JP3429765B2 - 芳香族アミノ酸合成における共通経路の阻害除去 - Google Patents

芳香族アミノ酸合成における共通経路の阻害除去

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は生合成反応の効率向上に関する。より詳細に
は、本発明はホスト細胞中の共通経路における芳香族化
合物の生合成能を向上させる方法に関するものであっ
て、この方法は、前記経路中の律速反応段階を同定する
とともにホスト細胞を遺伝子工学的に操作してこれらの
律速段階を効果的に阻害除去（デブロッキング）するこ
とによって行うものである。
背景技術、産業上の利用可能性及び発明の開示 シキミ酸経路とも呼ばれる芳香族アミノ酸生合成の共
通経路は、細菌や植物中の芳香族アミノ酸であるフェニ
ルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを生産す
る。これらの芳香族アミノ酸に至る経路は、コリスメー
ト分子で終わる共通経路と、ここから分岐してフェニル
アラニン、チロシン、およびトリプトファンにいたる三
つの別個の末端経路とからなる。芳香族アミノ酸は、こ
れらの化合物を合成する能力を欠くヒトや動物の栄養に
おける必須成分である。これらはまた多くの興味深いか
つ商業的に重要な分子、たとえば２、３例を挙げると、
合成甘味料であるアスパルテーム、よく知られた染料で
あるインジゴ、およびパーキンソン病の症状に抗するた
めに用いられる薬であるＬ−DOPAなどの前駆体でもあ
る。
グルコースや他の糖類などの容易に入手しうる炭素源
から、芳香族アミノ酸群やそれらの誘導体を過剰に生産
する生体触媒的ルートの成否の鍵はホスト生物の経路を
経由して炭素量急増（サージ）を指向する力による。経
路中で代謝阻止剤（代謝ブロック）に遭遇することによ
って、その後の生体触媒的転換で生じる生成物の収率や
純度が影響を受けることがある。
芳香族生合成の共通経路における生産効率を増加させ
る従前の試みは、1991年２月８日に出願された米国特許
出願第07/652933号に対し1992年12月１日に許可された
米国特許第5186056号に記載されており、その記載をこ
こに本明細書を構成する一部として援用する。この特許
はDAHPシンターゼとトランスケトラーゼの生体内触媒活
性を増加させることによって経路内への炭素の流れを増
加させるという関連発明を記載している。その特許明細
書は、共通経路において各段階の反応を触媒するその他
の酵素が、主要標的であるトランスケトラーゼおよびDA
HPシンターゼと共に過発現され得ることを述べている
が、この共通経路を指向する炭素流は、基質中間体が生
産される速度とほぼ等しい速度で中間体を触媒転換させ
ることができない一以上の経路酵素が存在した場合には
もはや炭素流の増加をもたらさないことが判明してい
る。つまりこの生合成経路には一種の律速段階があり、
経路上の反応段階の進行を阻害するように作用する。本
発明はそのような阻害を除去するものである。
核磁気共鳴スペクトル法（NMR）を用いた大腸菌株D27
04（pheA−、tyrA−、ΔtrpE−Ｃ）の培養上清の分析か
ら、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・
キナーゼ、５−エノールピルヴォイルシキメート−３−
フォスフェート・シンターゼ、およびコリスメート・シ
ンターゼが、芳香族アミノ酸生合成の共通経路における
律速酵素として同定された。aroL（シキメート・キナー
ゼ）、aroA（EPSPシンターゼ）、およびaroC（コリスメ
ート・シンターゼ）をコードする遺伝子フラグメントを
含有するプラスミドとプラスミドpKD136（これは芳香族
アミノ酸生合成の共通経路への炭素の増量をもたらすこ
とが分かっている）とを大腸菌株D2704に挿入すると、
培養ブロスから律速酵素の多くの基質を除去できるとと
もに最終産物生成において顕著な増収がもたらされた。
図面の簡単な説明 図１は、芳香族アミノ酸の生合成における共通経路を
示す。
図２は、pKD130AとpKD136のプラスミド地図である。
図3Aと3Bは、大腸菌株D2704の共通経路における各中
間体の濃度と、この菌株のフェニルアラニンおよびフェ
ニル乳酸の平均濃度を示す棒グラフである。
図４は、プラスミドpIA321とpSU18からプラスミドpKD
28を構築する様子を示す。
図５は、図４と同様、プラスミドpKAD31の構築を示
す。
図6A、6B、6CはaroEaroLプラスミドpKAD34の製造を示
す。
図７−13は、図４−７に類似のものであって、それぞ
れプラスミドpKAD38、pKAD43、pKAD39、pKAD50、pKAD4
4、pKAD51、およびpKAD42の構築を示す。
図14は、本発明の大腸菌形質転換体の培養基におけ
る、フェニルアラニン、フェニル乳酸、及びプレフェン
の総蓄積量を示す棒グラフである。
発明を実施するための最良の形態 本発明は、共通経路を経由してホスト細胞中での芳香
族化合物の生合成能を向上させる方法を提供する。その
経路においては、代謝されうる炭素源は、多段階反応シ
ーケンスで中間体である芳香族化合物に転換されるが、
このシーケンスは、中間体基質に作用する酵素の種類に
よって異なる。本発明方法の一態様は前記経路において
律速段階を同定する方法を開発することを包含し、この
方法はホスト細胞の培養上清を分析して蓄積した共通経
路中間体、すなわち経路における酵素に仲介された律速
段階のための基質、を同定することを含むものである。
律速段階が同定されると、ホスト細胞は、経路の律速反
応段階における同定された蓄積中間体基質に作用する酵
素種をコードするDNAを含有するリコンビナントDNAで形
質転換され、ホスト細胞中の酵素種の発現を増加させ
る。加えて律速段階に関与する酵素種の高度の発現はま
た、本分野で受け入れられている方法を用いて内因性コ
ントロール配列を修正するかあるいは既存の発現コント
ロール配列の抑制解除に変化を起こすことによってホス
ト細胞を遺伝子工学的に操作し、そのような酵素種に対
