JP2002535008A - 生物学的触媒によるシキミ酸の合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 炭素源からシキミ酸生産のための生物学的合成スキームが提供されている。合成スキームを基にした、その合成スキームに基づいて炭素源からキニン酸を生産する方法もまた、提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 ＜後援＞ 本発明についての研究は、一部、米国農務省第９５−３７５００−１９３０号
及び米国国立科学財団第ＣＨＥ９６３３６８号補正００２の支援を受けている。
米国政府は、本発明に関して一定の権利を有する場合がある。

【０００２】 ＜発明の分野＞ 本発明は、シキミ酸の生産に関するものであり、特に炭素源の生物学的変換に
よって、シキミ酸を生産する方法に関するものである。

【０００３】 ＜発明の背景＞ シキミ酸は、高度に機能化された六個のメンバーからなる環状炭素と多数の非
対称中心を持つ魅力的なキラルなシントンである。芳香族アミノ酸の代謝中間体
であるシキミ酸は、インフルエンザの治療に効果的なニューラミニダーゼ阻害剤
の合成における必須のキラルな出発材料である。Kim, C.U. et al. J.Am.Chem.S
oc. 119:681 (1997);Rohloff, J.C. et al., J.Org.Chem. 63: 4545 (1998)。芳
香族だけでなく、キラルな化学物質もまた、シキミ酸から合成され得る。例えば
、酸が触媒するシキミ酸の脱水化によって、ｐ−ヒドロキシ安息香酸が生じる（
Eykmann, J.F., Ber.Dtch.Chem.Ges., 24: 1278 (1891)）。ｐ−ヒドロキシ安息
香酸は、年間７×１０^６ｋｇの製造量があり、液体結晶ポリマー合成に使われる
パラオキシ安息香酸エステル類とモノマーに対して、キーとなる前駆体である。
シキミ酸は、最近、分子の大きな組み合わせライブラリーの合成にとっての出発
点としてもまた、使われている。Tan, D.S., et al., J.Am.Chem.Soc. 120: 856
5 (1998)。

【０００４】 シキミ酸は植物から、時間がかかる多段階の単離手段によって得られる。残念
なことに、植物のオオウイキョウ（Illicium）の果実からのシキミ酸の単離（Ha
slem,E., Shikimic Acid: Metabolism and Metabolites, Wiley & Sons, New Yo
rk, pp40-42 (1993)）は、キログラム単位の合成における使用を除外している。

【０００５】 従って、多量のシキミ酸を製造する方法を提供することは望ましいだろう。も
し、そんな方法が、安い出発材料を用いて、費用に対し効率がよかったら、それ
もまた望ましいだろう。その方法が無害の化合物を用い、環境に優しかったら、
さらに望ましいだろう。

【０００６】 ＜発明の概要＞ 炭素源からシキミ酸を製造するための生物工学的合成スキームが提供されてい
る。ある態様では、本発明の生物学的変換は、微生物によって触媒される炭素源
のシキミ酸への変換を含む。図１の合成スキームで示されているように、本発明
の微生物によって触媒される変換ステップは、組換え微生物によって提供される
四つの酵素を必要とする。ある好ましい態様では、組換え微生物は、３−デヒド
ロシキミ酸をシキミ酸に還元し、芳香族アミノ酸生合成経路に沿ってシキミ酸を
さらに変換することを阻害するように設計されている大腸菌である。

【０００７】 ここで提供されるシキミ酸の生物触媒的合成方法は、環境に優しく、経済的に
魅力的で、出発材料として豊富に再生可能な原料を使用していると思われる。

【０００８】 本発明の更なる目的、利点、特徴は、添付された図とともに、以下の記述と添
付の請求項から明らかになるだろう。

【０００９】 ＜好適実施例の詳細な説明＞ ここでは、炭素源からシキミ酸を生産する生物工学的合成スキームが提供され
ている。合成スキームに基づいた炭素源からシキミ酸を生産する方法もまた、提
供されている。

【００１０】 ある態様では、組換え微生物によって炭素源がシキミ酸に変換される方法が提
供されている。微生物の一般的な芳香族アミノ酸生合成経路の操作によって、組
換え微生物が炭素源の存在下で培養されたとき、かなりの量のシキミ酸を生産す
る。炭素源は、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（
ＤＡＨＰ）に変換され、引き続いて、３−デヒドロキニン酸シンターゼによって
、３−デヒドロキニン酸（ＤＨＱ）に変換され、それから３−デヒドロキニン酸
デヒドラターゼによって脱水化され、デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）になる（ｃ、
図１）。３−デヒドロシキミ酸は、シキミ酸脱水素酵素によってシキミ酸に変換
される（ｄ、図１）。シキミ酸代謝は、シキミ酸キナーゼ活性を妨害したり阻害
したりすることによって妨げられ（ｅ、ｆ、図１）、こうしてかなりの量のシキ
ミ酸を蓄積させる。好ましい態様では、微生物はシキミ酸取り込みにおける変異
（shiA）のため、培地からシキミ酸を再吸収することができないだろう。こうし
て、いったん形成されれば、シキミ酸はキニン酸や経路上の他の分子に変換され
得ない。

【００１１】 本発明の生物学的変換方法は、炭素源からシキミ酸への最大限の変換を提供す
るため、時間、温度、ｐＨ、栄養源の種類、濃度の条件や、通気条件、及び制御
された酸素濃度の下で、なされた。実施例で詳細に説明するが、好ましい態様で
は、バッチ式発酵器（fed-batch fermentor）が炭素源からシキミ酸に変換する
のに使われ、その後イオン交換クロマトグラフィーによって発酵培地からシキミ
酸が単離された。バッチ式発酵器の過程とクロマトグラフィーの技術は、当業者
には既知である。

【００１２】 ここで用いる場合、「炭素源」という語句は、キシロース、アラビノース、グ
リセロール、グルコースと、クレブス回路の中間体（即ち、ジカルボン酸）を、
単体で、あるいは複数で含むが、それらに制限されない炭素源由来のバイオマス
を意味する。好ましい態様では、炭素源はグルコースである。炭素源は、以下の
例に制限されるわけでないが、トウモロコシ、テンサイ、サトウキビのような再
生可能な原料に由来してもよい。

