JP2013537802A - プロテアーゼ操作を介した代謝経路におけるフラックスの制御のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2010年8月31日に出願された米国仮出願U.S.S.N. 61/378,828の35 U. S. C.§119(e)に基づく優先権を主張し、該仮出願は、本明細書に参照により組み込まれる。
微生物宿主において、合成酵素の経路を介して化学物質を生産することは、イソプレノイド、ポリケチド、非リボソーム性のペプチド、バイオプラスチック、および化学的構成要素を含む多くの重要なクラスの分子に有用であることが証明されている。合成生物学は、生物情報に固有のモジュール性により、微生物で生産した化合物のこのリストをさらにもっと広げる可能性を多いに有する。とはいえ、宿主細胞の代謝ネットワークに新規生化学的経路を埋め込むことによって、細胞が何千年にもわたって徐々に進化させてきた繊細な調節機構が破壊される可能性もある。操作された細胞の代謝への悪影響は、細胞内で起こる複雑な相互作用についての理解が限られているため予測することが難しく、実際に化合物の最終的な収率はしばしば制限されてしまう。細胞内資源の制御されない消費、異種タンパク質生産による代謝負担、および宿主に対して抑制性または毒性である経路中間体/産物の蓄積はすべて、全体の収率を制限し得る大きな問題である。
目的の経路に関与する酵素と競合する標的酵素の改変を介して代謝経路フラックスを制御するための、システム、組成物および方法が提供され、これは、細胞増殖期の間の標的酵素の細胞濃度を維持または変化させる改変と、その後の、目的の経路の生成物が生成される生成期の間の標的酵素の濃度を低下させる操作とを含む。細胞増殖期は、必然的に完全な(intact)細胞を伴うが、生成期は、かかる細胞のライセートにより行ってもよい。
本明細書に記載されるシステム、組成物および方法は、目的の経路に関与する酵素と競合する標的酵素の遺伝子改変を介して代謝経路のフラックスを制御するために、遺伝子改変された細胞を操作することができるという概念に基づいており、これは、細胞増殖期の間の標的酵素の細胞濃度を維持または改変する遺伝子改変と、その後の、目的の経路の生成物が生成される生成期の間の活性な標的酵素の濃度を低下させる操作とを含む。生成期の間に、部位特異的プロテアーゼによる酵素の切断の結果として、標的酵素の不活化がもたらされる。部位特異的プロテアーゼは、内因性プロテアーゼであっても外因性プロテアーゼであってもよい。ある態様において、標的酵素は、部位特異的プロテアーゼにより切断されるモチーフ(例えば部位特異的プロテアーゼ認識部位)を含むように遺伝子改変される。
目的の生成物の高収率生成は、目的の経路を含む細胞質酵素が、例えば生理学的に正常なレベルで、または生理学的に正常なレベルよりも高く発現される細胞を提供することにより達成され、ここで、前記経路に関与する少なくとも1の標的酵素は、(a)正常なレベルで発現され、および(b)部位特異的プロテアーゼのための不活化認識物を含む。一部の態様において、部位特異的プロテアーゼは、細胞において発現されるが、それが標的酵素と接触しない部位へ再配置される。
本明細書において用いられる場合、用語「酵素経路」または「目的の経路」とは、基質を目的の生成物へと転換するための細胞または無細胞(セルフリー)のシステムを指し、ここで、該システムは、複数の酵素を含み、さらに、酵素の1または2以上により作用される基質、酵素触媒反応の生成物、酵素により利用される補助因子などを含んでもよい。システムは、完全な細胞において存在しても、細胞のライセート中に存在してもよい。微生物システムにおける多くの代謝経路が既知であって、記載されており、公共のデータベースにおいてアクセス可能である:例えば、Smolke編、The Metabolic 経路 Engineering Handbook: Tools and Applications, CRC Press, New York (2009);Stephanopoulos、NielsenおよびAristidou編、Metabolic Engineering: Principles and Methodology, Academic Press, New York (1998);Greenberg, Metabolic Pathways: Energetics, Tricarboxylic Acid Cycle, and Carbohydrates, Academic Press, New York (1967);ならびにD.M. Greenbergの複数巻のシリーズである表題Metabolic Pathways、第1〜7巻を参照:これらの各々は本明細書に参照により組み込まれる。
a)抗生物質;例えば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、リファマイシン、クロラムフェニコール、カルバペネム、テトラサイクリン、リンコマイシン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、サイクロセリン、バシトラシン、ペニシリン、セファロスポリン、バンコマイシン、ポリミキシンおよびグラミシジン;
