で優れた方法である

本発明のヒトァ口ティン C誘導体の活性は、あらかじめ蛇毒（プロタック ®、ァメリカンダイァグノスチカ社製〉で活性化して合成基質（ P C a⑧、ァメリカンダイァグノスチカ社製）の切断活性で調べた。本発明のヒトプロティン C誘導体は触媒ドメィンについては天然型と同一であるので、合成基質切断活性をもって、本来の活性である抗凝固活性、線溶促進活性を表わすことができる発明の効果

本発明で得られる蛋白は、ヒトァ口ティン Cおよび Z または A P C様活性を有するものであり、殊にその一部は A P C活性化酵素で処理することなく A P C活性を有している。

従って本発明の蛋白を用いることにより、活性化処理に伴う酵素の除去、ウィルスの混入等の問題が解消されこれにより抗凝固剤または線溶促進剤として用いられる A P Cの供耠をより安定的に行うことが可能となる

また軽鎖 C末が一部削られた蛋白は、天然のものに比ベて安定性が高く、薬剤として保存する際により有利なものとなる。

実施例

本発明の実施例では、次の方法を用いた .

N Aの切断

1 i のアラスミド D N Aまたは M 13ファージのレアリカティブ . フォーム（ R F〉 D N Aまたは D N A断片の切断は、 ΙΟ の緩衝液中、 4 〜10単位の制限酵素を用い、メ一カーにより指定された温度で 2時間保つことにより行った。緩衝液は、制限酵素に付属のものを用いた。

D Ν Α断片のァガロースゲルからの回収

制限酵素で切断した D N A断片は、サブマリン型電気泳動槽を用いた 0· 8 %ァガ口一スゲル電気泳動で分離し卞目的の D NA断片を含むァガロースゲルを切り出し、 GBNECLEAN (Bio 101社）を用いて回収した。方法は添付の説明書に従った。

D NA断片の結合

D N Aライゲーシヨンキット（宝酒造）を用いて行つた。方法は、添付の説明書に従った。

大腸菌の形質転換

大腸菌 HM01 株のコンビテントセル（宝酒造〉に、 20 T以下の D N A溶液を加え、 1時間氷上に置いた。次に 42Cの水浴に 1分間つけたあと、再び氷上に 5分間置いた。これを 1 mlの L一ブロスに加え、 1時間振盪培養した後、その一部〈 50〜300 ϋ 〉を、アンヒ。シリンブレート（ L—ブロス、寒天、アンピシリン 5G g ml ) にまいてー晚 37°Cで培養し、コロニーを作らせた：アラスミド D N Aの小スケール調製

アルカリ溶菌法（『Molecular Cloning 』（ Τ·

Maai at i s. Col d Spring Harbor Laboratory, 1982 ¾ P368 参照〉による調製を行った。必要に応じて前述の

『GENECLEAN 』による精製を行った。

アラスミド D N Aの大スケール調製

アルカリ溶菌 i£ ( 『 Transcription and Translation 』 (B. D. Hames, IRL press, 1984) P8参照）および CsC 1平衡密度勾配遠心法によって行った。ここで、超遠心用口一ターは日立製 RP- 67VFバ一チカルロ一ターを用いた。また CsClの除去は透析によらず、 T E ( lOmM Tris-H Ci PH 8.0, lin EDTA} で 4倍に希釈後、エタノ一ル沈澱をすることで代えた。

N Aの塩基配列の決定

少ィテオキシ · チェーン · タ一ミ不一ション ideoxy chain te rmi nat i on)法を用いた。反応に用いた試薬は宝酒造の『7-deaza ' シークェンスキット』のものを使用した。操作手順はそれに添付された説明書に従ったラベルには³⁵ s — d C T P a S ( 400 Ci,/ ol,アマジャム社）を用いた。電気泳動は 6 %ァクリルアミドの 0.3mm 厚のゲルを使用し、泳動後乾燥してからォートラジォグラフィーにかけた。用いたテンペレート D N Aは、ヒトプロティン C cD N Aの改変操作後は一本鎖 D N Aを用いたが、それ以外では 2本鎖のアラスミドをアル力リ変性後、中和したものを用いた。その際の手順は『ベクタ — D N A』（榊佳之、講談社、 1986) P67 に記載の方法によったまたァライマーは、調べたい部分の近傍の配列 18塩基分を化学合成し、それを精製して用いた...

D N A断片の化学合成およびその精製

cD N A改変用プライマー及び塩基配列決定用プライマ一はアプライド ' バイォシステムズ社 380A型 D N A 合成装置で『 ON, AUTO 』の条件で合成した。その精製には同社製『オリゴヌクレオチド精製力一トリ、'/ジ』を添付の説明書に従って使用した。

予備実施例 1

ヒトァ口ティン Cをコードする cD N Aの取得

ヒト肝細胞より、グァニジンチオシァネ一ト法（ J. M. Chirgwin, 『 Bi ochemi stry』， 5294, 1979参照〉に従って mR N Aを抽出した。ヒト肝細胞 2 X 10⁸ 個に 5 mlの G T C溶液（ 6 Mグァニジニゥムィソチオシァネ一ト、 5 ιηΜクェン酸十トリウム、 0· 1M2 —メルカアトエタノール、 0. 5 %N—ラウロイルザルコシン酸十トリウム〉を加え、ホモゲナイズした 3.8 mlの 5.7M CsCl , 0. 1M E D T A水溶液の上に重層し、これを RPS-40T ローター (日立製）を用いて 35, OOOrpm で時間、 25。Cで超遠心した。超遠心後注意深く溶液を取り除いた後、エタノール約 1 mlで 3回リンスし、 1.4 mlの水に溶解後エタノール沈澱させた。この沈澱を 0. 5M NaC!, 10mM Tris- H C1 (ρΗ 7.5), ImM E D TA, 0.05¾' S D Sの組成の洗浄液 0.5 mlに溶解し、 0.5 mlの Oi igo T}セルロースカラムを通した。このカラムを上記洗浄液で洗った後、 10mM Tris- H C1 (pH 7. 5}, ImME D T A , 0.05½ S D Sの組成の溶出液で溶出し、約の P(HyA+ R N Aを得た : これをもとに、 Gublerと Hoiiman の方法（『Gene』， 25_: 263, 1983 参照）に徒いアマシャム社製 cD N A合成キットを用いて cD N Aを合成した。

