JPH04252185A - アミド化繊維素溶解酵素及びその前駆体並びにその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト繊維素溶解酵素プ
ロ−ウロキナーゼのＣ末端アミド化誘導体、その前駆体
、及び該前駆体を製造するための組換えＤＮＡ技術を含
むそれらの製造方法に係る。

【０００２】ヒトプロ−ウロキナーゼのＣ末端アミド化
誘導体として、天然型蛋白質またはその改変体例えば欠
失変異体、挿入変異体、及び置換変異体が本発明に包含
される。

【０００３】このようなアミド化誘導体は、塩基性アミ
ノ酸残基からなる短鎖が必要に応じて直後に結合しても
よい付加的グリシン残基がＣ末端に存在している適切な
前駆体を酵素処理することにより製造することができる
。

【０００４】本発明はまた、該前駆体をコードする構造
遺伝子、該遺伝子を含有するベクター、及び該ベクター
で形質転換された適切な宿主も包含する。

【０００５】

【発明の背景】生理学的繊維素溶解を制御する分子相互
作用に関する知識が増加するにつれて、凝血溶解機構の
理解が深まり、また新規血栓溶解剤の開発が進展した。

【０００６】ヒト繊維素溶解系に於いて、酵素前駆体、
即ちプラスミノーゲンは、幾つかの種類のプラスミノー
ゲン活性化因子によって活性化され得、活性酵素、即ち
プラスミンとなる［Ｃｏｌｌｅｎ　Ｄ．ら．，（１９８
６）ＣＲＣ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ
　ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，４（３）
２４９；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｍ．ら．，（１９８６
）Ｂｌｏｏｄ，６７（６）１５２９］。プラスミンは、
凝血のフィブリン成分を分解する主要なプロテアーゼで
ある［Ｒａｋｏｃｚｉ　Ｉ．ら．，（１９７８）Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５４０，２９５
；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．ら．，（１９６７）Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４２，２３３３；Ｗｉｍａｎ　Ｂ
．（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７６，１
２９］。

【０００７】しかしながら、プラスミンは、血液凝固経
路（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｐａｔｈｗａｙ）成分即
ちフィブリノーゲン、第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子のよ
うな幾つかの血漿蛋白質にもその蛋白質分解作用を及ぼ
し得るので、出血を起こしやすくしてしまう［Ｃｏｌｌ
ｅｎＤ．ら．，（１９８６）ＣＲＣ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ
　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａ
ｔｏｌｏｇｙ．４，（３）２４９；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔ
ｅ，Ｍ．ら．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ，６７（６）１
５２９；Ｗｉｍａｎ　Ｂ．ら．，（１９７９）Ｂｉｏｃ
ｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　５７９，１４２］
。

【０００８】プラスミノーゲン活性化が全身レベル（ｓ
ｙｓｔｅｍｉｃ　ｌｅｖｅｌ）で起きると、α２−プラ
スミン阻害物質によりプラスミンが迅速に中和されて循
環されるため、繊維素溶解に不適である［Ｃｏｌｌｅｎ
　Ｄら．，（１９８６）ＣＲＣ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏ
ｌｏｇｙ，４（３）２４９；Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｍ
．ら．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ，６７（６）１５２９
］。α２−プラスミン阻害物質のレベルが著しく減少す
るときには、プラスミンはそれほど迅速には中和されな
いので、フィブリンだけでなく前述の凝固蛋白質にもそ
の蛋白質分解作用を及ぼし得る。凝固過程、血小板凝集
及びフィブリン重合の際の幾つかのフィブリノーゲン分
解産物によって付与される阻害作用を伴って、血漿中の
フィブリノーゲン、第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子の濃度
が過度に低下すると、止血作用の低下を招き、続いて出
血する危険性を増大させる［Ｌａｔｔｌｏ　Ｚ．Ｓ．ら
．，（１９７３）Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｄｉａｔｈ．Ｈａ
ｅｍｏｕｈ　５６，２５３；Ｔｏｔｔｙ　Ｗ．Ｇ．ら．
，（１９８２）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　１４３，５９］。 他方、プラスミノーゲンの活性化がフィブリンレベルで
起こると（フィブリン結合プラスミノーゲン活性化）、
フィブリン結合プラスミンとなるが［Ｃｏｌｌｅｎ　Ｄ
．ら．，（１９８６）ＣＲＣ　Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅ
ｖｉｅｗｓ　ｉｎ　ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈｅｍａｔｏｌ
ｏｇｙ，４（３）２４９；Ｖｅｓｔｒａｅｔｅ，Ｍ，ら
．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ，６７（６）１５２９］、
このプラスミンはα２−プラスミン阻害物質によって中
和され、かなり少量となるため、全身的なフィブリノー
ゲン分解を誘起し得ない。

【０００９】従来のヒト血栓治療に於いて最も一般的に
使用されるプラスミノーゲン活性化因子であるウロキナ
ーゼ及びストレプトキナーゼは、フィブリンに対して特
異的な親和性を全く持たない。これらの化合物は共に、
比較的無差別に循環プラスミノーゲンまたはフィブリン
結合プラスミノーゲンを活性化する［Ｚａｍａｒｒｏｎ
　Ｃ．ら．，（１９８４）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓ
ｔａｓ．５２，１９；Ｓａｍａｍａ　Ｍ．ら．，（１９
８５）Ｓｅｍ．Ｈｏｐ．Ｐａｒｉｓ　６１（２０），１
４２３］。その結果、全身的な止血作用の崩壊がストレ
プトキナーゼ及びウロキナーゼを用いた治療の間にしば
しば起こるため、その立証済の臨床的効能にも拘らず、
高い出血危険性がそれら止血剤の広範な臨床使用を妨げ
てきた［ＳａｍａｍａＭ．ら．，（１９８５）Ｓｅｍ．
Ｈｏｐ．Ｐａｒｉｓ　６１（２０），１４２３；Ｍａｉ
ｚｅｌ，Ａ．Ｓら．，（１９８６）Ｃａｒｄｉｏｖａｓ
ｃ，Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．Ｒａｄｉｏｌ，９，２３６；
Ｂｅｌｌ　Ｗ．Ｒ．ら．，（１９７６）Ｔｈｒｏｍｂ．
Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．３５，５７；Ａｃａｒ　Ｊ．ら．
，（１９８７）Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂ
．ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔ．１３（２）１８６：Ｇｒｕ
ｐｐｏ　Ｉｔａｌｉａｎｏ　ｐｅｒ　ｌｏ　ｓｔｕｄｉ
ｏ　ｄｅｌｌａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｈｉｎａｓｉ　ｎｅ
ｌｌ’ｉｎｆａｒｔｏ　ｍｉｏｃａｒｉｃｏ（ＧＩＳＳ
Ｉ）（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ　１，３９７］。

