JPH08502176A

JPH08502176A - エンテロキナーゼのクローニングおよび使用方法

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Publication number: JPH08502176A
Application number: JP6513518A
Authority: JP
Inventors: ラヴァリー，エドワード・アール
Original assignee: ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-13
Publication date: 1996-03-12
Anticipated expiration: 2016-03-26
Also published as: JP3149185B2; US5665566A; WO1994016083A1; AU6089894A; EP0679189A1; AU675506B2; CA2153254C; EP0679189B1; CA2153254A1; ATE242330T1; DE69432787D1

Abstract

(57)【要約】エンテロキナーゼ活性をコードしている核酸配列、その発現産物、および該発現産物の使用方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】エンテロキナーゼのクローニングおよび使用方法発明の分野本発明は、一般的には、エンテロキナーゼ活性のクローニングならびに発現、およびその製造ならびに使用方法に関する。発明の背景組み換え蛋白製造のための道具としての融合蛋白の使用は、生物医薬産業においてよく知られている。所望組み換え蛋白の暗号配列を十分に発現される遺伝子と融合させることはいくつかの利点を有する。大部分の融合蛋白製造方法は、十分に翻訳されることが知られ、高発現レベルを保証しうる「証明された」遺伝子配列上で翻訳開始を起こさせる、高度に発現される融合相手のＣ末端に対象蛋白を置く。いくつかの融合相手は、特異的細胞局在化、精製もしくは検出を補助するためのアフィニティーリガンドへの結合、および蛋白分解に対する安定性ならびにコンフォーメーション上の安定性のごとき多くの有利な特質を融合蛋白に与える。融合蛋白は多くの利点を提供するが、その共有結合に由来する２個（またはそれ以上）の成分を分離することが必要となる場合、この蛋白ドメインの有益な物理的連結もまた問題となりうる。蛋白の開裂方法は、特異的かつ効果的でなければならず、所望でない副産物を生じてはならない。このことは、ヒト用の生物医薬製造のために融合蛋白によるアプローチを用いる場合には、特に重要である。理想的には、最も有用な方法は、内部蛋白配列に関係なく、そして／または融合相手の組成に関係なく、特異的な標的配列において開裂を起こさせる。その方法は、真正なＮ−およびＣ−末端を伴った開裂生成物を生じるべきであり、所望蛋白生成物を修飾またはこれに付加物を添加するものであってはならず、さらに、反応成分が開裂反応に重大な影響を及ぼすことなく融合蛋白の物理的性質に適合できるように広範囲の反応条件に耐えるべきである。さらに、生物医薬の製造および適用については、感染性因子による汚染の心配があるため、開裂試薬は動物起源由来であってはならない。かかる「普遍的な」融合蛋白開裂方法のための理想的な選択は、哺乳動物酵素エンテロキナーゼ（エンテロペプチダーゼ）の使用である。エンテロキナーゼは、トリプシノーゲンの生理学的アクチベーターであり、高い特異性で配列（Ａｓｐ₄）−Ｌｙｓの後ろを開裂する。ライト（Light）ら，ジャーナル・オブ・プロテイン・ケミストリー（J.Protein Chem.）第１０巻：４７５〜４８０頁（１９９１年）。エンテロキナーゼにより認識されるアミノ酸配列をコードするリンカーＤＮＡ配列を含むように融合蛋白を設計することことが可能である。例えば、ボレン（Bollen）ら，ＵＳＰＮ４，８２８，９８８（１９８８年５月９日）；ルッター（Rutter），ＵＳＰＮ４，７６９，３２６（１９８８年９月６日）；およびメイン（Mayne）ら，ＵＳＰＮ４，７４５，０６９（１９８８年５月１７日）参照。しかしながら、１５年以上も前のウシ・エンテロキナーゼの部分精製以来、いくつかの異なる研究グループにより非常な研究努力がなされてきたが、エンテロキナーゼのクローニングにはだれも成功していない。ブタ・エンテロキナーゼは、１９７０年代初期にはじめて単離され（マルー（Maroux）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２４６巻：５０３１頁（１９７１年））、ウシ（アンダーソン（Anderson）ら，バイオケミストリー（Biochemistry）第１６巻：３３５４頁（１９７７年））およびヒト（グラント（Grant）ら，バイオケミカル・ジャーナル（Biochem.J.）第１５５巻：２４３頁（１９７６年））のエンテロキナーゼは１９７０年代後期に単離された。リープニークス（Liepnieks）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２５４巻：１６７７頁（１９７９年）に、３５％の炭水化物を有し、１個またはそれ以上のジスルフィド結合により結合した重鎖（分子量１１５０００）および軽鎖（分子量３５０００）を有する分子量１５００００のエンテロキナーゼが記載された。軽鎖、すなわち触媒サブユニットに関する継続した研究が、ライトら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２５９巻：１３１９５頁（１９８４年）において報告された。より最近になって、ライトら，ジャーナル・オブ・プロテイン・ケミストリー第１０巻：４７５頁（１９９１年）に、不正確な部分アミノ末端配列であると後になってわかったウシ・エンテロキナーゼの触媒サブユニットについての配列が開示された。現在まで、組み換え的に生産されたエンテロキナーゼ活性を得ることは不可能であり、かかる産物の必要性が存在し続ける。簡単な要約本発明は、エンテロキナーゼ活性をコードしている新規精製核酸配列を提供する。詳細には、ヒトおよびウシ・エンテロキナーゼを包含し、触媒軽鎖ならびに重鎖の一部をコードしている配列番号：１に示す核酸配列からなる哺乳動物エンテロキナーゼ活性が提供される。該配列は２５８１個のヌクレオチドからなり、触媒ドメイン、すなわちヌクレオチド１６９１ないし２３９８を含む。このエンテロキナーゼ活性をコードし、ｐＥＫ−２／ＧＩ７３４と命名されたプラスミド中に含まれているヌクレオチド配列は、１９９３年２月２日に、受託番号６９２３２として、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。さらなる具体例において、本発明は、エンテロキナーゼ活性を有する新規配列の発現産物からなる。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ならびにヌクレオチドからデノボ化学合成により調製されたＤＮＡならびに欠失または変異、対立遺伝子変種配列、および緊縮条件下でそれにハイブリダイズする配列（もしくは遺伝暗号の縮重がなければハイブリダイズする配列）もまた、上記エンテロキナーゼ活性を有するポリペブチドをコードしているかぎり本発明の範囲内である。さらに、エンテロキナーゼによる認識される特異的開裂部位の変更を可能にするエンテロキナーゼの触媒部位の修飾を有する形態も包含される。さらに、それらのＤＮＡ配列に対応した新規メッセンジャーＲＮΛ（ｍＲＮＡ）配列も提供される。本発明により提供される核酸配列と、プロモーター、オペレーター、レギュレーター等のごとき同種または異種の発現調節配列との結合は、対応ｍＲＮＡへのインビボおよびインビトロ転写を可能にし、次いで、エンテロキナーゼ活性を有する多量の蛋白および関連ポリーならびにオリゴーペプチドの翻訳を可能にする。本発明の好ましい発現系において、例えば、プロテアーゼ活性を有するエンテロキナーゼポリペプチドを提供するために、真核細胞中での転写および翻訳を可能にする調節プロモーター配列に、作動するように連結される。所望により、新規核酸配列がエンテロキナーゼの重鎖および軽鎖の両方をコードしていてもよく、あるいは驚くべきことに、やはりエンテロキナーゼ活性を提供する軽鎖のみをコードしていてもよい。本発明エンテロキナーゼ活性が、それぞれがエンテロキナーゼ活性の１部またはそれ以上の部分からなる１種またはそれ以上の発現ベクターから生じてもよく、あるいはまた、エンテロキナーゼ活性が、それぞれがエンテロキナーゼ活性の全部または一部を発現する１種またはそれ以上の細胞系中に含有される１種またはそれ以上の発現ベクターから生じてもよい。かくして、所望ならば、重鎖および軽鎖は、別々の細胞系において別々に発現されてもよい。さらに、エンテロキナーゼ活性が、例えばチオレドキシンを融合相手とする融合蛋白として生産されてもよい。所望により、融合相手が、ＰＡＣＥ、トリプシノーゲン等のごときさらに別の蛋白分解酵素の全部または一部であってもよい。実際、かかるエンテロキナーゼ融合蛋白が、成分蛋白ドメイン間に開裂部位を有し、そのことにより、自己触媒的プロセッシングが可能となり、２個のドメインが分離され、成熟した活性のあるエンテロキナーゼが得られる。標準的な形質転換およびトランスフェクション法により、これらの配列を原核および真核宿主細胞中に取り込ませることもまた、本発明の範囲内であり、組織起源から得られるエンテロキナーゼよりも非常に多量の有用なエンテロキナーゼが供給されると期待される。本発明発現産物にさらなる生物学的活性を付与することが必要な場合には、適当な宿主細胞を使用することにより、かかる翻訳後の修飾、例えば、切形、グリコシレーション等が提供される。かかる適当な宿主細胞は、例えば、イー・コリ（E.coli）、ＣＨＯ）酵母、および鱗翅目細胞を包含する。本発明新規蛋白生成物は、配列番号：２に示すものと実質的に同じ配列からなるエンテロキナーゼの１次構造コンフォーメーション（すなわち、アミノ酸配列）を有する蛋白生成物を包含する。本発明の好ましい具体例は、配列番号：２に示すものと実質的に同じ配列からなり、特別には、アミノ酸５６４ないし７９８からなる。かかる生成物に対する抗体も提供される。さらに、本発明により、本発明新規蛋白生成物を用いる融合蛋白の開裂方法も提供される。これらの蛋白生成物は、重鎖および軽鎖の両方を含んでいてもよく、あるいは軽鎖のエンテロキナーゼ活性のみでもよい。軽鎖のみのものはエンテロキナーゼの「可溶性」形態であり、インビボにおいて膜への錨として作用すると考えられている非酵素的な重鎖を欠いている。驚くべきことに、この形態（軽鎖のみ）のエンテロキナーゼは、トリプシノーゲンに対してはあまり有効でない酵素であるが、融合蛋白に対してはずっと有効である。融合蛋白構成員の１つがそれ自体エンテロキナーゼ活性である製造方法も提供される。それにより、計画的に設けられたエンテロキナーゼ認識部位における融合蛋白ドメインの開裂の際に、開裂のたびごとににさらなるエンテロキナーゼ活性が生じてさらに融合蛋白を開裂する。本発明新規蛋白生成物を投与することからなる、低レベルのエンテロキナーゼ活性に関連する消化疾患を治療するための方法および医薬組成物も提供される。