する内因性遺伝子を過発現することによっても達成され
る。
律速酵素種の発現を高めるために用いられる正確なメ
カニズムが何であれ、それは典型的にはホスト細胞への
リコンビナント遺伝子エレメントの移行によって影響も
しくは仲介されるのではないかということが考えられ
る。ここでいう遺伝子エレメントとは、共通経路におい
て律速酵素を発現させるかまたは発現を調整する産物、
特に酵素等のタンパク、アポタンパク、またはアンチセ
ンスRNAなどの産物、を発現可能なコード配列を有する
核酸（通常DNAまたはRNA）を含む。発現されたタンパク
は酵素として機能することができ、酵素活性を抑制もし
くは抑制解除し、または酵素の発現をコントロールす
る。これらの発現可能な配列をコードするリコンビナン
トDNAは、染色体内（例えば相同組換えによってホスト
細胞染色体に組み込まれたもの）または染色体外（例え
ばプラスミド、コスミド、および目的とする形質転換を
起こすことが可能なその他のベクターによって担持され
るもの）のいずれのものでもよい。
本発明におけるホスト細胞を転換するために用いられ
るリコンビナントDNAは、構造遺伝子の他に、タンパ
ク、アポタンパク、またはアンチセンスRNAに対するコ
ード配列の発現や抑制解除をコントロールするエンハン
サー、プロモーター、およびリプレッサーを含む発現コ
ントロール配列を包含することができる。たとえばその
ようなコントロール配列を野性型のホスト細胞に挿入し
て、ホスト細胞ゲノム中に既にコードされた選択酵素の
過発現を促進したり、あるいはそれらを用いて染色体外
でコードされた酵素の合成をコントロールするために用
いることができる。
リコンビナントDNAは、プラスミド、コスミド、ファ
ージ、イースト人工染色体、その他、ホスト細胞中への
遺伝子エレメントの移入の仲介を行うベクターによって
ホスト細胞へと導入される。これらのベクターは、ベク
ターおよびベクターに担持される遺伝子エレメントの複
製をコントロールするcis−作用コントロールエレメン
トとともに複製起点を有することができる。ベクター上
には選択可能なマーカーが存在してもよく、これは遺伝
子エレメントが導入されたホスト細胞の同定に役立つ。
そのような選択可能なマーカーの例として、テトラサイ
クリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマ
イシン、またはネオマイシンなどの特定の抗生物質に耐
性を与える遺伝子が挙げられる。
ホスト細胞に遺伝子エレメントを導入する好ましい手
段は、本発明による遺伝子エレメントが挿入された染色
体外マルチコピープラスミドベクターを用いるものであ
る。ホスト細胞への遺伝子エレメントのプラスミドによ
る導入にあたっては、まず制限酵素でプラスミドベクタ
ーを切断し、本発明による標的酵素種をコードする遺伝
子エレメントと当該プラスミドとを連結する。連結され
たプラスミドが再環化したら、感染（例えばλファージ
中へのパッケージング）その他のプラスミド伝達メカニ
ズム（例えば電気穿孔法、マイクロインジェクションな
ど）を利用してプラスミドをホスト細胞に伝達させる。
ホスト細胞に遺伝子エレメントを挿入するのに適当なプ
ラスミドの例としてはpBR322およびその誘導体であるpA
T153、pXf3、pBR325、およびpBR327、pUCベクター群、p
ACYCおよびその誘導体、pSC101およびその誘導体、およ
びColE1が挙げられるがこれらに限定されるものではな
い。
本発明において好適に使用されるホスト細胞は、希望
する芳香族化合物の工業的生合成的生産に使用可能な属
（genus）に属するものである。従って、ホスト細胞
は、Escherichia（エシェリキア）、Corynebacterium
（コリネバクテリウム）、Brevibacterium（ブレヴィバ
クテリウム）、Arthrobacter（アルスロバクター）、Ba
cillus（バチルス）、Pseudomonas（シュードモナ
ス）、Streptomyces（ストレプトマイセス）、Staphylo
coccus（スタフィロコッカス）、およびSerratia（セラ
チア）の各属に属する原核生物を包含する。真核ホスト
細胞も使用できるが、イースト類またはSaccharomyces
（サッカロマイセス）属やSchizosaccharomyces（シゾ
サッカロマイセス）属が好ましい。
より具体的には原核ホスト細胞はたとえば次の種から
誘導されるがこれらに限定されるものではない:Escheri
chia coli（エシェリキア・コリ）、Corynebacterium
glutamicum（コリネバクテリウム・グルタミカム）、
Corynebacterium herculis（コリネバクテリウム・ヘ
ルキュリス）、Brevibacterium divaricatum（ブレヴ
ィバクテリウム・ディヴァリカタム）、Brevibacterium
lactofermentum（ブレヴィバクテリウム・ラクトフェ
ルメンタム）、Brevibacterium flavum（ブレヴィバク
テリウム・フラヴァム）、Bacillus brevis（バチル
ス）、Bacillus cereus（バチルス・セレウス）、Baci
llus circulans（バチルス・サーキュランス）、Bacil
lus coagulans（バチルス・コアギュランス）、Bacill
us lichenformis（バチルス・リシェニフォルミス）、
Bacillus megaterium（バチルス・メガテリウム）、Ba
cillus mesentericus（バチルス・メセンテリカス）、
Bacillus pumilis（バチルス・ピュミリス）、Bacillu
s subtilis（バチルス・サブチリス）、Pseudomonas
aeruginosa（シュードモナス・エルジノーサ）、Pseudo
monas angulata（シュードモナス・アングラータ）Pse
udomonas fluorescens（シュードモナス・フルオレッ
センス）、Pseudomonas tabaci（シュードモナス・タ
バシ）、Streptomyces aureofaciens（ストレプトマイ
