KR20070027878A - 자일리톨의 고수율 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 이용하여 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 자일리톨의 고수율 생산방법은 자일리톨 탈수소효소 유전자의 일부가 비특이적으로 결실, 치환 또는 부가되어 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 자일리톨의 전구체인 자일로스, 탄소원, 질소원 및 미량원소를 포함하는 배지에 접종하고, 배지에 함유된 자일로스가 전량 소모될 때까지 배양한 다음, 이로부터 자일리톨을 수득하는 단계를 포함한다. 본 발명의 자일리톨의 고수율 생산방법을 이용할 경우, 종래의 제조방법보다도 높은 수율로 자일리톨을 생산할 수 있었으므로, 자일리톨을 포함하는 각종 식품, 의약품 등의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.
자일리톨, 자일로스, 자일리톨 탈수소효소, 자일리톨 생산균주
Description
도 1은 형질전환 벡터 pXYL2-Ura3의 유전자 지도이다.
도 2는 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 자일리톨을 생산할 경우, 시간의 경과에 따른 건조균체, 포도당, 글리세롤, 자일로스 및 자일리톨의 각 농도변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 자일리톨의 고수율 생산방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 이용하여 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.
자일리톨(xylitol)은 오탄당 당알코올로서 높은 감미도를 가지고 있어 설탕을 대체하는 기능성 감미료로 널리 이용되고 있다. 자일리톨은 감미도가 설탕과 비슷하고 솔비톨(sorbitol)보다는 2배 높을 뿐 아니라, 열량이 설탕의 1/3 밖에 되지 않고 용해열이 153J/g으로 용해될 때 열감소가 일어나는 특성으로 인하여 입안에서 느끼는 청량감이 커서 제과제품의 무설탕 원료로 사용되고 있다. 아울러, 체내 섭취 후의 대사과정이 인슐린과 무관하기 때문에, 당뇨병 환자의 대용당으로 사용되고 있다. 특히, 충치유발균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 생육을 억제하는 특성을 가지고 있어, 충치억제 성분으로서 치약 등에 널리 이용되고 있다.
이러한 자일리톨을 생산하기 위하여, 화학적 방법으로 자일로스를 수소첨가반응으로 환원하는 방법을 사용하였으나, 생산수율이 50~60%로 높지 않고, 산물을 분리 정제하는 과정이 복잡하고 많은 비용이 소요되며, 고온 고압의 공정이므로 위험성이 높고, 폐기물이 많다는 단점이 있었다. 근래에는, 이러한 단점을 보완하는 생물학적인 방법에 의한 자일리톨 생산방법과 관련된 연구가 집중적으로 수행되었다. 예를 들어, 대한민국 특허등록 제 199819호에는 천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)를 자일로스, 질소원 및 무기염류를 함유하는 배지에서 배양시켜, 자일로스를 자일리톨로 전환시킴으로써 자일리톨을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 이러한 생물학적인 자일리톨의 제조방법은 화학적인 방법에 비해 원료물질로 상대적으로 낮은 순도의 자일로스를 이용할 수 있고, 자일리톨 생산이 끝나면 자일로스가 완전히 소모되기 때문에 자일리톨을 분리 정제하는 과정이 간단해져 생산비용을 낮출 수 있으며, 공정자체가 상온, 상압에서 이루어지므로 안전하고, 폐기물을 배출하지 않는다는 장점이 있다. 그러나, 자일리 톨의 제조수율이 70-80% 정도에 불과하여, 보다 제조수율을 향상시키려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
따라서, 생물학적 방법으로 자일리톨의 제조수율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 생물학적 방법으로 자일리톨의 제조수율을 향상시킬 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 자일리톨 탈수소효소 유전자의 일부가 결실되어 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 사용할 경우, 자일리톨을 고수율로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 이용하여 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 자일리톨의 고수율 생산방법은 자일리톨 탈수소효소 유전자의 일부가 비특이적으로 결실, 치환 또는 부가되어 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 자일리톨의 전구체인 자일로스, 탄소원, 질소원 및 미량원 소를 포함하는 배지에 접종하고, 배지에 함유된 자일로스가 전량 소모될 때까지 배양한 다음, 이로부터 자일리톨을 수득하는 단계를 포함한다. 이때, 자일리톨 생산균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 캔디다 속 균주를 사용함이 바람직하고, 보다 바람직하게는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파라프실로시스(C. parapsilosis) 또는 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)를 사용한다. 또한, 탄소원으로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 글리세롤, 과당, 갈락토스, 설탕, 만노스, 말토스, 셀로바이오스 또는 이들의 혼합물을 사용함이 바람직하고, 질소원으로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 효모추출물을 사용함이 바람직하며, 미량원소로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 이인산칼륨, 황산마그네슘 또는 이들의 혼합물을 사용함이 바람직하다. 아울러, 자일리톨 생산균주의 배양조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 20 내지 40℃에서 배양함이 바람직하다.