本発明の他の態様および利点は、添付した配列表を参考にした本発明の実施に関する多くの説明的な例を含む以下の詳細な説明を考慮すれば明らかであろう。配列番号：１は、２５８１個のヌクレオチド配列を示し、配列番号：２は、ウシ・エンテロキナーゼの非触媒ドメイン（重鎖）および触媒ドメイン（軽鎖）の推定アミノ酸配列を示す。軽鎖は、ヌクレオチド１６９１ないし２３９８（アミノ酸５６４ないし７９８）によりコードされ、エンテロキナーゼ重鎖のＣ末端部分はヌクレオチド１から１６９０まで伸長している。詳細な説明本発明は、組み換え的に生産されたエンテロキナーゼ活性ならびにエンテロキナーゼの製造方法および使用方法を提供する。本明細書に用いるエンテロキナーゼ活性とは、特異的な部位におけるペプチドまたは蛋白基質を開裂する能力を意味する。蛋白基質に関しては、この配列は一般的に、下記の配列、（Ａｓｐ₄）−Ｌｙｓまたはライト（Light）ら，アナリティカル・バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第１０６巻：１９９頁（１９８０年）に記載された配列のごとき同様の配列（正に荷電したアミノ酸があとに続く負に荷電したアミノ酸クラスター）である。典型的には、かかる活性は、エンテロキナーゼでＮ末端プロペプチド（（Ａｓｐ₄）−Ｌｙｓを含んでいる）を開裂することによるトリプシノーゲンの活性化を行い、次いで、トシルーアルギニン−メチルエステル（ＴＡＭＥ）を用いて生じた活性トリプシン量をアッセイすることにより測定される。例えば、マルー（Maroux）らの上記文献参照。別法として、酵素を、ペプチド基質Ｇｌｙ−（Ａｓｐ₄）−Ｌｙｓ−β−ナフチルアミドとともにインキュベーションし、次いで、β−ＮＡ（β−ナフチルアミド）残基の遊離により生じる蛍光（励起３３７ｎｍ、エミッション４２０ｎｍ）の増加を測定することにより、エンテロキナーゼ活性を直接測定することもできる。例えば、グラント（Gran t）ら，バイオケム・バイオフィジ・アクタ（Biochem.Biophys.Acta）第５６７巻：２０７頁（１９７９年）参照。ウシ・エンテロキナーゼも、ＴＡＭＥおよびＢＡＥＥ（ベンジルーアルギニン−エチルーエステル）のようないくつかのトリプシン基質に対して活性がある。最適活性は、ホロ酵素、すなわち酵素の重鎖および軽鎖２つの鎖に由来すると一般的に考えられているが、出願人らの発明は、軽鎖のみに由来する蛋白分解活性も提供する。かくして、本発明に用いるエンテロキナーゼ活性なる語は、重鎖および軽鎖の両方の存在を要求するのではなく、軽鎖のみに由来するものでもよい。そのうえ、鎖または鎖の領域は１つのベクターの発現産物である必要はなく、むしろ、それらは別々および個々に発現されることができる。本明細書に用いる同時トランスフェクションまたは同時発現なる語は、重鎖および／または軽鎖をコードしている適切な核酸配列が、単一または１種もしくはそれ以上の別々のトランスフェクションもしくは発現ベクター上にあってもよい。同時トランスフェクションおよび同時発現に１個またはそれ以上の重鎖および／または軽鎖配列を用いてもよく、あるいは欠失および／または変異があるが、なお上記エンテロキナーゼ活性を有している配列を用いてもよい。本発明の１の具体例において、エンテロキナーゼ活性は、配列番号：１に示すヌクレオチド配列によりコードされる蛋白であり、成熟触媒ドメイン、すなわち、ヌクレオチド１６９１ないし２３９８を含む。本明細書に用いる、配列番号に示すものと「実質的に同じ配列」とは、緊縮条件下て該配列とハイブリダイズする配列ならびに遺伝暗号の縮重がなければハイブリダイズするであろう配列を包含する。緊縮条件は、一般的には、６５℃においおて、０．２ｘＳＳＣプラス０．１％ＳＤＳである。「実質的に複製」および「実質的に対応」なる語は、配列番号に記載示したものと同じではないが、やはり発現産物、蛋白、および／またはエンテロキナーゼ活性を有する合成ポリペプチドを生じる配列を包含する。かくして、配列番号：１に示すヌクレオチド配列を用いて、エンテロキナーゼ活性をコードしているＤＮＡを単離することができ、同様に、適当なベクター、選択マーカーおよび組み換えＤＮＡ法を用いて他の起源からクローン化することができる。対応するｃＤＮＡを適当なｍＲＮＡ起源から調製することができる。エンテロキナーゼ活性をコードしているゲノムＤＮＡを、ｃＤＮＡプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブを用いてゲノムライブラリーから得てもよい。別法として、エンテロキナーゼ活性をコードしているＤＮＡ配列を合成的に調製してもよい。細菌での発現はイントロンのない配列が必要であるため、イントロンのない、すなわちｃＤＮＡ配列の使用が好ましい。上記した細菌での発現のために、配列を適当に修飾してもよい。さらに本発明は、好ましくはグリコシレーションされていない形態でエンテロキナーゼ活性を製造する方法を提供する。該方法は、宿主細胞、好ましくは細菌細胞を培養し、適当な転写調節配列の発現調節下にあるエンテロキナーゼ活性をコードしているＤＮＡ配列（エンテロキナーゼ活性を含みこれを発現しうる）で形質転換することを包含する。ＤＮＡ配列が、重鎖および軽鎖の両方または軽鎖のみをコードしていてもよく、あるいはエンテロキナーゼ活性の発現を起こすのに必要なだけの量であってもく、当該分野においてよく知られた細菌細胞における発現のための好ましいコドンを含むように計画的に設計されていてもよい。後者の場合、このように計画的に設計されたＤＮＡ配列から得られる発現産物がエンテロキナーゼ活性全長を含んでいてもよく、エンテロキナーゼ活性、例えば軽鎖のみをコードしている、切形され生物学的に活性のある成熟ペプチド配列を含んでいてもよい。エンテロキナーゼ活性発現のためのもう１つの好ましい方法において、エンテロキナーゼの触媒ドメインをコードしているＤＮＡ配列は、ヒト・ＰＡＣＥ遺伝子のごとき遺伝子のシグナルペプチド（プレ−領域）およびプロ−領域と融合させられる。ＰＡＣＥは、塩基度２の残基の後ろを開裂し、多くの分泌性蛋白のプロペプチドプロセッシングに必要なセリンプロテアーゼである。ＰＡＣＥシグナルペプチド（プレ−領域）およびプロ領域暗号配列が成熟エンテロキナーゼ軽鎖暗号配列とフレーム中で融合され、哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞等において発現される場合、配列は、翻訳されて分泌されるキメラ蛋白として産生され、次いで、プロセッシングされてシグナルペプチドが除去され、プロ−エンテロキナーゼが得られる。内因性または外因性ＰＡＣＥいずれかによって引き続いて起こる開裂により、エンテロキナーゼのＮ末端からプローペプチドが除去され、ならし培地中に成熟エンテロキナーゼ活性が分泌される。所望により、この方法が、ＰＡＣＥ経膜ドメインが欠失した修飾された可溶性形態のＰＡＣＥ遺伝子の同時発現をＰＡＣＥ源として用いるものであってもよい。可溶性ＰＡＣＥの説明および該蛋白のプローペプチド部分の説明については、例えば、ハツザワ（Hatsuzawa）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２６７巻：１６０９４頁（１９９２年）参照。他のプレ／プロ領域、例えば、ブレナー（Brenner）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Ac ad.Sci.U.S.A.）第８９巻：９２２頁（１９９２年）に記載された酵母・Ｋｅｘ２のブレ／プロ領域、またはリューロン（Lelleuron）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）第１９３巻：７６７頁（１９９０年）に記載されたトリプシノーゲンのプレ／プロ領域を用いて、エンテロキナーゼ活性発現において同様の便宜を図ることもできる。本明細書に用いる「プロ−蛋白」なる語は、「プロ」領域が付いた蛋白を意味し、「プレ−プロ−蛋白」は「プレ−プロ」領域を有している。「プレ」領域またはシグナルペプチドは、膜、例えば小胞体膜を越えて転移されるポリペプチドの残りの部分を標的とするアミノ酸の大部分のＮ末端伸長部分をいい、通常は、引き続き内因性シグナルペプチダーゼにより開裂される。「プロ」領域は、シグナルペプチド（プレ−領域）と成熟蛋白との間の介在領域である。この配列は、いくつかの翻訳後修飾の促進に必要となりうる。それは、正常なフォールディングに必要であるかもしれず、あるいはそれは、翻訳後除去されるまで成熟蛋白の活性を抑制する作用をするかもしれない。プロ領域は、通常、エンドペプチダーゼによるシグナルペプチド開裂後に除去される。「プレ／プロ」領域は、上記「プレ」領域と「プロ」領域との組み合わせである。より詳細には、有用なＤＮＡ構築物は、トリプシノーゲンのプレ／プロ領域とエンテロキナーゼ活性をコードしているＤＮＡとの融合物を含んでいる。ウシ・アニオン性トリプシノーゲンのシグナルペプチドおよび全８アミノ酸のプロ領域（エンテロキナーゼ認識部位を含む）を、成熟エンテロキナーゼ触媒ドメインのアミノ末端と融合させる。さらに別のＤＮＡ構築物は、成熟エンテロキナーゼ触媒ドメインとイー・コリ・チオレドキシンのＣ末端との融合物を含み、エンテロキナーゼ開裂部位のごとき既知開裂部位をコードしている介在スペーサー配列を有している。エンテロキナーゼ活性をコードしているＤＮＡ配列を、慣用的方法により、当該分野においてよく知られた所望宿主細胞に適する発現ベクター中に挿入してもよい。細菌または酵母での生産には、ＤＮＡ配列はイントロンを含んでいてはならない。高等真核細胞での発現には、イントロンを避ける必要はないが、ｃＤＮＡ配列が好ましい。好ましくは、真核細胞での発現には、ＤＮＡ配列が分泌リーダー配列を含んでいるべきである。ベクターは、複製部位、選択マーカーおよび選択宿主と両立できる転写調節配列をはじめとする当該分野においてよく知られた典型的なベクターエレメントを含んでいるべきである。グリコシレーションされていない均一なエンテロキナーゼ活性の生産に有用な種々のイー・コリ株も当該分野においてよく知られている。かかる株の排他的でない一覧表は、実施例で使用する株をはじめとして、ＭＣ１０６１、ＤＨ１、ＲＲ１、Ｃ６００ｈｆ１、Ｋ８０３、ＪＡ２２１、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１および種々のＫ１２株を包含する。これとは別に、ビー・スブチリス（B.subtilis）、シュードモナス（Pseudomonas）の種々の株、他のバチルス属等をはじめとする、他の細菌種を用いてもよい。エンテロキナーゼ活性を、呻乳動物細胞におけるエンテロキナーゼ活性をコードしている配列の異種発現により製造してもよい。かくして、グリコシレーションを防止しない場合には、エンテロキナーゼ活性をグリコシレーションされた形態で得ることができる。所望であれば、ツニカマイシンまたは当該分野においてよく知られたグリコシレーション部位の部位特異的変異により、グリコシレーションを抑制することができる。エンテロキナーゼ活性の製造のための適当な哺乳動物発現ベクターおよび宿主細胞も当該分野においてよく知られており、ベクターｐＸＭおよびｐＭＴ２およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル・ＣＯＳ−１細胞、ＣＶ−１、ＨｅＬａ、マウス・Ｌ−９２９細胞、３Ｔ３細胞およびＢＨＫ細胞を包含するが、これらに限定しない。