セス・オーレオフェシエンス）、Streptomyces avermi
tilis（ストレプトマイセス・アヴァーミチリス）、Str
eptomyces coelicolor（ストレプトマイセス・コエリ
コロール）、Streptomyces griseus（ストレプトマイ
セス・グリセウス）、Streptomyces kasugensis（スト
レプトマイセス・カスゲンシス）、Streptomyces lave
ndulae（ストレプトマイセス・ラヴェンジュレ）、Stre
ptomyces lipmanii（ストレプトマイセス・リプマ
ニ）、Streptomyces lividans（ストレプトマイセス・
リヴィダンス）、Staphylococcus epidermis（スタフ
ィロコッカス・エピデルミス）、Staphylococcus sapr
ophyticus（スタフィロコッカス・サプロフィチカ
ス）、およびSerratia marcescens（セラチア・マルセ
ッセンス）。
好ましい真核ホスト細胞としては、Saccharomyces c
erevisiae（サッカロマイセス・セレヴィシエ）およびS
accharomyces carlsbergensis（サッカロマイセス・カ
ールスベルゲンシス）が挙げられる。
コリスメート（芳香族アミノ酸など）からの一次代謝
物を工業的に生産するためには、代謝生合成経路におい
て一以上の酵素をフィードバック阻害しない上述の種の
非調整（deregulated）突然変異株が好ましい。そのよ
うな株はランダムまたは特異的突然変異によって生成さ
れるかあるいは商業的に入手可能である。DAHPシンター
ゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、あるいはコリスミ酸
ムターゼのフィードバック阻害を除去した大腸菌の例
は、Tribe（トライブ）に許可された米国特許第4681852
号およびBeckman（ベックマン）に許可された米国特許
第4753883号に記載されており、これらの開示を本明細
書の一部を構成するものとしてここに援用する。
本発明の好ましい実施態様においては、ホスト細胞中
の律速酵素種の高発現がホスト細胞の形質転換によって
達成されるが、この形質転換は次の酵素種、すなわち３
−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナー
ゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−
リン酸シンターゼ（EPSPシンターゼ）、をコードするDN
Aを含有するプラスミドベクターによってなされる。よ
り好ましくは、形質転換ベクターはさらにコリスミ酸シ
ンターゼをコードするDNAを含有する。本発明方法にお
ける最も好ましい実施態様においては、大腸菌株は、次
の酵素をコードするDNAを含有するリコンビナントDNAで
形質転換されてホスト細胞中のそれら酵素の発現を増加
させる：トランスケトラーゼ（tkt）、３−デオキシ−
Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンター
ゼ（DAHPシンターゼ）、３−デヒドロキネート・シンタ
ーゼ（DHQシンターゼ）、シキメート・キナーゼ、５−
エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンター
ゼ、およびコリスミ酸シンターゼ。
典型的には、リコンビナントDNAは、上記酵素種をコ
ードするDNAを含有する一以上のリコンビナントプラス
ミドベクターの一部としてホスト細胞中に導入される。
本発明の他の実施例には、本発明方法によって調製さ
れる細胞形質転換体および、そのような細胞形質転換体
を用いて炭素源から芳香族化合物を生物触媒的に生産す
る方法が含まれる。この方法は、炭素源の存在下、共通
経路において当該炭素源を利用しうる本発明の細胞形質
転換体を、経路における炭素源の使用を助成する条件下
において培養する段階を包含するものである。本発明の
その他の実施態様には、共通芳香族生合成経路の２以上
の律速酵素に対する構造遺伝子を包含するプラスミド構
造体が含まれる。例えば、好ましい構造体としてシキメ
ート・キナーゼとEPSPシンターゼに対する構造遺伝子を
含有するものが挙げられ、より好ましくはコリスミ酸シ
ンターゼに対する構造遺伝子も含有される。そのような
プラスミド構造体で形質転換された微生物もまた本発明
に含まれる別の一態様である。
すでに述べたように、ホスト細胞中の共通経路から導
かれる化合物の生合成能を高めるために、その経路上で
の反応を促進するタンパクの発現を増加させることが従
前なされてきた。本発明は、共通経路を経由してホスト
細胞中の芳香族化合物を生成するにあたりその生成効率
を目ざましく改善するものである。これまでの報告で
は、共通経路のトランスケトラーゼ単独もしくはトラン
スケトラーゼと他の酵素、例えばDAHPシンターゼ、DHQ
シンターゼさらにはシキミ酸シンターゼとの組み合わせ
での濃度を高めることによって経路の上流端（反応シー
ケンス開始点）への炭素の流れを増加させることができ
ることが知られている。しかし、律速酵素種が同定でき
ること、および、この同定結果を利用してホスト細胞を
形質転換して律速酵素種を過発現させ芳香族経路中の炭
素流の顕著な増加をもたらしうること、についてはなん
らの示唆もなされていない（このことは形質転換ホスト
細胞の培養基中の「プロセス内」芳香族代謝産物の濃度
によってわかる）。このように本発明は共通経路から得
られる化合物の生合成収率を向上させるという従前なさ
れてきた努力をさらにつぎの（１）、（２）のように改
善するものと見ることができる：（１）前記経路におけ
る律速反応段階を同定すること、および（２）その経路
において同定された律速段階を触媒するタンパクの発現
を増大させること。本発明においては、発現の増大は、
好ましくはホスト細胞を形質転換して当該タンパク触媒
（酵素）をコードする構成的外因性遺伝子を発現させ、
これによってホスト細胞中のタンパクの濃度を増加させ