5 JUL の po A+ R N Aに 50ユニットのヒト胎盤由来 RNase阻害剤（ HPRI) の存在下 5〃 g の Ol igo (dT) 12 〜】 8を加え 100 ュニ卜の逆転写酵素を 42°Cで 1. 5 時間働かせて約 30%の収率で一本鎖 eD N Aを合成した。この反応液に 4ュニットの大腸菌リボヌクレア一ゼ Hと 115 ュニットの大腸菌 D N Aポリメラーゼ I を加え 12。C で 1時間、 22でで 1時間反応させた後 70 Cで 10分間放置して酵素を失活させた。その後 10ュニットの T4D N Aポリメラ一ゼを加え 3 Cで 10分間反応させて、約 95%の収率で 2本鎖 cD N Aを得た -, この 2本鎖 cD N Aに 20ュ二ッ卜の EcoRI メチラーゼを 37°Cで 1時間作用させた後 EcoRI リンカ一〈宝酒造製）を結合させた -. これに 16ュニットの EcoRI を加え 37°Cで 2時間反応させた後、セフアロース CL-4B カラムを通し、純化した約 Ο. δ JUL % の c D N Aを得た。

次にこの cD N A O.4 j と A gtlOアーム 1.0 j g 〈ベクタークローニングシステムズ社製〉とを連結したものを用いて in vitroパッケージングを行い、ヒト肝細胞由来 cD N Aライブラリーを得た。このライブラリーを大腸菌 C 600 hf I" 株に感染させ、アラークを形成させた。ヒトプロテイン C遺伝子を含むクローンは、次に示す³² Pで標識した合成 D N A PC-1, PC-2 をプローブとしたァラ一クハイプリダイゼ一ション法により選別した。

PC-1 (5' ) ATCGACGGCATCGGCAGCTT

CAGCTGCGACTGCCGCAGCG (3' }

PC-2 (5' ) CGCTGCGGCAGTCGCAGCTG

AAGCTGCCGATGCCGTCGAT (3' )

(ここで（5' )および（3' )はそれぞれ D N A配列の 5'末端側および 3'末端側を示すものである。）

ヒトァロティン Cの cD N Aを含む A gt 10 ファージからの D N Aの調製は、 Thomasと Davis の方法

( 『Jouriial of Molecular Biology』， 91, 315, 1974 参照〉により行った。この D N Aを EcoRI で消化し、ァガロ一スゲル電気泳動にかけ、ヒトァ口ティン Cの cD A断片を回収した。この D N A断片を、予め EcoRI 処理、およびバクテリァのアル力リ性ホスファターゼで処理した PUC8とライゲーシヨンすることにより PUC8-PC1を造成した。このヒ卜ァ口ティン C eD N Aの塩基配列を調べたところ、完全長ヒトァ口ティン C cD N Aと比較してその上流部分が欠けていることがわかったため、予備実施例 2で述べる方法で下記の部分を補った。

( + strand)

AG CTT ATG TGG CAG CTC ACA AGC CTC CTG CTG TTC GTG GGC ACC TGG GGA ATT TCC GGC ACA CCA GCT CCT CTT GAC

(― strand)

TGA GTC AAG AGG AGC TGG TGT GCC GGA AAT TCC CCA GGT GGC CAC GAA CAG CAG GAG GCT TGT GAG CTG CCA CAT A

予備実施例 2

天然型ヒトァロティン C発現ベクターの造成

第 5図に示されるように、予備実施例 1で得られた P C8-PC1をそれぞれ 1ケ所づつ切断部位をもつ HindUと Sac IIで切断してァガロースゲル電気泳動にかけ、 Sac H— HindlEの小断片を回収した（これを A断片とする。）。

また Pl]C8-PUを Sac ϋと EcoRI で切断してァガロースゲル電気泳動にかけ、 Sac Eより上流側の ECGRI -Sac 1断片を回収したこの D N A断片をさらに、この断片中 1ケ所の切断部位をもつ Dde Iで切断した後ァガロースゲル電気泳動にかけ、 Dde I -Sac ϋ断片を回収した (これを Β断片とする )

一方、翻訳開始点の上流から、上記 Dde Iまでの DN A断片を上流側の末端は Hind ΠΙで切断された形で、下流側の末端は Dde Iで切断された形で化学合成法により合成した。（これを C断片とする。 ).

次にそれぞれ 1ケ所の HindEI , Sac II切断部位をもつァラスミド pN AKを HindMと Sac I [とで切断し、ァガロ —スゲル電気泳動にかけることにより HindU— Sac E大断片（アンピシリン耐性遺伝子および大腸菌中での複製開始点を含む〉を回収した。この DN A断片と上記 B断片， C断片との 3分子ライゲーシヨンを行い、 pNAK 一 PC Uを造成した。

次にこの pN A K— P C Uを Hindinと Sac Eで切断し、ァガロースゲル電気泳動にかけることにより、 HindEI― Sac E小断片を回収した。（これを' D断片とする）

一方、 PSV 2— gpt を Apa Iで部分消化し、ァガロースゲル電気泳動にかけ、 2ケ所の Apa Iサイトのうち 1ケ所だけが切断されたもの（ linear型）を回収し、さらに Hind Πで完全消化後再びァガロースゲル電気泳動にかけ、第 5図に示した Hindi— (Apal > -Apa I断片を回収した。この断片に、 DNAボリメラーゼ Iクレノウ断片とデォキシリボヌクレオチド三リン酸を作用させて、 Hindi!サイトおよび Apa Iサイトを平滑末端化した、 - この D N A断片にリン酸化された Hind リンカ一（宝酒造）をライゲーシヨンした後、 HindM処理を行い、ァガ口一スゲル電気泳動にかけ再び回収した。この D N A断片を分子内でライゲーシヨンしたものを大腸菌 HB101 に導入することにより、これを増やした。この大腸菌より抽出したアラスミド D N Aを再び H dnで切断し、バクテリァのアル力リ性ホスファターゼで処理したものと、上記 A断片および D断片と 3分子ライゲーシヨンし、天然型ヒトァロティン C発現べクタ一 pSV 2— PC1 を得た。