b)生物系界面活性剤;例えば、ラムノリピド(rhamnolipid)、ソホロリピド(sophorolipid)、糖脂質およびリポペプチド;
c)生物燃料;例えば、バイオエタノール、バイオディーゼルおよびバイオブタノール;
d)アミノ酸;例えば、L−グルタミン酸、L−リジン、L−フェニルアラニン、L−アスパラギン酸、L−イソロイシン、L−バリン、L−トリプトファン、L−プロリン(ヒドロキシプロリン)、L−スレオニン、L−メチオニン、L−チロシンおよびD−p−ヒドロキシフェニルグリシン;
e)有機酸;例えば、クエン酸、乳酸、グルコン酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、フマル酸およびイタコン酸;
f)脂肪酸;例えば、アラキドン酸、多価不飽和脂肪酸(PUBA)およびα−リノール酸;
g)アルコールおよびポリオール;例えば、グリセロール、マンニトール、エリスリトール、キシリトール、ポリ−3−ヒドロキシ酪酸、イソブタノールおよびl−ブタノール;
h)フレーバーおよびフレグランス;例えば、バニリン、ベンズアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、4−(R)−デカノリドおよび2−アセチル−1−ピロリン;
i)ヌクレオチド;例えば、5’−グアニル酸および5’−イノシン酸;
j)ビタミン;例えば、ビタミンC、ビタミンF、ビタミンB2、プロビタミンD2、ビタミンB12、葉酸、ニコチンアミド、ビオチン、2−ケト−L−グロン酸およびプロビタミンQ10;
k)色素;例えば、アスタキサンチン、β−カロテン、ロイコペン(leucopene)、モナスコルビン(monascorubrin)およびルブロプンクタチン(rubropunctatin);
l)糖および多糖;例えば、リボース、ソルボース、キサンタン、ジェランおよびデキストラン;ならびに
m)バイオポリマーおよびプラスチック;例えば、ポリヒドロキシアルカノアート(PHA)、ポリ−γ−グルタミン酸および1,3−プロパンジオール。
(EC1)酸化還元酵素;例えば、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、レダクターゼ、酸化還元酵素、シンターゼ、オキシゲナーゼ、モノオキシゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、リポキシゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ、トランスヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、エポキシダーゼ、ヒドロキシラーゼ、デメチラーゼ、デサチュラーゼ、ジスムターゼ、ヒドロキシルトランスフェラーゼ、デハロゲナーゼおよびデヨードナーゼ;
(EC2)トランスフェラーゼ;例えば、トランスアミナーゼ、キナーゼ、ジキナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、ホルムイミノトランスフェラーゼ、カルボキシトランスフェラーゼ、カルバモイルトランスフェラーゼ、アミジノトランスフェラーゼ、トランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、パルミトイルトランスフェラーゼ、スクシニルトランスフェラーゼ、マロニルトランスフェラーゼ、ガロイルトランスフェラーゼ、シナポイルトランスフェラーゼ、チグロイルトランスフェラーゼ、テトラデカノイルトランスフェラーゼ、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ、フェルロイルトランスフェラーゼ、ミコリル(mycolyl)トランスフェラーゼ、ベンゾリルトランスフェラーゼ、ピペロイルトランスフェラーゼ、トリメチルトリデカノイルトランスフェラーゼ、ミリストイルトランスフェラーゼ、クマロイルトランスフェラーゼ、チオラーゼ、アミノアシルトランスフェラーゼ、ホスホリラーゼ、ヘキソシルトランスフェラーゼ、ペントシルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、ピリジニラーゼ、ジホスホリラーゼ、シクロトランスフェラーゼ、スルフリラーゼ、アデノシルトランスフェラーゼ、カルボキシビニルトランスフェラーゼ、イソペンテニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、ジメチルアリルトランスフェラーゼ、ファルネシルトランストランスフェラーゼ、ヘキサプレニルトランストランスフェラーゼ、デカプレニルシストランスフェラーゼ、ペンタプレニルトランストランスフェラーゼ、ノナプレニルトランスフェラーゼ、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、アミノカルボキシプロピルトランスフェラーゼ、オキシイミノトランスフェラーゼ、プリントランスフェラーゼ、ホスホジスムターゼ、ホスホトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、コリンホスホトランスフェラーゼ、ホスホリルムターゼ、スルファートランスフェラーゼ、スルホトランスフェラーゼおよびCoA−トランスフェラーゼ;