【００１０】これに対して、組織型のプラスミノーゲン
活性化因子（ｔ−ＰＡ）［Ｈｏｙｌａｅｒｔｓ　Ｍ．ら
．，（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７（６
）２９１２］及びごく最近見出されたプロ−ウロキナー
ゼ（ｐｒｏＵＫ）［Ｈｕｓａｉｎ　Ｓ．Ｓ．ら．，（１
９８３）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
２２０，３１］の天然型蛋白質は、循環プラスミノーゲ
ンの弱い活性化因子であり且つ逆にフィブリン結合プラ
スミノーゲンの強い活性化因子であることが知見された
。

【００１１】全身的なプラスミノーゲンとα２−プラス
ミン阻害物質の消費並びにフィブリノーゲン分解が、“
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ”及び“ｉｎ　ｖｉｖｏ”実験で研究
動物体内で僅かながら起こることが明らかになった。

【００１２】従って、これらの蛋白質は共に、血栓症の
患者に対し、低い出血発生率でストレプトキナーゼ及び
ウロキナーゼよりもずっと効率的な血栓溶解効果を誘発
するようにデザインされてきた。

【００１３】ｔ−ＰＡのフィブリン特異的血栓溶解活性
は、ｔ−ＰＡ分子の、ジスルフィドによって結合された
三重の『クリングルドメイン（ｋｒｉｎｇｌｅ　ｄｏｍ
ａｉｎｓ）』に位置する特異的リシン結合部位を介する
フィブリンとの結合能によって説明されてきた。従って
フィブリン結合プラスミノーゲンは、止血作用をひどく
弱められることなく活性化されることが可能となった［
Ｃｏｌｌｅｎ　Ｄ．ら．，（１９８６）Ｈａｅｍｏｓｔ
ａｓｉｓ，１６（３），２５］。他方、ｐｒｏＵＫ（１
本鎖のウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性化因子、
即ちｓｃｕ−ＰＡとも呼称される）はフィブリンには結
合しないが、全身的に止血作用を消失させることなくフ
ィブリン特異的血栓溶解能を示す［Ｐａｎｎｅｌｌ　Ｒ
．ら．，（１９８６）Ｂｌｏｏｄ　６７，１２１５；Ｇ
ｕｒｅｗｉｃｈ　Ｖ．ら．，（１９８７）Ｓｅｍｉｎａ
ｒｓ　ｉｎ　Ｔｈｒｏｍｂ．ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔ．
１３（２），１４６；Ｌｉｊｎｅｎ　Ｈ．Ｒ．ら．，（
１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，１２５３
］。

【００１４】これらの蛋白質をコードするヒト遺伝子の
単離及び特性、並びに組換えＤＮＡ法による該蛋白質の
産生の研究がさらに為されてきた［Ｃｏｌｌｅｎ　Ｄ．
ら．，（１９８４）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．
Ｔｈｅｒ．２３１（１），１４６；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．
Ｅ．ら．，（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　
３，９２３］。組換えｔ−ＰＡを、急性心筋梗塞患者の
マルチセンター臨床試験に使用した結果、閉塞した冠動
脈の再疎通に於いてストレプトキナーゼよりもかなり効
果的であることが明らかとなった［Ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐ
ｅａｎ　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ　Ｓｔｕｄｙ　Ｇｒｏ
ｕｐ　ｆｏｒ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｔｉｓｓｕｅ
−ｔｙｐｅ　Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　Ａｃｔｉｖａｔ
ｏｒ（１９８５）Ｌａｎｃｅｔ，１，８４２；Ｓｈｅｅ
ｈａｎＦ．Ｈ．ら．，（１９８７）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉ
ｏｎ　７５，（４），８１７］。

【００１５】プロ−ウロキナーゼは、現在フェイズＩＩ
の臨床試験中であり、血栓溶解活性及び安全性の点で、
少なくともｔ−ＰＡと同様の効果があると考えられてい
る［Ｖａｎ　ｄｅＷｅｒｆ　Ｆ．ら．，（１９８６）Ａ
ｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｅｃｉｎ
ｅ，１０４，３４５；Ｖａｎ　ｄｅ　Ｗｅｒｆ　Ｆ．ら
．，（１９８６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７４（５）
，１０６６］。

【００１６】多くの生物学的に活性なペプチドが、アミ
ド化によってそのＣＯＯＨ末端で保護され、その多くの
場合アミド化は、レセプター認識及び／または生物活性
に重要である［Ｊ．Ｆ．Ｒｅｈｆｅｌｄ（１９８１）Ａ
ｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４０，６２５１−６２６６
］。ＣＯＯＨ末端のアミド化（または、α−アミド化）
は、多くのカルボキシペプチダーゼに対する安定性を付
与し、半減期を延長し、且つ生物活性、レセプター選択
性、細胞透過性、組織分布などを変化させ得る［Ｇ，Ｓ
，Ｗａｎｄら．，（１９８５）Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．４１，４８２−４８９］。

【００１７】α−アミド化は、真核生物に於ける分泌ペ
プチドの翻訳後修飾のひとつを表す。この修飾は、ＣＯ
ＯＨ末端のグリシン伸長ペプチドを、グリオキシル酸の
形成を伴って対応する脱（ｄｅｓ）グリシンα−アミド
化ペプチドに変換させるペプチジルグリシンα−アミド
化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）と呼称される酵素によ
って実施され得る［Ａ．Ｆ．Ｂｒａｄｂｕｒｙら．，（
１９８２），Ｎａｔｕｒｅ，２８９，６８６−６８８］
。触媒反応は酸素存在下に起こり、且つ銅カチオン及び
アスコルビン酸塩（ａｓｃｏｒｂａｔｅ）を補助因子と
して要求する［Ｂ．Ｅｉｐｐｅｒら．，（１９８３），
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０
，５１４４ー５１４８］。

【００１８】生合成法に於いては、Ｇｌｙ伸長ペプチド
（α−アミド化酵素用の基質）は、特異的カルボキシペ
プチダーゼＢ様プロテアーゼによる蛋白質分解によって
前駆体分子から生成される。この前駆体は、該ペプチド
のＧｌｙ伸長末端直後に１〜４個の付加的塩基性アミノ
酸残基をもつ［Ｒ．Ｅ．Ｍａｉｎｓら．，（１９８３）
Ｔ．Ｉ．Ｎ．Ｓ．２２９−２３５］。塩基性残基は、特
異的α−アミド化酵素（類）の認識に寄与し及び／また
はアミド化機構に関係すると示唆されてきた［Ｓ．Ｇｏ
ｍｅｚら．，（１９８４）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．１６７
，１６０−１６４］。

