JPH04252185A - アミド化繊維素溶解酵素及びその前駆体並びにその製造方法 - Google Patents
アミド化繊維素溶解酵素及びその前駆体並びにその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒト繊維素溶解酵素プ
ロ−ウロキナーゼのC末端アミド化誘導体、その前駆体
、及び該前駆体を製造するための組換えDNA技術を含
むそれらの製造方法に係る。
ロ−ウロキナーゼのC末端アミド化誘導体、その前駆体
、及び該前駆体を製造するための組換えDNA技術を含
むそれらの製造方法に係る。
【0002】ヒトプロ−ウロキナーゼのC末端アミド化
誘導体として、天然型蛋白質またはその改変体例えば欠
失変異体、挿入変異体、及び置換変異体が本発明に包含
される。
誘導体として、天然型蛋白質またはその改変体例えば欠
失変異体、挿入変異体、及び置換変異体が本発明に包含
される。
【0003】このようなアミド化誘導体は、塩基性アミ
ノ酸残基からなる短鎖が必要に応じて直後に結合しても
よい付加的グリシン残基がC末端に存在している適切な
前駆体を酵素処理することにより製造することができる
。
ノ酸残基からなる短鎖が必要に応じて直後に結合しても
よい付加的グリシン残基がC末端に存在している適切な
前駆体を酵素処理することにより製造することができる
。
【0004】本発明はまた、該前駆体をコードする構造
遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、及び該ベクター
で形質転換された適切な宿主も包含する。
遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、及び該ベクター
で形質転換された適切な宿主も包含する。
【0005】
【発明の背景】生理学的繊維素溶解を制御する分子相互
作用に関する知識が増加するにつれて、凝血溶解機構の
理解が深まり、また新規血栓溶解剤の開発が進展した。
作用に関する知識が増加するにつれて、凝血溶解機構の
理解が深まり、また新規血栓溶解剤の開発が進展した。
【0006】ヒト繊維素溶解系に於いて、酵素前駆体、
即ちプラスミノーゲンは、幾つかの種類のプラスミノー
ゲン活性化因子によって活性化され得、活性酵素、即ち
プラスミンとなる[Collen D.ら.,(198
6)CRC Critical Reviews in
oncology/hematology,4(3)
249;Verstraete,M.ら.,(1986
)Blood,67(6)1529]。プラスミンは、
凝血のフィブリン成分を分解する主要なプロテアーゼで
ある[Rakoczi I.ら.,(1978)Bio
chem.Biophys.Acta.540,295
;Robbins,K.C.ら.,(1967)J.B
iol.Chem.242,2333;Wiman B
.(1977)Eur.J.Biochem.76,1
29]。
即ちプラスミノーゲンは、幾つかの種類のプラスミノー
ゲン活性化因子によって活性化され得、活性酵素、即ち
プラスミンとなる[Collen D.ら.,(198
6)CRC Critical Reviews in
oncology/hematology,4(3)
249;Verstraete,M.ら.,(1986
)Blood,67(6)1529]。プラスミンは、
凝血のフィブリン成分を分解する主要なプロテアーゼで
ある[Rakoczi I.ら.,(1978)Bio
chem.Biophys.Acta.540,295
;Robbins,K.C.ら.,(1967)J.B
iol.Chem.242,2333;Wiman B
.(1977)Eur.J.Biochem.76,1
29]。
【0007】しかしながら、プラスミンは、血液凝固経
路(coagulation pathway)成分即
ちフィブリノーゲン、第V因子及び第VIII因子のよ
うな幾つかの血漿蛋白質にもその蛋白質分解作用を及ぼ
し得るので、出血を起こしやすくしてしまう[Coll
enD.ら.,(1986)CRC Critical
Reviews in oncology/hema
tology.4,(3)249;Verstraet
e,M.ら.,(1986)Blood,67(6)1
529;Wiman B.ら.,(1979)Bioc
him.Biophys.Acta 579,142]
。
路(coagulation pathway)成分即
ちフィブリノーゲン、第V因子及び第VIII因子のよ
うな幾つかの血漿蛋白質にもその蛋白質分解作用を及ぼ
し得るので、出血を起こしやすくしてしまう[Coll
enD.ら.,(1986)CRC Critical
Reviews in oncology/hema
tology.4,(3)249;Verstraet
e,M.ら.,(1986)Blood,67(6)1
529;Wiman B.ら.,(1979)Bioc
him.Biophys.Acta 579,142]
。
【0008】プラスミノーゲン活性化が全身レベル(s
ystemic level)で起きると、α2−プラ
スミン阻害物質によりプラスミンが迅速に中和されて循
環されるため、繊維素溶解に不適である[Collen
Dら.,(1986)CRC Critical R
eviews in oncology/hemato
logy,4(3)249;Verstraete,M
.ら.,(1986)Blood,67(6)1529
]。α2−プラスミン阻害物質のレベルが著しく減少す
るときには、プラスミンはそれほど迅速には中和されな
いので、フィブリンだけでなく前述の凝固蛋白質にもそ
の蛋白質分解作用を及ぼし得る。凝固過程、血小板凝集
及びフィブリン重合の際の幾つかのフィブリノーゲン分
解産物によって付与される阻害作用を伴って、血漿中の
フィブリノーゲン、第V因子及び第VIII因子の濃度
が過度に低下すると、止血作用の低下を招き、続いて出
血する危険性を増大させる[Lattlo Z.S.ら
.,(1973)Thrombos.Diath.Ha
emouh 56,253;Totty W.G.ら.
,(1982)Radiology 143,59]。 他方、プラスミノーゲンの活性化がフィブリンレベルで
起こると(フィブリン結合プラスミノーゲン活性化)、
フィブリン結合プラスミンとなるが[Collen D
.ら.,(1986)CRC Critical Re
views in oncology/hematol
ogy,4(3)249;Vestraete,M,ら
.,(1986)Blood,67(6)1529]、
このプラスミンはα2−プラスミン阻害物質によって中
和され、かなり少量となるため、全身的なフィブリノー
ゲン分解を誘起し得ない。
ystemic level)で起きると、α2−プラ
スミン阻害物質によりプラスミンが迅速に中和されて循
環されるため、繊維素溶解に不適である[Collen
Dら.,(1986)CRC Critical R
eviews in oncology/hemato
logy,4(3)249;Verstraete,M
.ら.,(1986)Blood,67(6)1529
]。α2−プラスミン阻害物質のレベルが著しく減少す
るときには、プラスミンはそれほど迅速には中和されな
いので、フィブリンだけでなく前述の凝固蛋白質にもそ
の蛋白質分解作用を及ぼし得る。凝固過程、血小板凝集
及びフィブリン重合の際の幾つかのフィブリノーゲン分
解産物によって付与される阻害作用を伴って、血漿中の
フィブリノーゲン、第V因子及び第VIII因子の濃度
が過度に低下すると、止血作用の低下を招き、続いて出
血する危険性を増大させる[Lattlo Z.S.ら
.,(1973)Thrombos.Diath.Ha
emouh 56,253;Totty W.G.ら.
,(1982)Radiology 143,59]。 他方、プラスミノーゲンの活性化がフィブリンレベルで
起こると(フィブリン結合プラスミノーゲン活性化)、
フィブリン結合プラスミンとなるが[Collen D
.ら.,(1986)CRC Critical Re
views in oncology/hematol
ogy,4(3)249;Vestraete,M,ら
.,(1986)Blood,67(6)1529]、
このプラスミンはα2−プラスミン阻害物質によって中
和され、かなり少量となるため、全身的なフィブリノー
ゲン分解を誘起し得ない。
【0009】従来のヒト血栓治療に於いて最も一般的に
使用されるプラスミノーゲン活性化因子であるウロキナ
ーゼ及びストレプトキナーゼは、フィブリンに対して特
異的な親和性を全く持たない。これらの化合物は共に、
比較的無差別に循環プラスミノーゲンまたはフィブリン
結合プラスミノーゲンを活性化する[Zamarron
C.ら.,(1984)Thromb.Haemos
tas.52,19;Samama M.ら.,(19
85)Sem.Hop.Paris 61(20),1
423]。その結果、全身的な止血作用の崩壊がストレ
プトキナーゼ及びウロキナーゼを用いた治療の間にしば
しば起こるため、その立証済の臨床的効能にも拘らず、
高い出血危険性がそれら止血剤の広範な臨床使用を妨げ
てきた[SamamaM.ら.,(1985)Sem.
Hop.Paris 61(20),1423;Mai
zel,A.Sら.,(1986)Cardiovas
c,Intervent.Radiol,9,236;
Bell W.R.ら.,(1976)Thromb.
Haemostas.35,57;Acar J.ら.
,(1987)Seminars in Thromb
.and Haemost.13(2)186:Gru
ppo Italiano per lo studi
o della Streptochinasi ne
ll’infarto miocarico(GISS
I)(1986)Lancet 1,397]。
使用されるプラスミノーゲン活性化因子であるウロキナ
ーゼ及びストレプトキナーゼは、フィブリンに対して特
異的な親和性を全く持たない。これらの化合物は共に、
比較的無差別に循環プラスミノーゲンまたはフィブリン
結合プラスミノーゲンを活性化する[Zamarron
C.ら.,(1984)Thromb.Haemos
tas.52,19;Samama M.ら.,(19
85)Sem.Hop.Paris 61(20),1
423]。その結果、全身的な止血作用の崩壊がストレ
プトキナーゼ及びウロキナーゼを用いた治療の間にしば
しば起こるため、その立証済の臨床的効能にも拘らず、
高い出血危険性がそれら止血剤の広範な臨床使用を妨げ
てきた[SamamaM.ら.,(1985)Sem.