이하, 본 발명의 자일리톨의 고수율 생산방법을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
자일리톨을 생물학적으로 제조하는 방법으로는 주로 자일로스가 함유된 배지에서 캔디다 속 균주를 배양하고, 배양된 균주로부터 자일리톨을 수득하는 방법이 이용되어 왔다. 지금까지 연구된 바에 의하면, 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파라프실로시스(C. parapsilosis), 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis) 등의 캔디다 속 균주는 세포외부에서 흡수한 자일로스를 자일로스 환 원효소(xylose reductase)로 처리하여 자일리톨로 변환시키고, 이를 자일리톨 탈수소효소(xylitol dehydrogenase)로 처리하여, 자일룰로스(xylulose)로 전환시키며, 전기 자일룰로스는 다시 자일룰로스 인산화효소(xylulose kinase)에 의해 오인산 자일룰로스(xylulose-5-phosphate)로 전환되고, 이는 계속해서 오탄당 인산 대사회로(pentose phosphate pathway)를 통해 세포성장과 유지에 이용되는 것으로 알려져 있다(참조: Laplace, J. M. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36:158-162, 1991; Hahn-Hagerdal, B. et al., Enzyme Microb. Technol., 16:933-943, 1994).
이에, 본 발명자들은 캔디다 속 균주에서 생성된 자일리톨이 자일리톨 탈수소효소에 의해서 자일룰로스로 전환된다는 점에 착안하여, 전기 자일리톨 탈수소효소의 활성을 억제시키거나 또는 발현을 억제시키면, 자일로스로부터 생산된 자일리톨은 더 이상 세포성장 및 유지에 이용되지 못하므로, 이론상으로는 100%의 수율로 자일리톨을 생산할 수 있을 것이라고 가정하였다.
본 발명자들은 미지의 캔디다 트로피칼리스 자일리톨 탈수소효소를 클로닝하기 위해, 이미 밝혀진 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)의 자일리톨 탈수소효소와 이와 유사한 효소 집단인 중간사슬 알코올 탈수소효소(medium-chain alcohol dehydrogenase) 집단에 속하는 유전자들(솔비톨 탈수소효소(sorbitol dehydrogenase), 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase), 트레오닌 탈수소효소(threonine dehydrogenase) 등) 간의 유전자 상동성을 비교하여, 유전자의 상동성 이 높은 부분(conserved region)을 주형으로 사용한 유전자증폭기술(PCR)을 통해, 1,095bp의 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소 유전자를 수득하였다. 전기 수득한 유전자의 일부를 비특이적으로 결실, 치환 또는 부가시켜서, 자일리톨 탈수소효소가 정상적으로 발현되지 않는 변형된 유전자를 작제한 다음, 이를 정상적인 캔디다 트로피칼리스 세포내에 도입시키면, 상동성 재배열(homologous recombination)이라는 세포 내 기작을 통해 선택적으로 유전자가 제거되어, 탄소원으로 자일로스만이 포함된 배지에서 성장할 수 없는 형질전환 균주를 작제할 수 있다.
전기 작제된 형질전환된 균주를 포도당, 자일로스, 효모 추출물, 이인산칼륨 및 황산마그네슘으로 구성된 액체배지에서 배양한 결과, 12.5g/L 자일로스를 소모하여 12.5g/L 자이리톨을 생산하는데 성공하여, 수율 100%로 자일로스로부터 자일리톨을 생산할 수 있었다. 그러나, 배지내의 자일로스를 모두 자일리톨로 전환시키지는 못하였는데, 이는 탄소원으로 사용된 포도당이 자일리톨의 생산에 필요한 세포 내 환원력을 충분히 공급하지 못한 것으로 분석되었다. 이에, 다양한 탄소원을 대상으로 자일리톨 생산에 필요한 환원력을 충분히 공급할 수 있는 탄소원을 검색한 결과, 글리세롤, 설탕, 만노스, 말토스 및 셀로바이오스가 자일리톨의 생산에 효과적인 탄소원임을 알 수 있었다. 특히, 글리세롤은 다른 탄소원에 비해 상대적으로 적은 량을 배지에 함유하여도 자일리톨을 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하였다.