【００１９】

【発明の詳細】本発明は、ヒト繊維素溶解酵素プロ−ウ
ロキナーゼのＣＯＯＨ末端アミド化誘導体、その前駆体
及び、前記前駆体を製造するための組換えＤＮＡ技術を
含むそれらの製造方法に関する。前記前駆体をコードす
る構造遺伝子、前記遺伝子を含むベクター及び、前記ベ
クターで形質転換した好適な宿主も本発明の範囲内に含
まれる。

【００２０】本発明の第１の目的は、式（Ｉ）：Ｐ−Ｃ
ＯＮＨ２　　　　　　　　　（Ｉ）（式中、Ｐはヒトプ
ロ−ウロキナーゼ部分を表す）を有するヒトプロ−ウロ
キナーゼのＣＯＯＨ末端アミド化誘導体または、該誘導
体分子のカルボキシ末端に先行する部分が改変したヒト
プロ−ウロキナーゼの改変体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ）である。

【００２１】プロ−ウロキナーゼ改変体は、例えばプロ
−ウロキナーゼの欠失、挿入または置換変異体であり得
る。

【００２２】本発明のもう１つの目的は、式（ＩＩ）：
Ｐ−Ｇｌｙ−Ｙｎ　　　　　　　　　　　　　　　　（
ＩＩ）（式中、Ｐは上述の定義通りであり、Ｇｌｙはグ
リシン残基であり、Ｙは塩基性アミノ酸残基であり、ｎ
は０または１〜４の整数である）を有する、式（Ｉ）の
ＣＯＯＨ末端アミド化誘導体の前駆体によって表される
。

【００２３】ｎが２〜４の整数であるとき、Ｙ残基は等
しくても異なっていてもよい。

【００２４】例えば、ｎが２であるとき、Ｙｎは例えば
Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒｇを表し得る。

【００２５】本発明のさらにもう１つの目的は、式（Ｉ
Ｉ）に於いて定義した前駆体を酵素変換することを含む
、式（Ｉ）のＣＯＯＨ末端アミド化誘導体を製造する方
法である。

【００２６】これらは、（ｎが０でないときに）例えば
カルボキシペプチダーゼＢでＹｎ伸長前駆体を蛋白質分
解してＹｎ塩基性アミノ酸残基を除去した後、例えば天
然または組換えペプチジル−グリシンα−アミド化モノ
オキシゲナーゼ（ＰＡＭ）などのアミド化酵素の作用に
よって、対応するアミド化ポリペプチドに変換し得る。

【００２７】さらに、本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏアミド
化用の可能な前駆体として式（ＩＩ）の化合物を製造す
るための組換えＤＮＡ法も包含する［Ｇ．Ｇａｆｖｅｌ
ｉｎら．，（１９８４）ＦＥＢＳ．Ｌｅｔｔ．１８４，
３４７−３５２］。

【００２８】この方法に従って、プロ−ウロキナーゼ遺
伝子のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行い、
次いで変異した遺伝子を、適当な宿主微生物中で新規前
駆体を合成し得る好適な発現ベクター中に挿入すること
によって前記前駆体を製造する。

【００２９】本発明のさらにもう１つの目的は、式（Ｉ
Ｉ）によって表されるアミノ酸配列をコードする化学的
に合成したポリヌクレオチドを含む遺伝子によって構成
される。

【００３０】１つ以上の態様に於いては、本発明は、前
記遺伝子を保有し、且つ式（ＩＩ）に定義されたプロ−
ウロキナーゼ前駆体を合成し得る発現ベクターに関する
。

【００３１】本発明は、前記発現ベクターで形質転換し
た宿主微生物及び、この宿主微生物を用いる式（ＩＩ）
の前駆体の製造にも関する。

【００３２】式（Ｉ）の化合物または式（ＩＩ）の化合
物及び１種以上の医薬上許容可能なキャリヤ及び／また
は希釈剤及び／または賦形剤を含む医薬組成物も同様に
本発明の範囲内に含まれる。

【００３３】前記組成物は、慣用成分及び慣用手順を使
用して従来法で製造し得る。プロ−ウロキナーゼ（ｐｒ
ｏＵＫ）は、多くの蛋白質と同様に、末端が遊離カルボ
ン酸である、４１１個のアミノ酸残基のセリン−プロテ
アーゼである［Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．Ｅ．ら．（１９８５
）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３，９２３］。本発明
によると、プロ−ウロキナーゼは、組換え技術により製
造された化合物であるのが好ましい。最後のアミノ酸残
基がロイシンであるため、プロ−ウロキナーゼはＰＡＭ
酵素によりアミド化できない。従ってｐｒｏＵＫをこの
方法によってアミド化した状態で得るためには、Ｃ末端
にグリシン残基を付加することが不可欠である。

【００３４】

【好ましい実施態様の説明】ａ）式（ＩＩ）のアミド化
前駆体の組換えＤＮＡ法による製造 式（Ｉ）のアミド化したプロ−ウロキナーゼ誘導体の前
駆体、即ち式（ＩＩ）の化合物を、プロ−ウロキナーゼ
遺伝子のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によっ
て製造した。

【００３５】あるいは、プロ−ウロキナーゼの欠失、挿
入または置換変異体をコードする遺伝子、例えば欧州特
許出願第３３８４０９号に記載されているような遺伝子
を、出発物質としても使用し得る。

【００３６】突然変異誘発法の原理は、例えばファージ
ベクターＭ１３などの１本鎖型で得ることができるベク
ターに、プロ−ウロキナーゼまたは変異遺伝子をサブク
ローニングさせることである。組換体１本鎖を、ＣＯＯ
Ｈ伸長コード配列を含む相補的な合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドでアニールした。ＤＮＡポリメラーゼ及
びリガーゼを用いて、新規ストランドを伸長し、次いで
環状形に結合した。この新規に作製したヘテロ二重鎖Ｄ
ＮＡを使用して細胞系を形質転換した。この細胞系内で
は、該ＤＮＡが複製され、子孫を生産させ、元のｐｒｏ
ＵＫ遺伝子または所望の挿入物を含む遺伝子を持つファ
ージを２つの異なる分子種に分離する。出発物質である
変異性オリゴヌクレオチドを、新規に合成した前駆体遺
伝子を認識するためのプローブとして使用した。この方
法は、より多くの実験の詳細内容が得られる文献中に詳
しく記載されている［Ｚｏｌｌｅｒ　Ｍ．Ｊ．ら．，（
１９８２）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ　１０１，６４８７］。