(EC3)ヒドロラーゼ;例えば、リパーゼ、エステラーゼ、アミラーゼ、ペプチダーゼ、ヒドロラーゼ、ラクトナーゼ、デアシラーゼ、デアセチラーゼ、フェオホルビダーゼ(pheophorbidase)、デポリメラーゼ、チオールエステラーゼ、ホスファターゼ、ジホスファターゼ、トリホスファターゼ、ヌクレオチダーゼ、フィターゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、シクラーゼ、オリゴヌクレオチダーゼ、リボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、ヌクレオシダーゼ、グリコシラーゼ、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、オメガ−ペプチダーゼ、セリンエンドペプチダーゼ、システインエンドペプチダーゼ、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、スレオニンエンドペプチダーゼ、アミナーゼ、アミダーゼ、デスクシニラーゼ、デホルミラーゼ、アシラーゼ、デイミナーゼ、デアミナーゼ、ジヒドロラーゼ、シクロヒドロラーゼ、ニトリラーゼ、ATPアーゼ、GTPアーゼ、ハリダーゼ(halidase)、デハロゲナーゼおよびスルホヒドロラーゼ;
(EC4)リアーゼ;例えば、デカルボキシラーゼ、カルボキシラーゼ、カルボキシキナーゼ、アルドラーゼ、エポキシリアーゼ(epoxylyase)、オキソ酸リアーゼ、炭素−炭素リアーゼ、デヒドラターゼ、ヒドラターゼ、シンターゼ、エンドリアーゼ、エキソリアーゼ、アンモニアリアーゼ、アミジンリアーゼ、アミンリアーゼ、炭素−硫黄リアーゼ、炭素−ハライドリアーゼ、リン−酸素リアーゼおよびデヒドロクロリナーゼ(dehydrochlorinase);
(EC5)イソメラーゼ;例えば、イソメラーゼ、ラセマーゼ、ムターゼ、トートメラーゼ、ホスホムターゼ、ホスホグルコムターゼ、アミノムターゼ、シクロイソメラーゼ、シクラーゼ、トポイソメラーゼ;ならびに
(EC6)リガーゼ;例えば、シンテターゼ、tNRA−リガーゼ、酸−チオールリガーゼ、アミドシンターゼ、ペプチドシンターゼ、シクロリガーゼ、カルボキシラーゼ、DNAリガーゼ、RNAリガーゼおよびシクラーゼ。
(EC1.1)ドナーのCH−OH基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.2)ドナーのアルデヒドまたはオキソ基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.3)ドナーのCH−CH基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.4)ドナーのCH−NH2基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.5)ドナーのCH−NH基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.6)NADHまたはNADPHおよびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.7)ドナーとしての他の窒素含有化合物およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.8)ドナーの硫黄基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.9)ドナーのヘム基およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.1)ドナーとしてのジフェノールおよび関連する物質およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.11)アクセプターとしてのぺルオキシドに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.12)ドナーとしての水素およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.13)1または2個の酸素原子を組み込む分子酸素の組み込みを伴う単独ドナーに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.14)分子酸素の組み込みまたは還元を伴い、ドナーが2−オキソグルタル酸、NADH、NADPH、還元フラビン、フラボタンパク質、プテリジン、鉄−硫黄タンパク質、アスコルビン酸である、対のドナーに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.15)アクセプターとしてのスーパーオキシドラジカルに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.16)金属イオンおよびアクセプターを酸化する酸化還元酵素;