Hop.Paris 61(20),1423;Mai
zel,A.Sら.,(1986)Cardiovas
c,Intervent.Radiol,9,236;
Bell W.R.ら.,(1976)Thromb.
Haemostas.35,57;Acar J.ら.
,(1987)Seminars in Thromb
.and Haemost.13(2)186:Gru
ppo Italiano per lo studi
o della Streptochinasi ne
ll’infarto miocarico(GISS
I)(1986)Lancet 1,397]。
【0010】これに対して、組織型のプラスミノーゲン
活性化因子(t−PA)[Hoylaerts M.ら
.,(1982)J.Biol.Chem.257(6
)2912]及びごく最近見出されたプロ−ウロキナー
ゼ(proUK)[Husain S.S.ら.,(1
983)Arch.Biochem.Biophys.
220,31]の天然型蛋白質は、循環プラスミノーゲ
ンの弱い活性化因子であり且つ逆にフィブリン結合プラ
スミノーゲンの強い活性化因子であることが知見された
。
活性化因子(t−PA)[Hoylaerts M.ら
.,(1982)J.Biol.Chem.257(6
)2912]及びごく最近見出されたプロ−ウロキナー
ゼ(proUK)[Husain S.S.ら.,(1
983)Arch.Biochem.Biophys.
220,31]の天然型蛋白質は、循環プラスミノーゲ
ンの弱い活性化因子であり且つ逆にフィブリン結合プラ
スミノーゲンの強い活性化因子であることが知見された
。
【0011】全身的なプラスミノーゲンとα2−プラス
ミン阻害物質の消費並びにフィブリノーゲン分解が、“
in vitro”及び“in vivo”実験で研究
動物体内で僅かながら起こることが明らかになった。
ミン阻害物質の消費並びにフィブリノーゲン分解が、“
in vitro”及び“in vivo”実験で研究
動物体内で僅かながら起こることが明らかになった。
【0012】従って、これらの蛋白質は共に、血栓症の
患者に対し、低い出血発生率でストレプトキナーゼ及び
ウロキナーゼよりもずっと効率的な血栓溶解効果を誘発
するようにデザインされてきた。
患者に対し、低い出血発生率でストレプトキナーゼ及び
ウロキナーゼよりもずっと効率的な血栓溶解効果を誘発
するようにデザインされてきた。
【0013】t−PAのフィブリン特異的血栓溶解活性
は、t−PA分子の、ジスルフィドによって結合された
三重の『クリングルドメイン(kringle dom
ains)』に位置する特異的リシン結合部位を介する
フィブリンとの結合能によって説明されてきた。従って
フィブリン結合プラスミノーゲンは、止血作用をひどく
弱められることなく活性化されることが可能となった[
Collen D.ら.,(1986)Haemost
asis,16(3),25]。他方、proUK(1
本鎖のウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子、
即ちscu−PAとも呼称される)はフィブリンには結
合しないが、全身的に止血作用を消失させることなくフ
ィブリン特異的血栓溶解能を示す[Pannell R
.ら.,(1986)Blood 67,1215;G
urewich V.ら.,(1987)Semina
rs in Thromb.and Haemost.
13(2),146;Lijnen H.R.ら.,(
1986)J.Biol.Chem.261,1253
]。
は、t−PA分子の、ジスルフィドによって結合された
三重の『クリングルドメイン(kringle dom
ains)』に位置する特異的リシン結合部位を介する
フィブリンとの結合能によって説明されてきた。従って
フィブリン結合プラスミノーゲンは、止血作用をひどく
弱められることなく活性化されることが可能となった[
Collen D.ら.,(1986)Haemost
asis,16(3),25]。他方、proUK(1
本鎖のウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子、
即ちscu−PAとも呼称される)はフィブリンには結
合しないが、全身的に止血作用を消失させることなくフ
ィブリン特異的血栓溶解能を示す[Pannell R
.ら.,(1986)Blood 67,1215;G
urewich V.ら.,(1987)Semina
rs in Thromb.and Haemost.
13(2),146;Lijnen H.R.ら.,(
1986)J.Biol.Chem.261,1253
]。
【0014】これらの蛋白質をコードするヒト遺伝子の
単離及び特性、並びに組換えDNA法による該蛋白質の
産生の研究がさらに為されてきた[Collen D.
ら.,(1984)J.Pharmacol.Exp.
Ther.231(1),146;Holmes,W.
E.ら.,(1985)Biotechnology
3,923]。組換えt−PAを、急性心筋梗塞患者の
マルチセンター臨床試験に使用した結果、閉塞した冠動
脈の再疎通に於いてストレプトキナーゼよりもかなり効
果的であることが明らかとなった[The Europ
ean Cooperative Study Gro
up for Recombinant Tissue
−type Plasminogen Activat
or(1985)Lancet,1,842;Shee
hanF.H.ら.,(1987)Circulati
on 75,(4),817]。
単離及び特性、並びに組換えDNA法による該蛋白質の
産生の研究がさらに為されてきた[Collen D.
ら.,(1984)J.Pharmacol.Exp.
Ther.231(1),146;Holmes,W.
E.ら.,(1985)Biotechnology
3,923]。組換えt−PAを、急性心筋梗塞患者の
マルチセンター臨床試験に使用した結果、閉塞した冠動
脈の再疎通に於いてストレプトキナーゼよりもかなり効
果的であることが明らかとなった[The Europ
ean Cooperative Study Gro
up for Recombinant Tissue
−type Plasminogen Activat
or(1985)Lancet,1,842;Shee
hanF.H.ら.,(1987)Circulati
on 75,(4),817]。
【0015】プロ−ウロキナーゼは、現在フェイズII
の臨床試験中であり、血栓溶解活性及び安全性の点で、
少なくともt−PAと同様の効果があると考えられてい
る[Van deWerf F.ら.,(1986)A
nnals of Internal Medecin
e,104,345;Van de Werf F.ら
.,(1986)Circulation 74(5)
,1066]。
の臨床試験中であり、血栓溶解活性及び安全性の点で、
少なくともt−PAと同様の効果があると考えられてい
る[Van deWerf F.ら.,(1986)A
nnals of Internal Medecin
e,104,345;Van de Werf F.ら
.,(1986)Circulation 74(5)
,1066]。
【0016】多くの生物学的に活性なペプチドが、アミ
ド化によってそのCOOH末端で保護され、その多くの
場合アミド化は、レセプター認識及び/または生物活性
に重要である[J.F.Rehfeld(1981)A
m.J.Physiol.240,6251−6266
]。COOH末端のアミド化(または、α−アミド化)
は、多くのカルボキシペプチダーゼに対する安定性を付
与し、半減期を延長し、且つ生物活性、レセプター選択
性、細胞透過性、組織分布などを変化させ得る[G,S
,Wandら.,(1985)Neuroendocr
inol.41,482−489]。
ド化によってそのCOOH末端で保護され、その多くの
場合アミド化は、レセプター認識及び/または生物活性
に重要である[J.F.Rehfeld(1981)A
m.J.Physiol.240,6251−6266
]。COOH末端のアミド化(または、α−アミド化)
は、多くのカルボキシペプチダーゼに対する安定性を付
与し、半減期を延長し、且つ生物活性、レセプター選択
性、細胞透過性、組織分布などを変化させ得る[G,S
,Wandら.,(1985)Neuroendocr
inol.41,482−489]。
【0017】α−アミド化は、真核生物に於ける分泌ペ
プチドの翻訳後修飾のひとつを表す。この修飾は、CO
OH末端のグリシン伸長ペプチドを、グリオキシル酸の
形成を伴って対応する脱(des)グリシンα−アミド
化ペプチドに変換させるペプチジルグリシンα−アミド
化モノオキシゲナーゼ(PAM)と呼称される酵素によ
って実施され得る[A.F.Bradburyら.,(
1982),Nature,289,686−688]
。触媒反応は酸素存在下に起こり、且つ銅カチオン及び
アスコルビン酸塩(ascorbate)を補助因子と
して要求する[B.Eipperら.,(1983),
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80
,5144ー5148]。
プチドの翻訳後修飾のひとつを表す。この修飾は、CO
OH末端のグリシン伸長ペプチドを、グリオキシル酸の
形成を伴って対応する脱(des)グリシンα−アミド
化ペプチドに変換させるペプチジルグリシンα−アミド
化モノオキシゲナーゼ(PAM)と呼称される酵素によ
って実施され得る[A.F.Bradburyら.,(
1982),Nature,289,686−688]
。触媒反応は酸素存在下に起こり、且つ銅カチオン及び
アスコルビン酸塩(ascorbate)を補助因子と
して要求する[B.Eipperら.,(1983),
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80
,5144ー5148]。
【0018】生合成法に於いては、Gly伸長ペプチド
(α−アミド化酵素用の基質)は、特異的カルボキシペ
プチダーゼB様プロテアーゼによる蛋白質分解によって
前駆体分子から生成される。この前駆体は、該ペプチド
のGly伸長末端直後に1〜4個の付加的塩基性アミノ
酸残基をもつ[R.E.Mainsら.,(1983)
T.I.N.S.229−235]。塩基性残基は、特
異的α−アミド化酵素(類)の認識に寄与し及び/また
はアミド化機構に関係すると示唆されてきた[S.Go