いくつかの哺乳動物ベクターの構造および使用は当業者によく知られており、ＷＯ８８／００５９８に詳細に記載されている。当業者に知られた多くの酵母細胞もまた、本発明エンテロキナーゼ発現用宿主細胞として利用できる。酵母細胞は、上記成熟エンテロキナーゼに対するＰＡＣＥプレ／プロ融合用宿主として特に有用である。適当なベクターを用いて発現された場合、融合物はＰＡＣＥシグナルペプチドによる分泌され、次いで、ＰＡＣＥプロ領域は、対になった塩基性残基のうしろを開裂するヒト・ＰＡＣＥと同種の酵素である内因性酵母プロテアーゼＫＥＫ２によりブロセッシングされる。さらに、所望であれば、昆虫細胞を宿主細胞として使用してもよい。例えば、ミラー（Miller）ら，ジェネティック・エンジニアリング（Genetic Engineering）第８巻：２７７〜２９８頁（プレナム・プレス（Plenum Press））１９８６年を参照。本発明エンテロキナーゼ活性が細菌細胞において発現される場合、蛋白を活性形態で得ることが典型的に不要であるので、通常は、蛋白の再生を考慮せずに細胞内に発現させてもよく、あるいは分泌リーダーが含まれている場合には、活性形態で細菌細胞から分泌されうる。必要または所望であれば、低下した生物活性が観察された場合には、蛋白を尿素またはグアニジンＨＣ１中でジチオスレイトールまたはβ−メルカプトエタノールとともにインキュベーションし、次いで、希釈してこれらの薬剤濃度を低下させ酸化剤で処理するような慣用的方法により、エンテロキナーゼ活性生成物を再生してもよい。例えば、遺伝子操作されて本明細書記載のエンテロキナーゼ活性ＤＮＡ配列を発現するイー・コリ細胞を、エンテロキナーゼ活性蛋白の生産および細胞内蓄積を可能にする適当な条件下において培養する。次いで、細胞を収穫、すなわち、細胞を、細胞が培養された培地および他のすべての物質から分離し、溶解し、所望の生物学的に活性なエンテロキナーゼ活性蛋白を溶解物から精製する。所望により、エンテロキナーゼ活性の最小限の精製のみを必要としてもよい。「生物学的に活性」なる語は、上記慣用的方法によりアッセイされた場合、検出可能な蛋白開裂活性を示すエンテロキナーゼ活性標品を意味する。カラムクロマトグラフィー（例えば、免疫アフィニティー等）、大豆トリプシンインヒビター（ＳＴＩ）、膵臓トリプシンインヒビター（ＰＴＩ）またはＰＡＢＡ上のアフィニティー精製、ゲル濾過および逆相ＨＰＬＣのごとき種々の精製法が、所望蛋白の精製に有用である。例えば、ゴスポダロビッツ（Gospodarowic z）ら，ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（J.Cell.Phys.）第１２２巻：３２３〜３３２頁（１９８５年）、イワネ（Iwane）ら，バイオケム・アンド・バイオフィジ・リサーチ・コミュニケーションズ（Biochem.and Biophy s.Res.Comm.）第１４６巻：４７０〜４７７頁（１９８７年）、フォックス（Fox）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Ch em.）第２６３巻：１８４５２〜１８４５８頁（１９８８年）、１９８７年６月４日公開のＥＰ第０２５９９５３号、および１９８７年９月２３日公開のＥＰ第０２３７９６６号参照。本発明エンテロキナーゼ活性を、エンテロキナーゼ開裂部位を有する蛋白、そして特に、その配列中に加工されたかかる開裂部位を有する融合蛋白の開裂方法に使用することができる。その所要量は、当業者により容易に実験的に決定される。実際、本明細書記載のように、組み換えウシ・エンテロキナーゼ触媒ドメインは、ウシ由来の２つの鎖からなる形態と比較した場合、ずっと有効で、除去困難な痕跡量の他の蛋白分解性蛋白の混入がないので、融合蛋白の開裂のための優れた試薬である。本発明の別の態様として、本発明エンテロキナーゼ活性は、さらに別の蛋白に対する融合相手の１つとして取り込まれる。そのようなものとして、最小量の外因性エンテロキナーゼ活性の反応容器への添加により（あるいは単純に融合蛋白を濃縮することにより）、最小量の融合蛋白の開裂がさらなるエンテロキナーゼ活性の放出を生じ、それが順に、融合蛋白のより多くの蛋白開裂を触媒しうる。このようにして、自己触媒的方法で、大量のエンテロキナーゼ活性が融合蛋白から生成されうる。さらに、本発明により、以下の段階：（ａ）（ｉ）エンテロキナーゼ活性をコードしており、発現するとペリプラズム空間中に隔離される核酸配列、および（ii）融合蛋白ならびにエンテロキナーゼ開裂部位をコードしており、発現されると細胞質空間に隔離される１種またはそれ以上の核酸配列で形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養して増殖させ、（ｂ）該ペリプラズム空間および該細胞質空間を混ぜ合わせ、それにより、（ｃ）該エンテロキナーゼ活性に該融合蛋白を開裂させ、次いで、（ｄ）蛋白産物を得るからなる融合蛋白からの蛋白の製造方法を提供する。均一な本発明エンテロキナーゼ活性を含有する医薬組成物は、消化剤として有用でありうる。かかる医薬組成物はさらに、医薬上許容される担体、希釈剤、充填剤、塩類、緩衝剤、安定化剤および／または当該分野においてよく知られた他の物質を含有していてもよい。「医薬上許容される」なる語は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される宿主に対して毒性でない物質を意味する。担体または他の物質の性質は投与経路に依存するであろう。投与を種々の慣用的方法で行うことができる。経口投与が好ましい。かかる場合、本発明エンテロキナーゼ活性を腸溶コーティングすることができ、その標品は当業者に知られている。本発明治療方法の実施において、治療上有効量のエンテロキナーゼ活性を投与する。「治療上有効量」なる語は、有意な利益、すなわち消化機能の回復を示すに十分な方法または組成物における各活性成分の総量を意味する。その語を、単独で投与される個々の活性成分に対して用いる場合、その語はその成分のみをさす。その語を、混合物に対して用いる場合、混合して、連続して、あるいは同時に投与するとしても、その語は治療効果を生じる活性成分の合計量をいう。個人および消化疾患の重さに応じて投与回数を変更してもよい。さらに別の使用方法において、エンテロキナーゼをコードしているＤＮＡは、エンテロキナーゼ欠乏による消化疾患の修正方法としての遺伝子治療に有用であろう。本発明はさらに以下の実施例において記載される。実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１は、２６塩基対のウシ・エンテロキナーゼ遺伝子フラグメントのクローニングを記載する。ウシ・エンテロキナーゼのさらなる蛋白配列を実施例２に記載する。実施例１のフラグメントに隣接する遺伝子フラグメントの増幅およびクローニングは実施例３の対象である。実施例４はエンテロキナーゼ触媒鎖のクローニングに関する。異なるｃＤＮＡクローンならびに非触媒鎖（重鎖）の部分暗号配列の比較を実施例５に示す。実施例６はさらに重鎖配列を含むさらなるエンテロキナーゼ暗号配列の単離を記載する。実施例７は、他の噛乳動物エンテロキナーゼ遺伝子をクローン化するためのウシ・エンテロキナーゼ配列の使用を記載する。実施例８は、原核細胞系ならびに真核細胞系の双方におけるウシ・エンテロキナーゼの触媒ドメインをコードしている遺伝子の発現を記載する。実施例９は、融合蛋白の同時発現に関し、さらに活性エンテロキナーゼの製造に関する。実施例１０は、ある種の消化疾患の治療における治療薬としてのエンテロキナーゼの使用に関する。実施例１ウシ・エンテロキナーゼ遺伝子フラグメントのクローニングウシ・エンテロキナーゼの触媒（軽）鎖のＮ末端の２７個のアミノ酸配列は、パーデュー大学（Purdue University）のアルバート・ライト（Albert Light）により提供され、後に、ライトらの上記文献に公表された。以下に非常に詳しく議論されているように、この配列は正しくなかった。その誤りのために、位置８にあると報告されたチロシンが、その低い縮重のため、プローブおよびプライマーの設計に使用された（可能性のある２つのコドンのみがチロシンをコードしている）。しかしながら、位置８における実際の残基は、実は可能性のある６つのコドンを有するアルギニンである。この（誤りのある）配列は以下のごとし：配列番号：３該「提供された」配列を、該配列をコードしうる可能性のあるすべてのＤＮＡコドンへと逆に翻訳し、ＰＣＲ反応においてプライマーとして用いられる制限エンドヌクレアーセ開裂部位をコードする５’方向へ伸長した１７塩基対の長さのオリゴヌクレオチドプライマー設計用プールとして用いた［サイキ（Saiki）ら，サイエンス（Science）第２３０巻１３５０〜１３５４頁（１９８５年），ムリス（Mullis）ら，コールド・スプリング・ハーバー・シンポジア・オン・クワンタテイティブ・バイオロジー（Cold Spring Harbor Symposia on Quantat ative Biology），第LI巻：２６３〜２７３頁（１９８６年）］。これらのオリゴヌクレオチドプールの設計は、努力の有効な成功にとり重要であった。、このＮ末端蛋白配列を、以前同定された配列とデーターベースにおいて比較することにより、多数の噛乳動物の膵臓および血清セリンプロテアーゼに対する有意な相同性を明らかとなった。これらの「望ましくない」蛋白をコードしているＤＮＡ配列の望ましくない増幅を防止するために、意図的にこれらの高度に相同的な領域を避けるようにＰＣＲプライマーのプールを設計した。しかしながら、プライマープールがアニーリングする配列をできるかぎり離すという競争的な要求を考慮して、増幅に関して得られる正確なエンテロキナーゼ配列の量を最大にして、有用な情報を得た。ともにＮ末端アミノ酸配列（ＩＶＧＧＳＤ（アミノ酸１〜６）配列番号：８）に対するすべての可能なコドンを含む２個の縮重したオリゴヌクレオチドのプールを合成した。これら２つのプールは、蛋白配列におけるセリンに対して用いられるコドンにおいてのみ異なり、それぞれのプール：の縮重を減らす手段として独立して使用された。本明細書で用いるシンボル「Ｈ」は、ヌクレオチドＣ、ＴおよびＡの等しい存在比率をいう。シンボル「Ｖ」は、ヌクレオチドＣおよびＴの等しい存在比率をいう。「Ｒ」は、その位置でのＡまたはＧいずれかの等しい存在比率をいう。シンボル「Ｎ」は４種のヌクレオチドＧ、Ａ、ＴおよびＣの等しい存在比率をいう。これらのプールのそれぞれが、太字で示すＥｃｏＲＩ部位を含んだ５’側への伸長を有していた。最も知られたＣ末端配列：配列番号：６ＤＱＱＶＣＧ（配列番号：３のアミノ酸２２〜２７）に対するすべての可能なコドンの逆向きの相補配列を含むオリゴヌクレオチドのもう１つのプールを合成した。このプールは、太字で示したＨｉｎｄIII部位を有する共通の５’側への伸長：配列番号：７を含んでいた。１回目のシリーズの増幅反応からのＤＮＡ生成物を、直鎖状配列中の第１のセットの内側のアミノ酸配列をコードしていると推定されるＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドのプールにより開始される２回目のシリーズの増幅のための鋳型として用いた。