(EC1.17)CHまたはCH2基、およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.18)ドナーとしての鉄−硫黄タンパク質およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.19)ドナーとしての還元フラボドキシンおよびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;
(EC1.2)ドナー中のリンまたはヒ素およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;ならびに
(EC1.21)X−Y結合を形成するX−HおよびY−H、およびアクセプターに対して作用する酸化還元酵素;ここで、各々のドナー分類についてのアクセプターとして、限定されないが、NAD、NADP、ヘムタンパク質、酸素、ジスルフィド、キノン、鉄−硫黄タンパク質、フラビン、窒素含有基、チトクロム、二窒素、およびH+が挙げられ得る。
(EC2.1)1炭素基を転移するトランスフェラーゼ;
(EC2.2)アルデヒドまたはケトン基を転移するトランスフェラーゼ;
(EC2.3)アシルトランスフェラーゼ;
(EC2.4)グリコシルトランスフェラーゼ;
(EC2.5)メチル基以外のアルキルまたはアリール基を転移するトランスフェラーゼ;
(EC2.6)窒素含有基を転移するトランスフェラーゼ;
(EC2.7)リン含有基を転移するトランスフェラーゼ;
(EC2.8)硫黄含有基を転移するトランスフェラーゼ;ならびに
(EC2.9)セレン含有基を転移するトランスフェラーゼ。
(EC3.1)エステル結合に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.2)グリコシラーゼ;
(EC3.3)エーテル結合に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.4)ペプチド結合に対して作用するヒドロラーゼ(ペプチダーゼ);
(EC3.5)ペプチド結合以外の炭素−窒素結合に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.6)酸無水物に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.7)炭素−炭素結合に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.8)ハライド結合に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.9)ゼリン−窒素結合に対して作用するヒドロラー;
(EC3.1)硫黄−窒素結合に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.11)炭素−リン結合に対して作用するヒドロラーゼ;
(EC3.12)硫黄−硫黄結合に対して作用するヒドロラーゼ;ならびに
(EC3.13)炭素−硫黄結合に対して作用するヒドロラーゼ。
(EC4.1)炭素−炭素リアーゼ;
(EC4.2)炭素−酸素リアーゼ;
(EC4.3)炭素−窒素リアーゼ;
(EC4.4)炭素−硫黄リアーゼ;
(EC4.5)炭素−ハライドリアーゼ;ならびに
(EC4.6)リン−酸素リアーゼ。
(EC5.1)ラセマーゼおよびエピマラーゼ;
(EC5.2)シス−トランス−イソメラーゼ;
(EC5.3)分子内イソメラーゼ;
(EC5.4)分子内トランスフェラーゼ(ムターゼ);ならびに
(EC5.5)分子内リアーゼ。
(EC6.1)炭素−酸素結合を形成するリガーゼ;
(EC6.2)炭素−硫黄結合を形成するリガーゼ;
(EC6.3)炭素−窒素結合を形成するリガーゼ;
(EC6.4)炭素−炭素結合を形成するリガーゼ;
(EC6.5)リン酸エステル結合を形成するリガーゼ;ならびに
(EC6.6)窒素−金属結合を形成するリガーゼ。
「フラックス」または「代謝フラックス」とは、分子が目的の経路または反応を通過する速度を指す。フラックスを制御する因子の中には、経路における酵素の触媒の速度、基質のアベイラビリティー、細胞における酵素の濃度、および/または経路における酵素の近接度がある。
本明細書において用いられる場合、当該用語は、特異的なアミノ酸モチーフで選択的に切断するプロテアーゼ、例えばエンドプロテアーゼを指す。一部の態様において、アミノ酸モチーフは、バックグラウンドのタンパク質切断を低減するために、少なくとも4アミノ酸残基のモチーフであり、少なくとも5アミノ酸、少なくとも6アミノ酸またはそれより多いアミノ酸のモチーフであってよい。かかるプロテアーゼは、当業者に既知であり、限定することなく、タバコエッチ病ウイルスプロテアーゼ(ENLYFQG/S);黄熱病ウイルスプロテアーゼ(GARRG/S);トロンビン(LVPRGS);ならびにXa因子(IE/DGR)を含む。