なお、 P D X— P C 594 の製造法は、実施例 1の末尾に P D XZ P Cベクターの製造法として引用により記載されている内容と同一である

実施例 1

ヒトァ口ティン C誘導体発現べクタ一 PDX-PCLCA14 , PDX-PCLCA12 ， PDX-PCLCA8の作製

ヒトプロテン C軽鎖カルボキシル末端を欠失させた蛋白の発現べクタ一 PDX-PCLCA14 , pDX-PCLCA12 ， pDX- PCLCASは第 2図に示す方法に従って作製した。

まず合成 D NA Aおよび合成 D N A Bとして下記の合成 D NAを用いた。

「 PDX-PCLCA14 作製の場合]

合成 D NA Aとして下記の合成 D NA PCL1A を用いた。

PCL1A 5' GTGTCACCCCGCAGTGAAGTT CCCTTGTAAACGAGACACAGAAGA

CCAAGAAGACCAAGTAGATCCGC 3

( L bases)

合成 D N A Bとして下記の合成 D N A PCL1B を用いた。

PCL1B 5' GGATCTACTTGGTCTTCTTGG

TCTTCTGTGTCTCGTTTACAA GGGAACTTCACTGCGGGGTGA CACTGCA 3'

(70 bases)

[ pDX-PCLCA12 作製の場合]

合成 D N A Aとして下記の合成 D N A PCL2A を用いた。

PCL2A V GTGTCACCCCGCAGTGAAGTT

CCCTTGTGGGAGGAAACGAGA CACAGAAGACCAAGAAGACCA AGTAGATCCGC 3'

(74 bases)

合成 D N A Bとして下記の合成 D N A PCL2B を用いた。

PCL2B V GGATCTACTTGGTCTTCT

TGGTCTTCTGTGTCTCGTTTC CTCCCACAAGGGAACTTCACT GCGGGGTGACACTGCA 3' { 16 ases)

「i>DX-PCLCA8作製の場合]

合成 D NA Aとして下記の D N A PCUA をいた, PCL3A GTQTCACCCCGCAGTGAAGTT

CCCTTGTGGGAGGCCCTGGAA

GCGGAAACGAGACACAGAAGA CCAAGAAGACCAAGTAGATCC GC 3'

(86 ases)

合成 D NA Bとして下記の D NA PCL3B を用いた,

PCL3B 5' GGATCTACTTGGTCTTCTTGG

TCTTCTGTGTCTCGTTTCCGC TTCCAGGGCCTCCCACAA GGGAACTTCACTGCGGGG TGACACTGCA 3'

(88 bases)

合成 D NA Aを 2 ug 含む溶液 20 ϋ と合成 D NA Bを含む溶液 20 とを混合し、 10X キナーゼ溶液 Tris-KCi pH7.6, 0.1M gC , 50mMジチォスレイト一レ（ Dithio-threitoi)、 l mMスペルミジン'、： i mM EDTA) ΙθΛ ί と、蒸留水 48 を加え Τ4ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガ一マンハイム製） 2 ju ( 20単位）を加えて 37。Cで 30分間ィンキュベートした . その後、反応液を 9CTCに加熱し、室温まで徐々に冷却して、 2本の合成 D N Aをァ二一ルさせた。この液に 3 M 酢酸力リゥム溶液を 10 i) 加え、さらにエタノ一ル 250 μ を加え一 7(TCで 2G分冷却後 15, 000回転 Z毎分で遠心し、 D N Aをエタノール沈殿させた.:. 約 800 I St のエタノールで沈殿をリンスした後、 50 の 10mM Tris-HCI pH7.6, ImM EDTA 溶液に溶解した。 .

一方、天然型のヒトプロテイン C発現ベクター pDX- PC 594 10 / を制限酵素 H dEIと Sae Πとで完全消化し、 0.8 %ァガロースゲル電気泳動をおこない、最も大きな ]) N Aフラグメント 1 をゲルから回収した。この D NA フラグメント 1の 3 g を 30 の lOffiM Tris-HCl H 8.0 EDTA溶液に溶解した。

別に PDX-PC594 10 i を制限酵素 Hindllと Pst I とで完全消化し、' 0.8 %ァガロースゲル電気泳動をおこない、 2番目に小さな D N Aフラグメント 2をゲルから回収した。この D NAフラグメント 2の l g を 30 ϋ の lOmM Tris-HCl pH8.0, ImM EDTA溶液に溶解した。

次に合成 D N A Aと合成 D NA Bとをァニールさせた溶液 1 〃と、フラグメント 1の溶液 1 と、フラグメント 2の溶液 1 ζ とを混合し、宝酒造製ライゲ —シヨンキットの Α液 18 および Β液 3 を加えでで 45分反応させた。反応液 5 を、宝酒造製 HB101 コンビテントセル液】 00 に加え、 42。Cで 1分閭加温した後 1 mlのい Broth を加え 30分間 37。Cでィンキュベートした後 100 JJ. g mlのアンピシリンを含んだ 1· 5 %ァガープレートにまいて 3 Cで 18時間培養してトランスフオームされた大腸菌クローンを得た。このクローンからアラスミド D N Αを小スケール調製し、得られたフ。ラスミドの制限酵素マツァを作製して、各々 PDX-PCLCA14 ， PDX-PCLCA12 ， pDX-PCLCASに相当するヒトァ口ティン C 誘導体発現ベクターを得た。