결과적으로, 자일리톨의 전구물질인 자일로스와 탄소원인 글리세롤을 포함하 는 배지에서, 캔디다 트로피칼리스의 형질전환 균주를 배양할 경우, 약 97 내지 100%의 수율로 자일리톨을 생산할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 자일리톨의 고수율 생산방법을 이용할 경우, 종래의 제조방법보다도 높은 수율로 자일리톨을 생산할 수 있었으므로, 자일리톨을 포함하는 각종 식품, 의약품 등의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 이하의 실시예에서는 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소의 발현을 억제시킨 형질전환체를 작제하고, 이를 이용하여, 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법이 개시되어 있으나, 이는 본원발명을 설명하기 위한 일 실시태양에 불과한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의해 제한되지 않음은 자명할 것이다.
실시예 1: 자일로스 탈수소효소의 발현이 억제된 형질전환된 캔디다 트로피칼리스의 작제
캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 이용한 PCR(94℃ 1분, 25회 반복(94℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초) 및 72℃ 3분)을 수행하여, 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소의 유전자를 증폭하고, 전기 증폭된 캔디다 트로피칼리스의 자일리톨 탈수소효소의 유전자를 pGEM-T easy 벡터(BIONEX, 한국)에 클로닝한 다음, 전기 자일리톨 탈수소효소의 유전자의 중간에 BamHI 좌위를 도입하고, 전기 도입된 BamHI 좌위에 ura3 유전자를 도입하여, 4.7kb의 형질전환 벡터 pXYL2-Ura3를 수득하였다(참조: 도 1). 도 1은 형질전환 pXYL2-Ura3 벡터의 유전자 지도이다.
primer F: 5'-aatggtcttgggtcacgaatcc-3'(서열번호 1)
primer R: 5'-gctctgaccaagtcgtaggcttc-3'(서열번호 2)
전기에서 수득한 벡터 pXYL2-Ura3를 캔디다 트로피칼리스에 도입하고, 이를 유라실(uracil)이 결핍된 선별용 고체배지(효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7g/L, 포도당 20g/L, 한천 가루 15g/L)에 도말하고 30℃에서 2일간 정치배양하였다. 그런 다음, 고체배지에서 형성된 콜로니를 자일로스가 포함된 고체배지(효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7g/L, 자일로스 20g/L, 한천 가루 15g/L)와 포도당이 포함된 고체배지(효모 질소 베이스(무 아미노산) 6.7g/L, 포도당 20g/L, 한천 가루 15g/L)에 각각 접종하여 30℃에서 2일간 정치배양하고, 자일로스가 포함된 고체배지에서는 자라지 못하고, 포도당이 포함된 고체배지에서만 자라는 균주를 선별하여, 자일리톨 탈수소효소가 제거된 캔디다 트로피칼리스(이하, 편의상 "BS-xdh"라 함)를 수 득하였다.
실시예 2: 형질전환체를 이용한 자일리톨의 제조
전기 실시예 1에서 작제된 형질전환체 BS-xdh를 YM 배지(포도당 20g/L, 효모 추출물 3g/L, 맥아 추출물 3g/L 및 펩톤 5g/L) 3㎖에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕시키면서, 12시간 동안 배양하면서, 6시간 간격으로 시료(시료 1 내지 3)를 수득하였다.
이어, 전기 배양액 1㎖를 생산배지(포도당 10g/L, 자일로스 50g/L, 효모 추출물 10g/L, 이인산칼륨 5g/L 및 황산마그네슘 0.2g/L, pH 5.0) 50㎖에 접종하고, 24시간 동안 30℃에서 200rpm으로 진탕배양하면서, 6시간 간격으로 시료(시료 4 내지 7)를 수득하였다.