【００３７】次いで前駆体遺伝子を、　好適な宿主微生
物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓな
どの原核生物または、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなどの
真核細胞、昆虫または哺乳類細胞系など）中の新規ｐｒ
ｏＵＫ誘導体を合成し得る好適な発現ベクターに挿入し
た。

【００３８】前駆体遺伝子を保有する得られた形質転換
体を培養して、変異体を発現させた。標準技術を使用し
て、我々はｐｒｏＵＫ変異体を抽出且つ精製し、アミド
化反応用の基質として使用した。

【００３９】バクテリア、特に例えばＥ．ｃｏｌｉを、
宿主微生物とするのが好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現
させるために、我々は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＷＯ９
０／０４０２３号に記載した、以下の実施例１でその構
築を報告するプラスミドｐＦＣ４４を使用した。このプ
ラスミドを、図７に示す。伝統的な遺伝子操作技術［Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　Ｔ．ら．，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕ
ｒ］を使用して、我々はｐＦＣ４４中に挿入したｐｒｏ
ＵＫ野生型遺伝子を、ＣＯＯＨ伸長プロ−ウロキナーゼ
をコードする変異遺伝子で置換した。

【００４０】特定の一態様に於いて、本発明は、欠失、
挿入または置換プロ−ウロキナーゼ誘導体をコードする
プロ−ウロキナーゼ野生型遺伝子またはその変異体が、
グリシン伸長変異体をコードする新規遺伝子で置換され
た、ｐＰＵＫ−Ｇｌｙと呼称される新規プラスミドを提
供する。

【００４１】Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞中に挿入し、次いで
得られた形質転換体を増殖後、該変異体の高レベルの発
現を得た。形質転換及び増殖条件は、国際特許出願第Ｐ
ＣＴ／ＷＯ９０／０４０２３号に既に記載した条件及び
以下の実施例２に記載した条件と同じである。

【００４２】標準技術を使用して、ｐｒｏＵＫ変異体を
抽出、精製し、アミド化酵素用の基質として使用した。

【００４３】Ｇｌｙ伸長プロ−ウロキナーゼ前駆体［式
（ＩＩ）、ｎ＝０］の製造で使用した技術と同一技術に
よって、Ｃ末端に付加的塩基性残基を保持する前駆体［
式（ＩＩ）、ｎ＝１〜４］も製造できた。例えば、以下
の特定分子： ｐｒｏＵＫ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　　　　及び　　
　　ｐｒｏＵＫ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｒｇが得られた。

【００４４】この場合、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞中で発現させ
るためには、前記前駆体をコードする遺伝子を、ｐｒｏ
ＵＫ野生型遺伝子のかわりにプラスミドｐＦＣ４４に挿
入した。

【００４５】ｂ）ｐｒｏ−ＵＫ−Ｇｌｙ−Ｙｎ−　　か
ら　　ｐｒｏ−ＵＫ−ＮＨ２への酵素的転換 ｐｒｏ−ＵＫ−Ｇｌｙ−Ｙｎ−ＯＨ前駆体を、カルボキ
シペプチダーゼＢ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　　Ｍａｎｎ
ｈｅｉｍ）（Ｅ／Ｓ，１：２０００重量比）の存在下に
（ｎは０ではない）または非存在下に（ｎは０である）
、例えば、ラット髄甲状腺癌からのＰＡＭ酵素［Ｎ．Ｍ
．Ｍｅｈｔａら（１９８８）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６１，４４−５４］または、この
腫瘍から誘導した細胞のならし培地からのＰＡＭ酵素［
Ｊ．Ｐ．Ｇｉｌｌｉｇａｎら（１９８９）Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．１２４，２７２９−２７３６］などのＰＡＭ
酵素の半精製したプロテアーゼを含まない調製物とイン
キュベートした。

【００４６】酵素反応を、銅イオン、アスコルビン酸塩
、カタラーゼ、ヨウ化カリウム、ＳＤＳ及びＴｗｅｅｎ
２０を含む例えばＴＥＳ（ｐＨ７）などの水性緩衝液中
で実施した。

【００４７】あるいは、アミド化をＳ−スルホン化Ｐｒ
ｏ−ＵＫ−Ｇｌｙ−Ｙｎで実施したが、ＳＤＳの添加は
必要なかった。

【００４８】総ての場合に於いて、アミド化の程度は、
ニトロソベンゼンを用いた誘導反応後、グリオキシル酸
の測定に基づいた『Ｃｏｒｂｅｔｔ　ａｎｄ　Ｃｏｒｂ
ｅｔｔ法』［Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９８０），４
５，２８３４−２８３９］で測定した。アミド化した生
成物を従来法で精製した。

【００４９】Ｃ末端の正確さ（ｃｏｒｒｅｃｔｎｅｓｓ
）は、カルボキシペプチダーゼＹ（ＣＰ−Ｙ）処理（Ｌ
ｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ及びＡｓｎの放出）によって確認
した。ＣＰ−Ａでの処理に於いてはアミノ酸の放出は観
察されず、総ての生成物がアミド化されていることが確
認された。

【００５０】類似の方法によって、アミド化を、先のａ
）に於いて述べたプロ−ウロキナーゼの欠失、挿入及び
置換変異体に於いて実施した。

【００５１】ｃ）生物学的活性 式（Ｉ）または式（ＩＩ）で定義した化合物を使用して
、プロ−ウロキナーゼが活性である、例えば急性心筋梗
塞、肺塞栓症または深静脈血栓症などに於ける同一治療
分野に於いて適用すると有用であることが知見し得る。 天然型プロ−ウロキナーゼと同様、本発明のアミド化誘
導体及びその前駆体は、循環プラスミノーゲンよりも、
凝血中のフィブリンに結合したプラスミノーゲンに対し
より強い親和性を有し、従って高い血栓選択性を特徴と
し、治療に付随する出血の危険性を低下させる。さらに
、ＣＯＯＨ末端アミド化化合物は、対応する非アミド化
酵素よりも例えば、殆どのカルボキシペプチダーゼに対
する増大した安定性及び延長した半減期などの改善され
た特性を示すことができる。