かくして、配列：配列番号：８ＹＥＧＡＷＰ（配列番号：３のアミノ酸８〜１３に対応、位置８においてＹの誤った帰属を含む）に対するすべての可能なコドンに相補的な１７塩基対のオリゴヌクレオチドのプール：配列番号：９プライマー３５’ＴＡＹＧＡＲＧＧＮＧＣＮＴＧＧＣＣ３’ ６４ｘが合成された。次いで、このプライマーのプールを、２回目のＰＣＲ反応において、配列：配列番号：１０ＦＤＤＱＱＶ（配列番号：３のアミノ酸２０〜２５に対応）に対するすべての可能なコドンの逆向きの相補的配列からなるもう１つのプール：配列番号：１１中に混合した。このプールは、１回目のシリーズの増幅に用いた３’側のプールと部分的に重複を有しており、ＨｉｎｄIII部位を有する（太字）５’側への伸長配列を有していた。ウシ・ゲノムＤＮＡ（ｄＨ₂Ｏ中０．９ｍｇ／ｍｌ）を５分間煮沸して変性させ、次いで、すぐに氷上に置いた。各５０μ１の増幅の反応条件は：熱変性ウシ・ゲノムＤＮＡ２μｇ）１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、ゼラチン０．１％、各オリゴヌクレオチドプール１．０μＭ、各ｄＮＴＰ２００μＭ）およびアンプリタック（Amplitaq）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー・シータス（Perkin-Elmer Cetus）製）とした。以下の条件下で４０回の増幅サイクルを行った：サイクル１＝９４℃３分／４０℃１分／７２℃１分。サイクル２〜４０＝９４℃１分／４０℃１分／７２ ℃１分。４０サイクルからなる第１ラウンドには、プライマープール１Ａおよび２またはプール１Ｂおよび２を使用した。４０サイクルの増幅後、この反応物のうち０．５μｌを、プライマープール３および４を用いる次の３５サイクルからなるＰＣＲの鋳型として使用した。反応成分は、ＤＮＡ鋳型以外は第１ラウンドと同じであった。第２ラウンドのＤＮＡ鋳型は前のラウンドの生成物であった。上記のごとく得られたＰＣＲ生成物を、５％アクリルアミド調製用ゲル上で泳動させ、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムでバンドを染色した。標準的方法［サムブルック（Sambrook）ら，「モレキュラー・クローニング，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,a Laboratory Manual）第２版，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laborator yPress）（１９８９年）］を用いてＤＮＡの取り扱いおよびライゲーションを行った。まず、ＰＣＲ生成物を、デオキシヌクレオチドトリホスフェートの存在下でＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、次いで、ＨｉｎｄII I（ニュー・イングランド・バイオラブズ（New England Biolabs）製）で消化し、ｐＵＣ１９［ノランダー（Norrander）ら，ジーン（Gene）第２６巻：１０１〜１０６頁（１９８３年）］ＨｉｎｃII−ＨｉｎｄIIIベクター中にサブクローニングした。見かけ上７２塩基対の挿入物を含んでいる形質転換体を同定した。これらのプラスミドを単離し、シークエンス・キット（Sequence kit）（ユナイティッド・ステイツ・バイオケミカル（United States Biocemical）製）およびｐＵＣ１９にアニーリングする配列決定用プライマーを用いてその挿入物の配列決定を行った。次いで、挿入物のＤＮＡ配列を翻訳して既知蛋白配列により予想されたアミノ酸配列（ＷＶＶＡＬＹ，配列番号：３のアミノ酸１４〜１９）に正確に対応するオープンリーディングフレームを明らかにした。プライマーのアニーリングの間のミスマッチ耐性の可能性のため、２つのＰＣＲプライマー間の配列のみが正確であると考えることができた。しかしながら、他のプール（１Ａ）は特異的生成物を生じないため、正当なセリンのコドンがプライマープール１Ｂ（ＡＧＹ）にあると考えられた。このことは、配列番号：９と命名されたプールをプローブとする、最初の４０サイクルからの生成物のサザンブロットにより確定された。さらに、Ｐｒｏ¹³に対するコドンの「ゆらぎ」位置はチミジンと決定され、隣接するＴｒｐ¹²に対するただ１つの可能性なコドンが存在し、さらに５個の塩基がかなり確実であると考えられた。Ｐｈｅ²⁰に対するコドンの最初の２個の不変塩基が包含される場合、エンテロキナーゼの触媒鎖の９個のアミノ酸（アミノ酸Ｔｒｐ¹²からＰｈｅ²⁰まで）に対する暗号配列の連続した２６個の塩基対はかなりの程度の確実さで決定されたものである。この配列は配列番号：１のヌクレオチド１７２４から１７４９までである。実施例２ウシ・エンテロキナーゼの蛋白配列成熟ウシ・エンテロキナーゼ軽鎖のアミノ酸１２〜２０の正確なＤＮＡ配列（２６塩基対）は、ハイブリダイゼーション法によるｃＤＮＡ単離を可能にするには十分でなかった。したがって、さらなる隣接蛋白配列を検索した。ウシ・エンテロキナーゼ（ＥＫ−２）をバイオザイム（Biozyme）から購入した。この酵素は純度９９％以上であり、よって、活性化セファロースＣＬ−４Ｂ（シグマ（Sigma）製）に結合したブタ・膵臓トリプシンインヒビター（シグマ製）を用いてさらに生成した［リープニークス（Liepnieks）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）第２５４巻：１６７７〜１６８３頁（１９７９年）］。得られた酵素を還元し、アルキル化して軽鎖から重鎖を分離し、調製用アクリルアミドゲル上で泳動した。蛋白をゲルからプロブロット膜（Problot membrane）（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレーテッド（Applied Biosystems,Inc.）製）上に電気的にブロッティングし、分子量４２０００ダルトンの触媒鎖を染色後膜から切り取り、アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）のモデル４７０Ａパルスリキッドシークエンサーを用いて配列決定した。最初の３０個のアミノ酸の配列が決定され：配列番号：１２である。８番目の位置のアミノ酸残基が、ライト（Light）らの上記文献により誤ってチロシンであると報告されたのとは対照的に、アルギニンであると決定されたという観察結果は特に注目すべきである。この領域は、縮重が少ないと報告されているため、ＰＣＲプライマーの設計のための配列の重要な領域である。さらに２個のバンドが電気ブロッティングにおいて観察された。分子量１５００００ダルトンの予想された重鎖バンドおよび分子量９００００ダルトンの別のバンドをプロブロット膜から切り出し、別個にトリプシン処理し、得られたフラグメントを逆相で分離した。十分に分離されたピークを集め、配列決定した。還元されアルキル化されたウシ・酵素をさらにＣ４逆相カラム（ビダック（Vy dac）製）にかけて触媒（軽）鎖から非触媒（重）鎖を分離した。得られたトリプシン消化ペプチドをＣ１８逆相ＨＰＬＣ（ビダック）により分離した。個々のピークを蛋白シークエンサーによる配列分析に付した。結果を実施例３に示す。実施例３隣接した遺伝子フラグメントの増幅およびクローニングトリプシン消化され、クロマトグラフィー分離され、単離され、次いで、個々に得られたペプチドを配列決定されたエンテロキナーゼ触媒鎖の個々のペプチドフラグメントは、以下の配列であった。配列番号：１３配列番号：１４ＤＷＬＶＳＡＡＨＣＶＹＧＲ配列番号：１５ＦＴＥＷＩＱＳＦＬＨ配列番号：１６ＩＣＳＩＡＧＷＧＡＬＩＹＱＧＳＴＡＤＶＬＱＥＡ配列番号：１７ＷＬＬＡＧＶＴＳＦＧＹＱＣＡＬＰＮ（Ｎ？）ＰＧＶＹＡ配列番号：１８ＮＭＥＰＳＫ配列番号：１３は、実施例２において決定されたＮ末端配列と部分的に重複していた。これらのペプチド配列を用いて、相同性に関して蛋白配列データベースを検索した。エンテロキナーゼＮ末端ペプチド配列と最も高い相同性を示した蛋白は、ヘプシン（hepsin）［レイタス（Leytus）ら，バイオケミストリー（Bioc hemistry）第２７巻：１０６７〜１０７４頁（１９８８年）］と命名されたヒト・肝臓ｃＤＮＡクローン由来の推定アミノ酸配列であった。ヘプシン配列を指標として用いると、別のエンテロキナーゼ触媒鎖トリプシン消化ペプチド（配列番号：１４）は、すでに同定されたＮ末端／重複トリプシン消化配列に隣接しているかもしれないと思われた。このペプチドは、セリンプロテアーゼに特徴的な「触媒的な３個（catalytic triad）」のうちのヒスチジン領域に対して非常に相同的な配列を含んでいた。このペプチドの１つの領域（ＡＨＣＶＹ）について逆向きに翻訳されたアミノ酸配列の逆相補鎖に対して相補的なオリゴヌクレオチドプールを合成した。これらのオリゴヌクレオチドも、ＢａｍＨＩ部位（太字で示す）をコードしている５’側の伸長：配列番号：１９を有していた。このプールを、他のヌクレオチドプールと、そしてさらに下記５’制限部位伸長部：配列番号：２０配列番号２１を有する実施例１の最初のＰＣＲクローン由来の１９塩基対の正確なエンテロキナーゼＤＮＡ配列（ヌクレオチド１７２９〜１７４７）（および逆向きの相補鎖）を含むオリゴヌクレオチドと組み合わせて、ゲノムＤＮＡのＰＣＲに使用した。ウシ・ゲノムＤＮＡに対してネスティッド（nested）法を再び用いた。以下の組み合わせ：１）配列番号：５＋７，４０サイクル、次いで、配列番号：５＋２１，３５サイクル２）配列番号：５＋１９，４０サイクル、次いで、配列番号：２０＋１９，３５サイクルが有用であることがわかった。サブクローニングおよび配列決定後、組み合わせ１は、翻訳されて配列番号：１２のエンテロキナーゼ軽鎖ペプチド配列のＡｓｐ⁶からＰｒｏ¹³となる２１塩基対に加えてＡｓｐ⁶コドンの推定される残りの２個の塩基の合計２３塩基対の配列（そのうち５塩基対はすでに決定されていた）を生じた。このＤＮＡ配列は配列番号：１のヌクレオチト１７０６から１７２８に対応しており、８番目の残基が実際にアルギニンであって、ライトらの上記文献により誤って報告されたようにチロシンでないことが確認された。同様に、組み合わせ２は、翻訳されてエンテロキナーゼ軽鎖Ｎ末端蛋白配列（配列番号：１２）のＰｈｅ²⁰からＡｌａ⁴⁰となる６０塩基対の配列（そのうち２塩基対はすでに決定されていた）および重複ペプチド配列（配列番号：１３）を生じ、隣接ペブチド配列番号：１４は残基３４から開始することが示された。蛋白配列決定からは決定されなかったがトリプシン加水分解に感応する塩基性残基であると推定される位置３３の残基は、暗号配列からアルギニンであると決定された。３種すべてのＰＣＲ生成物をつなぎ合わせた場合に、全部で１０４塩基対の正確な連続暗号配列が、ウシ・エンテロキナーゼの触媒鎖のＡｓｐ⁶からＡｌａ⁴ ⁰ （およびＡ１ａ⁴¹に対するコドンの最初の２塩基）に関して決定された。この配列の情報が得られので、適当な成功の機会をもって、エンテロキナーゼの触媒ドメインをクローン化する試みがついに可能となった。実施例４エンテロキナーゼ触媒鎖のクローニング２つの別々のウシ・小腸ｃＤＮＡライブラリーを、エンテロキナーゼ触媒ドメインの関する遺伝子のクローニング用に使用した。