전기 각각 수득한 시료 1 내지 7을 대상으로 하여, 건조균체농도(배양액 1L당 건조균체의 중량(g)) 및 자일로스농도(배양액 1L당 자일로스의 중량(g))를 각각 측정하였다. 즉, 건조균체농도는 전기 시료를 흡광계(spectrophotometer, Shimadzu, Japan)에 적용하여 600nm에서 흡광도를 측정하고, 미리 분석한 표준곡선으로 환산하여 산출하였다. 또한, 전기 시료를 원심분리하여 상층액을 수득하고, 이를 HPLC(Shimazu, Japan) 시스템(Sugar-Pak I column(Waters, USA), refracive index detector(Waters, USA), 용매: 물, 유속: 0.5ml/min, column 온도: 90℃)에 적용하여, 자일로스의 농도를 측정하였다.
한편, 전기 수득한 각 시료를 원심분리하여 균체를 분리하고 상층액을 수득한 다음, 전기 HPLC 시스템을 적용하여 자일리톨의 농도(배양액 1L당 자일리톨의 중량(g))를 측정하였다(참조: 표 1).
| 시료 | 배양시간(h) | 건조균체농도(g/L) | 자일로스농도(g/L) | 자일리톨농도(g/L) |
| 1 | 0 | 0.10 | 45.4 | 0.0 |
| 2 | 6 | 0.52 | 45.3 | 0.0 |
| 3 | 12 | 2.63 | 45.3 | 0.0 |
| 4 | 18 | 6.76 | 37.5 | 7.8 |
| 5 | 24 | 6.65 | 32.9 | 12.5 |
| 6 | 30 | 6.55 | 32.9 | 12.4 |
| 7 | 36 | 6.58 | 32.8 | 12.4 |
상기 표 1에서 보듯이, 자일로스가 소모된 양만큼의 자일리톨이 생성되었으므로, 자일리톨의 수율을 100%에 달함을 알 수 있었다. 그러나, 24시간 동안 배양한 이후에는 배지내에 자일로스가 더 이상 소모되지 않았고, 자일리톨도 더 이상 생성되지 않음을 알 수 있었는데, 이때 배지에 존재하는 자일로스의 이용율은 약 28%정도에 불과하여, 배지에 포함된 자일로스가 충분하게 활용되지 않음을 알 수 있었다.
실시예 3: 자일로스의 이용율을 향상시킬 수 있는 탄소원의 선별
먼저, 전기 실시예 1에서 작제된 형질전환체 BS-xdh를 YM 배지 3㎖에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕시키면서, 12시간 동안 배양하였다.
이어, 전기 배양액 1㎖를, 포도당 대신에 다양한 탄소원(만노스, 과당, 갈락토스, 말토스, 설탕, 젖당, 셀로바이오스, 멜리오바이오스(meliobios), 글리세롤, 초산, 글루코닌산(gluconic acid), 프로피오닌산(propionic acid) 또는 말산(malic acid))을 포함하는 생산배지 50㎖에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕시키면서, 96시간 동안 배양하였다.
배양이 종료된 후, 전기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, 건조균체농도(A), 배양액내에서 소모된 탄소원의 농도(B), 배양액에서 소모된 자일로스의 농도(C) 및 생성된 자일리톨의 농도(D)를 측정하고, 소모된 자일로스의 농도를 배양초기에 배지내에 포함된 자일로스의 농도로 나누어 자일로스의 이용율(E)을 산정한 다음, 생성된 자일리톨의 농도를 소모된 자일로스의 농도로 나누어 자일리톨의 수율(F)을 산정하고, 이를 서로 비교하였다(참조: 표 2). 이때, 배양액내의 탄소원의 농도, 배양액에서 소모된 자일로스의 농도 및 생성된 자일리톨의 농도는 실시예 2의 HPLC 시스템을 이용하여 측정하였다.