【００１３】 他の態様では、本発明の方法で使用されている微生物は大腸菌である。好まし
い態様では、大腸菌は、serA遺伝子座に挿入されたaroBカセットを含み、aroLと
aroKの遺伝子座が破壊されている（e、f、図１）。この組換え大腸菌は、さらに
、aroF^FBR、aroE、serA遺伝子のインサートを持つプラスミドを含んでもよい。a
roLとaroKにコードされるシキミ酸キナーゼのアイソザイムを欠くため、シキミ
酸は蓄積するが、一方aroBの２番目のコピーが３−デヒドロキネートシンターゼ
の触媒活性を増加させる。Dell, K.A. et al., J.Am.Chem.Soc. 115: 11581 (19
93)。好ましい態様では、組換え大腸菌は、aroF^FBR、serA、aroEのインサートを
持つプラスミドpKD12.112を含む。AroF^FBR遺伝子のインサートは、芳香族アミノ
酸やほかの芳香族分子によるフィードバック阻害に耐性の変異型３−デオキシ−
Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼアイソザイム（a、図
１）をコードする。このフィードバック阻害は、共通の芳香族アミノ酸の生合成
経路に入る炭素の流れを増加させる。aroEの発現の結果生じるシキミ酸脱水素酵
素の活性増幅がシキミ酸による酵素のフィードバック阻害を相補する。Pittard,
J. et al., J.bacterial. 92: 1070 (1966); Brown, K.D. et al., Biochim. B
iophys. Acta. 428: 550 (1976)。Ｌ−セリン生合成に必要な大腸菌ゲノム上のs
erA遺伝子座における変異のため、最少培地における増殖とプラスミド維持は、
プラスミド上のserAの発現後に起きる。このように、プラスミド上serAインサー
トによって、微生物を識別して、最少培地での微生物の増殖を可能にする。

【００１４】 別の態様では、大腸菌はプラスミドpKD12.138を含む。このプラスミドは、pKD
12.112由来で、同じ遺伝子インサートだけでなく、トランスケトラーゼをコード
するtrkA遺伝子のインサートを持つ。トランスケトラーゼは、細胞中では通常ほ
とんど存在しないくらい低い濃度で維持されている不安定なアルドースリン酸で
ある、Ｄ−エリスロース−４−リン酸の形成を触媒する。トランスケトラーゼの
過剰発現は、フォスフォエノールピルビン酸と引き続き縮合して、芳香族アミノ
酸生合成の最初に関係する中間体である３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
ソネート−７−リン酸を形成するために、付加的なＤ−エリスロース−４−リン
酸を提供する。

【００１５】 別の態様では、aroF^FBR、serA、及び／又はaroE遺伝子が、直接宿主細胞のゲ
ノムに挿入されている。これなら、プラスミドはそのような微生物からのシキミ
酸生産には必要ないだろう。

【００１６】 本発明の上記のような好ましい組換え大腸菌の例である、大腸菌SP1.1/pKD12.
112、SP2.1/pKD12.112、SP1.1/pKD12.138及びSP2.1/pKD12.138は実施例１におい
て記述されているが、ブダペスト条約の合意に基づいて、アメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ；12301 パークローン・ドライブ、ロック
ビル、メリーランド 20582）に寄託され、それぞれ、ATCC指定番号98905，9890
3，207055，207054が与えられた。委託物は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄
託所で、３０年間、あるいは最後の要求以降５年間、あるいは特許の有効期間の
うち、いずれか最長のものの間、維持され、寄託物が、その間になくなったり、
生存できなくなっても、補充される。この出願に特許が付与されると、寄託物の
サンプルは公に利用可能となり、寄託物の入手に課せられた全ての制限は取り除
かれるであろう。

【００１７】 以下の表は、グルコースをキニン酸に変換するために必要な４種類の酵素、そ
れらをコードする遺伝子、本発明の典型的な組換え微生物における遺伝子の起源
を開示している。

【００１８】

【表１】

【００１９】 この中で、大腸菌が本発明の方法を行うための微生物として特に述べられてい
るが、文献に引用されており、当業者に知られている一般的なタイプの微生物で
、その微生物が、望ましい変換、即ち、炭素源をシキミ酸への変換をもたらすこ
とができるように改変され得るなら、どんなものでも使用され得る。このように
、多くのタイプのカビ、細菌、酵母が、本発明の方法で、うまく機能するであろ
うということが予見される。そのような微生物は、本発明の合成スキームの一つ
の構成要素から、他の構成要素に変換する特徴的で必要な能力をもち、例えば、
選択、変異、及び／又は遺伝学的形質転換過程を通じて、さらに開発されるかも
しれない。そのような開発方法は、熟練した研究者にはよく知られている。

【００２０】 本発明の生物学的変換方法を行うため、炭素源を含む溶液が組換え微生物に接
触し、炭素源を望ましい構成要素、即ちシキミ酸に変換するのを促進するため、
適当な条件の下で維持される生物学的変換混合物を形成する。好ましい態様では
、生物学的変換混合物は、約３０℃から約３７℃の温度で、約6.5から約7.5のｐ
Ｈで維持される。生物学的混合物は、無機塩、バッファー、コファクター、栄養
物質などの、組換え微生物の生存を促進するのに必要な他の物質も含むのが好ま
しい。生物学的変換混合物は、グルコースが制限された条件で、定常状態で維持
されるのが好ましい。好ましい態様では、グルコースを付加する速度は、溶解し
た酸素の濃度のレベルで決定される。発酵過程の間ずっと、好ましい定常状態は
、約１００から約２００μmolのグルコースか、約５％から約３５％の空気飽和
の時の溶解した酸素濃度である。

【００２１】 微生物の生存の維持のためのもっと一般的な必要物や、特異的な微生物の生存
の維持のための特異的な必要物は、文献に書かれているようによく知られていて
、さもなくば、当業者には容易に決めることができるであろう。シキミ酸は、そ
れから当業者には知られた方法（例えば、イオン交換クロマトグラフィー）で、
生物学的変換混合物から回収され、さらに再結晶化によって精製し得る。