ることによって達成される。本発明による改良点が特に
顕著に現れるのは、ホスト細胞が、シキミ酸キナーゼ、
EPSPシンターゼおよびコリスミ酸シンターゼに対する遺
伝子を包含する外因性構造遺伝子を発現するように形質
転換された大腸菌の菌株の場合である。
pheA−、tyrA−、およびΔtrpE−Ｃである大腸菌株、
D2704は、理論的にはコリスミ酸が生成可能なはずであ
る。なぜならフェニルアラニン、チロシン、およびトリ
プトファンへと続く末端経路がそれぞれ阻害（ブロッ
ク）されているからである（図１）。この株を用いて、
経路に炭素流の急増が起こったとき、大腸菌中で芳香族
アミノ酸生合成の共通経路の阻害を除去することを計画
した。ここで阻止の指標としてコリスメートの蓄積増加
を用いた。富化した培地中でD2704細胞を成長させた
後、最小塩蓄積培地中への再懸濁で、ほとんどもしくは
全くコリスメートが蓄積しなくなり、一方フェニルアラ
ニンのレベルが目ざましく向上した。フェニルアラニン
の生成は、非酵素的なコリスミ酸からプレフェン酸への
クライゼン再転位の後、フェニルピルビン酸を生成する
脱水工程を経ることで説明される。酵素であるコリスミ
酸ムターゼはコリスメートからプレフェネートへの転換
を37℃で2x106倍加速するが、この反応は酵素の不存在
下でも起こりうる。報告によれば、プレフェン酸は通常
の細胞培養において創出されるような温和な酸性条件下
で非酵素的にフェニルピルベートを生成する。フェニル
ピルビン酸の生成と共に微生物は、tyrBでコードされた
完全アミノトランスフェラーゼによって、フェニルアラ
ニンを合成できるはずである。しかしながら非常に多量
のフェニルラクテートが培養上清の幾つかに観察され
た。
tyrBでコードされた芳香族アミノトランスフェラーゼ
は、窒素供与体としてグルタメートを、コエンザイムと
してピリドキサルリン酸を用いて芳香族ケト酸アミノ酸
をアミノ基転移させる［Mavrides,C.In Methodsin En
zymology;アカデミック社：サンディエゴ、1987年、14
2、253−267ページ］。フェニル乳酸の生成は、細胞中
のグルタメート供給が不十分でフェニルピルビン酸を完
全にアミノ基転移できないことによるものであろう。フ
ェニルピルビン酸のフェニル乳酸への還元が起こって、
細胞内のNAD+の供給を再びもたらす可能性がある。ま
た、酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ［Holbrook,J.J.;
Liljas,A.;Steindel,S.S.;Rossmann,M.G.In The Enzy
mes;Boyer,P.D.編；アカデミック・プレス：ニューヨー
ク、1975;第11巻、第４章］によって触媒される、ピル
ベートから乳酸への同様な還元が嫌気条件下で起こり、
NAD+の供給を再び起こして解糖機能を継続させることが
知られている。
芳香族アミノトランスフェラーゼの活性もまた、D270
4におけるpheA突然変異の存在によって制限される可能
性がある。pheAによってコードされる、二機能性の酵素
であるコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラター
ゼは、フェニルピルベートの存在下で芳香族アミノトラ
ンスフェラーゼと反応し、大腸菌内で複合体を形成する
［Powell,J.T.;Morrison,J.F.;Biochem.Biophys.Acta、
1979年、568、467−474］。D2704はpheAであるので、こ
れは複合体形成に必要なコリスミ酸ムターゼ−プレフェ
ン酸デヒドロラターゼ酵素を生成できないはずである。
酵素−酵素間の相互反応の役割は判明していないが、複
合体を形成できないことがアミノトランスフェラーゼ活
性に影響し、細胞内でフェニルピルビン酸の蓄積をもた
らす可能性がある。この仮説はもっともらしく聞こえる
が、フェニルラクテートの蓄積の理由は未だに実験的に
は解明されていない。しかしながら、フェニルラクテー
トの蓄積が共通経路からの阻害が除去されたグルコース
等価物を表すとみることには問題はない。よって芳香族
アミノ酸生合成の共通経路から代謝阻害がうまく除去で
きたときの除去量を、以下に記す研究によってフェニル
アラニンとフェニル乳酸の総蓄積の和として測定した。
培養上清における共通経路中間体の蓄積を利用して、共
通経路を下る炭素流中の律速段階である酵素を同定した
が、これは蓄積中間体が律速酵素の基質であるという考
えに基づくものであった。
適切な薬剤を含有するLB培地を用いて各株５ミリリッ
トルの出発培養を10時間生育した。容積４リットルのエ
ルレンマイヤー・フラスコにLB培地１リットルを入れ、
さらに必要に応じてイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド（IPTG）（0.2mM）、クロラムフェニコール
（20mg/L）、およびアンピシリン（50mg/L）を加えたも
のに上記出発培養を接種した。培養（１リットル）を37
℃で12時間、攪拌しながら生育させた（250RPM）。細胞
を収穫し（3000g、５分、４℃）、M9塩で３回洗浄した
［M9塩は１リットル当たりNa2HPO4を6g、KH2PO4を3g、N
aClを0.5g、NH4Clを1g含有する］（各サンプルを300ml
で洗浄）。グルコース（10g）、MgSO4（1mM）、および
チアミン（30mg）を含有させた１リットルのM9蓄積培地
を４リットルのエルレンマイヤー・フラスコにいれ、さ
らに必要な場合にはこれにクロラムフェニコール、アン
ピシリン、およびIPTGを添加し、これに細胞沈殿物を再
懸濁した。細胞は、さらに48時間の間、37℃で攪拌しな
がら蓄積培地中でインキュベートした（250RPM）。分割
量（25ml）を24時間および48時間の間隔で取り出して遠
心分離した（6000g;5分;4℃）。分離された上清10ミリ
リットルを各サンプルから集め、真空下で水分を除去し
た。サンプルを重水で二回交換し、1H−NMRで分析し
た。３−（トリメチルシリル）プロピオン−2,2,3,3−d