なお得られた発現ベクターは大スケール調製し、発現に用いた。

なお、 pDX/PCベクタ一については、 Poster, D. C. et ai. , Biochemistry , 7003-7011 ( 1987}に記載されており、さらに、 Busby, S. et aに， ature. SU, 271 - 273 (1985 ) . および Barkaer, K. L. et aに， uc. Acids Res. 13, 841, 857 ( 1985 ) に pDX/PCを構成する D N A機能部分に鬨して述べられている。

ここで Amp¹" はアンピシリン耐性遺伝子である。

全体の構造については第 3図を参照。

実施例 2

ヒトプロティン C誘導体の発現

BHK-21細胞（ATCC CCい 10)をファルコン 3025シャーレを用い、 30mlの 10%F C S— eR D F中で培養した。ほぼコンフルエンドになったシャ一レ 5枚分の細胞をトリァシン処理ではがし、 P B S (-) 30 mlの中に懸濁したものを lOOOrpm 室温で 5分間遠心し、上清を除いた再度 30mlの P B S (-) に懸濁し、 lOOOrpm 室温で 5分間遠心し、上清を除いたものを 0· 3 mlの P B S (-) に懸濁した一方、表 4記載の各々のヒトァロティン C誘導体発現べクタ一 32〃g はあらかじめ 1. 5 mlエツペンドルフチューゾの中でエタノール沈澱することにより滅菌しておき、 HOOOrpm 10 分間遠心後、無菌的に上清を除き、 P B S (-) 0. 2 mlに溶解した。これを上記の B H K細胞の懸濁液と合わせて（ほぼ 0. 8 mlとなる）バイオラ、'/ ド社『GE NE PULSER 』用キュベット（ 0.8 ml ) に入れ、軽く振盪して混和した。バイオラッド社『GENE PULSER 』を用い、 1200V, 25 JUL ? 1 回の条件でエレクト口ポレーシヨンを行った。すみやかに細胞懸濁液をファルコン 2059チューゾに移し、 4. 2 mlの 1 F C S— eR D F - 2 JUL ξ / ml ビタミン K 1を滴下しながらゆるやかに振盪し、希釈した。これを 30mlの 10% F C S - eR D F - 2 g 7 mlビタミン K 1を入れたファルコン 3025シャーレ 5枚に 1 ml づっ加え、希釈した。これを C Ozインキュベータ一で 24 時間培養後、 30mlの P B S (-) で 2回よく洗い、 I T E S - eR D F— 2 g z lビタミン K 1の無血清培地をシャーレ当り 30ml加え、さらに 48時間培養した。（ I T ]： S ： 9 j g ./mlィンスリン、 10 g / ml トランスフエリン、 10 M エタノールァミン、 2 X 10— ^δΜセレ十ィト、 eR D F ; 極東製薬製〉

培養上清を回収し、アミコン社 YM10メンブレンを用いた限外 F過法により、 150 mlの培養上清を 2 ml程度まで濃縮した。さらにアミコン社セントリコン 10を用いて約 180 ϋ になるまで濃縮を行った · これに l mlの T B S ( 50mM Tris-H CI _PH 7.4, 0.15M NaCl)を加え、再び約 180 j il まで濃縮した。

培養上清および濃縮液 6 At を 1 %B S A— T B Sで 120 に希釈し、 E L I S A法でその中のヒトフ"ロティン C誘導体の濃度および Gl a をもつヒトァロティン C 誘導体の濃度を測定した。プレート側のモノクロ一十ル抗体は JTC4 (重鎮認識）を用い、西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ（HRP0) 標識抗体として JTC1 ( Gla ドメイン認識 Gla をもつヒトァ口ティン C誘導体の測定用〉または JTC5 (活性化ペプチド認識、ヒトァ口ティン C誘導体全体の測定用〉を用いた。これらのモノクロ一十ル抗体は『Journai of Biological Chemistry 』 Wakabayashi,

261, 11097 ( 1986 ) に記载のものである。培養上清中のヒトァ口ティン C誘導体の量を表 4に、濃縮液中のヒトプロティン誘導体の量を表 5に記した。表 4

培養上清中のヒトァロティン C誘導体量

1 発現べク夕一；全体の量 Gla を有するもの

π？ , ml ng. ' ml

\ PDX-PC594 150 110

； (天然型〉

pDX-PCLCA8 190 180

. DX-PCLCA12 20 20

！ pDX-PCLCA14 検出限界以下；検出限界以下

5

実施例 3

ヒトプロティン C誘導体の合成基質切断活性

実施例 2で得られた Gla をもつヒトプロティ C誘導体のうち pDX-PCLCA8ベクタ一による蛋白 pDX - PCLCA12 ベクターによる蛋白（PCA12) 、および pDX-PCLC Δ14 ベクターによる蛋白（PCA14) を 0. 1%B S A— T B S ( 50m Tris-H Ci pH7.4, 0.15M Nad ) で希釈して 0.125, 0.25, 0. 5, 1, 2 g 160 ,0 の溶液とし、これに 1 Uz' mlのァロタック ® (ァメリカンダイァグノスチカ社）を 40 J3 加え、 37 Cで 1, 5 時間ィンキュベ一ションし。

活性化後 0. 1 ¾ B S A - T B S ( ΡΗ7. で希釈し、各々 12.5, 25, 50, 100, 200 ng,-' 50 ϋ とした。希釈後 50 バ JJ のサンアルと 20 の PCa ® ( P A C活性測定用合成基質；アメリカンダイァグノスティカ社製） — C , 30 /ζϋ の 0.1 %B S A - T B S ( ΡΗ7.4).を加え、その直後と、 37°Cで 10分間インキュベートした後に、 405nm における吸光度（ A ₄₀₅ ) を測定した。その結果を表 6に示寸表 6