上記実施例３記載のこの新たに決定されたヌクレオチド配列に対して設計された正確なプライマーを用いてウシ・肝臓および小腸ｃＤＮＡのλライブラリーに関してＰＣＲを行った。ウシ・肝臓由来のｃＤＮＡは、ライブラリー中の豊富さが非常に低いことを示す非常に弱い生成物を与えたが、小腸のライブラリーはずっと特異的な生成物を生じた。かくして、ウシ・小腸がｍＲＮＡ源として選択された。第１のｃＤＮＡライブラリーは、クローンテック（Clontech）から購入したλｇｔ１０ライブラリーであった。ラムダＺａｐライブラリーと呼ばれる第２のｃＤＮＡライブラリーは以下のようにして調製された。ウシ・十二指腸組織を得、グアニジウム抽出法［チャーグウィン（Chirgwin）ら，バイオケミストリー（Biochemistry）第１８巻：５２９４頁（１９７９年）］を用いて組織の一部からｍＲＮＡを調製した。標準的方法［サムブルックら，上記］を用いてオリゴ（ｄＴ）−プライムドｃＤＮＡを合成した。合成ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩアダプター（インビトロジェン（Invitrog en）製）を得られたｃＤＮＡにライゲーションし、次いで、ラムダＺａｐII ＥｃｏＲＩアーム（インビトロジェン製）中にライゲーションした。両方のｃＤＮＡライブラリー由来の組み換えファージを、実施例３のサブクローン化されたＰＣＲフラグメントから決定されたエンテロキナーゼＤＮＡ配列に対して相補的な２つの別個のオリゴヌクレオチドと２系でハイブリダイズさせた。第１のオリゴヌクレオチドは２１塩基の長さで、Λｓｐ⁶からＴｒｐ¹²に対する暗号配列のプラス鎖からなっていた。第２のオリゴヌクレオチドは２０塩基の長さで、Ａｓｐ³⁵からＡｌａ⁴¹までの残基に対する暗号配列のマイナス鎖からなっていた。［³²Ｐ］−γＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ［サムブルックら，上記］を用いてオリゴヌクレオチドを標識した。記載されたように［サムブルックら，上記］、以下の条件を用いてハイブリダイゼーションを行った：６ｘＳＳＣ）、０．５％ＳＤＳ、５ｘデンハーツ（Denhardt's）溶液、１０ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ酵母ＲＮＡ、および０．１ピコモル／ｍｌ標識オリゴヌクレオチド。６０℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った後、フィルターを室温で、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、４回（各１５分間）洗浄した。両方のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイスする配列を含む単一プラークを、クローンテックのライブラリー由来の１ｘ１０⁶個の組み換えファージから単離した。この組み換えファージ中の挿入物（クローン＃３ｅと呼ぶ）の配列は７６９塩基対であった。該挿入物は、先に配列決定された数個のトリブシン消化ペプチド（配列番号：１３、１４、１７）ならびに配列番号：１６の一部をコードしている長いオープンリーディングフレームを含んでいた。該リーディングフレームは該挿入物の３’末端を越えたところまでを含んでおり、該クローンが不完全であることが示された。さらに、該リーディングフレームは終止コドンの手前の別の２６個のコドンのために５’方向において開いたままであった。ラムダＺａｐIIウシ・小腸ｃＤＮＡライブラリーから、上記と同一の２つのオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションにより、５ｘ１０⁵個のファージがスクリーニングされた。オリゴヌクレオチドプローブに対して相補的なエンテロキナーゼ特異的配列を含む２個の組み換えファージのみが単離された。これらのうちの１つ（クローン＃１１と呼ぶ）は、１４９４塩基対の長さで、クローンテックのライブラリー由来のｃＤＮＡクローンに存在する軽鎖暗号配列のすべてを含んでいたが、軽鎖暗号配列の５’は異なっていた。該クローンは、残りの３ ’暗号配列および約８０塩基対の３’非翻訳配列をさらに含んでいた。このクローンは、成熟触媒鎖のＮ末端のＩＶＧＧに先行するオープンリーディングフレームの有意な伸長（２６６コドン伸長）およびこのクローンの５’リミットにおける残りのオープンを含んでおり、クローン３ｅとは異なっていた。第２のファージは、かなり小型でわずか５３１塩基対（配列番号：１，ヌクレオチド１５５３〜２０６８）の挿入物（クローン＃２２と呼ぶ）を有しており、その配列は第１のクローンに十分含まれるものであった。しかしながら、クローン＃２２に含まれるオープンリーディングフレームの最後の２１個のコドン（他の２つのｃＤＮＡクローン中には存在しない）は興味深いものであった（配列番号：１，ヌクレオチド２００６〜２１０１）。かくして、この配列がどこに適合するのか、そして／またはそれが単なるクローニングによる人工物であるのかどうかははっきりしなかった。実施例５異なるｃＤＮＡクローンの比較クローンテックのライブラリークローン＃３とクローン＃１１との比較により、該２つの配列は、ほとんど正確に、クローン＃３ｅの５’オープンリーディングフレームが終了する点で分岐していることが明らかとなった。この点の近傍のＤＮＡ配列を調べることにより、有効なｍＲＮＡスプライシング部位［パジェット（Padgett）ら，アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー（Ann.Rev .Biochem.）第５５巻：１１１９〜１１５０頁（１９８６年）］か明らかとなり、クローン＃３ｅが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を中断するスプライシングされないイントロンを含んでいる可能性がある。さらに、この可能性は、クローン＃１１中の成熟触媒鎖のＩＶＧＧＮ末端配列に直接先行するＯＲＦ配列に合う１５００００ダルトンの蛋白フラグメントから単離されたトリプシン消化配列：配列番号：２２ＬＶＴＱＥＶＳＰＫの同定によっても支持される。このトリプシン消化配列は、クローン＃３ｅにおける分岐配列により中断される。さらに、１５００００ダルトンのエンテロキナーゼ蛋白バンドから単離された２つの他のトリプシン消化ペプチド：配列番号：２３Ａ−ＦＴＴＧＹＧＬＧＩＰＥＰおよび配列番号：２４ＬＦ−ＧＴＴＤＳＳＧＬＶＱＦは、触媒鎖暗号配列の上流にあるクローン＃１１の翻訳されたＯＲＦの２つの領域に合致する。それゆえ、明らかに、この上流のＯＲＦは、非触媒鎖から成熟触媒鎖を分離する成熟触媒鎖Ｎ末端配列の直前の単一の蛋白開裂により生じると考えられる非触媒（重）鎖に対する暗号配列を表す。実施例６さらなるエンテロキナーゼ暗号配列の単離ｃＤＮＡ挿入物のクローニング部位に隣接したラムダＤＮＡ配列に相補的なネスティッドオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。これらのプライマーをラムダプライマーとして下に示す。さらに、上記エンテロキナーゼ暗号領域配列の大部分の５’領域のプラス鎖に相補的なプライマーを設計した。これらのプライマーをＥＫプライマーとして下に示す。最も深い部分のプライマーは、５’伸長を含み制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をコードするように設計された。ラムダプライマー配列番号：２５５’ＣＴＡＴＡＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＴＡＧＴＣＣＣＣ３’ 内側配列番号：２６次いで、ネスティッドＰＣＲを以下のように行った：各１００μ１の反応物は、クローンテックのウシ・小腸ラムダｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー由来の１ｘ１０⁸個の組み換えファージ、外側のプライマー各１マイクロモル、ｄＴＮＰ２００μＭ、およびアンプリタック（パーキン−エルマー・シータス）１ユニットを、最終濃度１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂中に含有していた。以下の条件下で３５サイクルを行った：９４℃１分；６５℃２分；７２℃２分。反応物から５マイルロリットルを取り、内側のプライマーおよび同じ反応条件を用いるさらなる３５サイクルのための鋳型として使用した。次いで、この反応からの生成物を、１％ポリアクリルアミドゲル上を泳動させ、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウム溶液で染色し、ＵＶライトで可視化した。得られたバンドを切り出し、電気溶出し、ｐBluescriptＳＫ＋（ストラタジーン（Stratagene）製）ＮｏｔＩ／ＳａｌＩベクター中へのサブクローニングの前にＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化した。得られたサブクローンを配列決定し、エンテロキナーゼ重鎖の別の１１６個のアミノ酸をコードしているさらなるＤＮＡ配列を決定した。この新たな蛋白配列は、１５０Ｋｄ蛋白バンドから単離された２個のさらなるトリプシン消化ペプチド（ＬＳ）ＩＮＩＳＳＤＱＮＭＥＫ［配列番号：２９］およびＶＳＦＹＧＦＫ［配列番号：３０］、ならびに９０Ｋｄ蛋白バンドからの別の配列ＱＫＥＧＮＹＧＱＮＷＮＹＧＱＶＴＬＮＥＴ［配列番号：３１］に対応する領域を含んでいた。さらに、９０Ｋｄバンド由来の２個の別々のＮ末端が配列決定され、両方とも、この配列において同定される：（ＶＧＬＬＴＬＰ...）［配列番号：３２］および（ＴＩＦＱＫ...）［配列番号：３３］。よって、還元されアルキル化されたウシ由来の酵素において見られる９０Ｋｄ蛋白バンドは、これらのゲル上で見かけ上１５０Ｋｄの位置に移動する重鎖の蛋白分解形態であるかもしれない。これら２つのＮ末端は両方とも塩基性残基に続いており、トリプシン様酵素がインタクトな重鎖のこの小型の形態（９０Ｋｄ）への蛋白分解に関与しているかもしれないことが示される。上記方法を用いて、各回ごとにこの方法を繰り返すことにより、完全な重鎖配列を得、さらなる５’を同定した。新たなネスティッドＰＣＲプライマーを大部分の５’配列に対して設計し、ウシ・小腸λｃＤＮＡライブラリー由来の１ｘ１０⁸個の組み換えファージでのネスティッドＰＣＲを行った。かくして、さらなる５’エンテロキナーゼ重鎖暗号配列を増幅し、サブクローン化し、配列決定し、全暗号配列が同定され単離されるまで手順を繰り返した。実施例７他の噛乳動物エンテロキナーゼ遺伝子をクローニングするためのウシ・エンテロキナーゼＤＮＡの使用。ウシ・エンテロキナーゼＤＮＡ配列の決定により、多くの他の哺乳動物種由来の等価な酵素に関する遺伝子の単離および配列決定が直接的に可能となる。本発明は、エンテロキナーゼ遺伝子が十二指腸において発現されることを明らかにし、そのことにより、種に関係なくエンテロキナーゼｍＲＮＡの組織源の不確実性が除去される。