mezら.,(1984)FEBS Lett.167
,160−164]。
(α−アミド化酵素用の基質)は、特異的カルボキシペ
プチダーゼB様プロテアーゼによる蛋白質分解によって
前駆体分子から生成される。この前駆体は、該ペプチド
のGly伸長末端直後に1〜4個の付加的塩基性アミノ
酸残基をもつ[R.E.Mainsら.,(1983)
T.I.N.S.229−235]。塩基性残基は、特
異的α−アミド化酵素(類)の認識に寄与し及び/また
はアミド化機構に関係すると示唆されてきた[S.Go
mezら.,(1984)FEBS Lett.167
,160−164]。
【0019】
【発明の詳細】本発明は、ヒト繊維素溶解酵素プロ−ウ
ロキナーゼのCOOH末端アミド化誘導体、その前駆体
及び、前記前駆体を製造するための組換えDNA技術を
含むそれらの製造方法に関する。前記前駆体をコードす
る構造遺伝子、前記遺伝子を含むベクター及び、前記ベ
クターで形質転換した好適な宿主も本発明の範囲内に含
まれる。
ロキナーゼのCOOH末端アミド化誘導体、その前駆体
及び、前記前駆体を製造するための組換えDNA技術を
含むそれらの製造方法に関する。前記前駆体をコードす
る構造遺伝子、前記遺伝子を含むベクター及び、前記ベ
クターで形質転換した好適な宿主も本発明の範囲内に含
まれる。
【0020】本発明の第1の目的は、式(I):P−C
ONH2 (I)(式中、Pはヒトプ
ロ−ウロキナーゼ部分を表す)を有するヒトプロ−ウロ
キナーゼのCOOH末端アミド化誘導体または、該誘導
体分子のカルボキシ末端に先行する部分が改変したヒト
プロ−ウロキナーゼの改変体(modificatio
n)である。
ONH2 (I)(式中、Pはヒトプ
ロ−ウロキナーゼ部分を表す)を有するヒトプロ−ウロ
キナーゼのCOOH末端アミド化誘導体または、該誘導
体分子のカルボキシ末端に先行する部分が改変したヒト
プロ−ウロキナーゼの改変体(modificatio
n)である。
【0021】プロ−ウロキナーゼ改変体は、例えばプロ
−ウロキナーゼの欠失、挿入または置換変異体であり得
る。
−ウロキナーゼの欠失、挿入または置換変異体であり得
る。
【0022】本発明のもう1つの目的は、式(II):
P−Gly−Yn (
II)(式中、Pは上述の定義通りであり、Glyはグ
リシン残基であり、Yは塩基性アミノ酸残基であり、n
は0または1〜4の整数である)を有する、式(I)の
COOH末端アミド化誘導体の前駆体によって表される
。
P−Gly−Yn (
II)(式中、Pは上述の定義通りであり、Glyはグ
リシン残基であり、Yは塩基性アミノ酸残基であり、n
は0または1〜4の整数である)を有する、式(I)の
COOH末端アミド化誘導体の前駆体によって表される
。
【0023】nが2〜4の整数であるとき、Y残基は等
しくても異なっていてもよい。
しくても異なっていてもよい。
【0024】例えば、nが2であるとき、Ynは例えば
Lys−ArgまたはArg−Argを表し得る。
Lys−ArgまたはArg−Argを表し得る。
【0025】本発明のさらにもう1つの目的は、式(I
I)に於いて定義した前駆体を酵素変換することを含む
、式(I)のCOOH末端アミド化誘導体を製造する方
法である。
I)に於いて定義した前駆体を酵素変換することを含む
、式(I)のCOOH末端アミド化誘導体を製造する方
法である。
【0026】これらは、(nが0でないときに)例えば
カルボキシペプチダーゼBでYn伸長前駆体を蛋白質分
解してYn塩基性アミノ酸残基を除去した後、例えば天
然または組換えペプチジル−グリシンα−アミド化モノ
オキシゲナーゼ(PAM)などのアミド化酵素の作用に
よって、対応するアミド化ポリペプチドに変換し得る。
カルボキシペプチダーゼBでYn伸長前駆体を蛋白質分
解してYn塩基性アミノ酸残基を除去した後、例えば天
然または組換えペプチジル−グリシンα−アミド化モノ
オキシゲナーゼ(PAM)などのアミド化酵素の作用に
よって、対応するアミド化ポリペプチドに変換し得る。
【0027】さらに、本発明は、in vivoアミド
化用の可能な前駆体として式(II)の化合物を製造す
るための組換えDNA法も包含する[G.Gafvel
inら.,(1984)FEBS.Lett.184,
347−352]。
化用の可能な前駆体として式(II)の化合物を製造す
るための組換えDNA法も包含する[G.Gafvel
inら.,(1984)FEBS.Lett.184,
347−352]。
【0028】この方法に従って、プロ−ウロキナーゼ遺
伝子のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行い、
次いで変異した遺伝子を、適当な宿主微生物中で新規前
駆体を合成し得る好適な発現ベクター中に挿入すること
によって前記前駆体を製造する。
伝子のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行い、
次いで変異した遺伝子を、適当な宿主微生物中で新規前
駆体を合成し得る好適な発現ベクター中に挿入すること
によって前記前駆体を製造する。
【0029】本発明のさらにもう1つの目的は、式(I
I)によって表されるアミノ酸配列をコードする化学的
に合成したポリヌクレオチドを含む遺伝子によって構成
される。
I)によって表されるアミノ酸配列をコードする化学的
に合成したポリヌクレオチドを含む遺伝子によって構成
される。
【0030】1つ以上の態様に於いては、本発明は、前
記遺伝子を保有し、且つ式(II)に定義されたプロ−
ウロキナーゼ前駆体を合成し得る発現ベクターに関する
。
記遺伝子を保有し、且つ式(II)に定義されたプロ−
ウロキナーゼ前駆体を合成し得る発現ベクターに関する
。
【0031】本発明は、前記発現ベクターで形質転換し
た宿主微生物及び、この宿主微生物を用いる式(II)
の前駆体の製造にも関する。
た宿主微生物及び、この宿主微生物を用いる式(II)
の前駆体の製造にも関する。
【0032】式(I)の化合物または式(II)の化合
物及び1種以上の医薬上許容可能なキャリヤ及び/また
は希釈剤及び/または賦形剤を含む医薬組成物も同様に
本発明の範囲内に含まれる。
物及び1種以上の医薬上許容可能なキャリヤ及び/また
は希釈剤及び/または賦形剤を含む医薬組成物も同様に
本発明の範囲内に含まれる。
【0033】前記組成物は、慣用成分及び慣用手順を使
用して従来法で製造し得る。プロ−ウロキナーゼ(pr
oUK)は、多くの蛋白質と同様に、末端が遊離カルボ
ン酸である、411個のアミノ酸残基のセリン−プロテ
アーゼである[Holmes,W.E.ら.(1985
)Biotechnology 3,923]。本発明
によると、プロ−ウロキナーゼは、組換え技術により製
造された化合物であるのが好ましい。最後のアミノ酸残
基がロイシンであるため、プロ−ウロキナーゼはPAM
酵素によりアミド化できない。従ってproUKをこの
方法によってアミド化した状態で得るためには、C末端
にグリシン残基を付加することが不可欠である。
用して従来法で製造し得る。プロ−ウロキナーゼ(pr
oUK)は、多くの蛋白質と同様に、末端が遊離カルボ
ン酸である、411個のアミノ酸残基のセリン−プロテ
アーゼである[Holmes,W.E.ら.(1985
)Biotechnology 3,923]。本発明
によると、プロ−ウロキナーゼは、組換え技術により製
造された化合物であるのが好ましい。最後のアミノ酸残
基がロイシンであるため、プロ−ウロキナーゼはPAM
酵素によりアミド化できない。従ってproUKをこの
方法によってアミド化した状態で得るためには、C末端
にグリシン残基を付加することが不可欠である。
【0034】
【好ましい実施態様の説明】a)式(II)のアミド化
前駆体の組換えDNA法による製造 式(I)のアミド化したプロ−ウロキナーゼ誘導体の前
駆体、即ち式(II)の化合物を、プロ−ウロキナーゼ
遺伝子のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によっ
て製造した。
前駆体の組換えDNA法による製造 式(I)のアミド化したプロ−ウロキナーゼ誘導体の前
駆体、即ち式(II)の化合物を、プロ−ウロキナーゼ
遺伝子のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によっ
て製造した。
【0035】あるいは、プロ−ウロキナーゼの欠失、挿
入または置換変異体をコードする遺伝子、例えば欧州特
許出願第338409号に記載されているような遺伝子
を、出発物質としても使用し得る。
入または置換変異体をコードする遺伝子、例えば欧州特
許出願第338409号に記載されているような遺伝子
を、出発物質としても使用し得る。
【0036】突然変異誘発法の原理は、例えばファージ
ベクターM13などの1本鎖型で得ることができるベク
ターに、プロ−ウロキナーゼまたは変異遺伝子をサブク
ローニングさせることである。組換体1本鎖を、COO
H伸長コード配列を含む相補的な合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドでアニールした。DNAポリメラーゼ及
びリガーゼを用いて、新規ストランドを伸長し、次いで
環状形に結合した。この新規に作製したヘテロ二重鎖D
NAを使用して細胞系を形質転換した。この細胞系内で
は、該DNAが複製され、子孫を生産させ、元のpro
UK遺伝子または所望の挿入物を含む遺伝子を持つファ
ージを2つの異なる分子種に分離する。出発物質である
変異性オリゴヌクレオチドを、新規に合成した前駆体遺
伝子を認識するためのプローブとして使用した。この方
法は、より多くの実験の詳細内容が得られる文献中に詳
しく記載されている[Zoller M.J.ら.,(
1982)Nucleic Acid Researc
h 101,6487]。
ベクターM13などの1本鎖型で得ることができるベク
ターに、プロ−ウロキナーゼまたは変異遺伝子をサブク
ローニングさせることである。組換体1本鎖を、COO
H伸長コード配列を含む相補的な合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドでアニールした。DNAポリメラーゼ及
びリガーゼを用いて、新規ストランドを伸長し、次いで
環状形に結合した。この新規に作製したヘテロ二重鎖D
NAを使用して細胞系を形質転換した。この細胞系内で
は、該DNAが複製され、子孫を生産させ、元のpro
UK遺伝子または所望の挿入物を含む遺伝子を持つファ