上記のように、部位特異的プロテアーゼは、配列特異的な様式で、例えばENLYFQG/S、GARRG/S、LVPRGSまたはIE/DGRで、標的酵素を切断する。本明細書に記載される方法は、部分的に、部位特異的プロテアーゼ消化および結果としての不活化に対して不安定な標的酵素を作製するために、標的となる遺伝子配列の改変を利用する。さらに、部位特異的プロテアーゼは、目的の経路の酵素がプロテアーゼにより切断されないように選択してもよい。
一部の態様において、部位特異的プロテアーゼの再配置は、細胞の周辺質空間へのものである。かかる側面において、本明細書に記載されるのは、細胞を作製する方法、ライセート、およびそれらの使用であり、それにより、プロテアーゼは、プロテアーゼの周辺質への標的化をもたらすペプチド再配置配列を組み込むように、遺伝子改変される。周辺質再配置配列(また、本明細書において、標的化ペプチド配列、標的化シグナル、シグナルペプチドまたはシグナル配列としても言及される)は、一部の態様において、細菌の分泌タンパク質のN末端に見出される。それらの長さは、約15〜約70アミノ酸で変化する。アミノ酸の一次配列もまた変化するが、以下の部分を含む共通の全体構造を有していてもよい:(i)可変性の長さを有し、例えば正味の負の電荷を帯びるN末端;(ii)約6〜約15アミノ酸の中心の疎水性コア;ならびに(iii)シグナルペプチダーゼのための切断部位を規定する約4〜約6アミノ酸。
本明細書に記載されるように使用される核酸は、RNA、iRNA(RNAiとしてもまた知られる)、アンチセンス核酸、cDNA、ゲノムDNA、ベクター、人工染色体、ウイルス、またはこれらのハイブリッドのいずれであっても、多様なソースから単離し、遺伝子操作し、増幅し、および/または組換えにより発現/生成することができる。本明細書に記載される態様に関連する標的酵素または部位特異的プロテアーゼのいずれかをコードする核酸分子を、当該分野において既知の方法および技術を用いて細胞内に導入することができる。例えば、化学的形質転換(chemical transformation)およびエレクトロポレーションを含む形質転換、形質導入ならびに微粒子銃などの標準的なプロトコルにより、核酸分子を細胞に導入することができる。標的酵素または部位特異的プロテアーゼをコードする核酸分子の発現はまた、細胞のゲノム中へ核酸分子を組み込むことによっても達成することができる。核酸分子は、当該分野において既知の標準的な技術を用いて、細胞のゲノムDNA中に組み込むことができる。これらの核酸から生成される組換えポリペプチドは、個々に単離またはクローニングして、所望の活性について試験することができる。「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において用いられる場合、標的酵素および部位特異的プロテアーゼを包含する。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含むがこれらに限定されない、任意の組換え発現系を用いてよい。本明細書に記載されるように用いられる核酸は、例えば、Adamsら、J. Am. Chem. Soc. (1983) 105:661;Belousovら、Nucleic Acids Res. (1997) 25:3440-3444;Frenkelら、Free Radic. Biol. Med. (1995) 19:373-380;Blommersら、Biochemistry (1994) 33:7886-7896;Narangら、Meth. Enzymol. (1979) 68:90;Brownら、Meth. Enzymol. (1979) 68:109;Beaucageら、Tetrahedron Letters (1981) 22:1859;ならびに米国特許4,458,066(これらの各々は、本明細書に参照により組み込まれる)において記載されるような周知の化学合成技術によりin vitroで合成してもよい。
標的酵素および/または部位特異的プロテアーゼをコードする単離されたDNAフラグメントの好適な宿主細胞(例えばE. coli細胞)内への形質転換のために有用なベクターは、当該分野において既知である。本明細書において用いられる場合、「ベクター」は、異なる遺伝子環境間における輸送のため、または宿主細胞における発現のために、制限酵素切断およびライゲーションにより所望の配列(例えば標的酵素または部位特異的プロテアーゼをコードする配列)を挿入することができる、多数の核酸のうちのいずれかであってよい。ベクターは、代表的にはDNAからなるが、RNAベクターもまた利用可能である。ベクターとして、限定されないが、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体が挙げられる。ベクターは、関連する遺伝子の転写および翻訳を指揮する配列、選択マーカー、および自己複製または染色体への組み込みを可能にする配列を含んでもよい。好適なベクターは、転写開始の制御を保有する遺伝子の5’領域、および転写終結を制御するDNAフラグメントの3’領域を含む。融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子の宿主細胞のゲノム中への組み込みを促進するベクターもまた、用いることができる。かかるベクターは、ランダムな組み込み、部位特異的な組み込み、または相同組み換えのためのものである。ベクターは、単一交差または二重交差型の相同組み換えを可能にする特徴を有していてもよい。1つまたは複数のコピーを、宿主細胞(例えば細菌または酵母細胞)のゲノム中に組み込んでもよい。