この情報は、十二指腸ｍＲＮＡから生じたｃＤＮＡがエンテロキナーゼ遺伝子を含んでいるであろうという確証を提供する。よって、実質的に、いかなる哺乳動物由来の十二指腸ｍＲＮＡから生じるｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ発現ライブラリーであっても、検索されるべき特別なエンテロキナーゼ蛋白に対する抗体を用いてスクリーニングすることができる。ウシ・酵素に対するポリクローナル抗体は、他の種から作成された発現ライブラリー由来のエンテロキナーゼクローンの同定に有用である。さらに、ウシ・酵素に対するｃＤＮＡ配列を、哺乳動物エンテロキナーゼ遺伝子に対するハイブリダイゼーションプローブとして直接使用することができ、あるいは、他の種のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡから作成されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー由来のエンテロキナーゼ遺伝子のクローニングに有用なオリゴヌクレオチドプローブの設計に使用することができる。基質認識配列のほとんど絶対的な保存性がある思われるという事実のために、エンテロキナーゼ触媒ドメイン蛋白配列は種間において高度に保存的であると仮定することは合理的である。全ウシ・エンテロキナーゼ触媒ドメインをハイブリダイゼーションプローブとして用いて緊縮性を減少させて他の種のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることは、所望のエンテロキナーゼ遺伝子の単離を可能にする。別法として、「触媒的な３個（catalytic triad）」、すなわち、Ｈｉｓ⁴¹、Ａｓｐ⁹²およびＳｅｒ¹⁸⁷の周囲の領域をコードしているＤＮＡ配列を包含するオリゴヌクレオチドは、最も高度に保存され、種間ハイブリダイゼーションに最も有用でありうる。実施例８ウシ・エンテロキナーゼの触媒ドメインをコードしている遺伝子の発現Ａ．ＣＨＯ細胞での発現１．ＰＡＣＥウシ・エンテロキナーゼ触媒ドメイン（ヌクレオチド１６９１から２３９８まで）をコードしているＤＮＡ配列を、ヒト・ＰＡＣＥ遺伝子のシグナルペプチドおよびプロ−領域をコードしているＤＮＡの３’末端に、フレーム中で融合させた。ＰＡＣＥは、二塩基性残基の後ろを開裂し、種々の分泌蛋白のブロペプチドのプロセッシングに関与している哺乳動物のセリンプロテアーゼである（ワイス（Wise）ら，プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）第８７巻：９３７８〜９８３２頁（１９９０年））。ＣＨＯ細胞において発現された場合、この配列は翻訳されてキメラ蛋白を生じ、続いて起こるシグナルペプチドのプロセッシングで分泌されてプロ−エンテロキナーゼを生じた。ＰＡＣＥプロペプチドは、成熟エンテロキナーゼ配列に関するＣ末端ジャンクションにおける配列（−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−）を含んでいる。これはＰＡＣＥ酵素のための開裂部位である。さらにＣＨＯ細胞は内在レベルのＰＡＣＥを産生する。ＰＡＣＥプロ／エンテロキナーゼ軽鎖の分泌の間、宿主のＰＡＣＥはエンテロキナーゼのＮ末端からプロペプチドを開裂し、ならし培地への成熟エンテロキナーゼ触媒ドメインの分泌を引き起こした。ウシ由来のエンテロキナーゼに対して生成されたウサギ・ポリクローナル抗血清を用いる免疫沈降実験により、ならし培地中に４２Ｋｄの生成物が分泌されることが明らかとなった。このならし培地は、蛍光発生性エンテロキナーゼ基質Ｇｌｙ−（Ａｓｐ）₄−Ｌｙｓ−βＮＡ（バケム・バイオサイエンス（BachemBio science）製）（細胞系により、約５０〜５００ｎｇ／ｍｌに相当）を含有していた。大豆・トリプシンインヒビター（ＳＴＩ，シグマ製）またはウシ・膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ，シグマ製）いずれによってもこの活性は阻害された。ウシ・ホロ酵素、すなわち、重鎖および軽鎖の両方を有する酵素は、ＢＰＴＩのみにより阻害され、ＳＴＩによっては阻害されないが、部分的に還元されアルキル化された軽鎖は両方により阻害されることが報告されている［ライト（Light）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem .）第２５９巻・１３１９５〜１３１９８頁（１９８４年）］。さらに、このならし培地を、エンテロキナーゼ開裂配列（−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ− Ｇｌｙ−［Ａｓｐ］₄−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−）からなるドメイン間スペーサーを有するイー・コリ（E.coli）・チオレドキシン／ヒト・ＩＬ−１１からなる部分精製融合蛋白とともにインキュベーションすると、この融合蛋白はすべて特異的にその２つの成分ドメイン（チオレドキシンおよびＩＬ−１１）に開裂され、スペーサー配列中のＬｙｓとＡｓｎとの間で開裂が起こっていた。さらに、このＣＨＯにより産生された組み換えエンテロキナーゼ触媒ドメインは、これと同じスペーサーを有する他の融合蛋白、例えば、イー・コリ・チオレドキシン／ヒト・ＭＩＰ−１α融合蛋白およびイー・コリ・チオレドキシン／ヒト・ＭＩＦ融合蛋白をその成分部分に特異的に開裂することができた。相対的モル活性（relative molar activity）は以下のようであった：開裂の効率基質ホロ酵素ＣＨＯにより産生された軽鎖 Gly-（Asp₄）-Lys-βNA １１トリプシノーゲン１００１Ｔｒｘ／ＩＬ−１１１２５全く驚くべきことに、ＣＨＯにより産生された軽鎖は、２個の蛋白ドメイン間にエンテロキナーゼ開裂部位を有するチオレドキシン／ＩＬ−１１融合蛋白を開裂させるのに使用した場合、ウシ由来の酵素よりも２５倍有効であった。この劇的な相違は、上記の他の融合蛋白についても同様である。さらに、ウシ由来のホロ酵素と一緒に精製された混入セリンプロテアーゼ（例えば、トリ，プシンおよびキモトリプシン）による二次的蛋白分解は、組み換え単鎖形態に関しては存在しなかった。かくして、組み換え単鎖エンテロキナーゼは、融合蛋白の開裂のための優れた試薬である。２．修飾ＰＡＣＥこの発現系は、経膜ドメインを欠失したＰＡＣＥ遺伝子の修飾バージョンの同時発現により改良された。レームツラ（Rehemtulla）ら，ブラッド（Blood）第７９巻：２３４９頁（１９９２年）。ＣＨＯ細胞における内在性ＰＡＣＥレベルは低く、高度に発現されたプロ−エンテロキナーゼをプロセッシングすることが不可能であるが、この過剰発現され分泌されたＰＡＣＥは、有効にＰＡＣＥプレ／プロ−エンテロキナーゼをプロセッシングし、エンテロキナーゼ過剰発現のためのより大きいプロセッシング能力を与える。かくして、高度な発現レベルにおいては、内在性ＰＡＣＥ活性は、プロセッシングされないままになっているいくらかのエンテロキナーゼに関して制限的となり、いくらかの不活性物質を生じる。可溶性ＰＡＣＥレベルを増大させることにより、適切にプロセッシングされ活性のある高レベルのエンテロキナーゼがならし培地中に蓄積される。３．トリプシノーゲンウシ・アニオン性トリプシノーゲンのプレ／プロ領域をコードしているＤＮＡ［リュールー（Le Heurou）ら，ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Eur.J.Biochem.）第１９３巻．７６７〜７７３頁（１９９０年）］が成熟エンテロキナーゼ触媒ドメインをコードしているＤＮＡ配列とフレーム中で融合している構築物を調製した。トリプシノーゲンのプロ領域は、エンテロキナーゼ開裂部位（Ａｓｐ₄−Ｌｙｓ）が天然基質であるために、これを含んでおり該構築物は、分泌されたエンテロキナーゼ「酵素前駆体」を、そのＮ末端に結合したトリプシノーゲンプロペプチドとともに生成するように設計された。次いで、該前駆体は、自己プロセッシングを開始させるためのエンテロキナーゼ添加により活性化されうる。ＣＨＯ細胞におけるこの構築物の発現は、大部分が細胞内蓄積となったが、分泌された少量の物質は、蛍光発生性エンテロキナーゼペプチドアッセイにおいて検出できないレベルの活性を示した。さらに、活性は、プロ蛋白へのエンテロキナーゼの添加によっては刺激されなかった。このキメラ蛋白は活性種を形成することができないと思われる。軽鎖は、大きな蛋白ドメイン（重鎖に類似）を伴った翻訳された融合体から恩恵を受けると推測された。該大きな蛋白ドメインは、翻訳後に除去されて軽鎖の活性コンフォーメーション形成を可能にする。Ｂ．イー・コリにおける発現溶解度を増大させ、真正のＮ末端を有するエンテロキナーゼを生成するために、触媒鎖に対する暗号配列を、フレーム中で、イー・コリ・ヂオレドキシン遺伝子［ルン（Lunn）ら，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー第２５９巻：１０４６９〜１０４７４頁（１９８４年）］の３’末端に、エンテロキナーゼ開裂部位（−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−［Ａｓｐ₄］−Ｌｙｓ）をコードしているスペーサーとともに融合させた。この構築物は、多コピープラスミド上のラムダｐＬプロモーター［シマタケ（Shimatake）ら，上記］の転写調節下にあり、チオレドキシン／エンテロキナーゼ触媒ドメイン融合蛋白の細胞質での発現を指令する。１７℃で発現された場合、発現された融合蛋白の一部は可溶性であり、低レベルの尿素（例えば、３Ｍ）の存在下で細胞を溶解させることにより十分な溶解度が達成されうる。この融合蛋白を細胞溶解物から精製し、エンテロキナーゼで開裂して活性エンテロキナーゼを得ることができる。この構築物の趣旨は、融合蛋白の自己触媒的プロセッシング、すなわち、開裂が少量の活性エンテロキナーゼ（ホロ酵素または触媒鎖いずれでもよい）により開始され、活性触媒鎖がその融合相手から遊離され、次いで、該活性触媒鎖が、反応系に残存する融合蛋白を開裂しつづけることを可能にすることである。イー・コリ細胞溶解物中に存在するエンテロキナーゼに対する阻害物質を除去するためには、少なくとも、融合蛋白の部分精製が必要である。特異的にＳＴＩにより阻害される活性軽鎖が生成される。別法として、他の融合相手を用いてもよい。例えば、有効な融合相手として記載された分泌蛋白であるイー・コリ・マルトース結合蛋白［マイナ（Maina）ら，ジーン（Gene）第７４巻：３６５頁（１９８８年）］がうまく用いられた。我々は、他の融合方法も、正しいフォールディングをさせるのにに役立ち、真正で活性のあるエンテロキナーゼ軽鎖を精製する手段を提供すると予想する。Ｃ．サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）における発現１．ＰＡＣＥ成熟ウシ・エンテロキナーゼ触媒鎖に対する暗号配列の５’末端に融合したＰＡＣＥプレ／プロ配列を用いる、ＣＨＯ細胞における使用について記載された発現構築物を、サッカロミセス・セレビシエからのエンテロキナーゼ分泌に使用することもできる。