【００２２】 本発明の組換え微生物の培養によって、シキミ酸だけではなく、発酵培地の中
にキニン酸もまた、生産されうる。もし、キニン酸の濃度があまりに高い場合、
キニン酸から分離してシキミ酸を精製するのは困難である。好ましい態様では、
発酵器中のシキミ酸のキニン酸に対する割合は、シキミ酸がキニン酸から分離し
て精製できるくらいである。好ましくは、モル比は約９以上であるだろう。もっ
と好ましくは、モル比は約２０以上で、もっとも好ましくは、モル比は４０以上
であるだろう。

【００２３】 ある態様において、発酵器中のキニン酸に対するシキミ酸のモル比は、発酵培
地中の炭素源の濃度を制御することによって制御される。理論に拘束されようと
は思わないが、低い炭素源の濃度では、発酵培地の中のシキミ酸は代わりの炭素
源として細胞に再び取り込まれ、キニン酸に変換し、そして発酵培地に再び分泌
されると考えられている。発酵中の炭素源の濃度の上昇は、シキミ酸のこの取り
込みを阻害し、混入しているキニン酸を減少させたり、あるいは排除したりする
。制限的でない例として、Ｋｃ値を０．１から０．８に上昇させることによって
、グルコース濃度を上昇させ、このためSP1.1/pKD12.112の発酵中に６５％（ｗ
／ｖ）グルコース溶液を加える速度を増加させると、シキミ酸のキニン酸に対す
るモル比は３．０から１２．０に増加する。

【００２４】 別の態様において、シキミ酸のキニン酸に対するモル比は、代謝できない（加
水分解できない）グルコース・アナログを発酵培地に加えることによって、制御
される。好ましくは、グルコース・アナログは、約０．１ｍＭと約１０ｍＭの間
の濃度で存在するメチルグルコピラノシドである。より好ましくは、メチルグル
コピラノシドは、メチル−α―グルコピラノシドかメチル−β―グルコピラノシ
ドか、それらの混合物であってもよい。これらのアナログは加水分解できないの
で、発酵の最初に加えられるだけでよい。

【００２５】 本発明から生じる利点をもっと完全に立証するため、以下の例が開示される。
以下は、例示のためだけであり、発明の範囲を制限するものとして意図されてい
ない。

【００２６】 ＜実施例１＞ プラスミド及び宿主菌の作出 二つの異なる大腸菌株に由来する、シキミ酸生合成のために作出された二つの
宿主株である。大腸菌SP1.1は、野生型W3110とはただ一つの変異で異なる株であ
るRB791から作出された。二つ目のシキミ酸の生産菌である大腸菌SP2.1は、特徴
が知られたいくつかの変異と、いくつかはわからないが、特徴が解析されていな
い変異とをもっている菌株から作出された。SP2.1は、本来、デヒドロキニン酸
デヒドラターゼをコードするaroD遺伝子における突然変異を得るため、化学的突
然変異誘発法を数回繰り返すことにより選択された、単離菌株であるAB2848から
作出された。シキミ酸生合成のために二つの生物を作出したことにより、異なる
ゲノムのバックグラウンドにおいて、様々な培養条件の効果を評価することがで
きた。

【００２７】 SP1.1の作出は、相同組換えにより、RB791のserA遺伝子座にaroBを挿入するこ
とからはじまった。このことによって、新たにはじまるセリン合成に必要な酵素
であるグリセリン酸燐酸脱水素酵素の発現が不活性化される一方、上昇したデヒ
ドロキニン酸シンターゼの活性をもつ大腸菌を生じた。ひきつづき、大腸菌AL08
07からaroL478::Tn10及びaroK17::Cm^Rを、P1を用いて形質導入することにより、
シキミ酸キナーゼの両方のアイソザイムが不活性化されたSP1.1を得た。SP2.1の
作出は同様に行われたが、生物にデヒドロキニン酸デヒドラターゼを再び導入す
る余分なステップの必要があった。AB2848のserA遺伝子座にaroBを挿入した後で
、機能するaroDのコピーをP1を用いて形質導入することにより、芳香族アミノ酸
の生合成はできるが、セリンの生合成はできない生物を得た。ひきつづき、大腸
菌AL0807からaroL478::Tn10及びaroK17::Cm^RをP1を用いて形質導入することによ
り、SP2.1を得た。

【００２８】 プラスミドpKD12.112は、pSU18を基にしたベクターで（１細胞あたり、およそ
１５ないし２０コピー）、フィードバックに耐性の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ
−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（aroF^FBR）、シキミ酸脱水素酵素（a
roE）、グリセリン酸リン酸脱水素酵素（serA）、及びβ−ラクタマーゼ（Ap^R）
をコードする遺伝子を含む。aroF^FBR、serA、及びβ−ラクタマーゼの発現は、
それぞれの固有のプロモーターからはじまるが、aroEの発現は、固有のプロモー
ター（P_aroE）と強力なハイブリッドのプロモーターtac（P_tac）の両方から起こ
る。フィードバック耐性のアイソザイム３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
ソン酸−７−リン酸シンターゼの発現が増強したため、シキミ酸生合成に直接入
る代謝系の割合が増える一方、シキミ酸脱水素酵素の発現が増強したため、この
酵素のシキミ酸による阻害効果は減少し、これにより副産物のデヒドロシキミ酸
の形成は減少する。PKD12.112上にserAが含まれることによって、宿主株のSP1.1
及びSP2.1は、セリンの添加のない培地において、プラスミドを維持することに
なる。最後に、β−ラクタマーゼを含むことによって、SP1.1とSP2.1において、
プラスミドの維持に対して選択的圧力をかける方法が、付加的に与えられる。し
かしながら、発酵用の接種菌の準備の間、アンピシリンに対する抵抗性は、ただ
二次的な選択的圧力としてのみ使用された。発酵培養には、アンピシリンは決し
て加えられなかった。