ージを2つの異なる分子種に分離する。出発物質である
変異性オリゴヌクレオチドを、新規に合成した前駆体遺
伝子を認識するためのプローブとして使用した。この方
法は、より多くの実験の詳細内容が得られる文献中に詳
しく記載されている[Zoller M.J.ら.,(
1982)Nucleic Acid Researc
h 101,6487]。
【0037】次いで前駆体遺伝子を、 好適な宿主微生
物(例えば、E.coli及びB.subtilisな
どの原核生物または、S.cerevisiaeなどの
真核細胞、昆虫または哺乳類細胞系など)中の新規pr
oUK誘導体を合成し得る好適な発現ベクターに挿入し
た。
物(例えば、E.coli及びB.subtilisな
どの原核生物または、S.cerevisiaeなどの
真核細胞、昆虫または哺乳類細胞系など)中の新規pr
oUK誘導体を合成し得る好適な発現ベクターに挿入し
た。
【0038】前駆体遺伝子を保有する得られた形質転換
体を培養して、変異体を発現させた。標準技術を使用し
て、我々はproUK変異体を抽出且つ精製し、アミド
化反応用の基質として使用した。
体を培養して、変異体を発現させた。標準技術を使用し
て、我々はproUK変異体を抽出且つ精製し、アミド
化反応用の基質として使用した。
【0039】バクテリア、特に例えばE.coliを、
宿主微生物とするのが好ましい。E.coli中で発現
させるために、我々は、国際特許出願第PCT/WO9
0/04023号に記載した、以下の実施例1でその構
築を報告するプラスミドpFC44を使用した。このプ
ラスミドを、図7に示す。伝統的な遺伝子操作技術[M
aniatis T.ら.,(1982)Molecu
lar cloning A laboratory
manual Cold Spring Harbou
r]を使用して、我々はpFC44中に挿入したpro
UK野生型遺伝子を、COOH伸長プロ−ウロキナーゼ
をコードする変異遺伝子で置換した。
宿主微生物とするのが好ましい。E.coli中で発現
させるために、我々は、国際特許出願第PCT/WO9
0/04023号に記載した、以下の実施例1でその構
築を報告するプラスミドpFC44を使用した。このプ
ラスミドを、図7に示す。伝統的な遺伝子操作技術[M
aniatis T.ら.,(1982)Molecu
lar cloning A laboratory
manual Cold Spring Harbou
r]を使用して、我々はpFC44中に挿入したpro
UK野生型遺伝子を、COOH伸長プロ−ウロキナーゼ
をコードする変異遺伝子で置換した。
【0040】特定の一態様に於いて、本発明は、欠失、
挿入または置換プロ−ウロキナーゼ誘導体をコードする
プロ−ウロキナーゼ野生型遺伝子またはその変異体が、
グリシン伸長変異体をコードする新規遺伝子で置換され
た、pPUK−Glyと呼称される新規プラスミドを提
供する。
挿入または置換プロ−ウロキナーゼ誘導体をコードする
プロ−ウロキナーゼ野生型遺伝子またはその変異体が、
グリシン伸長変異体をコードする新規遺伝子で置換され
た、pPUK−Glyと呼称される新規プラスミドを提
供する。
【0041】E.coli宿主細胞中に挿入し、次いで
得られた形質転換体を増殖後、該変異体の高レベルの発
現を得た。形質転換及び増殖条件は、国際特許出願第P
CT/WO90/04023号に既に記載した条件及び
以下の実施例2に記載した条件と同じである。
得られた形質転換体を増殖後、該変異体の高レベルの発
現を得た。形質転換及び増殖条件は、国際特許出願第P
CT/WO90/04023号に既に記載した条件及び
以下の実施例2に記載した条件と同じである。
【0042】標準技術を使用して、proUK変異体を
抽出、精製し、アミド化酵素用の基質として使用した。
抽出、精製し、アミド化酵素用の基質として使用した。
【0043】Gly伸長プロ−ウロキナーゼ前駆体[式
(II)、n=0]の製造で使用した技術と同一技術に
よって、C末端に付加的塩基性残基を保持する前駆体[
式(II)、n=1〜4]も製造できた。例えば、以下
の特定分子: proUK−Gly−Lys−Arg 及び
proUK−Gly−Arg−Argが得られた。
(II)、n=0]の製造で使用した技術と同一技術に
よって、C末端に付加的塩基性残基を保持する前駆体[
式(II)、n=1〜4]も製造できた。例えば、以下
の特定分子: proUK−Gly−Lys−Arg 及び
proUK−Gly−Arg−Argが得られた。
【0044】この場合、E.coli細胞中で発現させ
るためには、前記前駆体をコードする遺伝子を、pro
UK野生型遺伝子のかわりにプラスミドpFC44に挿
入した。
るためには、前記前駆体をコードする遺伝子を、pro
UK野生型遺伝子のかわりにプラスミドpFC44に挿
入した。
【0045】b)pro−UK−Gly−Yn− か
ら pro−UK−NH2への酵素的転換 pro−UK−Gly−Yn−OH前駆体を、カルボキ
シペプチダーゼB(Boehringer Mann
heim)(E/S,1:2000重量比)の存在下に
(nは0ではない)または非存在下に(nは0である)
、例えば、ラット髄甲状腺癌からのPAM酵素[N.M
.Mehtaら(1988)Arch.Biochem
.Biophys.261,44−54]または、この
腫瘍から誘導した細胞のならし培地からのPAM酵素[
J.P.Gilliganら(1989)Endocr
inol.124,2729−2736]などのPAM
酵素の半精製したプロテアーゼを含まない調製物とイン
キュベートした。
ら pro−UK−NH2への酵素的転換 pro−UK−Gly−Yn−OH前駆体を、カルボキ
シペプチダーゼB(Boehringer Mann
heim)(E/S,1:2000重量比)の存在下に
(nは0ではない)または非存在下に(nは0である)
、例えば、ラット髄甲状腺癌からのPAM酵素[N.M
.Mehtaら(1988)Arch.Biochem
.Biophys.261,44−54]または、この
腫瘍から誘導した細胞のならし培地からのPAM酵素[
J.P.Gilliganら(1989)Endocr
inol.124,2729−2736]などのPAM
酵素の半精製したプロテアーゼを含まない調製物とイン
キュベートした。
【0046】酵素反応を、銅イオン、アスコルビン酸塩
、カタラーゼ、ヨウ化カリウム、SDS及びTween
20を含む例えばTES(pH7)などの水性緩衝液中
で実施した。
、カタラーゼ、ヨウ化カリウム、SDS及びTween
20を含む例えばTES(pH7)などの水性緩衝液中
で実施した。
【0047】あるいは、アミド化をS−スルホン化Pr
o−UK−Gly−Ynで実施したが、SDSの添加は
必要なかった。
o−UK−Gly−Ynで実施したが、SDSの添加は
必要なかった。
【0048】総ての場合に於いて、アミド化の程度は、
ニトロソベンゼンを用いた誘導反応後、グリオキシル酸
の測定に基づいた『Corbett and Corb
ett法』[J.Org.Chem.(1980),4
5,2834−2839]で測定した。アミド化した生
成物を従来法で精製した。
ニトロソベンゼンを用いた誘導反応後、グリオキシル酸
の測定に基づいた『Corbett and Corb
ett法』[J.Org.Chem.(1980),4
5,2834−2839]で測定した。アミド化した生
成物を従来法で精製した。
【0049】C末端の正確さ(correctness
)は、カルボキシペプチダーゼY(CP−Y)処理(L
eu、Ala、Gly及びAsnの放出)によって確認
した。CP−Aでの処理に於いてはアミノ酸の放出は観
察されず、総ての生成物がアミド化されていることが確
認された。
)は、カルボキシペプチダーゼY(CP−Y)処理(L
eu、Ala、Gly及びAsnの放出)によって確認
した。CP−Aでの処理に於いてはアミノ酸の放出は観
察されず、総ての生成物がアミド化されていることが確
認された。
【0050】類似の方法によって、アミド化を、先のa
)に於いて述べたプロ−ウロキナーゼの欠失、挿入及び
置換変異体に於いて実施した。
)に於いて述べたプロ−ウロキナーゼの欠失、挿入及び
置換変異体に於いて実施した。
【0051】c)生物学的活性
式(I)または式(II)で定義した化合物を使用して
、プロ−ウロキナーゼが活性である、例えば急性心筋梗
塞、肺塞栓症または深静脈血栓症などに於ける同一治療
分野に於いて適用すると有用であることが知見し得る。 天然型プロ−ウロキナーゼと同様、本発明のアミド化誘
導体及びその前駆体は、循環プラスミノーゲンよりも、
凝血中のフィブリンに結合したプラスミノーゲンに対し
より強い親和性を有し、従って高い血栓選択性を特徴と
し、治療に付随する出血の危険性を低下させる。さらに
、COOH末端アミド化化合物は、対応する非アミド化
酵素よりも例えば、殆どのカルボキシペプチダーゼに対
する増大した安定性及び延長した半減期などの改善され
た特性を示すことができる。
、プロ−ウロキナーゼが活性である、例えば急性心筋梗
塞、肺塞栓症または深静脈血栓症などに於ける同一治療
分野に於いて適用すると有用であることが知見し得る。 天然型プロ−ウロキナーゼと同様、本発明のアミド化誘
導体及びその前駆体は、循環プラスミノーゲンよりも、
凝血中のフィブリンに結合したプラスミノーゲンに対し
より強い親和性を有し、従って高い血栓選択性を特徴と
し、治療に付随する出血の危険性を低下させる。さらに
、COOH末端アミド化化合物は、対応する非アミド化
酵素よりも例えば、殆どのカルボキシペプチダーゼに対
する増大した安定性及び延長した半減期などの改善され
た特性を示すことができる。
【0052】式(II)に定義された化合物、特に式(
II)(式中、nが1〜4の整数である)の化合物は、
in vivoアミド化用の可能な前駆体であり得る。
II)(式中、nが1〜4の整数である)の化合物は、
in vivoアミド化用の可能な前駆体であり得る。
【0053】
【実施例】実施例1……プラスミドpFC44の構築発
現プラスミドpFC44を得るために、以下のステップ
を実施することが必須である。
現プラスミドpFC44を得るために、以下のステップ
を実施することが必須である。
【0054】1)プロ−ウロキナーゼをコードするヒト
cDNA遺伝子のクローニング ヒトプロ−ウロキナーゼをコードするcDNAクローン
を得るために、本発明者らは、文献中に記載されている
蛋白質配列データを用いた[Gunzler,W.A.