| 탄소원 | A(g/L) | B(g/L) | C(g/L) | D(g/L) | E(%) | F(%) |
| 만노스 | 2.9 | 9.0 | 36.4 | 36.3 | 72.8 | 99.6 |
| 과당 | 5.3 | 8.9 | 23.3 | 23.6 | 46.6 | 101.2 |
| 갈락토스 | 2.7 | 9.2 | 26.0 | 27.0 | 52.0 | 103.6 |
| 말토스 | 2.2 | 8.3 | 29.9 | 27.2 | 59.8 | 90.9 |
| 설탕 | 4.4 | 8.9 | 35.5 | 36.0 | 71.0 | 101.3 |
| 젖당 | 0.4 | 0.1 | 2.5 | 2.7 | 5.0 | 108.0 |
| 셀로바이오스 | 3.5 | 9.1 | 39.4 | 38.3 | 78.8 | 97.2 |
| 멜리오바이오스 | 1.1 | 1.6 | 5.0 | 4.0 | 10.0 | 80.0 |
| 글리세롤 | 3.2 | 9.1 | 45.2 | 46.2 | 90.4 | 102.3 |
| 초산 | 1.0 | 9.0 | 11.0 | 12.3 | 22.0 | 112.1 |
| 글루코닌산 | 1.0 | 2.1 | 3.9 | 4.0 | 7.8 | 102.2 |
| 프로피오닌산 | 2.6 | 1.9 | 1.7 | 1.7 | 3.4 | 100.0 |
| 말산 | 2.1 | 0.9 | 4.0 | 4.1 | 8.0 | 102.4 |
상기 표 2에서 보듯이, 탄소원으로 글리세롤, 과당, 갈락토스, 설탕, 만노스, 말토스 또는 셀로바이오스를 사용할 경우에는, 90% 이상의 자일리톨 생산수율을 나타낼 뿐만 아니라, 포도당을 탄소원으로 사용할 때의 자일로스의 이용율(28%) 보다도, 자일로스의 이용율이 증가됨을 알 수 있었다. 특히, 탄소원으로 글리세롤을 사용할 경우에는 100%의 자일리톨 생산수율과 90% 이상의 자일로스 이용율을 나타내었으므로, 자일리톨의 생산에 가장 적합함을 알 수 있었다.
실시예 4: 글리세롤을 탄소원으로 이용한 자일리톨의 제조(I)
먼저, 전기 실시예 1에서 작제된 형질전환체 BS-xdh를 YM 배지 3㎖에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕시키면서, 12시간 동안 배양한 다음, 전기 배양액 1㎖를 YM 배지 50㎖에 다시 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕시키면서, 12시간 동안 배양하였다.
이어, 전기 배양액 50㎖를, 글리세롤 20g/L을 포함하는 생산배지 1.0ℓ가 든 발효기에 접종하고, 30℃에서 600rpm으로 교반시키면서, 24시간 동안 배양한 다음, 시간의 경과에 따른 건조균체농도, 포도당 농도, 글리세롤 농도, 자일로스 농도 및 자일리톨 농도의 변화를 측정하였다(참조: 도 2). 이때, 건조균체의 농도는 실시예 2의 방법으로 측정하였고, 포도당, 글리세롤, 자일로스 및 자일리톨의 농도는 실시예 2의 HPLC 시스템을 이용하여 측정하였다.
도 2는 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 자일리톨을 생산할 경우, 시간의 경과에 따른 건조균체농도, 포도당 농도, 글리세롤 농도, 자일로스 농도 및 자일리톨 농도의 변화를 나타내는 그래프로서, (■)은 건조균체농도를 나타내고, (●)는 포도당 농도를 나타내며, (○)는 글리세롤 농도를 나타내고, (▼)은 자일로스 농도를 나타내며, (▽)은 자일리톨 농도를 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 배양초기에 균체의 농도가 증가될 때, 포도당의 농도는 급속히 감소되었으나, 글리세롤의 농도는 크게 감소되지 않았으므로, 포도당이 균체의 성장에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 또한, 자일로스의 농도가 급격히 감소하는 구간에서는 글리세롤의 농도 역시 급격하게 감소되었고, 자일리톨의 농도는 급격히 증가되었으므로, 글리세롤은 균체의 성장에는 별다른 영향을 미치지 않고 자일리톨의 생산에 영향을 미침을 알 수 있었다. 아울러, 배양을 시작한지 15시간 만에 자일리톨의 생산이 종료되었는데, 이때 자일리톨의 생산성은 2.97g/L/h이고 수율은 93.7%임을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 글리세롤을 탄소원으로 이용한 자일리톨의 제조(II)
먼저, 전기 실시예 1에서 제조된 형질전환체 BS-xdh를 YM 배지 3㎖에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕시키면서, 12시간 동안 배양하였다.