【００２９】 プラスミドpKD12.138は、トランスケトラーゼをコードするtktAを挿入するこ
とによって、pKD12.112から調製された。トランスケトラーゼは、通常細胞中で
はほとんど存在しないくらい低い濃度で維持されている不安定なアルドースリン
酸である、Ｄ−エリトロース−リン酸の形成を触媒する。トランスケトラーゼの
過剰発現は、シキミ酸の形成速度及び最終タイターの両方を改善する。

【００３０】 ＜実施例２＞ グルコースからシキミ酸の合成 Ｉ．結果 SP1.1/pKD12.112をＫｃ＝0.1で４２時間培養し、結果として、２７．２ｇ／Ｌ
のシキミ酸、１２．６ｇ／Ｌのキニン酸、４．４ｇ／Ｌの３−デヒドロシキミ酸
（ＤＨＳ）が得られたＤＨＳの蓄積は、予想されていた、シキミ酸によるシキミ
酸脱水素酵素のフィードバック阻害を反映していた。Draths, K.M. et al, J.Am
.Chem.Soc. 114: 9726 (1992)。これに対し、３−デヒドロキニン酸とキニン酸
の変換を触媒するキニン酸脱水素酵素が大腸菌に存在しないことを考えると、キ
ニン酸生合成は驚くべき事であった。ＤＨＳは発酵培地を加熱することによって
容易に除去され、漂白の間活性炭によって吸収されるプロトカテキュ酸に変換す
る。残念なことに、キニン酸の混入は、結晶化によってシキミ酸から分離して精
製されることができたものより過剰だった。

【００３１】 ３−デヒドロキニン酸の細胞内濃度を最小限にすることは、大腸菌SP1.1/pKD1
2.112によって合成されるシキミ酸中のキニン酸混入を減らすための合理的な方
法であるように見えた。それゆえ、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼをコー
ドするAroD遺伝子を、aroE、aroF^FBR、serAと共に、プラスミドpKD12.152Aに位
置させた。しかしながら、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼの付随する過剰
発現は、SP1.1/pKD12.112に対して用いられたものと同じバッチ式発酵器の条件
で、SP1.1/pKD12.152Aによって合成されるシキミ酸におけるキニン酸の混入レベ
ルを低下させなかった。理論に拘束されようとは思わないが、これらの結果は、
キニン酸形成が、新たに始まる生合成から生じるのではなく、最初に合成された
シキミ酸の平衡から生じるのかもしれないということを示唆する。

【００３２】 キニン酸とシキミ酸の平衡は、以前Klebsiella pneumoniaeの無細胞抽出物中
で、調べられた。Mitsuhashi, S. et al., Biochim. Biophys. Acta 15: 268 (1
954)。大腸菌SP1.1/pKD12.112におけるキニン酸形成に関連して、一般的な経路
は、生体条件内で（in vivo）正常な生合成の方向の逆に作用することもできな
ければならない。この可能性をテストするため、２４時間後に発酵器から集菌し
たSP1.1/pKD12.112細胞を洗い、シキミ酸を含む新しい最少培地に再び懸濁し、
それから振とうした。キニン酸（黒塗りの棒、図２）及び３−デヒドロシキミ酸
（斜線の棒、図２）の形成は、SP1.1/pKD12.112が最初合成されたシキミ酸から
キニン酸の形成が触媒されることを示している。

【００３３】 観察された平衡化の間に、培地から微生物の細胞質に輸送されたシキミ酸の、
可能な役割によって、キニン酸混入を最小限にするための対策が示された。大腸
菌におけるシキミ酸輸送（Pittard. J. et a;. J. Bacteriol. 92:1070 (1966);
Brown, K. D. et al., Biochim. Biophys. Acta 428: 550 (1976)）は、増殖と
代謝のための唯一の炭素源としてシキミ酸とキニン酸を触媒する、かつてあった
能力の進化的痕跡なのかもしれない。グルコース以外の炭素源を利用すると、し
ばしば代謝抑制に陥るので、Ｄ−グルコースの利用性が増大すると、シキミ酸の
輸送が抑制され、それによってキニン酸の形成が最小限になる。

【００３４】 すべての発酵実験におけるＤ−グルコース添加速度及びこれによるＤ−グルコ
ースの利用性は、比例−積分−微分制御のＫ_ｃによって制御された。例えば、大
腸菌SP1.1/pKD12.112によるシキミ酸とキニン酸の混合物の合成（表２）におい
ては、K_C=0.1のPID設定値が使われた。PID設定値をK_C=0.8まで増やすことによっ
てグルコースの利用性を増加させると、発酵全体を通じて、キニン酸の形成の劇
的な減少という結果が得られた。４２時間の培養の後、大腸菌SP1.1/pKD12.112
は２０．２ｇ／Ｌのシキミ酸、４．６ｇ／ＬのＤＨＳ、ただ１．９ｇ／Ｌしかな
いキニン酸が合成された。同様な条件の下で、SP2.1/pKD12.112は３７ｇ／Ｌの
シキミ酸、２．１ｇ／Ｌのキニン酸、４．２ｇ／ＬのＤＨＳを合成した。シキミ
酸の合成されたタイターの減少は、大腸菌によるＬ−フェニルアラニンの濃度と
収量に対する、Ｄ−グルコース利用性の増大の既知の影響と矛盾がない。Konsta
ntinov. K. B. et al., J. Ferment. Bioeng. 70:253 (1990); Konstantinov, K
. B. et al., J. Ferment. Bioeng. 71: 350(1991)。もっと重要なことは、２．
４：１（K_C=0.1）ないし１１．８：１（K_C=0.8）のシキミ酸対キニン酸のモル比
の改善によって、キニン酸は、シキミ酸の結晶化の間に完全に除去されうる。