本明細書に記載される方法は、多様なコード配列の制御された発現を利用する。発現は、多様なキュー、例えば化学物質による誘導、増殖期の変化、栄養の枯渇、温度シフトおよび光により、制御され得る。一部の態様において、誘導性プロモーターは、当該分野において既知の誘導剤、例えばラクトース、アラビノースおよびテトラサイクリンなどの化学物質の存在により制御される。
以下の例は、当業者に、本明細書に記載される態様を作製および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために記載され、本発明の範囲を限定すること、または以下の実験が、行われる全てもしくは唯一の実験であることを表わすことを意図しない。用いられる数値(例えば、量、温度など)に関して正確性を期するために努力がなされたが、いくらかの実験的誤差および偏差が存在する。他に示されない限りにおいて、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏におけるものであり、圧力は大気圧またはその付近におけるものである。
幾つかのプロテアーゼ遺伝子を、プロテアーゼ酵素を周辺質へ標的化する多様な周辺質シグナル配列とともに含む、プラスミドのライブラリーを構築する。例えば、5つの特定のプロテアーゼと6つの周辺質シグナル配列を組みわせて、30メンバーのライブラリーを作製することができる。
プラスミド、細胞増殖および発現。ウシエンテロキナーゼをコードする遺伝子(GenbankアクセッションL19663.1)を、E. coliにおける発現のために最適化されたコドン内容を有するように、および以下の周辺質シグナル配列を有するように、化学合成した。
ウシエンテロキナーゼについての遺伝子配列を、E. coliにおける発現のためにコドン最適化して、OmpA周辺質発現シグナル配列を付加し、発現ベクターpACYCDuet-1(Novagen)中にサブクローニングした。コンストラクトを、E.coli株BL21(DE3)中で形質転換させた。細胞を、0.6の光学密度(OD600)まで増殖させ、0.8mMのIPTGの添加により発現を誘導し、37℃で3時間増殖を継続させた。培養物は、誘導の間に2.4倍になり、このことは、エンテロキナーゼの発現が増殖を阻害しなかったことを示す。細胞を、遠心分離により収集し、アッセイバッファー(20mMのTris HCl(pH7.4);50mMのNaCl;2mMのCaCl2)中で再懸濁し、ホモジェナイザーを用いて溶解した。
エンテロキナーゼ発現細胞からのホールセルライセートを、エンテロキナーゼ切断部位(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)を含む切断対照タンパク質とともにインキュベートして、組換えエンテロキナーゼの活性と比較することにより、プロテアーゼ活性について試験した。組換えエンテロキナーゼおよび切断対照タンパク質は、Novagenから入手した。40μlのライセートまたは40μlのアッセイバッファー(20mMのTris HCl(pH7.4);50mMのNaCl;2mMのCaCl2)中の2単位の組換えエンテロキナーゼを、4μgの切断対照タンパク質とともに室温でインキュベートした。エンテロキナーゼを発現しない株から同様に調製したライセートを、陰性対照として用いた。ゼロ時間または2時間の試料を、切断対照タンパク質上のアミノ末端のSタグを認識するS proteinと西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)とのコンジュゲートによるイムノブロットにより分析した。標的タンパク質は、組換えエンテロキナーゼ(レーン2)により、および周辺質を標的とするエンテロキナーゼを発現する株からのライセート(レーン4)により、特異的に切断されたが、エンテロキナーゼ発現を欠くライセート(レーン6)によっては特異的に切断されなかった。
ウシエンテロキナーゼについての遺伝子配列を、E. coli細胞における発現のためにコドン最適化し、周辺質発現シグナル配列を付加して、誘導性プラスミド発現ベクター中にサブクローニングする。AroL酵素をコードする遺伝子を、エンテロキナーゼ特異的切断部位を含むように改変する。E. coli細胞を、周辺質において部位特異的プロテアーゼを発現し、細胞質において改変された標的酵素を発現するように、改変する。細胞を、0.6の光学密度(OD600)まで増殖させ、エンテロキナーゼの発現を誘導し、37℃で3時間、細胞に増殖を続けさせる。