이어, 전기 배양액 1㎖를, 글리세롤 10g/L을 포함하는 생산배지 50㎖에 접종하고, 30℃에서 200rpm으로 진탕시키면서, 60시간 동안 배양하였다. 배양을 진행하면서, 0, 6, 12, 18, 24, 36, 48 및 60시간이 경과한 시점에서 시료(시료 11 내지 18)를 수득하고, 건조균체농도, 글리세롤 농도, 자일로스 농도 및 자일리톨 농도를 측정하였다(참조: 표 3). 이때, 건조균체의 농도는 실시예 2의 방법으로 측정하였고, 글리세롤, 자일로스 및 자일리톨의 농도는 실시예 2의 HPLC 시스템을 이용하여 측정하였다.
| 시료 | 배양시간 (h) | 건조균체 농도(g/L) | 글리세롤 농도(g/L) | 자일로스 농도(g/L) | 자일리톨 농도(g/L) |
| 11 | 0 | 0.32 | 9.69 | 47.43 | 0.00 |
| 12 | 6 | 1.85 | 9.57 | 47.37 | 0.00 |
| 13 | 12 | 6.89 | 8.73 | 40.21 | 7.40 |
| 14 | 18 | 6.72 | 7.63 | 29.53 | 15.12 |
| 15 | 24 | 6.82 | 5.84 | 21.20 | 27.71 |
| 16 | 36 | 6.57 | 2.09 | 3.05 | 41.49 |
| 17 | 48 | 6.57 | 2.10 | 0 | 46.61 |
| 18 | 60 | 6.62 | 2.11 | 0 | 46.21 |
상기 표 3에서 보듯이, 배양을 시작한지 48시간만에 배지내의 자일로스가 모두 자일리톨로 전환되었음을 알 수 있었으며, 2.97g/L/h의 생산성과 93.7%의 수율을 나타냄을 확인할 수 있었는 바, 이는 대한민국 특허등록 제 199819호에 개시된 종래의 캔디다 트로피칼리스를 사용한 자일리톨의 생산수율인 80% 보다도 월등히 높은 수율임을 확인할 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 이용하여 자일리톨을 고수율로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 자일리톨의 고수율 생산방법을 이용할 경우, 종래의 제조방법보다도 높은 수율로 자일리톨을 생산할 수 있었으므로, 자일리톨을 포함하는 각종 식품, 의약품 등의 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.
<110> Korean Advanced Institute of Science and Technology
<120> Method for Manufacturing Xylitol with High-Yield
<160> 2
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
aatggtcttg ggtcacgaat cc 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
gctctgacca agtcgtaggc ttc 23
Claims (7)
- 자일리톨 탈수소효소 유전자의 일부가 비특이적으로 결실, 치환 또는 부가되어 자일리톨 탈수소효소의 발현이 억제된 자일리톨 생산균주를 자일리톨의 전구체인 자일로스, 탄소원, 질소원 및 미량원소를 포함하는 배지에 접종하고, 배지에 함유된 자일로스가 전량 소모될 때까지 배양한 다음, 이로부터 자일리톨을 수득하는 단계를 포함하는, 자일리톨의 고수율 생산방법.
- 제 1항에 있어서,자일리톨 생산균주는 캔디다 속 균주인 것을 특징으로 하는자일리톨의 고수율 생산방법.
- 제 2항에 있어서,캔디다 속 균주는 캔디다 구일러몬디(C. guillermondi), 캔디다 파라프실로시스(C. parapsilosis) 또는 캔디다 트로피칼리스(C. tropicalis)인 것을 특징으로 하는자일리톨의 고수율 생산방법.
- 제 1항에 있어서,탄소원은 글리세롤, 과당, 갈락토스, 설탕, 만노스, 말토스, 셀로바이오스 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는자일리톨의 고수율 생산방법.
- 제 1항에 있어서,질소원은 효모추출물인 것을 특징으로 하는자일리톨의 고수율 생산방법.
- 제 1항에 있어서,미량원소는 이인산칼륨, 황산마그네슘 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는자일리톨의 고수율 생산방법.
- 제 1항에 있어서,자일리톨 생산균주는 20 내지 40℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는자일리톨의 고수율 생산방법.
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