【００３５】

【表２】

【００３６】 さらに行われた発酵実験でも、同様のシキミ酸の収量及びシキミ酸：キニン酸
の割合が得られた。グルコース添加に対する比例−積分−微分制御の利得（K_C）
が０．１に設定されたとき、SP1.1/pKD12.112及びSP2.1/pKD12.112は両方ともシ
キミ酸とキニン酸の許容できない混合物を合成した。SP1.1/pKD12.112はシキミ
酸のキニン酸に対するモル比が３．０に達する一方、SP2.1/pKD12.112はモル比
が５．０に達した（表３）。モル比がこの範囲にある培地から純粋なシキミ酸を
得る試みは、成功しなかった。副産物の合成は、シキミ酸タイターの損失を示し
たが、ＤＨＳは精製中容易にシキミ酸から分離できる。純粋なシキミ酸を得るの
に、ＤＨＳ形成は障害ではなかった。

【００３７】

【表３】

【００３８】 グルコース添加を制御する利得を０．１から０．８に増加したとき、シキミ酸
のキニン酸に対するモル比のかなりの増加が観察された。K_Cを０．８に増加する
と、溶解酸素濃度が設定値からはずれたとき、グルコース・ポンプによるより強
い反応が生じた。K_Cを０．８に設定して、４２時間培養後、SP1,1/pKD12.112は
、２０．２ｇ／Ｌのシキミ酸及びただ１．９ｇ／Ｌのキニン酸だけを合成し、モ
ル比は１２に達した（表３）。匹敵する完全がSP2.1/pKD12.112に対しても見ら
れ、４２時間後、３６．６ｇ／Ｌのシキミ酸と２．２ｇ／Ｌのキニン酸を合成す
ることにより、モル比は１８に達した（表３）。そのモル比が約９を越えると、
培地中のキニン酸から分離してシキミ酸を容易に精製できる。

【００３９】 K_Cを増加させると、効果的にキニン酸形成を抑制できるが、これらの実験を制
御するのは、極端に難しい。溶解酸素レベルは、グルコース添加レベルにおける
振動の直接的な結果として、振動する。これらの実験は、大量の、不必要なグル
コースの添加を避けるため、実験開始後約３６時間後から緻密にモニターしなけ
ればならない。実験は、４２時間まで機械的に、慎重に管理されたが、４２時間
経つと、実験は終了された。培地内での一定のグルコース濃度を増加させると、
SP1.1/pKD12.112に対しては、シキミ酸生産速度にかなりの影響があった。SP1.1
/pKD12.112は、利得が低い値に設定されたときは、４２時間後に３３ｇ／Ｌのシ
キミ酸を合成したのに対し、より高い利得では、同時刻に２０．２ｇ／Ｌ合成し
た。しかしながら、SP2.1/pKD12.112に対しては、生産速度に対する効果は見ら
れなかった。

【００４０】 キニン酸形成を抑制するために、Kcを増やすのと別の方法は、加水分解されな
いグルコースアナログを培地に加えることであった。メチルα−Ｄ−グルコピラ
ノシド（ＭαＤＧ）が菌の接種の時に発酵培地に加えられ、発酵がそれ以上の調
整なしに始められた。１ｍＭのＭαＤＧをSP1.1/pKD12.112の発酵に加えた結果
、４０．３ｇ／Ｌのシキミ酸合成が生じた（表３）。キニン酸は検出されなかっ
た。いくつかの濃度が調べられたが、１ｍＭのＭαＤＧが、キニン酸形成を完全
に抑制できた最小の濃度であった。ＭαＤＧをSP2.1/pKD12.112の培養に加えた
結果も、キニン酸の抑制が生じた。０．５ｍＭのＭαＤＧの存在下で４８時間培
養した後、SP2.1/pKD12.112（表３）は３９．６ｇ／Ｌのシキミ酸および、４．
１ｇ／Ｌのキニン酸を合成した結果、モル比は１１になった。より高濃度のＭα
ＤＧは、キニン酸抑制において、それ以上の改善は示さなかった。

【００４１】 相当の妥協をするような条件ではなく、十分にキニン酸形成を抑制する条件を
確立し、トランスケトラーゼの過剰発現を用いてシキミ酸のタイターを増やすほ
うに注意が向けられた。１ｍＭのＭαＤＧの存在下で培養されたとき、SP1.1/pK
D12.138は、５１．１ｇ／Ｌのシキミ酸及び４．３ｇ／Ｌのキニン酸を合成し、
１３を越すモル比が得られた（表３）。トランスケトラーゼを発現させた結果、
シキミ酸を単離できるシキミ酸のキニン酸に対するモル比を維持しながら、シキ
ミ酸のタイターが２５％増加した。ＤＨＳ副産物の濃度はまた８．８ｇ／Ｌに増
加したが、それはシキミ酸抑制に耐性のシキミ酸脱水素酵素を得るための余分な
刺激となった。SP1.2/pKD12.138が標準的な条件で培養された時、発酵は決して
相変化のポイントまで達しなかった。３３℃では、SP2.1/pKD12.138の増殖は遅
く、かなりの酢酸の生産が生じた。この状態を防ぐため、培養温度を少し上昇さ
せると増殖速度が上昇するようである。

【００４２】 ここで述べたように、微生物によるシキミ酸の合成は、シキミ酸合成ユーティ
リティの制限となっている植物源からこの水素化芳香物の単離に、とって代わる
かもしれない。同時に、シキミ酸の利用性の増加は、この水素化芳香族のより幅
広い利用を予見しているのかもしれない。シキミ酸の微生物合成に対する理論上
の最大収量は、Ｄ−グルコースからの４３％である。Draths, K. M. et al., J.
Am. Chem. Soc. 117: 2395 (1995)。微生物の生物学的触媒に対してこの水素化
芳香物の毒性が明らかにないことと共に、これまでのシキミ酸の微生物合成で達
成された収率（１４〜２２％）と比較すると、収率とタイターの規模の拡大は可
能であることが示唆される。

【００４３】 II．方法 ＝全般＝ 溶質濃度の^１Ｈ ＮＭＲ定量のため、溶液は陰圧の下で乾燥するまで濃縮され
、重水を加えてもう一度乾燥するまで濃縮され、それから既知の濃度の３−（ト
リメチルシリル）−２，２，３，３四ジュウテリオプロピオン酸（ＴＳＰ）のナ
トリウム塩（ランカスター・シンセシス社から購入）を含む重水に、再び溶解さ
れた。濃度は、各化合物に対応する数字を、^１Ｈ ＮＭＲにおけるＴＳＰ（δ＝
０．００ｐｐｍ）に対応した数字と比較することにより、決定された。全ての^１ Ｈ ＮＭＲスペクトラムは、ヴァリアンＶＸＲ−３００ ＦＴ−ＮＭＲスペクト
ロメーター（３００ＭＨｚ）で記録された。