この酵母は、ＰＡＣＥと同様に二塩基性残基のＣ末端側を開裂するＫｅｘ２と呼ばれる酵素を産生することが示されている［ジュリアス（Juli us）ら，セル（Cell）第３７巻：１０７５頁（１９８４年）］。酵母・ｋｅｘ２遺伝子とＰＡＣＥプレ／プローウシ・エンテロキナーゼ軽鎖構築物とのＣＯＳ細胞における同時発現は、ＰＡＣＥプレ／プロ配列の完全なプロセッシングを引き起こし、ウシ・エンテロキナーゼ抗血清と免疫沈降可能で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で生成物を分離するとＰＡＣＥによりプロセッシングされたエンテロキナーゼ軽鎖と一緒に移動する生成物を生じる。このキメラ構築物（咄乳動物のＰＡＣＥ分泌リーダーおよび成熟ウシ・エンテロキナーゼ軽鎖配列が後に続くプロペプチド配列）に対する暗号配列を酵母発現ベクター中に挿入して融合蛋白を産生させ分泌させた。宿主のＫｅｘ２蛋白は、Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇに続くＰＡＣＥプロペプチドを開裂し、正しくプロセッシングされた成熟エンテロキナーゼ軽鎖の分泌を引き起こすと期待される。Ｋｅｘ２蛋白は同時発現されて、必要ならばプロセッシング活性を増加させるかもしれない。Ｋｅｘ２のかかる過剰発現は、ネイティブな蛋白またはブレナー（Brenner）らの上記文献に記載されたＣ末端経膜ドメインを欠く可溶性誘導体を伴って行われるかもしれない。この形態のＫｅｘ２は、ＣＨＯ細胞での発現に使用したＰＡＣＥプレ／プローウシ・エンテロキナーゼ軽鎖とともに同時発現される可溶性ＰＡＣＥに類似である。別法として、哺乳動物ＰＡＣＥを、酵母において同時発現させて、宿主内在性レベルのＫｅｘ２の存在または不存在いずれにおいてもキメラなエンテロキナーゼ構築物のプローペプチドのプロセッシングを強調することもできる。２．α−因子別法として、成熟ウシ・エンテロキナーゼ軽鎖に対する暗号配列を、例えば、エス・セレビシエ由来のα−因子蛋白（自然に分泌され、次いで、Ｋｅｘ２によりプロセッシングされる蛋白）［ジュリアスら，セル第３２巻：８３９頁（１９８３年）］の分泌リーダーおよびプロ−ペプチドに対する暗号配列に融合させることもできる。この構築物は、上記の他の構築物と同様の物質、すなわち、活性形態で培地中に蓄積する正しくプロセッシングされた活性のあるエンテロキナーゼ軽鎖を生成すると期待される。実施例９融合蛋白および活性エンテロキナーゼの同時発現いくつかの状況において有利な配置は、あとで開裂される融合蛋白とともに活性エンテロキナーゼを同時発現する。該融合物は、増殖および融合蛋白合成の間の細胞の仕切り形成により隔離され、そのことにより、融合蛋白の所望の効果（例えば安定化、溶解性）が残される。次いで、細胞溶解により、活性エンテロキナーゼが、発現された融合蛋白と混合される（混じり合わされる）。これを行うための１つの方法は、細胞質で融合蛋白を産生させつつ、活性エンテロキナーゼをイー・コリのペリプラズム空間中に分泌させることである。他の方法は同じように、例えば、ＣＨＯでの上記活性エンテロキナーゼの生産のために用いられるＰＡＣＥとＰＡＣＥプロ／エンテロキナーゼとの同時分泌に類似の、ＣＨＯ細胞におけるエンテロキナーゼと融合蛋白の同時分泌に適する可能性がある。もう１つの方法は、エンテロキナーゼ融合蛋白（例えば、その間にエンテロキナーゼ開裂部位を有するＴｒｘ／エンテロキナーゼ軽鎖）と、さらにドメイン間にエンテロキナーゼ部位を有する所望蛋白生成物を含む融合蛋白との同時発現である。エンテロキナーゼは、精製されるまでは、そして自己触媒が起こるまでに濃縮されるまでは不活性のままであると考えられ、その後、同時精製された所望融合蛋白もプロセッシングされるであろう。実施例１０治療薬としてのエンテロキナーゼの使用蛋白を消化する能力が重大に損傷を受けているヒトの症状がある［ハドーン（ Hadorn）ら，ランセット（Lancet）第１巻：８１２〜８１３頁（１９６９年）；ターロウ（Tarlow）ら，アーカイブス・オブ・ディジーズ・イン・チャイルドフッド（Arch.Dis.Child.）第４５巻：６５１〜６５５頁（１９７０年）］。これらの患者についての研究により、患者らは、起こるべき消化に関与する多くの膵臓酵素前駆体を順次活性化するトリプシンへのトリプシノーゲンの変換に必要なエンテロキナーゼの産生能を欠いていることが明らかとなった。これらの患者由来の十二指腸液は、インビトロにおいてトリプシノーゲンを活性化できないが、この十二指腸液に精製エンテロキナーゼを添加すると蛋白分解酵素が活性化され、不活性な酵素前駆体が存在し、これが活性化されうることが示唆される［ハドーン（Hadorn）ら，上記］。この症状は、過去においては、膵臓抽出物を用いて治療されていた。この症状に、組み換え型エンテロキナーゼを治療薬として使用してもよい。経口投与されるように処方した場合、該酵素は十二指腸に入り、そこで、大膵管から入ってくる不活性な酵素前駆体と出会う。そこで、エンテロキナーゼはトリプシノーゲンを活性化し、これが他の酵素前駆体を順次活性化し、正しい消化が進行する。ヒト型のエンテロキナーゼ遺伝子は、この症状を直す遺伝子治療にも有用であるかもしれない。上記説明的実施例は、エンテロキナーゼ活性をコードしている核酸配列の単離および特徴付け、ならびに対応する蛋白およびポリペプチドを得るための該核酸配列の転写および翻訳に関するものである。重鎖および軽鎖を一緒にした、あるいは軽鎖のみでのこれらの蛋白の使用も記載されている。本発明は、特定の方法および組成物に関して記載されているが、本発明を考慮して、当業者により種々の変更および修飾がなされるであろうということが理解される。上記説明的実施例に記載された本発明における多くの修飾および変更が当業者により行われ、結果的に、添付された請求の範囲にある限定のみがそれらに課される。したがって、権利請求される本発明の範囲内のすべてのかかる等価な変更を包含することが、添付された請求の範囲において意図される。配列表（１）一般的情報：（ｉ）出願人（Ａ）名称：ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド（Ｂ）通り名：ケンブリッジ・パーク・ドライブ８７番（Ｃ）都市名：ケンブリッジ（Ｄ）州名：マサチューセッツ（Ｅ）国名：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：０２１４０（Ｇ）電話番号：（６１７）８７６−１１７０（Ｈ）テレファックス番号：（６１７）８７６−５８５１（ｉｉ）発明の名称：エンテロキナーゼのクローニングおよび使用方法（ｉｉｉ）配列の数：３３（ｉｖ）コンピューター・リーダブル・フォーム：（Ａ）媒体形式：フロッピーディスク（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）操作システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：ＰａｔｅｎｔＩｎＲｅｌｅａｓｅ＃１．０，バージョン＃１．２５（ＥＰＯ）（２）配列番号：１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５８１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１：（２）配列番号：２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７９８アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２：（２）配列番号：３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３：（２）配列番号：４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：４：（２）配列番号：５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：５：（２）配列番号：６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：６：（２）配列番号：７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：７：（２）配列番号：８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）１ポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：８：（２）配列番号：９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１７塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：９：（２）配列番号：１０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１０：（２）配列番号：１１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１１：（２）配列番号：１２に関する情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）配列の長さ：３０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１２：（２）配列番号：１３に関する情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２４アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１３：（２）配列番号：１４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１４：（２）配列番号：１５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１５：（２）配列番号：１６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１６：（２）配列番号：１７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１７：（２）配列番号：１８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：６アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１８：（２）配列番号：１９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２６塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：１９：（２）配列番号：２０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２０：（２）配列番号２１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２８塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