,Steffens,G.J.,Oetting,F.
,Kim,SM.A.,Frankus.E.,及びF
lohe,L.Hoppe−Seyler’s Z.P
hysiol.Chem.,363,p.1155,1
982;Gunzler,W.A.,Steffens
,G.J.,Oetting,F.,Buze,G.,
及びFlohe,L.:Hoppe−Seyler’s
Z.Physiol.Chem.363,p.133
,1982;Steffens,G.J.,Gunzl
er,W.A.:Oetting,F.,Franku
s,E.,及びFlohe,L.:Hoppe−Sey
ler’s Z.Physiol.Chem.,363
,P.1043,1982]。
cDNA遺伝子のクローニング ヒトプロ−ウロキナーゼをコードするcDNAクローン
を得るために、本発明者らは、文献中に記載されている
蛋白質配列データを用いた[Gunzler,W.A.
,Steffens,G.J.,Oetting,F.
,Kim,SM.A.,Frankus.E.,及びF
lohe,L.Hoppe−Seyler’s Z.P
hysiol.Chem.,363,p.1155,1
982;Gunzler,W.A.,Steffens
,G.J.,Oetting,F.,Buze,G.,
及びFlohe,L.:Hoppe−Seyler’s
Z.Physiol.Chem.363,p.133
,1982;Steffens,G.J.,Gunzl
er,W.A.:Oetting,F.,Franku
s,E.,及びFlohe,L.:Hoppe−Sey
ler’s Z.Physiol.Chem.,363
,P.1043,1982]。
【0055】これにより特定のプローブを調製し、好適
なcDNAライブラリーをスクリーニングした。1本鎖
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(pro−
UK)の選択ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド
を化学的に合成し[Caruthers,M.H.,G
assen,H.G.及びLang,J.A.ら編著、
Verlag−Chemie,Weinheim,De
efield Beach.Basel,p.71,1
982]、これを、pro−UK mRNAの集積物を
モニターするための特異的なプローブとして用い、且つ
集積されたcDNAライブラリーからプロ−ウロキナー
ゼを含むクローンを選択した。オリゴマーは、長さ14
〜17マー(mer)であり、各々を、図1に示したよ
うな非反復配列(p7と呼称)としてまたはオリゴヌク
レオチドを2個(p1、p2及びp3と呼称)若しくは
16個(p16と呼称)含むプールとして合成した。オ
リゴマーをノーザンハイブリダイゼーションによってp
ro−UKに対する特異性を試験した。この分析用に、
ポリA含有RNAを、HEp−3 偏平上皮癌(epi
dermoid carcinoma)から抽出した[
Miskin,R.,Haemostasis(スイス
),11,suppl1,p.63,1982]。各オ
リゴマーについて、ハイブリダイゼーション反応後の洗
浄温度を、サザンブロットに対するハイブリダイゼーシ
ョン用にSuggsらに従って計算されるように、最小
融解温度よりも2〜5℃低くなるように調整した[Su
ggs,S.V.,Hirose,T.,Miyake
.,Kawashima,E.G.,Johnson
M.Y.,Itakura,K.及びWallach,
P.B.:Developmental Biolog
yUsing Purified Genes;Bro
wan D.D.及びFox,C.F.編著,Acad
emic Press,New York,p.638
,1981]。 本明細書に於いて、図1に示される5つのpro−UK
プローブは、pro−UKのmRNAサイズと思われる
約2.3kbの1つの共通の主要な癌mRNAバンドと
反応した。
なcDNAライブラリーをスクリーニングした。1本鎖
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(pro−
UK)の選択ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド
を化学的に合成し[Caruthers,M.H.,G
assen,H.G.及びLang,J.A.ら編著、
Verlag−Chemie,Weinheim,De
efield Beach.Basel,p.71,1
982]、これを、pro−UK mRNAの集積物を
モニターするための特異的なプローブとして用い、且つ
集積されたcDNAライブラリーからプロ−ウロキナー
ゼを含むクローンを選択した。オリゴマーは、長さ14
〜17マー(mer)であり、各々を、図1に示したよ
うな非反復配列(p7と呼称)としてまたはオリゴヌク
レオチドを2個(p1、p2及びp3と呼称)若しくは
16個(p16と呼称)含むプールとして合成した。オ
リゴマーをノーザンハイブリダイゼーションによってp
ro−UKに対する特異性を試験した。この分析用に、
ポリA含有RNAを、HEp−3 偏平上皮癌(epi
dermoid carcinoma)から抽出した[
Miskin,R.,Haemostasis(スイス
),11,suppl1,p.63,1982]。各オ
リゴマーについて、ハイブリダイゼーション反応後の洗
浄温度を、サザンブロットに対するハイブリダイゼーシ
ョン用にSuggsらに従って計算されるように、最小
融解温度よりも2〜5℃低くなるように調整した[Su
ggs,S.V.,Hirose,T.,Miyake
.,Kawashima,E.G.,Johnson
M.Y.,Itakura,K.及びWallach,
P.B.:Developmental Biolog
yUsing Purified Genes;Bro
wan D.D.及びFox,C.F.編著,Acad
emic Press,New York,p.638
,1981]。 本明細書に於いて、図1に示される5つのpro−UK
プローブは、pro−UKのmRNAサイズと思われる
約2.3kbの1つの共通の主要な癌mRNAバンドと
反応した。
【0056】HEp−3偏平上皮癌からのmRNAに富
む画分を使用してクローニングを実施した。RNA調製
物を抽出し、2回の連続蔗糖密度勾配遠心により約3倍
に濃縮した。プライマーとしてオリゴ−dTを使用して
、cDNAを公知文献の方法に従って合成した[Efs
tratiadis,A.,Kafatos,F.C.
,Maxam,A.M.及びManiatis,T.:
Cell,7,p.279,1976;Buell,G
.N.,Wickens,M.P.,Payvar,F
.及びSchimke,R.T.J.:Biol.Ch
em.253,p.2471,1978]。長い分子を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して単離し、次
いで好適なゲル画分を電気−溶離(elecro−el
ution)した。cDNAを標準フェノール/クロロ
ホルム抽出、次いでエタノール沈澱を利用して抽出した
。
む画分を使用してクローニングを実施した。RNA調製
物を抽出し、2回の連続蔗糖密度勾配遠心により約3倍
に濃縮した。プライマーとしてオリゴ−dTを使用して
、cDNAを公知文献の方法に従って合成した[Efs
tratiadis,A.,Kafatos,F.C.
,Maxam,A.M.及びManiatis,T.:
Cell,7,p.279,1976;Buell,G
.N.,Wickens,M.P.,Payvar,F
.及びSchimke,R.T.J.:Biol.Ch
em.253,p.2471,1978]。長い分子を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して単離し、次
いで好適なゲル画分を電気−溶離(elecro−el
ution)した。cDNAを標準フェノール/クロロ
ホルム抽出、次いでエタノール沈澱を利用して抽出した
。
【0057】これらのcDNA分子をまずEcoRIリ
ンカーと連結させ、次いでDavis法の改良方法に従
ってファージλ−gt10ベクター中にクローニングし
た[Maniatis,T.,Fritsh,E.F.
,Sambrook J.:Molecular cl
oning.A laboratory manual
,Cold SpringHarbour Labor
atory,Cold Spring Harbour
,NY,1982]。このように実施することにより、
2×105pfu(プラーク形成単位)を含むライブラ
リーを形成した。
ンカーと連結させ、次いでDavis法の改良方法に従
ってファージλ−gt10ベクター中にクローニングし
た[Maniatis,T.,Fritsh,E.F.