【００５２】式（ＩＩ）に定義された化合物、特に式（
ＩＩ）（式中、ｎが１〜４の整数である）の化合物は、
ｉｎ　ｖｉｖｏアミド化用の可能な前駆体であり得る。

【００５３】

【実施例】実施例１……プラスミドｐＦＣ４４の構築発
現プラスミドｐＦＣ４４を得るために、以下のステップ
を実施することが必須である。

【００５４】１）プロ−ウロキナーゼをコードするヒト
ｃＤＮＡ遺伝子のクローニング ヒトプロ−ウロキナーゼをコードするｃＤＮＡクローン
を得るために、本発明者らは、文献中に記載されている
蛋白質配列データを用いた［Ｇｕｎｚｌｅｒ，Ｗ．Ａ．
，Ｓｔｅｆｆｅｎｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｏｅｔｔｉｎｇ，Ｆ．
，Ｋｉｍ，ＳＭ．Ａ．，Ｆｒａｎｋｕｓ．Ｅ．，及びＦ
ｌｏｈｅ，Ｌ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ．Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６３，ｐ．１１５５，１
９８２；Ｇｕｎｚｌｅｒ，Ｗ．Ａ．，Ｓｔｅｆｆｅｎｓ
，Ｇ．Ｊ．，Ｏｅｔｔｉｎｇ，Ｆ．，Ｂｕｚｅ，Ｇ．，
及びＦｌｏｈｅ，Ｌ．：Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ’ｓ
　Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６３，ｐ．１３３
，１９８２；Ｓｔｅｆｆｅｎｓ，Ｇ．Ｊ．，Ｇｕｎｚｌ
ｅｒ，Ｗ．Ａ．：Ｏｅｔｔｉｎｇ，Ｆ．，Ｆｒａｎｋｕ
ｓ，Ｅ．，及びＦｌｏｈｅ，Ｌ．：Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙ
ｌｅｒ’ｓ　Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６３
，Ｐ．１０４３，１９８２］。

【００５５】これにより特定のプローブを調製し、好適
なｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１本鎖
ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｐｒｏ−
ＵＫ）の選択ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド
を化学的に合成し［Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｇ
ａｓｓｅｎ，Ｈ．Ｇ．及びＬａｎｇ，Ｊ．Ａ．ら編著、
Ｖｅｒｌａｇ−Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｄｅ
ｅｆｉｅｌｄ　Ｂｅａｃｈ．Ｂａｓｅｌ，ｐ．７１，１
９８２］、これを、ｐｒｏ−ＵＫ　ｍＲＮＡの集積物を
モニターするための特異的なプローブとして用い、且つ
集積されたｃＤＮＡライブラリーからプロ−ウロキナー
ゼを含むクローンを選択した。オリゴマーは、長さ１４
〜１７マー（ｍｅｒ）であり、各々を、図１に示したよ
うな非反復配列（ｐ７と呼称）としてまたはオリゴヌク
レオチドを２個（ｐ１、ｐ２及びｐ３と呼称）若しくは
１６個（ｐ１６と呼称）含むプールとして合成した。オ
リゴマーをノーザンハイブリダイゼーションによってｐ
ｒｏ−ＵＫに対する特異性を試験した。この分析用に、
ポリＡ含有ＲＮＡを、ＨＥｐ−３　偏平上皮癌（ｅｐｉ
ｄｅｒｍｏｉｄ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ）から抽出した［
Ｍｉｓｋｉｎ，Ｒ．，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ（スイス
），１１，ｓｕｐｐｌ１，ｐ．６３，１９８２］。各オ
リゴマーについて、ハイブリダイゼーション反応後の洗
浄温度を、サザンブロットに対するハイブリダイゼーシ
ョン用にＳｕｇｇｓらに従って計算されるように、最小
融解温度よりも２〜５℃低くなるように調整した［Ｓｕ
ｇｇｓ，Ｓ．Ｖ．，Ｈｉｒｏｓｅ，Ｔ．，Ｍｉｙａｋｅ
．，Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｅ．Ｇ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ　
Ｍ．Ｙ．，Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．及びＷａｌｌａｃｈ，
Ｐ．Ｂ．：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙＵｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ；Ｂｒｏ
ｗａｎ　Ｄ．Ｄ．及びＦｏｘ，Ｃ．Ｆ．編著，Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐ．６３８
，１９８１］。 本明細書に於いて、図１に示される５つのｐｒｏ−ＵＫ
プローブは、ｐｒｏ−ＵＫのｍＲＮＡサイズと思われる
約２．３ｋｂの１つの共通の主要な癌ｍＲＮＡバンドと
反応した。

【００５６】ＨＥｐ−３偏平上皮癌からのｍＲＮＡに富
む画分を使用してクローニングを実施した。ＲＮＡ調製
物を抽出し、２回の連続蔗糖密度勾配遠心により約３倍
に濃縮した。プライマーとしてオリゴ−ｄＴを使用して
、ｃＤＮＡを公知文献の方法に従って合成した［Ｅｆｓ
ｔｒａｔｉａｄｉｓ，Ａ．，Ｋａｆａｔｏｓ，Ｆ．Ｃ．
，Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．：
Ｃｅｌｌ，７，ｐ．２７９，１９７６；Ｂｕｅｌｌ，Ｇ
．Ｎ．，Ｗｉｃｋｅｎｓ，Ｍ．Ｐ．，Ｐａｙｖａｒ，Ｆ
．及びＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．Ｊ．：Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５３，ｐ．２４７１，１９７８］。長い分子を
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して単離し、次
いで好適なゲル画分を電気−溶離（ｅｌｅｃｒｏ−ｅｌ
ｕｔｉｏｎ）した。ｃＤＮＡを標準フェノール／クロロ
ホルム抽出、次いでエタノール沈澱を利用して抽出した
。

【００５７】これらのｃＤＮＡ分子をまずＥｃｏＲＩリ
ンカーと連結させ、次いでＤａｖｉｓ法の改良方法に従
ってファージλ−ｇｔ１０ベクター中にクローニングし
た［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．
，Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌ
ｏｎｉｎｇ．Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ
，Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ
，ＮＹ，１９８２］。このように実施することにより、
２×１０５ｐｆｕ（プラーク形成単位）を含むライブラ
リーを形成した。

【００５８】ライブラリーの半分を、二重フィルター上
で即ちひとつのフィルター上では３２Ｐでラベルしたプ
ローブｐｌで、もうひとつのフィルター上ではプローブ
ｐ３とｐ６の混合物でスクリーニングした。全部で３６
の陽性クローンを得、その内の７つは二重フィルターで
陽性であり、このようにｃＤＮＡ挿入物がｐｒｏ−ＵＫ
コード配列の大部分と対応していることを示した。