4酸のナトリウム塩を内部標準として用いて中間体と蓄
積過程で生成した産物を定量した。全培養は三重に用意
して生育させ、蓄積した分子の平均値およびその標準偏
差を得た。
芳香族アミノ酸生合成の共通経路を通る炭素サージを
起こすためには、トランスケトラーゼ（tkt）を含有す
るプラスミド及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノーヘプツ
ロソネート−７−リン酸シンターゼ（DAHPシンターゼ）
のチロシン感受性アイソザイム（aroF）を用いた。トラ
ンスケトラーゼは、芳香族アミノ酸の生産において細胞
が利用できるエリスローズ４−リン酸のレベルを増大さ
せることが知られている一方、DAHPシンターゼは経路に
おける最初の不可逆的段階である。tkt、aroFプラスミ
ドpKD130A（図２）、アンピシリン耐性完全遺伝子を有
するpBR325誘導体、および複製起点pMB1は、３−デオキ
シ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（DA
HP）、３−デヒドロキシメート（DHS）、シキメート、
およびシキメート−３−リン酸という共通経路中間体を
蓄積した。総フェニルアラニンおよびフェニル乳酸蓄積
量は、D2704へ導入されたとき5.6＋／−0.7mMであった
（図３）。48時間のインキュベーションの後、DAHPに関
する1H−NMR共鳴を測定した結果は次の通りである：δ
1.79（dd、13、13Hz、1H）、δ2.20（dd、13、5Hz、1
H）、δ3.46（dd、９、9Hz、1H）、およびδ3.83（ｍ、
2H）。培地中のシキメートの存在は、共鳴によってδ4.
41（dd、４、4Hz、1H）およびδ6.47（ｍ、1H）におい
て示される。シキメートーフォスフェートの共鳴はδ6.
47（ｍ、1H）にある。フェニルアラニンの共鳴はδ3.14
（dd、14、8Hz、1H）、δ3.29（dd、14、5Hz、1H）、お
よびδ7.30−7.49（ｍ、5H）に見いだされる。フェニル
乳酸の共鳴はδ4.27（dd、８、4Hz、1H）およびδ7.30
−7.49（ｍ、5H）で観察される。DHSは24〜48時間の間
に蓄積培地から消失する。培養上清中のDAHP、DHS、シ
キメート、およびシキメート−３−フォスフェートの蓄
積から、３−デヒドロキネート・シンターゼ（DHQシン
ターゼ）、シキメート・デヒドロゲナーゼ、シキメート
・キナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメー
ト−３−リン酸シンターゼ（EPSPシンターゼ）のそれぞ
れが律速酵素であるといえる。DHQシンターゼとシキメ
ート・デヒドロゲナーゼは従前共通経路における律速段
階であると同定されていたが［Draths,K.M.;Frost,J.
W.;J.Am.Chem.Soc.、1990年、112、9360−9632;Draths,
K.M.Ph.D.、スタンフォード大学論文、1991年６月］、
シキメート・キナーゼとEPSPシンターゼが律速段階であ
るとの同定はこれまでに文献記載がない。
培養上清からDAHPの蓄積をなくするために、D2704にt
kt、aroF、aroBプラスミドpKD136（図２）が導入され
た。pKD136を用いるとDAHPが培養上清から成功裏に取り
除かれDHS、シキメート、およびシキメート−３−リン
酸の蓄積増加をもたらしたが、フェニルアラニンおよび
フェニルラクテートは増加しなかった（図３）。図3Aは
最小培地中で24時間生育させた後のD2704株中に蓄積し
た共通経路中間体の濃度を示す。図3Bは最小培地中で24
時間および48時間生育させた後のD2704株中に蓄積した
フェニルアラニンとフェニルラクテートの総蓄積量を示
す。本実験に使用した株は次のものを含む:1）D2704/pK
D130A;2）D2704/pKD136;3）D2704/pK136/pKD28;4）D270
4/pKD136/pKAD34;5）D2704/pKD136/pKAD31;6）D2704/pK
D136/pKAD38;7）D2704/pKD136/pKAD43;8）D2704/pKD136
/pKAD39;9）D2704/pKD136/pKAD51;10）D2704/pKD136/pK
AD44;11）D2704/pKD136/pKAD50。このように、経路から
律速段階を取り除いても、最終産物の蓄積増加は観察さ
れなかった。
pKD136へのaroEの挿入に関して好便なユニーク制限部
位がないことにより、残る阻害除去実験においては二つ
のプラスミド系を使うことになった。この系はpKD136お
よび、pSU2718/pSU2719［Martinez,E.;Bartolome,B.;de
la Cruz、F.Gene、1988年、68、159−162］から誘導
されたプラスミドであるpSU18とpSU19（これはクロラム
フェニコール耐性を有する）、lacプロモーター、およ
び複製起点p15Aからなるものであり、これに残りの阻害
除去遺伝子を挿入した。pSU18に基づくaroEプラスミド
であるpKD28［Draths,K.M.Ph.D.スタンフォード大学論
文、1991年６月］を作成したが、これはpIA321［Anton,
I.A.;Coggins,J.R.;Biochem.J.、1988年、249、319−32
6］からのaroE遺伝子およびtacプロモーターを含有する
1.6kbのフラグメントを単離し、さらに図４に示すpSU18
へと連結することによって行った。D2704/pKD136/pKD28
はDHS蓄積レベルを低下させない一方、培養上清から中
間体を完全には除去しなかった。シキメートとシキメー
ト−３−リン酸は培養ブロスに存在し続けた。フェニル
アラニンとフェニルラクテートの総生産は生育48時間後
で2.1＋／−0.9mMへと減少した（図３）が、これはaroE
での阻害除去による炭素流の増加によって最終物質がそ
れ以上蓄積することがなかったことを意味している。
シキメート・キナーゼの律速特性を除去するため、ar
oLとaroEaroLの両プラスミドを構築した。aroLは、機能