【００４４】 ＝培地＝ 全ての培地は、蒸留し、脱イオン化した水で調製した。Ｍ９塩（１Ｌ）は、Ｎ
ａ_２ＨＰＯ_４（６ｇ）、ＫＨ_２ＰＯ_４（３ｇ）、ＮａＣｌ（０．５ｇ）、ＮＨ_４ Ｃｌ（１ｇ）を含む。Ｍ９最少培地（１Ｌ）は、Ｄ−グルコース（１０ｇ）、Ｍ
ｇＳＯ_４（０．１２ｇ）、チアミン（塩酸塩）（０．００１ｇ）、Ｌ−フェニル
アラニン（０．０４０ｇ）、Ｌ−チロシン（０．０４０ｇ）、Ｌ−トリプトファ
ン（０．０４０ｇ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、ｐ−アミノ安
息香酸カリウム（０．０１０ｇ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（０．０１０
ｇ）を含んだＭ９塩１Ｌから成る。示されたところには、アンピシリン（０．０
５ｇ／Ｌ）を加えた。Ｍ９塩、ＭｇＳＯ_４、グルコースは、個々にオートクレー
ブし、その後で混合した。芳香族アミノ酸、芳香族ビタミン、アンピシリンは、
０．２２μｍ膜で滅菌した。

【００４５】 発酵培地（１Ｌ）は、Ｋ_２ＨＰＯ_４（７．５ｇ）、クエン酸アンモニウム鉄（
ＩＩＩ）（０．３ｇ）、クエン酸一水和物（２．１ｇ）、Ｌ−フェニルアラニン
（０．７ｇ）、Ｌ−チロシン（０．７ｇ）、Ｌ−トリプトファン（０．３５ｇ）
、濃硫酸（１．２ｍＬ）を含む。発酵培地は、オートクレーブする前に濃アンモ
ニア溶液を加えて、ｐＨ７．０に調整する。以下の補助物質は、発酵を始める直
前に加えられた。Ｄ−グルコース（２０ｇ）、ＭｇＳＯ_４（０．２４ｇ）、ｐ−
ヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、ｐ−アミノ安息香酸カリウム（０．０１
０ｇ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（０．０１０ｇ）、（ＮＨ_４）_６（Ｍｏ _７ Ｏ_２４）５・４Ｈ_２Ｏ（０．００３７ｇ）、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．００
２９ｇ），Ｈ_３ＢＯ_３（０．０２４７ｇ）、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ（０．００２
５ｇ）、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ（０．０１５８ｇ）を含んだ微量金属。Ｄ−グル
コースとＭｇＳＯ_４は、別にオートクレーブされ、芳香族ビタミンと微量金属は
、０．２２μｍ膜で滅菌された。

【００４６】 ＝発酵＝ 発酵には、２．０Ｌの作業容積を持つビー・ブラウンＭ２培養器が用いられた
。ユーティリティは、ＤＣＵ−１によって管理されたビー・ブラウン・バイオス
タット・ＭＤによって供給された。データを得るには、ビー・ブラウンのＭＦＣ
Ｓ／Ｗｉｎソフトウエアが装備されたデル オプティプレックスＧｓ^＋ ５１６
６Ｍパーソナルコンピューターが利用された。温度、ｐＨ、グルコースの添加は
、ＰＩＤ制御ループでコントロールされた。温度は、３３℃に保たれた。ｐＨは
、濃ＮＨ_４ＯＨか２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を加えることによって、７．０に維持された
。溶解した酸素（Ｄ．Ｏ．）は、インゴールドＡタイプＯ_２浸透膜を備えたメト
ラー・トレド社の１２ｍｍ滅菌可能Ｏ_２センサーを使って、測定された。Ｄ．Ｏ
．は、１０％空気飽和で維持された。

【００４７】 接種材料は、アンピシリンを含むＭ９培地５ｍＬに単一コロニーを植えること
によって始められた。接種された培地を、３７℃で、２５０ｒｐｍ、２４時間振
盪培養し、引き続いて、アンピシリンを含んだＭ９培地１００ｍＬに加えた。３
７℃、２５０ｒｐｍでさらに１２時間増殖後、接種材料は発酵器に移される準備
が整った。発酵培地の最初のグルコース濃度は２０ｇ／Ｌであった。実施してい
る間、１０％の空気飽和でＤ．Ｏ．レベルを維持するために、三つの段階になっ
た方法が使われた。最初０．０６Ｌ／Ｌ／ｍｉｎにセットした空気の流れで、イ
ンペラーの速度を、最初の設定値である５０ｒｐｍから最大プリセット値９４０
ｒｐｍへと増やすことにより、Ｄ．Ｏ．濃度は維持された。それから、９４０ｒ
ｐｍでインペラーを一定にし、質量流量制御器によって空気の流れの速度を０．
０６Ｌ／Ｌ／ｍｉｎから最大プリセット値１．０Ｌ／Ｌ／ｍｉｎに増加させるこ
とにより、Ｄ．Ｏ．レベルを維持した。最後に、一定のインペラーのスピードと
、一定の空気の流れの速度で、Ｄ．Ｏ．レベルは、酸素センサーによって制御さ
れるグルコースの添加による発酵の残り時間に、１０％空気飽和で維持された。
このステージの最初に、Ｄ．Ｏ．レベルはメディウム中の残った最初のグルコー
スのために、１０％空気飽和以下に落ちた。これは、グルコース（６５％ｗ／ｖ
）の添加が始まる前、約一時間続いた。ＰＩＤ制御パラメーターは、微分制御（
τＤ）に対しては、０．０（off）に、積分制御（τＩ）にたいしては、９９９
．９ｓ（最小制御動作）にセットされた。Ｘｐは、０．１のK_Cを得るためには９
５０％に設定され、０．８のK_Cを得るためには１２５％に設定された。