,Sambrook J.:Molecular cl
oning.A laboratory manual
,Cold SpringHarbour Labor
atory,Cold Spring Harbour
,NY,1982]。このように実施することにより、
2×105pfu(プラーク形成単位)を含むライブラ
リーを形成した。
【0058】ライブラリーの半分を、二重フィルター上
で即ちひとつのフィルター上では32Pでラベルしたプ
ローブplで、もうひとつのフィルター上ではプローブ
p3とp6の混合物でスクリーニングした。全部で36
の陽性クローンを得、その内の7つは二重フィルターで
陽性であり、このようにcDNA挿入物がpro−UK
コード配列の大部分と対応していることを示した。
で即ちひとつのフィルター上では32Pでラベルしたプ
ローブplで、もうひとつのフィルター上ではプローブ
p3とp6の混合物でスクリーニングした。全部で36
の陽性クローンを得、その内の7つは二重フィルターで
陽性であり、このようにcDNA挿入物がpro−UK
コード配列の大部分と対応していることを示した。
【0059】3つのプローブとハイブリダイズした組換
体ファージは、プローブplを使用して精製されるプラ
ークであり、さらにEcoRIを用いて制限マッピング
することによって及びDNAシーケンシングすることに
よって特徴付けられた。全cDNAライブラリー中の陽
性クローン画分は、HEp−3癌中のプロ−ウロキナー
ゼmRNAの出現率(frequency)がほぼ0.
01%であることを示している。
体ファージは、プローブplを使用して精製されるプラ
ークであり、さらにEcoRIを用いて制限マッピング
することによって及びDNAシーケンシングすることに
よって特徴付けられた。全cDNAライブラリー中の陽
性クローン画分は、HEp−3癌中のプロ−ウロキナー
ゼmRNAの出現率(frequency)がほぼ0.
01%であることを示している。
【0060】4つのpro−UK cDNAクローン
の配列分析から、クローンの内3つが欠失を有している
か、またはプロ−ウロキナーゼ酵素のアミノ酸配列と一
致しない配列を有していることが分かった。ただ1つの
クローン(λ−Uc17)が、公知のアミノ酸配列と完
全に一致した配列を有していた。
の配列分析から、クローンの内3つが欠失を有している
か、またはプロ−ウロキナーゼ酵素のアミノ酸配列と一
致しない配列を有していることが分かった。ただ1つの
クローン(λ−Uc17)が、公知のアミノ酸配列と完
全に一致した配列を有していた。
【0061】しかしながらλ−Uc17は、mRNAの
完全な3’非コード末端を含まず、コード配列の30個
のヌクレオチドを欠いていた。完全長のプレ−プロ−ウ
ロキナーゼcDNAクローンは、5’非コード領域及び
コード配列の大部分を含む1325 bpλ−Uc17
SmaI−BamHI断片と、もうひとつのクローン
λ−Uc6由来の3’領域欠失残部を含むBamHI−
EcoRI断片との連結によって構築された(図2)。
完全な3’非コード末端を含まず、コード配列の30個
のヌクレオチドを欠いていた。完全長のプレ−プロ−ウ
ロキナーゼcDNAクローンは、5’非コード領域及び
コード配列の大部分を含む1325 bpλ−Uc17
SmaI−BamHI断片と、もうひとつのクローン
λ−Uc6由来の3’領域欠失残部を含むBamHI−
EcoRI断片との連結によって構築された(図2)。
【0062】この構築物を、このようにcI遺伝子の殆
どを欠くプラスミドベクターpUN121のSmaI−
EcoRI部位に連結させ[Nilsson B.,U
hlen M.,Josephson S.,Gate
nbeck S.及びPhilipson L.:Nu
cleic Acid Research 11,p.
8019,1983]、これをpcUK176と命名し
た(図3)。
どを欠くプラスミドベクターpUN121のSmaI−
EcoRI部位に連結させ[Nilsson B.,U
hlen M.,Josephson S.,Gate
nbeck S.及びPhilipson L.:Nu
cleic Acid Research 11,p.
8019,1983]、これをpcUK176と命名し
た(図3)。
【0063】完全なcDNAクローンのDNA配列を図
4に示す。5’末端に69非コードヌクレオチド、12
96コードヌクレオチド、及び3’末端に931非コー
ドヌクレオチドを含む2296ヌクレオチドと、その後
に続く80残基以上のポリ(A)尾部とからなる。コー
ド配列は、『プレ−プロ−ウロキナーゼ』を含む20個
のアミノ酸をコードする60bpで開始し[Heyne
ker,H.L.,Holmes,W.E.及びVeh
ar,G.A.(1983);欧州特許出願公開第00
92182号]、その後にアミノ酸配列が完全に一致す
るプロ−ウロキナーゼ蛋白質全体をコードする配列が続
く。完全な断片を、配列及び制限分析によって確認した
。成熟プロ−ウロキナーゼをコードする配列を産生に使
用する発現ベクター中に挿入した。
4に示す。5’末端に69非コードヌクレオチド、12
96コードヌクレオチド、及び3’末端に931非コー
ドヌクレオチドを含む2296ヌクレオチドと、その後
に続く80残基以上のポリ(A)尾部とからなる。コー
ド配列は、『プレ−プロ−ウロキナーゼ』を含む20個
のアミノ酸をコードする60bpで開始し[Heyne
ker,H.L.,Holmes,W.E.及びVeh
ar,G.A.(1983);欧州特許出願公開第00
92182号]、その後にアミノ酸配列が完全に一致す
るプロ−ウロキナーゼ蛋白質全体をコードする配列が続
く。完全な断片を、配列及び制限分析によって確認した
。成熟プロ−ウロキナーゼをコードする配列を産生に使
用する発現ベクター中に挿入した。
【0064】2)pro−UK発現プラスミドの構築p
cUK 176中に存在する元の完全長のcDNAを使
用して、pro−UK遺伝子が、各々プロモーターPt
rpと、“Shine−Dalgarno”配列MS−
2との転写及び翻訳制御下にあるプロ−ウロキナーゼ発
現プラスミド、即ちpFC44を構築した。プラスミド
pFC44を、図7に示す。
cUK 176中に存在する元の完全長のcDNAを使
用して、pro−UK遺伝子が、各々プロモーターPt
rpと、“Shine−Dalgarno”配列MS−
2との転写及び翻訳制御下にあるプロ−ウロキナーゼ発
現プラスミド、即ちpFC44を構築した。プラスミド
pFC44を、図7に示す。
【0065】pFC44を得るために、幾つかの中間体
プラスミドを構築した。pDS20から出発して[Du
ester,G.,Helfard.R.M.及びHo
lmes,W.M.:Cell 30,.855,19
82]、まずガラクトースオペロンプロモーターPga
lをコードするEcoRI−HindIII断片を、M
13 mp8ベクターからのEcoRI−HindII
Iポリリンカー配列で置換し[Vieira,J.及び
Messing,I:Gene,19,p.259,1
982]、新規なプラスミドを得、これをpAB1と命
名した(図5)。
プラスミドを構築した。pDS20から出発して[Du
ester,G.,Helfard.R.M.及びHo
lmes,W.M.:Cell 30,.855,19
82]、まずガラクトースオペロンプロモーターPga
lをコードするEcoRI−HindIII断片を、M
13 mp8ベクターからのEcoRI−HindII
Iポリリンカー配列で置換し[Vieira,J.及び
Messing,I:Gene,19,p.259,1
982]、新規なプラスミドを得、これをpAB1と命
名した(図5)。
【0066】プロモーターPtrpを、EcoRI−S
alI制限断片としてプラスミドpDR720(ファル
マシア製)から得た。 この断片を、EcoRIとSalI部位の間のpAB1
ポリリンカー領域に挿入した。こうすることによって、
新規プラスミドを得、これをpFC10と命名した(図
5)。pFC10はベースベクターと考えることができ
、これに、pro−UK遺伝子並びに、ファージMS−
2からの“Shine−Dalgarno”配列を挿入
した。
alI制限断片としてプラスミドpDR720(ファル
マシア製)から得た。 この断片を、EcoRIとSalI部位の間のpAB1
ポリリンカー領域に挿入した。こうすることによって、
新規プラスミドを得、これをpFC10と命名した(図
5)。pFC10はベースベクターと考えることができ
、これに、pro−UK遺伝子並びに、ファージMS−
2からの“Shine−Dalgarno”配列を挿入
した。
【0067】成熟プロ−ウロキナーゼを発現させるため
に、pro−UKコード配列、成熟蛋白質の第1コドン
からイニシエータートリプレットATGまで、を融合さ
せることが必要である。このとき、“Shine−Da
lgarno”配列の後に該融合物を配置しなくてはな
らない。
に、pro−UKコード配列、成熟蛋白質の第1コドン
からイニシエータートリプレットATGまで、を融合さ
せることが必要である。このとき、“Shine−Da
lgarno”配列の後に該融合物を配置しなくてはな
らない。
【0068】バクテリアファージMS−2由来のリボソ
ーム結合部位(RBS)は公知であり、そのヌクレオチ
ド配列は既に報告済みである[Fiers,W.,Co
ntreras,R.,Duerinck,F.,Ha
egeman,G.,Iserentant,D.,M
erregaert,J.,Min Jou,W.,M
olemans,F.,Raeymaekers A.
,Van den Berghe,A.,Volcka
ert,G.及びYsebaert.M.:Natur
e,260,p.500(1976)]。
ーム結合部位(RBS)は公知であり、そのヌクレオチ
ド配列は既に報告済みである[Fiers,W.,Co
ntreras,R.,Duerinck,F.,Ha
egeman,G.,Iserentant,D.,M
erregaert,J.,Min Jou,W.,M
olemans,F.,Raeymaekers A.