が未知の遺伝子であるaroM［DeFeyter,R.C.;Pittard,
J.、J.Bacteriol.、1986年、165、226−232］を有する
転写ユニットに位置している。この転写ユニットを含む
2.7kbのフラグメントは既に単離されており、これはpBR
322にクローニングされてプラスミドpMU371［DeFeyter,
R.C.;Pittard,J.、J.Bacteriol.、1986年、165、226−2
32］を形成する。aroLを含有するkBフラグメントをプラ
スミドpMU371から単離し、ベクターpSU19に挿入して3.3
kbのaroLプラスミドpKAD31（図５）を製作する。4.9kb
のaroEaroLプラスミドpKAD34をpKD28からのaroE遺伝子
のフランキング制限部位の操作によって得たのち、それ
を単離してpKAD31のユニークなXba IおよびBamH部位へ
と連結する（図６）。
aroEaroL構成体（construct）であるD2704/pKD136/pK
AD34はDHSとシキメートを培養上清から完全に除去する
ことができ、蓄積された共通経路中間体としてシキメー
ト−３−リン酸を残すのみである。フェニルアラニンと
フェニル乳酸の総生産は3.4＋／−0.2mMであった。これ
はD2704/pKD136/pKAD28という最終産物からのわずかな
上昇にとどまったが、なおD2704/pKD130AとD2704/pKD13
6の両者で観察されるフェニルアラニンとフェニルラク
テートよりもまだ顕著に少ないものであった（図３）。
aroL構成体であるD2704/pKD136/pKAD31もまたDHSとシ
キメートを培養ブロスから完全に除去することができ、
ただ一つの過生産された遺伝子を有するシキメート・デ
ヒドロゲナーゼおよびシキメート・キナーゼ両者の律速
特性をから解放している。したがってシキメート・デヒ
ドロゲナーゼの律速特性はシキメート蓄積の人為結果
（アーティファクト）であると思われる。シキメート・
デヒドロゲナーゼの律速特性において培養基からシキメ
ートを除去することの重要性は、シキメートが酵素に対
して何らかの阻害効果を有するかも知れないことを示唆
するものである。シキメート−３−リン酸の蓄積はなお
観察され、またフェニルアラニンとフェニルラクテート
の総生産は5.6＋／−0.5mMであることが判明した。これ
は、D2704/pKD130AおよびD2704/pKD136で最初に観察さ
れた最終産物生成レベルである（図３）。このようにDH
Qシンターゼ、シキメート・デヒドロゲナーゼ、および
シキメート・キナーゼの代謝阻止を除去した時、経路の
最終産物の総蓄積量は、理由不明の阻害除去されたグル
コース同等物を別として顕著な増加はなかった。
EPSPはEPSPシンターゼの前進反応の阻害剤であること
が報告されており［Duncan,K.;Lewendon,A.;Coggins,J.
R..、FEBS Lett.、1984年、165、121−127］、これは
当該酵素が律速特性を遵守することに対する一説明を示
唆するものである。シキメート−３−リン酸を培養上清
から除去するために、aroAプラスミドおよびaroAaroLプ
ラスミドを構築した。aroA遺伝子は、セリンの生合成経
路酵素である３−フォスフォセリン・アミノトランスフ
ェラーゼをコードするserCを有するオペロン上に存在す
る。serCaroAオペロンをコードする4.7kbのフラグメン
トを単離し配列決定した［Duncan,K.;Coggins,J.R.、Bi
ochem.J.、1986年、234、49−57;Duncan,K.;Lewendon,
A.;Coggins,J.R.、FEBS Lett.、1984年、170、59−6
3］。4.7kbのaroAプラスミドpKAD38を作成するために、
2.4kbのaroAフラグメントをプラスミドpKD501から単離
し［Duncan,K.;Coggins,J.R.、Biochem.J.、1986年、23
4、49−57］、外部lacプロモーターの直後にあるベクタ
ーpSU18に連結した（図７）。serCaroAの転写ユニット
からのaroAの除去は、発現のために外部プロモーターの
後ろにそれが配置されることを必要とする。serCとaroA
遺伝子の間に位置しaroAの発現を自然に減衰させると信
じられている、rhoと独立の転写ターミネーターは、2.4
kbのaroAフラグメント上に完全な形で残存するが、この
理由は、除去に好都合な制限部位がないからである。外
部lacプロモーターの後方の転写ターミネーターでのト
ランケートされたaroA遺伝子はなおあるレベルのEPSPシ
ンターゼの過発現をもたらす。5.7kbのaroAaroLプラス
ミドであるpKAD（図８）は2.4kbのaroA遺伝子をフラン
キングPst Iと平滑末端化部位による単離および等価な
部位を有するように操作されたpKAD31ベクターへの連結
によって作成された。
D2704/pKD136/pKD38株の評価の結果、総フェニルアラ
ニンおよびフェニルラクテート生産量の顕著な増加が判
明した。この生産量は48時間蓄積後で7.9＋／−1.3mMで
あった（図３）。上清に蓄積した経路の中間体はDHS、
シキメート、およびシキメート−３−リン酸であった。
D2704/pKD136/pKAD43株は9.7＋／−0.3mMのフェニルア
ラニンとフェニルラクテートを生産したが、唯一の共通
経路中間体、シキメート−３−リン酸が蓄積したのみで
あった。aroAプラスミドが阻害除去されたグルコース等
価物から最終産物への転換が成功したことを最初に示し
た。aroA遺伝子がシキメート−３−リン酸蓄積を完全に
取り除くことができないことは、EPSPシンターゼによっ
て触媒される反応の可逆性から来るものと考えられえ
る。
コリスミ酸シンターゼは不可逆的であってかつ恐らく
は律速酵素であろうということが示唆されている［Pitt
ard,A.J.In Escherichia coli and Salmonella ty
phimurium;Neidhardt,F.C.、Inhgraham,J.L.、low,K.