２１：（２）配列番号：２２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：９アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２２：（２）配列番号：２３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２３：（２）配列番号：２４に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２４：（２）配列番号：２５に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２５：（２）配列番号：２６に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：４１塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２６：（２）配列番号：２７に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２５塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２７：（２）配列番号：２８に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：３３塩基対（Ｂ）配列の型：核酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２８：（２）配列番号：２９に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：１３アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：２９：（２）配列番号：３０に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３０：（２）配列番号：３１に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：２０アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３１：（２）配列番号：３２に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：７アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３２：（２）配列番号３３に関する情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）配列の長さ：５アミノ酸（Ｂ）配列の型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：１本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：蛋白（ｘｉ）配列の記載：配列番号：３３：

【手続補正書】【提出日】１９９５年８月４日【補正内容】（別紙）補正した請求の範囲１．エンテロキナーゼ活性をコードしている単離核酸配列からなる核酸配列。２．哺乳動物のエンテロキナーゼをコードしている請求項１の核酸配列。３．ウシ・エンテロキナーゼをコードしている請求項１の核酸配列。４．ヒト・エンテロキナーゼをコードしている請求項１の核酸配列。５．ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、および合成ＤＮＡからなる群より選択される請求項１の核酸配列。６．請求項１の核酸配列であって、実質的に配列番号：１に示す配列からなる核酸配列。７．エンテロキナーゼ活性をコードしている核酸配列からなり、配列番号：１に示す配列のヌクレオチド１６９１からヌクレオチド２３９８までを実質的に複製した配列からなる核酸配列。８．配列番号：１からなる核酸配列よりなる核酸配列。９．配列番号：１のヌクレオチド１６９１から２３９８までからなる核酸配列よりなる核酸配列。１０．エンテロキナーゼ活性をコードしている核酸配列であって、（ａ）実質的に配列番号：１に示す核酸配列（ｂ）緊縮条件下で（ａ）にハイブリダイズする核酸配列、および（ｃ）遺伝暗号の縮重がなければ（ａ）にハイブリダイズするであろう核酸配列からなる群より選択される配列。１１．さらにプレ−領域、プロ−領域、およびプレ／プロ領域からなる群より選択される構成員をコードしている第２の核酸配列からなる請求項１の核酸配列。１２．該第２の核酸配列が、ＰＡＣＥのプレ／プロ領域、トリプシノーゲンのプレ／プロ領域、および酵母・α−因子のプレ／プロ領域からなる群より選択される構成員である請求項１１の核酸配列。１３．さらにチオレドキシン様分子をコードしている第２の核酸配列からなる請求項１の核酸配列。１４．請求項１の核酸配列で形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。１５．請求項１記載の核酸配列からなる核酸配列ベクター。１６．さらに該核酸配列に作動するように連結された発現調節配列からなる請求項１５のベクター。１７．ＡＴＣＣ受託番号６９２３２として寄託されたプラスミドｐＥＫ−２／ＧＩ７３４に相当する請求項１５のベクター。１８．請求項１の核酸配列の発現産物。１９．（ａ）請求項１４の宿主細胞を培養して増殖させ、次いで（ｂ）該宿主細胞または培養物から該核酸配列のポリペプチド発現産物を単離するからなるエンテロキナーゼ活性の製造方法。２０．（ａ）請求項１記載の核酸配列を無細胞転写および翻訳系において処理し、次いで（ｂ）該核酸配列の発現のポリペプチド産物を該系から単離するからなるエンテロキナーゼ活性を有する蛋白の製造方法。２１．請求項１の核酸配列のインビボまたはインビトロ発現のポリペプチド産物。２２．エンテロキナーゼ中に存在またはエンテロキナーゼだけにあるアミノ酸配列の複製である合成ペプチド。２３．請求項２１記載のポリペプチドと特異的に免疫反応性のある抗体。２４．医薬上許容される担体中の請求項２１記載の治療上有効量のエンテロキナーゼ活性からなる、低レベルのエンテロキナーゼに関連した疾患の治療に使用する医薬組成物。２５．蛋白を請求項１の発現産物で開裂する段階からなる蛋白の開裂方法。２６．（ａ）（ｉ）エンテロキナーゼ活性をコードしており、発現するとペリプラズム空間中に隔離される核酸配列、および（ｉｉ）融合蛋白ならびにエンテロキナーゼ開裂部位をコードしており、発現されると細胞質空間に隔離される１種またはそれ以上の核酸配列で形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養して増殖させ、（ｂ）該ペリプラズム空間および該細胞質空間を混ぜ合わせ、それにより、（ｃ）該エンテロキナーゼ活性に該融合蛋白を開裂させ、次いで（ｄ）蛋白産物を得るの段階からなる融合蛋白からの蛋白の製造方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 9284−4Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】１．エテロキナーゼ活性をコードしている単離核酸配列からなる核酸配列。２．哺乳動物のエンテロキナーゼをコードしている請求項１の核酸配列。３．ウシ・エンテロキナーゼをコードしている請求項１の核酸配列。４．ヒト・エンテロキナーゼをコードしている請求項１の核酸配列。５．ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ、および合成ＤＮＡからなる群より選択される請求項１の核酸配列。６．請求項１の核酸配列であって、実質的に配列番号：１に示す配列からなる核酸配列。７．エンテロキナーゼ活性をコードしている核酸配列からなり、配列番号：１に示す配列のヌクレオチド１６９１からヌクレオチド２３９８までを実質的に複製した配列からなる核酸配列。８．配列番号．１からなる核酸配列よりなる核酸配列。９．配列番号：１のヌクレオチド１６９１から２３９８までからなる核酸配列よりなる核酸配列。１０．エンテロキナーゼ活性をコードしている核酸配列であって、（ａ）実質的に配列番号：１に示す核酸配列（ｂ）緊縮条件下で（ａ）にハイブリダイズする核酸配列、および（ｃ）遺伝暗号の縮重がなければ（ａ）にハイブリダイズするであろう核酸配列からなる群より選択される配列。１１．さらにプレ−領域、プロ−領域、およびプレ／プロ領域からなる群より選択される構成員をコードしている第２の核酸配列からなる請求項１の核酸配列。１２．該第２の核酸配列が、ＰＡＣＥのプレ／プロ領域、トリプシノーゲンのプレ／プロ領域、および酵母・α−因子のプレ／プロ領域からなる群より選択される構成員である請求項１１の核酸配列。１３．さらにチオレドキシン様分子をコードしている第２の核酸配列からなる請求項１の核酸配列。１４．請求項１の核酸配列で形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。１５．請求項１記載の核酸配列からなる核酸配列ベクター。１６．さらに該核酸配列に作動するように連結された発現調節配列からなる請求項１５のベクター。１７．ＡＴＣＣ受託番号６９２３２として寄託されたプラスミドｐＥＫ−２／ＧＩ７３４に相当する請求項１５のベクター。１８．請求項１の核酸配列の発現産物。１９．（ａ）請求項１３の宿主細胞を培養して増殖させ、次いで（ｂ）該宿主細胞または培養物から該核酸配列のポリペプチド発現産物を単離するからなるエンテロキナーゼ活性の製造方法。２０．（ａ）請求項１記載の核酸配列を無細胞転写および翻訳系において処理し、次いで（ｂ）該核酸配列の発現のポリペプチド産物を該系から単離するからなるエンテロキナーゼ活性を有する蛋白の製造方法。２１．請求項１の核酸配列のインビボまたはインビトロ発現のポリペプチド産物。２２．エンテロキナーゼ中に存在またはエンテロキナーゼだけにあるアミノ酸配列の複製である合成ペプチド。２３．請求項２１記載のポリペプチドと特異的に免疫反応性のある抗体。２４．請求項２１記載のポリペプチドを投与する段階からなる、低レベルのエンテロキナーゼに関連した疾患を治療する方法。２５．請求項１の核酸配列を投与する段階からなる、低レベルのエンテロキナーゼに関連した疾患を治療する方法。２６．医薬上許容される担体中の請求項２１記載の治療上有効量のエンテロキナーゼ活性からなる、低レベルのエンテロキナーゼに関連した疾患の治療に使用する医薬組成物。２７．蛋白を請求項１の発現産物で開裂する段階からなる蛋白の開裂方法。２８．（ａ）（ｉ）エンテロキナーゼ活性をコードしており、発現するとペリプラズム空間中に隔離される核酸配列、および（ii）融合蛋白ならびにエンテロキナーゼ開裂部位をコードしており、発現されると細胞質空間に隔離される１種またはそれ以上の核酸配列で形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞を培養して増殖させ、（ｂ）該ペリプラズム空間および該細胞質空間を混ぜ合わせ、それにより、（ｃ）該エンテロキナーゼ活性に該融合蛋白を開裂させ、次いで（ｄ）蛋白産物を得るの段階からなる融合蛋白からの蛋白の製造方法。