,Van den Berghe,A.,Volcka
ert,G.及びYsebaert.M.:Natur
e,260,p.500(1976)]。
【0069】RBSは、mRNAの効率的な翻訳のため
の、強力なシグナルであると考えられている。従って、
この領域をpro−UKの製造用の翻訳シグナルとして
選択した。pro−UK遺伝子と正しいヌクレオチド融
合させるために、pro−UK遺伝子の開始部位に直接
結合させたMS−2 RBSの二重鎖DNA領域を合成
した。TaqI部位は、成熟pro−UK配列の25番
目のヌクレオチド上にある。本発明者らは、この部位を
利用し、化学合成によって、上流にHindIII部位
を配置し、且つ下流にTaqI部位を配置する以下のD
NA配列: Hind III
MetSer 5’−AGCTTTAA
TAGACGCCGGCCATTCAAACATGAG
GATTACCCATGAGCA
3’−AATTATCTGCGGCCGGTAAGT
TTGTACTCCTAATGGGTACTCGT
TaqIATGAAC
TTCATCAAGTTCCAT−3’TACTTGA
AGTAGTTCAAGGTAGC−5’ を単離した。イニシエーターコドンATGを太字で示す
。成熟pro−UK配列の開始部位をコードする配列に
下線を引いた。
の、強力なシグナルであると考えられている。従って、
この領域をpro−UKの製造用の翻訳シグナルとして
選択した。pro−UK遺伝子と正しいヌクレオチド融
合させるために、pro−UK遺伝子の開始部位に直接
結合させたMS−2 RBSの二重鎖DNA領域を合成
した。TaqI部位は、成熟pro−UK配列の25番
目のヌクレオチド上にある。本発明者らは、この部位を
利用し、化学合成によって、上流にHindIII部位
を配置し、且つ下流にTaqI部位を配置する以下のD
NA配列: Hind III
MetSer 5’−AGCTTTAA
TAGACGCCGGCCATTCAAACATGAG
GATTACCCATGAGCA
3’−AATTATCTGCGGCCGGTAAGT
TTGTACTCCTAATGGGTACTCGT
TaqIATGAAC
TTCATCAAGTTCCAT−3’TACTTGA
AGTAGTTCAAGGTAGC−5’ を単離した。イニシエーターコドンATGを太字で示す
。成熟pro−UK配列の開始部位をコードする配列に
下線を引いた。
【0070】合成断片を以下の2つの制限断片:……ヌ
クレオチド155からヌクレオチド392までのpro
−UK配列を保持する、pcUK176(図3)からの
TaqI−BgIII断片(図4参照)と、 ……アンピシリンに対する抗生物質耐性遺伝子とプロモ
ーターPtrpとを保持するpFC10(図5)からの
大きなBamHI−HindIII断片との連結反応に
使用した。
クレオチド155からヌクレオチド392までのpro
−UK配列を保持する、pcUK176(図3)からの
TaqI−BgIII断片(図4参照)と、 ……アンピシリンに対する抗生物質耐性遺伝子とプロモ
ーターPtrpとを保持するpFC10(図5)からの
大きなBamHI−HindIII断片との連結反応に
使用した。
【0071】この構築を経て、我々は新規プラスミドを
単離し、これをpAB8と命名し、その構成地図を図6
に示した。このプラスミドに於いて、プロモーターPt
rp及びMS−2RBSを成熟pro−UK遺伝子の最
初の260ヌクレオチド(図4中のヌクレオチド131
〜391に対応)に融合した。 さらに、pAB8はただ1つのNcoI部位を有してお
り、これに、pcUK176からのNcoI−NcoI
制限断片を介してpro−UK配列の残部を挿入し、こ
うしてプラスミドpFC16を得た。 この連結は、非コード領域中のpro−UK遺伝子の下
流のNcoI−BglII断片の重複を引き起した。し
かしながら、この重複はプラスミドの安定性には影響し
ない。この構築により、シグナルは完全なpro−UK
配列を合成し得る(図6参照)。
単離し、これをpAB8と命名し、その構成地図を図6
に示した。このプラスミドに於いて、プロモーターPt
rp及びMS−2RBSを成熟pro−UK遺伝子の最
初の260ヌクレオチド(図4中のヌクレオチド131
〜391に対応)に融合した。 さらに、pAB8はただ1つのNcoI部位を有してお
り、これに、pcUK176からのNcoI−NcoI
制限断片を介してpro−UK配列の残部を挿入し、こ
うしてプラスミドpFC16を得た。 この連結は、非コード領域中のpro−UK遺伝子の下
流のNcoI−BglII断片の重複を引き起した。し
かしながら、この重複はプラスミドの安定性には影響し
ない。この構築により、シグナルは完全なpro−UK
配列を合成し得る(図6参照)。
【0072】今まで記載した総てのプラスミドを、アン
ピシリン耐性に基づいて、E.coli K−12宿主
株C−600 galK(ATCC 33955)中
で選択した。実際これらのプラスミドは、培養培地中で
抗生物質アンピシリンを分解する酵素β−ラクタマーゼ
をコードする遺伝子を保有する。初期の実験では、pF
C16は、E.coliタイプB株中にうまく挿入でき
、組換えpro−UKを高いレベルで製造できた。
ピシリン耐性に基づいて、E.coli K−12宿主
株C−600 galK(ATCC 33955)中
で選択した。実際これらのプラスミドは、培養培地中で
抗生物質アンピシリンを分解する酵素β−ラクタマーゼ
をコードする遺伝子を保有する。初期の実験では、pF
C16は、E.coliタイプB株中にうまく挿入でき
、組換えpro−UKを高いレベルで製造できた。
【0073】しかしながら、組換えDNA誘導産物を製
造する国際的な指針に従うために、我々はpFC16を
改変して、高いレベルでpro−UK遺伝子を発現し得
るテトラサイクリン耐性プラスミドを作製した。特に、
公知のプラスミドpBR322[Maniatis,T
.,Fritsch.E.F.,Sambrook,J
.:Molecular cloning,A lab
oratory manual.Cold Sprin
g Harbour Laboratory.Cold
Spring Harbour,NY.1982]か
ら(図6)、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を使
用して付着端を充填したEcoRI−AvaI断片を単
離した[Perbal.B.,A.Wiley:Int
erscience Publication Joh
n Wiley and Sons,p.231,19
84]。この断片を、その端をDNAポリメラーゼIに
より平滑(blunt)末端とした、pFC16由来の
より大きなAatII−PvuI断片に連結させた[P
erbal,B.,A.Wiley−Intersci
ence Publication John Wil
ey and Sons,p.231,1984]。こ
うすることによって、β−ラクタマーゼ遺伝子及びその
調節配列のアミノ末端部分を、テトラサイクリン耐性遺
伝子と置換した。 連結後、テトラサイクリン耐性遺伝子は、pro−UK
遺伝子と同一方向であった。
造する国際的な指針に従うために、我々はpFC16を
改変して、高いレベルでpro−UK遺伝子を発現し得
るテトラサイクリン耐性プラスミドを作製した。特に、
公知のプラスミドpBR322[Maniatis,T
.,Fritsch.E.F.,Sambrook,J
.:Molecular cloning,A lab
oratory manual.Cold Sprin
g Harbour Laboratory.Cold
Spring Harbour,NY.1982]か
ら(図6)、DNAポリメラーゼIのクレノウ断片を使
用して付着端を充填したEcoRI−AvaI断片を単
離した[Perbal.B.,A.Wiley:Int
erscience Publication Joh
n Wiley and Sons,p.231,19
84]。この断片を、その端をDNAポリメラーゼIに
より平滑(blunt)末端とした、pFC16由来の
より大きなAatII−PvuI断片に連結させた[P
erbal,B.,A.Wiley−Intersci
ence Publication John Wil
ey and Sons,p.231,1984]。こ
うすることによって、β−ラクタマーゼ遺伝子及びその
調節配列のアミノ末端部分を、テトラサイクリン耐性遺
伝子と置換した。 連結後、テトラサイクリン耐性遺伝子は、pro−UK
遺伝子と同一方向であった。
【0074】さらに、予め充填したPvuIとEcoR
I部位との間の接続部に新しいEcoRI部位を作製し
た。
I部位との間の接続部に新しいEcoRI部位を作製し
た。
【0075】このようにして得られたプラスミドが、p
FC44である(図7)。
FC44である(図7)。
【0076】実施例2……E.coliタイプB株の形
質転換E.coliの幾つかのタイプB株が入手可能で
あり、COOH伸長pro−UK遺伝子の有効な発現用
に使用し得る。好ましい菌株は、ATCC 12407
、ATCC 11303及びNCTC 10537であ
る。以下は、菌株NCTC 10537をプラスミドp
PUK−Glyで形質転換し、次いで形質転換体を培養
する一例である。
質転換E.coliの幾つかのタイプB株が入手可能で
あり、COOH伸長pro−UK遺伝子の有効な発現用
に使用し得る。好ましい菌株は、ATCC 12407
、ATCC 11303及びNCTC 10537であ
る。以下は、菌株NCTC 10537をプラスミドp
PUK−Glyで形質転換し、次いで形質転換体を培養
する一例である。
【0077】MandelとHigaの塩化カルシウム
法を使用して、株NCTC 10537のコンピーテン
ト細胞を調製した[Mandel,M.及びHiga.