【００４８】 発酵培地のサンプル（１０ｍＬ）は、６時間おきに採られた。細胞密度は、水
で発酵培地を薄めて、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ_６００）を計ることによって、
決定された。細胞の乾燥重量（ｇ／Ｌ）は、変換係数０．４３ｇ／Ｌ／ＯＤ_{６０ ０} を用いて得られた。残った発酵培地は、細胞のない培地を得るため、ベックマ
ン社微量遠心装置を用いて、４分間遠心した。細胞のない培地中の溶質の濃度は
、^１Ｈ ＮＭＲによって決定された。

【００４９】 ＝発酵培地からシキミ酸の精製＝ 発酵培地（１１００〜１２００ｍｌ）を１４０００ｇで２０分間遠心し、細胞
が捨てられた。結果として得られた上澄みが４時間還流され、室温まで冷やされ
、ｐＨは濃硫酸を加えることにより、２．５に調整された。１４０００ｇで２０
分間、遠心した後で、透明な黄色い液体が、細胞の残渣を残して注ぎ出され、濃
アンモニア水を加えることで、ｐＨ６．９に調整された。溶液は、ダルコＫＢ−
Ｂ活性炭５ｇと混ぜ合わされ、５０ｒｐｍで１〜２時間かき混ぜられ、それから
ワットマン５の濾紙で濾過された。濾されたものは、さらに水２５０ｍｌで洗わ
れた。一つにされた濾過液は、それから二番目の活性炭と同じやり方で処理され
た。

【００５０】 溶液を活性炭で処理した後、濃い色は処理前より薄くなっていたが、溶液は無
色ではなかった。活性炭での処理の後、溶液は少し灰色であった。氷酢酸を最終
濃度１５％になるように加えると、透明な黄色い液体になり、その後４℃でＡＧ
１−ｘ８（酢酸型、５ｃｍ×２０ｃｍ）を通して溶出させた。さらに液体の１５
％酢酸４００ｍｌで溶出させた後、一つにした溶出液を、４℃でダウエックス５
０（水素イオン型、５ｃｍ×２０ｃｍ）のカラムに通し、液体の２５％酢酸４０
０ｍｌでカラムを洗った。カチオン交換カラムを通った溶出液が混ぜ合わされ沸
騰させることで、１５０ｍＬまで濃縮し、回転式エバポレーターで乾燥するまで
濃縮すると、堅くて白い固体が残された（この段階までで、８３％の回収率）。
エタノールと酢酸エチルとの混合液によって再結晶化すると、細かく白い粉とし
て、シキミ酸が得られた（精製していない発酵培地で定量したシキミ酸を基準と
して、６１％の回収率）。

【００５１】 以上の議論は、本発明の例となる態様を開示し、記述しただけにすぎない。当
業者は、そういった議論や添付された図や請求項から、以下の請求項に提示され
ているような発明の精神と範囲を離れないで、様々な変更、修正、変形がなされ
得るだろう事は、容易に認識できるだろう。

【００５２】 ここで引用された全ての参考文献は、完全に記載されているのと同様に援用さ
れている。加えて、１９９９年１月２９日に提出された米国特許出願第０９／２
４０，４４１号「キニン酸の生物触媒による合成」もまた、明示的に援用されて
いる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 シキミ酸を製造するための本発明の生物工学的合成スキームの図
式である。

【図２】 SP1.1/pKD12.112によって触媒されたシキミ酸とキニン酸との平
衡関係を示しているグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ノップ，デヴィッド，アール． アメリカ合衆国・ミシガン州 48864・オ ケモス・エイチ−11・ダブリュー．グラン ド リバー 1821 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA80 CA04 DA06 EA04 FA02 FA13 GA11 4B064 AD42 CA02 CA19 CC03 CC24 CD09 DA01 4B065 AA26X AB01 BA02 BB15 CA10 CA27 CA28 CA44