【００５９】３つのプローブとハイブリダイズした組換
体ファージは、プローブｐｌを使用して精製されるプラ
ークであり、さらにＥｃｏＲＩを用いて制限マッピング
することによって及びＤＮＡシーケンシングすることに
よって特徴付けられた。全ｃＤＮＡライブラリー中の陽
性クローン画分は、ＨＥｐ−３癌中のプロ−ウロキナー
ゼｍＲＮＡの出現率（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）がほぼ０．
０１％であることを示している。

【００６０】４つのｐｒｏ−ＵＫ　　ｃＤＮＡクローン
の配列分析から、クローンの内３つが欠失を有している
か、またはプロ−ウロキナーゼ酵素のアミノ酸配列と一
致しない配列を有していることが分かった。ただ１つの
クローン（λ−Ｕｃ１７）が、公知のアミノ酸配列と完
全に一致した配列を有していた。

【００６１】しかしながらλ−Ｕｃ１７は、ｍＲＮＡの
完全な３’非コード末端を含まず、コード配列の３０個
のヌクレオチドを欠いていた。完全長のプレ−プロ−ウ
ロキナーゼｃＤＮＡクローンは、５’非コード領域及び
コード配列の大部分を含む１３２５　ｂｐλ−Ｕｃ１７
　ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ断片と、もうひとつのクローン
λ−Ｕｃ６由来の３’領域欠失残部を含むＢａｍＨＩ−
ＥｃｏＲＩ断片との連結によって構築された（図２）。

【００６２】この構築物を、このようにｃＩ遺伝子の殆
どを欠くプラスミドベクターｐＵＮ１２１のＳｍａＩ−
ＥｃｏＲＩ部位に連結させ［Ｎｉｌｓｓｏｎ　Ｂ．，Ｕ
ｈｌｅｎ　Ｍ．，Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ　Ｓ．，Ｇａｔｅ
ｎｂｅｃｋ　Ｓ．及びＰｈｉｌｉｐｓｏｎ　Ｌ．：Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１，ｐ．
８０１９，１９８３］、これをｐｃＵＫ１７６と命名し
た（図３）。

【００６３】完全なｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列を図
４に示す。５’末端に６９非コードヌクレオチド、１２
９６コードヌクレオチド、及び３’末端に９３１非コー
ドヌクレオチドを含む２２９６ヌクレオチドと、その後
に続く８０残基以上のポリ（Ａ）尾部とからなる。コー
ド配列は、『プレ−プロ−ウロキナーゼ』を含む２０個
のアミノ酸をコードする６０ｂｐで開始し［Ｈｅｙｎｅ
ｋｅｒ，Ｈ．Ｌ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｗ．Ｅ．及びＶｅｈ
ａｒ，Ｇ．Ａ．（１９８３）；欧州特許出願公開第００
９２１８２号］、その後にアミノ酸配列が完全に一致す
るプロ−ウロキナーゼ蛋白質全体をコードする配列が続
く。完全な断片を、配列及び制限分析によって確認した
。成熟プロ−ウロキナーゼをコードする配列を産生に使
用する発現ベクター中に挿入した。

【００６４】２）ｐｒｏ−ＵＫ発現プラスミドの構築ｐ
ｃＵＫ　１７６中に存在する元の完全長のｃＤＮＡを使
用して、ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子が、各々プロモーターＰｔ
ｒｐと、“Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ”配列ＭＳ−
２との転写及び翻訳制御下にあるプロ−ウロキナーゼ発
現プラスミド、即ちｐＦＣ４４を構築した。プラスミド
ｐＦＣ４４を、図７に示す。

【００６５】ｐＦＣ４４を得るために、幾つかの中間体
プラスミドを構築した。ｐＤＳ２０から出発して［Ｄｕ
ｅｓｔｅｒ，Ｇ．，Ｈｅｌｆａｒｄ．Ｒ．Ｍ．及びＨｏ
ｌｍｅｓ，Ｗ．Ｍ．：Ｃｅｌｌ　３０，．８５５，１９
８２］、まずガラクトースオペロンプロモーターＰｇａ
ｌをコードするＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、Ｍ
１３　ｍｐ８ベクターからのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩ
Ｉポリリンカー配列で置換し［Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．及び
Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｉ：Ｇｅｎｅ，１９，ｐ．２５９，１
９８２］、新規なプラスミドを得、これをｐＡＢ１と命
名した（図５）。

【００６６】プロモーターＰｔｒｐを、ＥｃｏＲＩ−Ｓ
ａｌＩ制限断片としてプラスミドｐＤＲ７２０（ファル
マシア製）から得た。 この断片を、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ部位の間のｐＡＢ１
ポリリンカー領域に挿入した。こうすることによって、
新規プラスミドを得、これをｐＦＣ１０と命名した（図
５）。ｐＦＣ１０はベースベクターと考えることができ
、これに、ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子並びに、ファージＭＳ−
２からの“Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ”配列を挿入
した。

【００６７】成熟プロ−ウロキナーゼを発現させるため
に、ｐｒｏ−ＵＫコード配列、成熟蛋白質の第１コドン
からイニシエータートリプレットＡＴＧまで、を融合さ
せることが必要である。このとき、“Ｓｈｉｎｅ−Ｄａ
ｌｇａｒｎｏ”配列の後に該融合物を配置しなくてはな
らない。

【００６８】バクテリアファージＭＳ−２由来のリボソ
ーム結合部位（ＲＢＳ）は公知であり、そのヌクレオチ
ド配列は既に報告済みである［Ｆｉｅｒｓ，Ｗ．，Ｃｏ
ｎｔｒｅｒａｓ，Ｒ．，Ｄｕｅｒｉｎｃｋ，Ｆ．，Ｈａ
ｅｇｅｍａｎ，Ｇ．，Ｉｓｅｒｅｎｔａｎｔ，Ｄ．，Ｍ
ｅｒｒｅｇａｅｒｔ，Ｊ．，Ｍｉｎ　Ｊｏｕ，Ｗ．，Ｍ
ｏｌｅｍａｎｓ，Ｆ．，Ｒａｅｙｍａｅｋｅｒｓ　Ａ．
，Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇｈｅ，Ａ．，Ｖｏｌｃｋａ
ｅｒｔ，Ｇ．及びＹｓｅｂａｅｒｔ．Ｍ．：Ｎａｔｕｒ
ｅ，２６０，ｐ．５００（１９７６）］。