A.:J.Mol.Bio.53,p.154,197
0]。これらの細胞の調製物約200μl(1×109
細胞/ml)を、プラスミドDNA(約5μl/ml濃
度)2μlで形質転換した。形質転換体を、12.5μ
g/mlのテトラサイクリンを含むL−寒天プレート上
で選択した。2個の小さなコロニーを木製の楊枝で同一
の抗生物質を含むL−寒天上に画線接種した(各々約1
cm長の3つの画線)。12時間37℃で培養後、画線
部分を、LB培地(テトラサイクリンを2.5μg/m
l濃度で含む)10ml上に接種してGly伸長プロ−
ウロキナーゼの産生を試験し、37℃で一晩培養した。 翌日、培養物をテトラサイクリンの同一濃度を含むM9
培地中で1:100に希釈し、次いで37℃で6時間培
養した。
法を使用して、株NCTC 10537のコンピーテン
ト細胞を調製した[Mandel,M.及びHiga.
A.:J.Mol.Bio.53,p.154,197
0]。これらの細胞の調製物約200μl(1×109
細胞/ml)を、プラスミドDNA(約5μl/ml濃
度)2μlで形質転換した。形質転換体を、12.5μ
g/mlのテトラサイクリンを含むL−寒天プレート上
で選択した。2個の小さなコロニーを木製の楊枝で同一
の抗生物質を含むL−寒天上に画線接種した(各々約1
cm長の3つの画線)。12時間37℃で培養後、画線
部分を、LB培地(テトラサイクリンを2.5μg/m
l濃度で含む)10ml上に接種してGly伸長プロ−
ウロキナーゼの産生を試験し、37℃で一晩培養した。 翌日、培養物をテトラサイクリンの同一濃度を含むM9
培地中で1:100に希釈し、次いで37℃で6時間培
養した。
【図1】図1は、ヒトプロ−ウロキナーゼに特異的な5
個の合成プローブを示す。
個の合成プローブを示す。
【図2】図2は、完全長のプレ−プロ−ウロキナーゼc
DNAクローンの制限地図を示す。
DNAクローンの制限地図を示す。
【図3】図3は、pUN121及び、pUN121のS
maI−EcoRI部位にヒトプロ−ウロキナーゼcD
NAのSmaI−EcoRI断片を組み込んだpcUK
176を示す。
maI−EcoRI部位にヒトプロ−ウロキナーゼcD
NAのSmaI−EcoRI断片を組み込んだpcUK
176を示す。
【図4】図4は、完全長のヒトプロ−ウロキナーゼcD
NAのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
NAのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
【図5】図4(続き)は、完全長のヒトプロ−ウロキナ
ーゼcDNAのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
を示す。
ーゼcDNAのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
を示す。
【図6】図4(続き)は、完全長のヒトプロ−ウロキナ
ーゼcDNAのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
を示す。
ーゼcDNAのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
を示す。
【図7】図5は、pFC44を構築するために作製され
た中間体プラスミドpDS20、pAB1、pDR72
0及びpFC10の構成地図を示す。
た中間体プラスミドpDS20、pAB1、pDR72
0及びpFC10の構成地図を示す。
【図8】図6は、新規プラスミドpAB8、pFC16
及び公知プラスミドpBR322の構成地図を示す。
及び公知プラスミドpBR322の構成地図を示す。
【図9】図7は、プラスミドpFC44及びpPUK−
Glyの構成地図を示す。
Glyの構成地図を示す。
Claims (22)
- 【請求項1】 式(I): P−CONH2 (I)(式中
、Pはヒトプロ−ウロキナーゼ部分を表す)のヒトプロ
−ウロキナーゼのCOOH末端アミド化誘導体、または
、該誘導体分子のカルボキシ末端に先行する部分が改変
したヒトプロ−ウロキナーゼの改変体。 - 【請求項2】 COOH末端アミド化ヒトプロ−ウロ
キナーゼであることを特徴とする請求項1に記載の誘導
体。 - 【請求項3】 ヒトプロ−ウロキナーゼのCOOH末
端アミド化欠失、挿入または置換変異体であることを特
徴とする請求項1に記載の誘導体。 - 【請求項4】 式(II): P−Gly−Yn
(II)(式中、Pは請求項1に記載の意味を有
し、Glyはグリシン残基であり、Yは塩基性アミノ酸
残基であり、nは0または1〜4の整数である)を有す
ることを特徴とする請求項1に記載のヒトプロ−ウロキ
ナーゼのCOOH末端アミド化誘導体の前駆体。 - 【請求項5】 Pがヒトプロ−ウロキナーゼを表すこ
とを特徴とする請求項4に記載の前駆体。 - 【請求項6】 Pがヒトプロ−ウロキナーゼの欠失、
挿入または置換変異体を表すことを特徴とする請求項4
に記載の前駆体。 - 【請求項7】 Yがリシンまたはアルギニンであるこ
とを特徴とする請求項4〜6のいずれか1項に記載の前
駆体。 - 【請求項8】 YnがLys−Argであることを特
徴とする請求項4に記載の前駆体。 - 【請求項9】 YnがArg−Argであることを特
徴とする請求項4に記載の前駆体。 - 【請求項10】 請求項4に記載の式(II)の対応
前駆体を酵素変換することを含む請求項1に記載の式(
I)のCOOH末端アミド化誘導体の製造方法。 - 【請求項11】 請求項4に記載の式(II)(式中
、nが0である)の化合物を、アミド化酵素により酵素
変換することを含む請求項10に記載の方法。 - 【請求項12】 請求項4に記載の式(II)(式中
、nは1〜4の整数である)の化合物を、アミド化酵素
とカルボキシペプチダーゼBとの併合作用により酵素変
換することを含む請求項10に記載の方法。 - 【請求項13】 アミド化酵素がペプチジルグリシン
α−アミド化モノオキシゲナーゼであることを特徴とす
る請求項11または12に記載の方法。 - 【請求項14】 ヒトプロ−ウロキナーゼ遺伝子のオ
リゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行い、次いで、
変異した遺伝子を、好適な宿主微生物内で新規前駆体を
合成し得る好適な発現ベクター中に挿入することを含む
請求項4に記載の式(II)の前駆体を製造するための
組換えDNA法。 - 【請求項15】 発現ベクターがプラスミドpPUK
−Glyであり、宿主微生物がE.coliであること
を特徴とする請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 請求項4に記載の式(II)で定義
したプロ−ウロキナーゼ前駆体をコードする化学的に合
成したポリヌクレオチドを含む遺伝子。 - 【請求項17】 請求項16に記載の遺伝子を保有し
且つ、請求項4に記載の式(II)を有するプロ−ウロ
キナーゼ前駆体を合成し得る発現ベクター。 - 【請求項18】 発現ベクターpPUK−Gly。
- 【請求項19】 請求項17に記載の発現ベクターで
形質転換した単細胞生物または動物細胞。 - 【請求項20】 発現ベクターpPUK−Glyで形
質転換したE.coli宿主細胞。 - 【請求項21】 有効量の請求項1に記載のヒトプロ
−ウロキナーゼのCOOH末端アミド化誘導体と、医薬
上許容可能なキャリヤ及び/または希釈剤とを含む医薬
組成物。 - 【請求項22】 有効量の請求項4に記載の前駆体と
、医薬上許容可能なキャリヤ及び/または希釈剤とを含
む医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9015369.3 | 1990-07-12 | ||
GB909015369A GB9015369D0 (en) | 1990-07-12 | 1990-07-12 | Amidated fibrinolytic enzymes and their precursors,and processes for their preparation |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04252185A true JPH04252185A (ja) | 1992-09-08 |
Family
ID=10679005
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3196960A Pending JPH04252185A (ja) | 1990-07-12 | 1991-07-11 | アミド化繊維素溶解酵素及びその前駆体並びにその製造方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH04252185A (ja) |
DE (1) | DE4122688A1 (ja) |
GB (2) | GB9015369D0 (ja) |
IT (1) | IT1250653B (ja) |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0651761B1 (en) * | 1992-07-13 | 2002-10-09 | Bionebraska, Inc. | Method for modification of recombinant polypeptides |
US5656456A (en) * | 1992-07-13 | 1997-08-12 | Bionebraska, Inc. | Chemical method for selective modification of the N- and/or C-terminal amino acid α-carbon reactive group of a recombinant polypeptide or a portion thereof |
WO1996017941A2 (en) * | 1994-12-07 | 1996-06-13 | Bionebraska, Inc. | Production of c-terminal amidated peptides from recombinant protein constructs |
CA2426115A1 (en) * | 2003-04-18 | 2004-10-18 | Victor Gurewich | Methods, devices, and compositions for lysis of occlusive blood clots while sparing wound sealing clots |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8523156D0 (en) * | 1985-09-19 | 1985-10-23 | Celltech Ltd | Polypeptide production |
GB2220938B (en) * | 1988-07-20 | 1992-01-29 | Erba Carlo Spa | Use of pam enzyme in solid phase peptide synthesis |
-
1990
- 1990-07-12 GB GB909015369A patent/GB9015369D0/en active Pending
-
1991
- 1991-07-08 IT ITMI911877A patent/IT1250653B/it active IP Right Grant
- 1991-07-09 DE DE4122688A patent/DE4122688A1/de not_active Withdrawn
- 1991-07-10 GB GB9114846A patent/GB2246133A/en not_active Withdrawn
- 1991-07-11 JP JP3196960A patent/JPH04252185A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ITMI911877A1 (it) | 1993-01-08 |
IT1250653B (it) | 1995-04-21 |
GB2246133A (en) | 1992-01-22 |
ITMI911877A0 (it) | 1991-07-08 |
DE4122688A1 (de) | 1992-01-16 |
GB9015369D0 (en) | 1990-08-29 |
GB9114846D0 (en) | 1991-08-28 |
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