MX2011003857A - Cepas de escherichia coli modificadas para producir 3,4-dihidroxi-l-fenilalanina (l-dopa). - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a nuevas cepas de la bacteria Escherichia coli con modificaciones genéticas que dan como resultado una alta capacidad para la síntesis 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) a partir de un azucares simples como la glucosa. Asimismo, se refiere al desarrollo de procesos fermentativos para lograr la síntesis de L-DOPA en la escala de gramos.

Description

CEPAS DE ESCHERICHIA COLI MODIFICADAS PARA PRODUCIR 3,4- DIHIDROXI-L-FENILALANINA (L-DOPA) CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a la generación de nuevas cepas de la bacteria Escherichia coli con modificaciones genéticas que dan como resultado una alta capacidad para la síntesis de 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) a partir de algún azúcar simple como la glucosa. Asimismo, se refiere al desarrollo de un proceso fermentativo para lograr la síntesis de L-DOPA en la escala de gramos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los compuestos aromáticos son una clase de moléculas orgánicas que incluyen una gran cantidad de productos con aplicaciones industriales. La mayoría de estos compuestos son actualmente generados mediante síntesis química, a partir de derivados de petróleo. Una alternativa a este esquema puede ser su producción bíotecnológica empleando microorganismos modificados. La mayoría de las bacterias y plantas poseen rutas metabólicas que les permiten convertir azúcares simples en diferentes compuestos aromáticos. La vía común de síntesis de compuestos aromáticos, también conocida como la vía del ácido shikímico, es el tronco común a partir del cual se originan vías biosintéticas que dan origen a metabolitos esenciales, así como a un gran número de los llamados metabolitos secundarios. La síntesis de los compuestos aromáticos en bacterias se inicia con la condensación entre el fosfoenolpiruvato (PEP) y la D-eritrosa 4-fosfato (E4P) para formar el 3-desoxi-D-arao/no-heptulosonato 7-fosfato (DAHP) en una reacción catalizada por la enzima DAHP sintasa (DAHPS) (Figura 1 ). Después de seis reacciones enzimáticas, se produce el intermediario corismato (COR), a partir del cual se sintetizan los aminoácidos aromáticos L-tirosina (L-Tir), L-fenilalanina (L-Fen) y L-triptofano (L-Trp). La enzima bifuncional corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa (CM-PDH), codificada por el gen tyrA, interviene en la etapa final de la biosíntesis de L-Tir. La reacción inicial involucra la conversión del COR en prefenato (PPA) por la enzima corismato mutasa (CM). Posteriormente, el PPA es sustrato de la enzima prefenato deshidrogenasa (PDH), la cual descarboxila y oxida al PPA en 4-hidroxifenilpiruvato (HPP) empleando NAD+. La conversión del HPP en L-Tir la cataliza la enzima aminotransferasa de L-Tir, codificada por el gen tyrB. La L-Tir controla su vía terminal de síntesis inhibiendo la actividad de la CM-PDH, de igual forma regula la entrada de carbono a la vía común de síntesis de compuestos aromáticos inhibiendo la actividad de una de las tres isoenzimas de DAHPS (Chávez-Béjar et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:3284).

En la naturaleza no es posible encontrar bacterias que sobreproduzcan L-Tir y la excreten al medio de cultivo, ya que su biosíntesis es costosa para la célula y la vía biosintética se encuentra altamente regulada. Por esta razón, la estrategia para la generación de cepas sobreproductoras incluye necesariamente modificaciones a las proteínas DAHPS y CM-PDH para obtener versiones que no sean inhibidas por el producto L-Tir.

Algunos esfuerzos se han centrado en generar cepas de E. coli productoras de L-Tir, para lo cual ha sido indispensable identificar y eliminar los controles alostéricos y transcripcionales que este aminoácido ejerce sobre las enzimas clave de su vía de síntesis y en los genes que las codifican.

La enzima CM/PDH forma parte de la familia de proteínas TyrA, la cual conforma el grupo de deshidrogenasas que participan en la biosíntesis de L-Tir. Las deshidrogenasas, además de presentar diversas especificidades por los sustratos, también tienen distinta sensibilidad a la inhibición por L-Tir. En el caso de la deshidrogenasa de E. coli, se sabe que la L-Tir inhibe en un 90% la actividad PDH, y en un 45% a la CM. Se ha reportado la generación y la caracterización de mutantes de la CM/PDH de E. coli resistentes a la inhibición por L-Tir (TyrAfbr) obtenidas por mutagénesis del gen tyrA empleando mefa-fluoro-D,L-tirosina (Lütke-Eversloh et al. 2005. Appl. Environ. Microbiol. 71 :7224). Lütke-Eversloh y Stephanopoulos construyeron cepas de E. coli productoras de L-Tir sobreexpresando variantes resistentes a inhibición por retroalimentación de la DAHPS y CM/PDH (Lütke-Eversloh et al., 2007. Met. Eng. 10:69).