ヒトプ 0テイン C誘導体の合成基質切断活性（ A₄₀

実施例 4

ヒ卜プロティン C誘導体の抗凝固活性

実施例 2で得られた Gla をもつヒトプロテイン C誘導体のうち PCA8, PCA12 ，および PCM4 を 0.1 % B S A - TB S { 50mM Tris-HCl pH7.4, 0.15M NaCl)で希釈して 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 _ff Z O ϋ の溶液とし、これに 1 Umlのァロタック〈アメリカンダイァグノスチカ社）を 40 加え、 37。Cで 1.5 時間保ち、活性化ヒトァ口ティン C誘導体とした。これを希釈して、 12.5， 25, 50, 100， 200ng 50/xi) 0.1 %B SA-TB S ( pH7.4) とした。 37でに 2分間保った 100 αϋ のシスメックス - コントロール血漿 Iに、このサンアル.と、のシスメックス ΑΡΤΤ試薬を加えて撹拌し、 37Cに 2分間保ったのち、 100 ϋ の 25mM CaCl₂ を加えて撹拌し、シスメックス CA-100型血液凝固分析器で APTTを測定した。天然型の活性化ヒトプロテイン Cと比較した結果を表 7に示す。

tトァ Πテイン C誘導体の抗凝固活性（ sec)

12.5 ； 25 50 100 200

！

天然型 3 ί 53 69 ！ 95

PCA8 31 31 32 35 1 40

PCA12 31 33 45 61 165

PCA14 122 ―

：バッファ-のみ 30 - ,

実施例 5

ヒトァロティン C誘導体発現べクタ一の造成

第 6図（に示すように、予備実施例 2で造成した PS V 2-PC1を Hind で切断し、ァガ口一スゲル電気泳動にかけ、ヒトァ口ティン C cD NA部分を回収した。この D N A断片をあらかじめ Hind およびバクテリアのアル力リ性ホスファターゼで処理した Ml 3 mp 11のレプリ力ティブ . フォーム（ RF〉 D NAとライゲーシヨンしこれを大腸菌 TG-1株に導入し、プラークを生じさせた。〈なお大腸菌 TG-1株は、アマ一シャム社「01 igoni leo- tide directed in vitro mutagenesis system 」に舍まれているものである。）

このプラークから組み換え M13 ファージをようじでとり 20ju l の大腸菌 TG-1株の一晩培養液とともに 2mlの ·2 X ΤΥ培地に加え、 5時間 37Cで振盪培養を行った。この培養液中の大腸菌を集め、アル力リ溶菌法でレアリカテイブ . フォーム（ RF〉 D NAを調製し、制限酵素切断による解析で、ヒトプロテイン C c:D NAがM13 の遣伝子とは逆方向に挿入されたクローンを同定した。このクローンを培養した時の培養上清中の組み換え M13 ファーシから、アマシャム社『 Oligonucleotide directed in vitro mutagenesis system』 tこ添付の手匿書^:従ってテンペレード D N Aを調製した。このテンペレート D N A と第 4図に示したプライマーを用い、アマシャム社『 01 i gonuc 1 eot i de directed i n vitro mutagenesis system』に添付の説明書に従って使用することによりヒトプロテイン C誘導体 cD NAを作成た。これは基本的には、 F. Eckstein らの方法に依るものである

( ucleic Acids Res. 8749, 1985 参照〉。得られたヒトァロティン C誘導体 cD NAを含む M13 ファージレアリカティブ · フォーム D N Aを大腸菌 TG-1株に導入し、ァラ一クを作らせた。このアラーク中の組み換え M13 ファ一ジを前述の方法で 2mlのスケールで培養し、その培養上清から組み換え M13 ファ一ジをボリエチレングリコール沈澱により調製し、それをフ Xノール処理することにより、一本鎖 D NAを得た。具体的にはアマシャム社 M13 cloning and sequencing kit；』 tこ添付のノヽンドフ" ックに徒った。この一本鎖 D N Aをテンペレートとし、化学合成した改変部近傍の 18塩基（十鎖）のァライマ一を使って塩基配列決定の操作を行い、目的の改変がなされたクロ一ンを選別した。保存しておいたそのクローンに対応する菌体からアル力リ溶菌法により組み換え Ml 3 ファージのレプリカティブ . フォーム（ R F ) D N Aを調製した。これを Bio 101 社『GENECLEAN 』で精製し、 BstEIと Sac E ( 8), 9), 10), 11), 12), 13), 14), )にまたは Sac I ( 1), 2} , 3), 4), 5), 16})で消化したものをァガロースゲル電気泳動にかけ、改変部分を含む D N A断片を回収した。

次に pSV 2— PC1 をこれを同じ制限酵素で切断し

( Sac Iで消化したものについてはさらにパクテリァのアルカリ性ホスファターゼで処理した）、ァガロースゲル電気泳動にかけ、大きい方の断片を回収し、上記の改変部分を含む D N A断片とライゲーシヨンし、大腸菌 HB 】01 株に導入した。得られた形質転換体からプラスミドをアル力リ溶菌法で調製し、 Hindinおよび組み換えに用いた制限酵素で切断後ァガロースゲル電気泳動で解析し、目的の組み換えがなされたものを選別した。更に 1), 2) , 3)， 4), 5), 16} については Hindinおよび BstEE処理で正しい向きに改変部を含む断片が挿入されたクローンを選別した。また全てのアラスミドについて改変部近辺の塩基配列を前述のァライマーを用いて調べ、正しい組み ^えがなされていることを確認した。このクローンを

400 ml L—ブロス中で培養したものからアル力リ溶菌法一 CaCl平衡密度勾配遠心法でアラスミドを調製し、ヒトプロティン C誘導体発現べクタ一として実施例 6の発現に供した。また第 6図（b) に示したように、 BstEEサイトと Sac Eサイト（いずれも 1ケ所切断）を利用して、

4)と 12), 13)から 6), 7)を作製した。

なお、ここで用いた 1)〜5)， 8)〜16) の番号はプライマーの番号を示すと同時に、そのプライマーを用いて作成したヒトァロティン C誘導体発現ベクターを表わす。さらにそれらの番号は、実施例 6においてはその発現べクタ一を用いて得たヒトァロティン C誘導体タンパクを表わす。これは 6)， 7)の発現ベクターについても同様である。