その各メンバーが、酵素のポリペプチド配列内の異なる位置にエンテロキナーゼ特異的切断部位を含むアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素(E. coli PurF)をコードする、ライブラリーを作製する。切断部位の位置の選択は、Muchmoreら、Protein Science (1998) 7:39-51において報告されるような公開されたPurFの三次構造により補助される。例えば、Muchmoreらは、切断部位の組み込みのために好適である、可橈性の、溶媒に露出するループを含む領域を記載する。ライブラリーは、PCR、遺伝子合成または他の標準的な分子生物学的方法により作製し、E. coli細胞における制御発現のためのベクターにおいて構築する。E. coli細胞を、改変された酵素ライブラリーを発現するベクターにより形質転換する。細胞を、0.6の光学密度(OD600)まで増殖させ、ライブラリーの発現を誘導し、37℃で3時間、細胞に増殖を継続させる。
他に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において参照される全ての特許、特許出願(公開または未公開)、および他の刊行物は、その全体が参照により組み込まれる。本出願において記載される定義が、本明細書に参照により組み込まれる特許、出願、公開された出願および他の刊行物において記載される定義と矛盾するかまたは一致しない場合は、本出願において記載される定義が、本明細書に参照により組み込まれる定義に対して優先する。
Claims (20)
- 再配置配列を含む部位特異的プロテアーゼコード配列;および
目的の経路に関与する酵素と競合する少なくとも1の標的酵素についてのコード配列、ここで、該標的酵素のコード配列は、部位特異的プロテアーゼ認識部位を含む、
を含むように遺伝子改変された細胞。 - 再配置配列が、周辺質を標的とする配列である、請求項1に記載の細胞。
- 周辺質を標的とする配列が、以下:
- 部位特異的プロテアーゼコード配列が、TEV NIa、HRV 3C、エンテロキナーゼ、Xa因子およびトロンビンからなる群より選択される部位特異的プロテアーゼをコードする、請求項1に記載の細胞。
- 標的酵素コード配列が、部位特異的プロテアーゼ認識部位を含むように遺伝子改変されている、請求項1に記載の細胞。
- 部位特異的プロテアーゼコード配列が、誘導性プロモーターに作動的に連結している、請求項1に記載の細胞。
- 標的酵素が、前駆体が目的の経路に供給される速度を増大させる酵素と競合する、請求項1に記載の細胞。
- 標的酵素が、重要な経路の入口酵素と競合する、請求項1に記載の細胞。
- 標的酵素のネイティブなカウンターパートをコードする遺伝子が、標的酵素をコードする遺伝子により置き換えられている、請求項1に記載の細胞。
- ネイティブなカウンターパート酵素をコードする遺伝子がノックアウトされている、請求項9に記載の細胞。
- 標的酵素が、細胞内で過剰発現されている、請求項1に記載の細胞。
- 標的酵素が、エピソームベクターまたは染色体のいずれかに存在する、請求項1に記載の細胞。
- 目的の経路が、
a)抗生物質;
b)生物系界面活性剤;
c)アミノ酸;
d)有機酸;
e)脂肪酸;
f)アルコールもしくはポリオール;
g)フレーバーもしくはフレグランス;
h)ヌクレオチド;
i)ビタミン;
j)色素;
k)糖もしくは多糖;
l)バイオポリマーもしくはプラスチック;
m)E. coli代謝物;
n)シキミ酸および/もしくはシキメート;
o)イソプレノイドもしくはテルペン;
p)ポリ−3−ヒドロキシ酪酸;または
q)イソブタノールおよび/もしくはl−ブタノール
の合成である、請求項1に記載の細胞。 - 目的の経路が、シキミ酸および/もしくはシキメート;イソプレノイドもしくはテルペン;ポリ−3−ヒドロキシ酪酸;またはイソブタノールおよび/もしくはl−ブタノールの合成である、請求項13に記載の細胞。
- 細胞増殖培地が、標的酵素の活性を増大または保持する因子の添加または増強により改変されている、請求項1に記載の細胞。
- 請求項1に記載の細胞の細胞ライセート。
- 目的の経路の生成物を生成するためのシステムであって、請求項1に記載の細胞のライセート;ならびに任意に1または2以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤およびATP生成システムを含む、前記システム。
- 1または2以上のさらなる細胞ライセートをさらに含む、請求項17に記載のシステム。
- 目的の経路の生成物を生成する方法であって、
請求項1に記載の細胞を所望の細胞密度まで増殖させること;
前記細胞の少なくとも一部を溶解すること;および
任意に、ライセートを、1または2以上の基質、酵素、栄養素、補助因子、緩衝化剤、還元剤またはATP生成システムと組み合わせること
を含み、
ここで、目的の経路における酵素が生成物の生成を触媒し、部位特異的プロテアーゼが標的酵素を切断する、前記方法。 - ライセートを1または2以上のさらなる細胞ライセートと組み合わせることをさらに含む、請求項19に記載の方法。
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