B.、Magasanik,B、Schaechter,M、Umbarger,H.E.、編、
アメリカ微生物学会：ワシントンD.C.、1987年;vol.、
第４章］。もし蓄積されたEPSPが引き続きEPSPシンター
ゼによってシンターゼ−３−リン酸へと転換されるなら
ば、コリスミ酸シンターゼの律速特性によって、シキメ
ート−３−リン酸は引き続き存在するであろう。培養上
清からシキメート−３−リン酸を完全に除去するため
に、aroAaroCaroLプラスミドを構築した。まずpGM602か
らの平滑末端化部位とSal Iによってフランキングされ
たaroCフラグメントの単離によってaroCプラスミドを構
築した［White,P.J.;Miller,G.;Coggins,J.R.;Biochem.
J.、1988年、251、313−322］。これはコリスミ酸シン
ターゼをコードする1.69kbのフラグメントを含有するプ
ラスミドである。pSU19のユニークなSal IおよびSma I
部位への連結によって4kbのプラスミドpKAD39を作成し
た（図９）。7.4kbのaroAaroCaroLプラスミドpKAD50を
作成するために、1.69kbのaroCフラグメントをpKAD39か
らSal I/平滑末端化フラグメントとして単離し、等価な
末端を有するように操作されたpKAD43ベクターへと連結
した（図10）。
D2704/pKD136/pKAD50株は12.3＋／−2.2mMのフェニル
アラニンとフェニルラクテートを産生したが、これはD2
704/pKD136/pKAD43のD2704/pKD136/pKAD43と比べて最終
物質生産量において目ざましい増加である（図３）。D2
704/pKD136/pKAD50はなおいくらかのシキメート−３−
リン酸を蓄積したが、その総蓄積量はD2704/pKD136/pKA
D43より少なかった。48時間後のD2704/pKD136/pKAD50蓄
積をNMRにより測定すると、δ3.29（dd、14、5Hz、1
H）、δ4.0（dd、８、5Hz、1H）、およびδ7.25−7.49
（ｍ、5H）における共鳴でフェニルアラニンの存在が示
される。フェニル乳酸の共鳴は、δ2.88（dd、14、8H
z、1H）、δ4.27（dd、８、4Hz、1H）、およびδ7.25−
7.49（ｍ、5H）である。少量のDHSもまた培養ブロス中
に存在し、これはδ6.4（ｄ、3Hz、1H）での共鳴で示さ
れる。阻害除去プラスミドにaroCを加えた時に観察され
た最終産物の増収は、蓄積されたEPSPがシキメート−３
−リン酸に転換される可能性を仮定すると、律速酵素と
してのコリスミ酸シンターゼの作用であるといえる。
さらに良くコリスミ酸シンターゼの役割を理解するた
めに、aroC（pKAD39;図９）、aroAaroC、およびaroCaro
LをD2704/pKD136中に構築し、評価した。6.39kbのaroCa
roAプラスミドpKAD44（図11）を、フランキングPst Iお
よび平滑末端部位を有するaroAフラグメントを単離する
ことにより製作し、次いで等価な平滑末端部位を含有す
るように操作したpKAD39ベクター中に連結した。5kbのa
roCaroLプラスミドpKAD51（図12）はSal I平滑末端フラ
グメントとしてaroCを単離し、等価な部位を含有するよ
うに操作したpKAD31ベクター中に連結した。図３から明
らかなように、pKAD39、pKAD44、pkAD51は、aroAaroCar
oLプラスミドpKAD50がD2704/pKD136へと挿入された時の
最終物質蓄積レベルに至らなかった。従ってD2704/pKAD
136/pKAD50株が最終産物の生産量を最大にする最適な株
であることが決定された。
この最適なD2704/pKAD136/pKAD50株中のトランスケト
ラーゼの役割を決定するために、BamH Iによる分解でプ
ラスミドpKAD136から遺伝子を除去し、次いで再連結し
てaroFtktプラスミドpKAD42を製作した（図13）。D2704
/pKAD42/pKAD50の培養の結果、多量のアセテートとラク
テートが蓄積したがこれは細胞死を招いた。この問題に
対して蓄積培地のpHを48時間のインキュベーションの間
モニターし、必要なときには5NのNaOHで中和した。中性
pHに保持することによって、D2704/pKAD42/pKAD50の24
時間および48時間の両時点でプレフェン酸が高度に蓄積
したが、この理由は恐らく中性pHでのフェニルピルベー
トへの転位能が低いことによるものであろう。このよう
に、D2704/pKAD42/pKAD50とD2704/pKAD136/pKAD50とで
共通経路末端に成功裏にもたらされる炭素流の量を比較
するために、フェニルアラニン、フェニル乳酸、および
プレフェン酸の総量を考察した。
図14に示すように、D2704/pKAD136/pKAD50株によって
生産される最終産物の量はD2704/pKAD42/pKAD50株によ
って生産される量よりも遥に多い。このことは、芳香族
アミノ酸およびその誘導体へと炭素サージをうまく向わ
せるためには、共通経路で利用可能な炭素レベルを上昇
させDAHPシンターゼ、DHQシンターゼ、シキメート・キ
ナーゼ、EPSPシンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼ
をコードする遺伝子を増加させるためにトランスケトラ
ーゼの染色体コピーが余分に必要とされ、その結果意図
する最終産物へのサージを成功裏に指向することができ
ることを示している。
NMRスペクトルによる細胞上清の分析の結果、DHQシン
ターゼ、シキメート・キナーゼ、EPSPシンターゼ、およ
びコリスミ酸シンターゼが芳香族アミノ酸生合成の共通
経路における代謝阻害剤であることが判明した。従前、
シキメート・デヒドロゲナーゼが代謝阻害剤であるとし
て同定されていたが、これは培地中でのシキメートの蓄
積による人為結果であると考えられる。生物触媒的過程
によって生産される芳香族アミノ酸およびその誘導体の
収率および純度の両者を、大腸菌の２つのプラスミド系
の利用によって向上させることができる。プラスミドpK
AD136またはその機能上の等価物は芳香族アミノ酸生合
成の共通経路への炭素流増加をもたらす必須要件であっ
て、一方プラスミドpKAD50またはその機能上の等価物は
当該共通経路の終点へと炭素流のサージを確実に向ける
ための必須要件である。阻害除去遺伝子aroB、aroL、ar
oA、およびaroCの導入時に観察される最終産物の純度の