実施例 6

ヒトァロティン C誘導体の発現

BHK-21細胞（ATCC CCL-10)をファルコン 3025シャーレを用い、 30mlの 10%F C S— eRD F中で培養した。ほぼコンフルェントになったシャーレ 5枚分の細胞をトリプシン処理ではがし、 P B S (-)3C) mlの中に懸濁したものを lOOOrpm 室温で 5分間遠心し、上清を除いた。再度 30mlの P B S (-) に懸濁し、 lOOOrpm 室温で 5分間遠心し、上清を除いたものを 0.3 mlの P B S (-) に懸濁した。一方、後記表 8の各々のヒトァロティン C誘導体発現べクタ一 32〃g はあらかじめ 1· 5 mlエツペンドルフチューブの中でエタノール沈澱することにより滅菌しておき、 l ^OOOrpin 10 分間遠心後、無菌的に上清を除き、 P B S (-） 0.2 に溶解した。これを上記の B H K細胞の懸濁液と合わせて〈ほほ' 0.8 mlとなる〉バイオラッド社『GE NE PULSER 』用キュベット（ 0.8 ml ) に入れ、輊く振盪して混和した。バイオラッド社『GENE PULSER 』を用い、 1200V, 25 P 1回の条件でエレクト口ポレーシヨンを行った。すみやかに細胞懸濁液をファルコン 2059チューブに移し、 4.2 mlの 10% F C S— eR D F - 2 u g ml ビタミン K 1を滴下しながらゆるやかに振盪し、希釈した。これを 30mlの 10% F C S— eR D F - 2 M g / mlビタミン K 1を入れたフアルコン 3025シャーレ 5枚に 1 ml づっ加え、希釈した。これを C02インキュベーターで 24 時間培養後、 30mlの P B S (-) で 2回よく洗い、 I T E S - eR D F— 2 g Zmlビタミン K 1の無血清培地をシャーレ当り 30ml加え、さらに 48時間培養した。（ I T E S ： 9 g /mlインスリン、 10 g /mlトランスフエリン、 IOJ M エタノールァミン 2 X10— ⁸Mセレナイト、 eR D F ；極東製薬製〉

培養上清を回収し、アミコン社 YM10メンブレンを用いた限外沪過法により、 150 mlの培養上清を 2 ml程度まで濃縮した。さらにアミコン社セントリコン 10を用いて約 150 JLL ^ になるまで濃縮を行った。これに 1 mlの T B S ( 50mM Tris-H Cl H 7.4, 0. 15M NaCi }を加え、再び約 ] 50 まで濃縮した。このうち 6 ju を 1 % B S A— T B Sで 120 j ^ に希釈し、 E L I S A法でその中のヒトァロティン C誘導体の漶度および Gl a をもつヒトプロテイン C誘導体の濃度を測定した。プレート側のモノクローナル抗体は JTC4

〈重鎖認識〉を用い、西洋ヮサビペル才キシダ一ゼ

( HRP0) 標識抗体として JTC1 ( G ドメイン認識、 Gl a をもつヒトプロテイン C誘導体の測定用）または JTC5

(活性化ペプチド認識、ヒトァ口ティン C誘導体全体の測定用）を用いた。これらのモノクローナル抗体は、

『Journal o f Biological Chemistry 』 Wakabayaslii, K. , Ul^ 11097 ( 1986) に記載のものである。なお、 1) , 2) , 3), 4)， 5) , 18) , 19)， 20) は JTC5によって認識されなかった。これらの結果から濃縮したサンプルには 3 〜18 u g ノ mlの Gla をもつヒトプロティン C誘導体が含まれることがわかった。また濃縮前の培養上清の一部について同様に測定したところ、表 8の値のヒトァロティン C誘導体が認められた。

8

実施例 7

ヒトプロティン C誘導体の合成基暂切断活性

実施例 6で得られた Gla をもつヒトプロテイン C誘導体のうち lOOng 相当分のサンアルを 0.1%B S A— TB S ( 50mM Tris-HCl pH7.4, 0.15 NaCl) で希釈して 40 J3 とし、これに 1 じ mlのフ。 _σ夕、、 ,ク ® (アメリカンダイァグノスチカ社〉を 10 ϋ 加え、 37。Cで 1時間インキュベーシヨンした。あるいは lOOng 相当分の Gla をもつヒトァロティン C誘導体を 0.1%B S A— T B Sで希釈し 50 ϋ とした。これらに 30 ϋ 0, 1%B S A— T B S， 2θ ζ ϋ の 4 mgZml PC_a ( A P C活性測定用合成基質、ァメリカンダイァグノスチカ社）を加え、 37。Cでインキュべ一シヨンした。その間 5分毎に 405 nmの吸光度を東洋測器 ETY - 型 E L I S Aアナライザーで測定した _c 5 分の時点と 25分の時点での吸光度の差を表 9に示す。この結果 8)， 9), 10) , 11), 12), 13) は天然型ヒトァロテイン Cと同様な挙動を示すことがわかった。また 14)， 1

5) , 16 ) は、活性化の操作をしなくてもある程度の A P C活性をもつことが明らかになつたく一方 1 2> , 3) , 4)， 5), 6) , 7>も活性化の操作を施さなくても A P C活性をもつことが示された。なお、 1)， 2) , 3) , 4) , 5),

6) , 7)については 200ng 相当の Gla —ヒトプロテイン C 誘導体を用いている。 9 (a)

}■ r o t a c— P r o t a c—

天然型（参考例） 0.119 0.591

8) 0.090

9) 0.073 0.605

10) 0.072 0.497

11) 0.061

12 0.090

13) 0.115 0.350

14) 0.151 0.205

15) 0.216 0.224

O O

16) 0.211 O O 、

9 (b)

Pr otac— ProtacT

天然型（参考例〉 0.218 1.273

1) 0.349

2) 0.319 0.607

3) 0.324 0.587

5)