【００６９】ＲＢＳは、ｍＲＮＡの効率的な翻訳のため
の、強力なシグナルであると考えられている。従って、
この領域をｐｒｏ−ＵＫの製造用の翻訳シグナルとして
選択した。ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子と正しいヌクレオチド融
合させるために、ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子の開始部位に直接
結合させたＭＳ−２　ＲＢＳの二重鎖ＤＮＡ領域を合成
した。ＴａｑＩ部位は、成熟ｐｒｏ−ＵＫ配列の２５番
目のヌクレオチド上にある。本発明者らは、この部位を
利用し、化学合成によって、上流にＨｉｎｄＩＩＩ部位
を配置し、且つ下流にＴａｑＩ部位を配置する以下のＤ
ＮＡ配列： 　　　　　　　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ＭｅｔＳｅｒ　　　　　　　５’−ＡＧＣＴＴＴＡＡ
ＴＡＧＡＣＧＣＣＧＧＣＣＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＧ
ＧＡＴＴＡＣＣＣＡＴＧＡＧＣＡ　　　　　　　　　　
　３’−ＡＡＴＴＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＴＡＡＧＴ
ＴＴＧＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＴ　　
　　　　　　　　　　　　　　　ＴａｑＩＡＴＧＡＡＣ
ＴＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＣＣＡＴ−３’ＴＡＣＴＴＧＡ
ＡＧＴＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＡＧＣ−５’ を単離した。イニシエーターコドンＡＴＧを太字で示す
。成熟ｐｒｏ−ＵＫ配列の開始部位をコードする配列に
下線を引いた。

【００７０】合成断片を以下の２つの制限断片：……ヌ
クレオチド１５５からヌクレオチド３９２までのｐｒｏ
−ＵＫ配列を保持する、ｐｃＵＫ１７６（図３）からの
ＴａｑＩ−ＢｇＩＩＩ断片（図４参照）と、 ……アンピシリンに対する抗生物質耐性遺伝子とプロモ
ーターＰｔｒｐとを保持するｐＦＣ１０（図５）からの
大きなＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片との連結反応に
使用した。

【００７１】この構築を経て、我々は新規プラスミドを
単離し、これをｐＡＢ８と命名し、その構成地図を図６
に示した。このプラスミドに於いて、プロモーターＰｔ
ｒｐ及びＭＳ−２ＲＢＳを成熟ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子の最
初の２６０ヌクレオチド（図４中のヌクレオチド１３１
〜３９１に対応）に融合した。 さらに、ｐＡＢ８はただ１つのＮｃｏＩ部位を有してお
り、これに、ｐｃＵＫ１７６からのＮｃｏＩ−ＮｃｏＩ
制限断片を介してｐｒｏ−ＵＫ配列の残部を挿入し、こ
うしてプラスミドｐＦＣ１６を得た。 この連結は、非コード領域中のｐｒｏ−ＵＫ遺伝子の下
流のＮｃｏＩ−ＢｇｌＩＩ断片の重複を引き起した。し
かしながら、この重複はプラスミドの安定性には影響し
ない。この構築により、シグナルは完全なｐｒｏ−ＵＫ
配列を合成し得る（図６参照）。

【００７２】今まで記載した総てのプラスミドを、アン
ピシリン耐性に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ−１２宿主
株Ｃ−６００　ｇａｌＫ（ＡＴＣＣ　　３３９５５）中
で選択した。実際これらのプラスミドは、培養培地中で
抗生物質アンピシリンを分解する酵素β−ラクタマーゼ
をコードする遺伝子を保有する。初期の実験では、ｐＦ
Ｃ１６は、Ｅ．ｃｏｌｉタイプＢ株中にうまく挿入でき
、組換えｐｒｏ−ＵＫを高いレベルで製造できた。

【００７３】しかしながら、組換えＤＮＡ誘導産物を製
造する国際的な指針に従うために、我々はｐＦＣ１６を
改変して、高いレベルでｐｒｏ−ＵＫ遺伝子を発現し得
るテトラサイクリン耐性プラスミドを作製した。特に、
公知のプラスミドｐＢＲ３２２［Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ
．，Ｆｒｉｔｓｃｈ．Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ
．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎ
ｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｃｏｌｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ，ＮＹ．１９８２］か
ら（図６）、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使
用して付着端を充填したＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩ断片を単
離した［Ｐｅｒｂａｌ．Ｂ．，Ａ．Ｗｉｌｅｙ：Ｉｎｔ
ｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｊｏｈ
ｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，ｐ．２３１，１９
８４］。この断片を、その端をＤＮＡポリメラーゼＩに
より平滑（ｂｌｕｎｔ）末端とした、ｐＦＣ１６由来の
より大きなＡａｔＩＩ−ＰｖｕＩ断片に連結させた［Ｐ
ｅｒｂａｌ，Ｂ．，Ａ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉ
ｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌ
ｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，ｐ．２３１，１９８４］。こ
うすることによって、β−ラクタマーゼ遺伝子及びその
調節配列のアミノ末端部分を、テトラサイクリン耐性遺
伝子と置換した。 連結後、テトラサイクリン耐性遺伝子は、ｐｒｏ−ＵＫ
遺伝子と同一方向であった。

【００７４】さらに、予め充填したＰｖｕＩとＥｃｏＲ
Ｉ部位との間の接続部に新しいＥｃｏＲＩ部位を作製し
た。

【００７５】このようにして得られたプラスミドが、ｐ
ＦＣ４４である（図７）。

【００７６】実施例２……Ｅ．ｃｏｌｉタイプＢ株の形
質転換Ｅ．ｃｏｌｉの幾つかのタイプＢ株が入手可能で
あり、ＣＯＯＨ伸長ｐｒｏ−ＵＫ遺伝子の有効な発現用
に使用し得る。好ましい菌株は、ＡＴＣＣ　１２４０７
、ＡＴＣＣ　１１３０３及びＮＣＴＣ　１０５３７であ
る。以下は、菌株ＮＣＴＣ　１０５３７をプラスミドｐ
ＰＵＫ−Ｇｌｙで形質転換し、次いで形質転換体を培養
する一例である。