向上は、D2704/pKD130AおよびD2704/pKD136/pKAD50のNM
Rデータにおいて容易に識別することができる。
フロントページの続き (72)発明者 フロスト，ジョン，ダブリュー. アメリカ合衆国・インディアナ州 47905・ラファイエット・ツイン オー クス レーン 1805 (72)発明者 デル，クリスティー，エー. アメリカ合衆国・インディアナ州 47907・ウェスト ラファイエット・ア パートメント 311・アンドリュー プ レイス 101 (72)発明者 ドレイス，カレン，エム. アメリカ合衆国・インディアナ州 47905・ラファイエット・ツイン オー クス レーン 1805 (72)発明者 ベリー，アラン アメリカ合衆国・ニューヨーク州 14468・ヒルトン・サンド ペブル レ ーン 144 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 13/00 - 17/18 C12N 15/00 - 15/909 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】大腸菌細胞形質転換体において、当該細胞
    に対し内因性の芳香族アミノ酸生合成共通経路を経由し
    て芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、
    当該方法は、代謝可能な炭素源を含有する培地中で当該
    炭素源の代謝を促す条件下で前記細胞形質転換体を培養
    する段階を包含するものであって、前記細胞形質転換体
    は共通経路酵素種をコードする外因性DNA配列を包含
    し、当該酵素種は、次の酵素、３−デヒドロキネート・
    シンターゼ、シキメート・キナーゼ、および５−エノー
    ルピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、お
    よびコリスミ酸シンターゼからなるものである、芳香族
    化合物を生物触媒的に生産する方法。
  2. 【請求項２】細胞形質転換体が、トランスケトラーゼ酵
    素をコードする外因性DNA配列をさらに包含するもので
    ある、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】一以上のリコンビナント・プラスミド・ベ
    クターが、前記酵素種をコードする外因性DNA配列を包
    含するものである、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】次の酵素種、３−デヒドロキネート・シン
    ターゼ、シキメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォ
    イル−シキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコリ
    スミ酸シンターゼをコードする構造遺伝子の発現向上を
    特徴とする、大腸菌形質転換体。
  5. 【請求項５】さらに次の酵素種、トランスケトラーゼお
    よび３−デオキシ−Ｄ−アラビノーヘプツロソネート−
    ７−リン酸シンターゼの発現向上を特徴とする、請求項
    ４に記載の大腸菌形質転換体。
  6. 【請求項６】炭素源から芳香族化合物を生物触媒的に生
    産する方法であって、当該方法は、前記炭素源の代謝を
    促す条件下で代謝可能な炭素源を含有する培地中で請求
    項５に記載の細胞形質転換体を培養する段階を包含する
    ものである方法。
  7. 【請求項７】共通経路酵素種に対する構造遺伝子を含有
    するプラスミド構成体であって、当該酵素種は基本的に
    ３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナ
    ーゼ、５−エノールピルヴォイル−シキメート−３−リ
    ン酸シンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼからなる
    ものである、プラスミド構成体。
  8. 【請求項８】Escherichia（エシェリキア）、Corynebac
    terium（コリネバクテリウム）、Brevibacteria（ブレ
    ヴィバクテリア）、Arthrobacter（アルスロバクタ
    ー）、Bacillus（バチルス）、Pseudomonas（シュード
    モナス）、Streptomyces（ストレプトマイセス）、Stap
    hylococcus（スタフィロコッカス）、およびSerratia
    （セラチア）の各属に属する原核生物からなる群から選
    択され、次の酵素種、トランスケトラーゼ、３−デオキ
    シ−Ｄ−アラビノーヘプツロソネート−７−リン酸シン
    ターゼ、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメー
    ト・キナーゼ、５−エノールピルヴォイル−シキメート
    −３−リン酸シンターゼおよびコリスミ酸シンターゼを
    コードする外因性構造遺伝子の発現を特徴とする、原核
    生物細胞形質転換体。
  9. 【請求項９】シキメート・キナーゼ、５−エノールピル
    ヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコ
    リスミ酸シンターゼのそれぞれをコードするDNAを含有
    するリコンビナント・プラスミド・ベクター。
  10. 【請求項１０】トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ
    −アラビノーヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ
    のチロシン感受性アイソザイム、および３−デヒドロキ
    ネート・シンターゼのそれぞれをコードするDNAを含有
    するリコンビナント・プラスミド・ベクター、およびシ
    キメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォイルシキメ
    ート−３−リン酸シンターゼ、およびコリスミ酸シンタ
    ーゼのそれぞれをコードするDNAを含有するリコンビナ
    ント・プラスミド・ベクターによって形質転換された大
    腸菌。
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