6) 0.799 0.879 実施例 8

新規なリーダーシークェンスを用いたプロテイン C発現べクターの造成

第 7図に示すように、予備実施例 2で造成した PS V 2 -PCI を Hind で切断し、ァガ口一スゲル電気泳動にかけ、ヒトプロテイン C cD N A部分を回収したこの D N A断片をあらかじめ H in dinおよびバクテリァのアルカリ性ホスファターゼで処理した Ml 3 mpllのレプリカテイブ ' フォーム（ R F〉 D N Aとライゲーシヨンし、これを大腸菌 TG-1株に導入し、アラークを生じさせたこのプラークから組み換え M13 ファージをようじでとり、 20 の大腸菌 TG-1株のー晚培養液とともに 2mlの 2 X TY培地に加え、 5時間 37Cで振盪培養を行った。この培養液中の大腸菌を集め、アル力リ溶.菌法でレプリカテイブ . フォーム（ R F ) D NAを調製し、制限酵素切断による解析で、ヒトプロテイン C (：D N AがM13 の遣伝子とは逆方向に挿入されたクローンを同定した。このクローンを培養した時の培養上清中の組み換え M13 ファ一シから、アマシャム社 " Ul igonucleotide directed in vitro mutagenesis s y s t e m』こ添付ク:)手 j®書 tこ従ってテンぺレート D N Aを調製した。このテンペレート D N A と以下に示す合成プライマーを用い、アマシャム社 u Uligoniicleotide directed in vitro mtitagene s i s system』を使用することによってヒトプロテイン C cD N Aのリーダ一シークェンス部分の改変を行った .，合成プライマ一 i ) {5' ) CTT GAC TCA GTG TTC CTG GCC CCC GAG CGT

GCC CAC CAG (3' ;

ii ) (5' } CTT GAC TCA GTG TTC CTG GCC CCC CAG CGT

GCC CAC CAG (3' )

この方法は基本的には、 F, Eckstein らの方法によるものである。得られた新規なリーダ一シ一クエンスをもつヒトァ口ティン C cD N Aを含んだ 1½ 13ファージ？ ]) N Aを大腸菌 TG-1株に導入し、プラークをつくらせたこのアラーク中の組換え M 13ファージを前述の方法で 2 mlのスケールで培養し、その培養上清から組換え M 13ファージをポリエチレングリコール沈澱により調製し、それをフエノール処理することにより、一本鎖 D N Aを得た。具体的にはアマシャム社『M13 cloniag and sequencing kit』に添付のノヽンドブックに従った。この一本鎖 D N Aをテンペレートとし、化学合成した改変部位近傍の 18塩基（十鎖〉のプライマ一を使って、塩基配列決定の操作を行ない、目的の改変がなされたクローンを選別した；保存しておいたそのクローンに対応する菌体から、アル力リ溶菌法により組換え M 13ファージ R F D N Aを調製した：これを Bio 101 社『& ene clean®』で精製し、 Bal ェと BstEIIとで消化したものをァガロースゲル電気泳動にかけ、改変部分を含む D N A断片を回収した。次に PS V 2 -PCI を Bai ェと BstEEとで切断し、ァガロースゲル電気泳動にかけ大きい方の断片を回収し、上記の改変部分を含む D N A断片とライグーションし、大腸菌 HB101 株に導入した，得られた形質転換体からアラスミドをアル力リ溶菌法で調製し、 HindEiあるいは Ba.l I と BstEHで消化後、ァガロースゲル電気泳動で解析し、目的の組換えがなされたものを選別した。それらについて、さらに改変部近辺の塩基配列を前述のァライマ一を用いて調べ、正しい組換えがなされていることを確認したこのクロ一ンを 400 mlの L-Broth 中で培養したものから、アル力リ溶菌法一 CsCl平衡密度勾配遠心法でアラスミドを調製し、実施例 9の発現に用いた。実施例 9

新規なリーダーシークェンスを用いたヒトァロティン C の発現

BHK-21細胞（ATCC CCL-10)をファルコン 3025シャーレを用い、 30mlの 10%F C S— eRD F中で培養したほぼコンフルェントになったシャーレ 5枚分の細胞をトリプシン処理ではがし、 P B S (- )30 mlの中に懸濁したものを lOOOrpm 室温で 5分間遠心し、上清を除いた。再度 30mlの P B S卜）に懸濁し、 lOOOrpm 室温で 5分間遠心し、上清を除いたものを 0.3 mlの P B S (-) に懸濁した。一方、実施例 8で作成した各々のヒトァロティン C誘導体発現ベクター 32 g はあらかじめ 1.5 mlエツペンドルフチューブの中でエタノール沈澱することにより滅菌しておき、 OOOrpm 10 分間遠心後、無菌的に上清を除き、 P B S ί-) 0.2 mlに溶解した：これを上記の B H K細胞の懸濁液と合わせて（ほぼ 8 mlとなる）バイオラッド社『GENE PULSER 』用キュベ、'/ ト（ 0.8 ml) に入れ、軽く振盪して混和した。バイオラ、、/ド社『GENE PULSER 』を用い、 1200V, 25 1回の条件でエレクト口ポレーシヨンを行った。すみやかに細胞懸濁液をファルコン 2059チューブに移し、 4.2 mlの 10% F C S— eR D F - 2 jit g mlビタミン K 1 を滴下しながらゆるやかに振 ¾ し、希釈した。これを 30mlの 10% F C S— eR D F - 2 g / mlビタミン K 1を入たファ /レコン 3025シャーレ 5枚に l mlづっ加え、希釈した。これを C 02インキュべ一ターで 24時間培養後、 30mlの P B S で 2回よく洗い、 I TE S— eRD F - 2 g mlビタミン K 1の無血清培地をシャーレ当り 30ml加え、さらに 48時間培養した。 ( I T E S ： 9 Λί g / mlィンスリン'、 ΙΟ Χ g トランスフェリン、 10 M エタノールァミン 2 X 1(T⁸Mセレナイト、 eRD F ；極東製薬製）