【００７７】ＭａｎｄｅｌとＨｉｇａの塩化カルシウム
法を使用して、株ＮＣＴＣ　１０５３７のコンピーテン
ト細胞を調製した［Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．及びＨｉｇａ．
Ａ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．５３，ｐ．１５４，１９７
０］。これらの細胞の調製物約２００μｌ（１×１０９
細胞／ｍｌ）を、プラスミドＤＮＡ（約５μｌ／ｍｌ濃
度）２μｌで形質転換した。形質転換体を、１２．５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬ−寒天プレート上
で選択した。２個の小さなコロニーを木製の楊枝で同一
の抗生物質を含むＬ−寒天上に画線接種した（各々約１
ｃｍ長の３つの画線）。１２時間３７℃で培養後、画線
部分を、ＬＢ培地（テトラサイクリンを２．５μｇ／ｍ
ｌ濃度で含む）１０ｍｌ上に接種してＧｌｙ伸長プロ−
ウロキナーゼの産生を試験し、３７℃で一晩培養した。 翌日、培養物をテトラサイクリンの同一濃度を含むＭ９
培地中で１：１００に希釈し、次いで３７℃で６時間培
養した。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトプロ−ウロキナーゼに特異的な５
個の合成プローブを示す。

【図２】図２は、完全長のプレ−プロ−ウロキナーゼｃ
ＤＮＡクローンの制限地図を示す。

【図３】図３は、ｐＵＮ１２１及び、ｐＵＮ１２１のＳ
ｍａＩ−ＥｃｏＲＩ部位にヒトプロ−ウロキナーゼｃＤ
ＮＡのＳｍａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を組み込んだｐｃＵＫ
１７６を示す。

【図４】図４は、完全長のヒトプロ−ウロキナーゼｃＤ
ＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。

【図５】図４（続き）は、完全長のヒトプロ−ウロキナ
ーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
を示す。

【図６】図４（続き）は、完全長のヒトプロ−ウロキナ
ーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列
を示す。

【図７】図５は、ｐＦＣ４４を構築するために作製され
た中間体プラスミドｐＤＳ２０、ｐＡＢ１、ｐＤＲ７２
０及びｐＦＣ１０の構成地図を示す。

【図８】図６は、新規プラスミドｐＡＢ８、ｐＦＣ１６
及び公知プラスミドｐＢＲ３２２の構成地図を示す。

【図９】図７は、プラスミドｐＦＣ４４及びｐＰＵＫ−
Ｇｌｙの構成地図を示す。

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　式（Ｉ）： Ｐ−ＣＯＮＨ２　　　　　　　　　　　　（Ｉ）（式中
   、Ｐはヒトプロ−ウロキナーゼ部分を表す）のヒトプロ
   −ウロキナーゼのＣＯＯＨ末端アミド化誘導体、または
   、該誘導体分子のカルボキシ末端に先行する部分が改変
   したヒトプロ−ウロキナーゼの改変体。
2. 【請求項２】　　ＣＯＯＨ末端アミド化ヒトプロ−ウロ
   キナーゼであることを特徴とする請求項１に記載の誘導
   体。
3. 【請求項３】　　ヒトプロ−ウロキナーゼのＣＯＯＨ末
   端アミド化欠失、挿入または置換変異体であることを特
   徴とする請求項１に記載の誘導体。
4. 【請求項４】　　式（ＩＩ）： Ｐ−Ｇｌｙ−Ｙｎ　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　（ＩＩ）（式中、Ｐは請求項１に記載の意味を有
   し、Ｇｌｙはグリシン残基であり、Ｙは塩基性アミノ酸
   残基であり、ｎは０または１〜４の整数である）を有す
   ることを特徴とする請求項１に記載のヒトプロ−ウロキ
   ナーゼのＣＯＯＨ末端アミド化誘導体の前駆体。
5. 【請求項５】　　Ｐがヒトプロ−ウロキナーゼを表すこ
   とを特徴とする請求項４に記載の前駆体。
6. 【請求項６】　　Ｐがヒトプロ−ウロキナーゼの欠失、
   挿入または置換変異体を表すことを特徴とする請求項４
   に記載の前駆体。
7. 【請求項７】　　Ｙがリシンまたはアルギニンであるこ
   とを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の前
   駆体。
8. 【請求項８】　　ＹｎがＬｙｓ−Ａｒｇであることを特
   徴とする請求項４に記載の前駆体。
9. 【請求項９】　　ＹｎがＡｒｇ−Ａｒｇであることを特
   徴とする請求項４に記載の前駆体。
10. 【請求項１０】　　請求項４に記載の式（ＩＩ）の対応
    前駆体を酵素変換することを含む請求項１に記載の式（
    Ｉ）のＣＯＯＨ末端アミド化誘導体の製造方法。
11. 【請求項１１】　　請求項４に記載の式（ＩＩ）（式中
    、ｎが０である）の化合物を、アミド化酵素により酵素
    変換することを含む請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】　　請求項４に記載の式（ＩＩ）（式中
    、ｎは１〜４の整数である）の化合物を、アミド化酵素
    とカルボキシペプチダーゼＢとの併合作用により酵素変
    換することを含む請求項１０に記載の方法。
13. 【請求項１３】　　アミド化酵素がペプチジルグリシン
    α−アミド化モノオキシゲナーゼであることを特徴とす
    る請求項１１または１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】　　ヒトプロ−ウロキナーゼ遺伝子のオ
    リゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を行い、次いで、
    変異した遺伝子を、好適な宿主微生物内で新規前駆体を
    合成し得る好適な発現ベクター中に挿入することを含む
    請求項４に記載の式（ＩＩ）の前駆体を製造するための
    組換えＤＮＡ法。
15. 【請求項１５】　　発現ベクターがプラスミドｐＰＵＫ
    −Ｇｌｙであり、宿主微生物がＥ．ｃｏｌｉであること
    を特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】　　請求項４に記載の式（ＩＩ）で定義
    したプロ−ウロキナーゼ前駆体をコードする化学的に合
    成したポリヌクレオチドを含む遺伝子。
17. 【請求項１７】　　請求項１６に記載の遺伝子を保有し
    且つ、請求項４に記載の式（ＩＩ）を有するプロ−ウロ
    キナーゼ前駆体を合成し得る発現ベクター。
18. 【請求項１８】　　発現ベクターｐＰＵＫ−Ｇｌｙ。
19. 【請求項１９】　　請求項１７に記載の発現ベクターで
    形質転換した単細胞生物または動物細胞。
20. 【請求項２０】　　発現ベクターｐＰＵＫ−Ｇｌｙで形
    質転換したＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞。
21. 【請求項２１】　　有効量の請求項１に記載のヒトプロ
    −ウロキナーゼのＣＯＯＨ末端アミド化誘導体と、医薬
    上許容可能なキャリヤ及び／または希釈剤とを含む医薬
    組成物。
22. 【請求項２２】　　有効量の請求項４に記載の前駆体と
    、医薬上許容可能なキャリヤ及び／または希釈剤とを含
    む医薬組成物。