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 炭素源からシキミ酸とその誘導体を生産するための方法であ
   って、 ａ）宿主細胞を選択する段階と、 ｂ）宿主細胞の中で炭素源をシキミ酸に変換する能力を宿主細胞に導入する段階
   と、 ｃ）宿主細胞の経路で、シキミ酸からシキミ酸３リン酸への変換を阻害する段階
   と、 ｄ）炭素源の存在下で、宿主細胞を培養する段階と を含む方法。
2. 【請求項２】 宿主細胞が大腸菌種から選択される請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 大腸菌内で炭素源をシキミ酸に変換する能力が、 ａ）シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子と、 ｂ）３−デヒドロキニン酸シンターゼをコードする遺伝子と を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換することによって与えられる請求項１に記
   載の方法。
4. 【請求項４】 シキミ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子がaroE遺伝子
   である請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 プラスミド上のaroE遺伝子が、宿主細胞に導入される請求項
   ４に記載の方法。
6. 【請求項６】 プラスミドがpKD12.112である請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 プラスミドがpKD12.138である請求項５に記載の方法。
8. 【請求項８】 ３−デヒドロキニン酸シンターゼをコードする遺伝子がaroB
   遺伝子である請求項３に記載の方法。
9. 【請求項９】 aroB遺伝子が宿主細胞のserA遺伝子座に挿入されることによ
   り、宿主細胞に導入される請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 シキミ酸からシキミ酸−３−リン酸への変換が、宿主細胞
    のシキミ酸キナーゼ活性を消失させるか、阻害するか、あるいは減少させること
    を含む請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 宿主細胞のシキミ酸キナーゼ活性の消失か阻害が、シキミ
    酸キナーゼをコードする遺伝子の全体か一部分が欠失しているか、前記遺伝子が
    変異を起こしていることによる請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 さらにaroK及びaroLを欠失させるか、変異していることを
    含む請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 さらに、炭素源から宿主細胞の一般的な芳香族アミノ酸生
    合成経路に行く流れを増大させる段階を含む請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 芳香族アミノ酸や他の芳香族分子によるフィードバック阻
    害に抵抗性のある３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロネート−７−リン酸シ
    ンターゼのアイソザイムをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主細胞を形
    質転換することによって、炭素源の経路への流れを増大させる請求項１３に記載
    の方法。
15. 【請求項１５】 アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸のアイソザイム
    をコードしている遺伝子がaroF^FBR遺伝子である請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 プラスミド上のaroF^FBR遺伝子が宿主細胞に導入される請
    求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 プラスミドがpKD12.112である請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 プラスミドがpKD12.138である請求項１６に記載の方法。
19. 【請求項１９】 宿主細胞の培養が、シキミ酸とキニン酸のモル比を制御す
    ることを含む請求項１に記載の方法。
20. 【請求項２０】 シキミ酸のキニン酸に対するモル比が９以上である請求項
    １９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 シキミ酸のキニン酸に対するモル比を制御することが、シ
    キミ酸のキニン酸に対する平衡を減少させるか、消失させる請求項１９に記載の
    方法。
22. 【請求項２２】 シキミ酸のキニン酸に対する平衡を減少させるか、消失さ
    せる方法が発酵培地に加水分解できないグルコース・アナログを加えることを含
    む請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 加水分解できないグルコース・アナログがメチルグルコピ
    ラノシドである請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 発酵培地の中のメチルグルコピラノシドの濃度が、約０．
    ５ｍＭないし１．０ｍＭである請求項２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 炭素源からシキミ酸を生産することができる形質転換細胞
    を生産するために、宿主細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、前記形質転
    換が、 ａ）宿主細胞内で炭素源をシキミ酸に変換できる能力を宿主細胞に与える段階と
    、 ｂ）宿主細胞の経路で、シキミ酸からシキミ酸−３−リン酸の変換を阻害する段
    階と を含む方法。
26. 【請求項２６】 宿主細胞内で炭素源をシキミ酸に変換する能力を、 ａ）シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子と、 ｂ）３−デヒドロキニン酸シンターゼをコードする遺伝子と を含む組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換することによって、導入する請求項２
    ５に記載の方法。
27. 【請求項２７】 シキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子がaroE遺伝子であ
    る請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 ３−デヒドロキニン酸シンターゼをコードする遺伝子がar
    oB遺伝子である請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 シキミ酸からシキミ酸−３−リン酸への変換が、宿主細胞
    のシキミ酸キナーゼ活性を消失させるか、阻害するか、あるいは減少させること
    を含む請求項２５に記載の方法。
30. 【請求項３０】 宿主細胞のシキミ酸キナーゼ活性の消失か阻害が、シキミ
    酸キナーゼをコードする遺伝子の全体か一部分が欠失しているか、前記遺伝子が
    変異を起こしていることによる請求項２９に記載の方法。
31. 【請求項３１】 さらにaroK及びaroLを欠失させるか、変異していることを
    含む請求項２５に記載の方法。
32. 【請求項３２】 宿主細胞が大腸菌種から選択される請求項２５に記載の方
    法。
33. 【請求項３３】 さらに、炭素源から宿主細胞の一般的な芳香族アミノ酸生
    合成経路に行く流れを増大させる段階をさらに含む請求項２５に記載の方法。
34. 【請求項３４】 芳香族アミノ酸や他の芳香族分子によるフィードバック阻
    害に抵抗性のある３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロネート−７−リン酸シ
    ンターゼのアイソザイムをコードする遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主細胞を形
    質転換することによって、炭素源の経路への流れを増大させる請求項３３に記載
    の方法。
35. 【請求項３５】 アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸のアイソザイム
    をコードしている遺伝子がaroF^FBR遺伝子である請求項３４に記載の方法。
36. 【請求項３６】 請求項２５の方法に従って調整された形質転換細胞。
37. 【請求項３７】 炭素源の存在下で、請求項３６の形質転換細胞を培養する
    ことを含む、炭素源からシキミ酸を生産する方法。
38. 【請求項３８】 炭素源からシキミ酸を合成する方法であって、芳香族アミ
    ノ酸や他の芳香族分子によるフィードバック阻害に抵抗性のある３−デオキシ−
    Ｄ−アラビノ−ヘプツロネート−７−リン酸シンターゼのアイソザイム、３−デ
    ヒドロキニン酸シンターゼ、３−デヒドロキニン酸デヒドラターゼ、及び３−デ
    ヒドロシキミ酸脱水素酵素をコードする遺伝子を含む組換え大腸菌を用いて、炭
    素源をシキミ酸に変換することを含む方法。
39. 【請求項３９】 シキミ酸キナーゼをコードする遺伝子が、全体あるいは一
    部分で欠失しているか、または変異を起こしていて、それにより、シキミ酸キナ
    ーゼ活性を消失させているか、阻害しているか、あるいは減少させている請求項
    ３８に記載の方法。
40. 【請求項４０】 さらに、aroＬ及びaroＫ遺伝子が欠失しているか、変異し
    ているか、あるいは発現レベルが低下しているかを含む請求項３９に記載の方法
    。
41. 【請求項４１】 組換え大腸菌が、 ａ）serA遺伝子座に挿入されたaroBカセットと、 ｂ）変異を起こしたaroLとaroK遺伝子座と、 ｃ）aroE、aroF^FBR、serA遺伝子のインサートを含むプラスミドと を含む請求項３８に記載の方法。
42. 【請求項４２】 プラスミドがpKD12.112である請求項４１に記載の方法。
43. 【請求項４３】 組換え大腸菌がＡＴＣＣ識別番号９８９０５によって同定
    される大腸菌である請求項３８に記載の方法。
44. 【請求項４４】 ＡＴＣＣ識別番号９８９０５によって同定される大腸菌SP
    1.1/pKD12.112。
45. 【請求項４５】 ＡＴＣＣ識別番号９８９０３によって同定される大腸菌SP
    2.1/pKD12.112。
46. 【請求項４６】 ＡＴＣＣ識別番号２０７０５５によって同定される大腸菌
    SP1.1/pKD12.138。
47. 【請求項４７】 ＡＴＣＣ識別番号２０７０５４によって同定される大腸菌
    SP2.1/pKD12.138。