培養上清を回収し、アミコン社 YM10メンブレンを用いた限外沪過法により、 150 mlの培養上清を 2 ml程度まで濃縮した。さらにアミコン社セントリコン 10を用いて約 150 μ. ^ になるまで濃縮を行った。これに 1 mlの T B S ( 50mM Tris-HCl H 7.4， 0.15M NaCl}を加え、再び約 150 χ ί まで濃縮した

この一部を 1 % B S Α— Τ B Sで希釈し、 E L I S A 法でその中のヒトァロティン C漶度および G をもつヒトプロティン Cの濃度を測定した。ァレ一ト側のモノク口一ナル抗体は C4 (童鎖認識〉を用い、西洋ヮサビベルォキシダ一ゼ（ HRP0) 標識抗体として JTC1 ( Gla ドメィン認識、 Gla をもつヒトァロティン Cの測定用〉および JTC5 (活性化ペアチド認識、ヒトァロティン C全体の測定用〉を用いた。これらのモノクロ一十ル抗体は、

|^; J Λ la r n a 1 of Biological Chemistry 』 Wakabayashi， K. , 2 L. 11097 ( 1986) に記載のものである。これらの結果から濃縮したサンプルには 7 〜ll/xg Z'mlの Gla をもつヒトァロティン Cが含まれていることがわかった。また濃縮前の培養上清の一部について.同様に測定したところ、次表の値のヒトプロテイン C誘導体が認められた < なお表 1 ◦，表 1 1における i)， i i) の番号は、実施例 8において用いた合成ァライマーの番号に対応するヒトァロティン C誘導体発現ベクターを用いて得たタンパクを示す。

表 1 0

ヒトァロティン Cの発現量

！ 1トダ-シ-クェンスヒトァ πティン C全体 Gla を有するもの：

I (ng/ml ) (ng/ml) ；

1 天然型 14.9 8.7 ！

1

1 i ) ¹ 22.0 17.0

！ ϋ ) ¹ 27.0 16.2 ！実施例 1 〇

ヒトァロティン C誘導体の合成基質切断活性

実施例 9で得られたヒトプロティン Cのうち 1 OOrig を 0.1%B S A- T B S ( 50inM Tris-HC! pH7.4, ϋ. 15 NaCl) で希釈して 40 ϋ とし、これに：！じ -' mlのァロタック ® (ァメリカンダイァグノスチカ社）を ΙΟ Χ 加え、 3 Cで 1時間インキュベーションした、これに 30 iJ の 0.1%B S A B S， 20 J1 の 4 - ml PCa

( A P C活性測定用合成基質、アメリカンダイァグノスチカ社）を加え、 37°Cで 1時間インキュベーションした後、 405 nmの吸光度を測定した。その結果を次に示す

表 1 1

ヒトァロティン Cの合成基質切断活性

リ-ダ-シ-クェンス合成基質切断活性

天然型 A ₄₀₅ = 0.93

i ) 1.18

； π ) 1.45

Claims

言青求の範囲

1. 基本的に天然型のヒトプロティン Cまたは活性型ヒトブ:口ティン Cの構造を有する蛋白であり、該蛋白の軽鎖におけるアミノ末端から 141 番目〜カルボキシル末端のアミノ酸配列が下記表 1で示されるアミノ酸配列であることを特徴とするヒトプロティン Cまたは活性化ヒトァロティン C様活性を有する蛋白。

！ ¾^ヒ卜プロティン cの

アミノ隱 'Jの麵の

ミノから号 141 142143144145 146 147148 ί

1 (1) Cys-Gly-Arg-Pro-Trp-Lys-Arg-Met

！

アミノ國例

(2) Cys-Gly-Arg-Pro-Trp-Lys-Arg

(3) Cys-Gly-Arg-Pro-Trp-Lys ！

(4) Cys-Gly-Arg-Pro-Trp ■

(5) Cys-Gly-Arg-Pro

！

(6) Cys-Giy-Arg ；

(7) Cys-Giy

(8) Cys

2. 請求項 1記載の蛋白をコードする D N A配列。

3. 当該蛋白の軽鎖をコードする D N A配列の 3'側末端と、重鎖をコードする D N A配列の 5'側末端とが、 Arg および..'' 'または Lys から主としてなる 2〜個のアミノ酸からなる配列を端部に有する 2 〜20のアミノ酸からなるアミノ酸配列をコードする D N A配列断片で連結されている請求項 2記載の L) N A配列。

4. 基本的に天然型のヒトァロティン Cの構造を有ォる蛋白であり、該蛋白のアミノ酸配列の重鎖のアミノ末端から 12番目アミノ酸から重鎖のアミノ末端迄のアミノ酸が下記表 2で示されるァミノ酸から選ばれた組み合わせ（ただし、一 3〜12までの組み合わせが欠失、欠失、欠失、 Asp, Thr, Glu, Asp, Gin, Glu, Asp, Gla, Val, Asp, Pro, Arg であることを除く。）あることを特徴とするヒトプロティン Cおよび./または活性化ヒトブロティン C様活性を有する蛋白。

2

請求項 2または 3の D N A配列をバクテリァアラスミド，バクテリオファージトランスファーベクタ一内に有するヒトァロティン Cまたは活性化ヒトプロティン Cの発現べクタ一。

6. 哺乳類宿主細胞へ導入し得る発現べクタ一であってプロモーター、これに続きその下流にある請求項 2，または 3の D N A配列、並びに必要に応じこれに続きその下流にあるポリアデ二レーションシグナルを含有し、上記 D N A配列の転写が前記プロモータ一により指令されるヒトァロティン Cまたは活性型ヒトァロテイン Cの発現べクタ一。

7. 請求項 5または 6の発現べクタ一によりトランスフェクトされている細胞。

8. 請求項 5または 6の発現ベクターによりトランスフェクトされている哺乳類細胞。

9. 上記細胞が C O S細胞、 B HK細胞、ヒト肝癌細胞 HepG2 細胞、 Chang Liver 細胞、マウス肝細胞、 C H 〇細胞、 HeLa細胞および 293 細胞からなる群から選ばれたものである請求項 7記載の細胞。

新たな ¾紙