Existen proteínas de la familia TyrA que no son inhibidas de manera natural por este aminoácido, un ejemplo de ello es la enzima ciclohexadienil deshidrogenasa (CDH), de Zymmomonas mobilis (Z. mobilis) la cual puede usar PPA como un sustrato para la biosíntesis de L-Tir (Zhao, G. et al., 1993. Eur. J. Biochem. 212:157). En un estudio realizado por Chávez-Béjar et al. (2008) se construyó el plásmido pJrctyrCpheACM como una alternativa para eliminar la regulación alostérica en la vía terminal de síntesis de L-Tir. Este operón sobreexpresa el gen tyrC que codifica para la enzima CDH de Z. mobilis y cataliza la conversión de PPA a HPP; y un fragmento del gen pheA (pheAcw) que corresponde al dominio CM de la enzima corismato mutasa/prefenato deshidratasa (CM/PDT) para reconstituir la vía completa de CHA a HPP (Chávez-Béjar et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:3284). La enzima bifuncional CM/PDT de E. coli está involucrada en la biosíntesis de L-Fen. Cuando el dominio CM de la proteína CM-PDT se expresa sólo (PheAcivi), éste retiene su actividad catalítica y es insensible a la inhibición por L-Fen (Zhang et al., 2003. Bioorg. Med. Chem. 11 :3109). En contraste, el dominio CM de la enzima CM/PDH, que participa en la síntesis de L-Tir, pierde su actividad catalítica cuando no está fusionado a su dominio correspondiente PDH. Para evaluar el efecto de la expresión del operón TrctyrCpheA M sobre la producción de L-Tir, Chávez-Béjar y colaboradores realizaron cultivos en matraz de la cepa PB12, que carece del sistema de fosfotransferasa (PTS Glc+) sobreexpresando los genes aroGftr(pJLBaroGftr) y tyrCpheAcu {pJrctyrCpheAcM) ó el gen silvestre tyrAm {^lxctyrAm). Los cultivos se crecieron a 30 °C en medio mínimo M9 suplementado con 10g/I de glucosa e IPTG 0.1 mM. Se observó que la velocidad específica de crecimiento de la cepa transformada con el plásmido pTrctyrCpheAcm disminuyó en un 40% con respecto a la cepa que expresó el gen tyrA 1 '. Sin embargo, fue capaz de producir más L-Tir que la cepa que expresaba simultáneamente los genes aroGfbr y tyrA^, teniendo una productividad (qi_-T¡r) y un rendimiento (Yi_--nr/Glc) 5.8 y 6.4 veces mayores. Estos resultados mostraron que la expresión del gen tyrC tiene un efecto positivo sobre la producción de L-Tir en cultivos realizados en la cepa PB12 transformada con los plásmidos pJLBaroGfcr y pTrcfyrCpfteAcM (Chávez-Béjar et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:3284).

La proteína TyrR regula la transcripción de varios genes, actuando como represor y, algunas veces, como activador. El principal efector de TyrR es la L-Tir por lo que, además de actuar como un regulador alostérico al inhibir la actividad de las enzimas DAHPS y CM-PDH, la L-Tir regula la expresión de varios genes de la vía del SHIK (Figura 1). La proteína TyrR de E. coli controla la expresión de un grupo de unidades de transcripción (reguión TyrR) cuyos productos de traducción están involucrados en la biosíntesis o en el transporte de los aminoácidos aromáticos. El reguión TyrR de E. coli abarca por lo menos ocho unidades de transcripción, cada una de las cuales está regulada de manera distinta por la proteína TyrR. Para que ocurra la regulación de manera eficiente, la proteína TyrR debe interaccionar con pequeñas moléculas ligando: ATP, L-Tir y L-Fen. En solución, en la ausencia de cofactores o en la presencia sólo de L-Fen, la proteína TyrR existe como un dímero. Sin embargo, en la presencia de ATP y L-Tir la proteína TyrR forma hexámeros. Las secuencias de DNA reconocidas por la proteína TyrR se refieren como cajas TyrR. Siete miembros del reguión tienen dos o más cajas TyrR, las cuales se clasifican como fuertes o débiles. Las cajas fuertes son aquellas en las que se une la proteína TyrR in vitro en la ausencia de cualquier cofactor. En contraste, las cajas débiles se unen únicamente por TyrR en la presencia de L-Tir; o en el caso de tyrB, L-Tir o L-Fen (Pittard et al. 2005. Mol. Microbiol. 55:16).

El gen aroP codifica para un transportador general de aminoácidos aromáticos y cuenta con tres promotores, lo que le provee un mecanismo por el cual cada uno de los sustratos del transportador influye en su síntesis. El gen mtr codifica para un transportador específico de triptófano y su expresión se activa por L-Tir o L-Fen, pero se reprime por L-Trp. El gen tyrP codifica un transportador específico de L-Tir y su expresión se activa por L-Fen o L-Trp, pero se reprime por L-Tir (Pittard et al. 2005. Mol. Microbiol. 55:16).

La represión de TyrR independiente de cofactor únicamente requiere de una caja fuerte TyrR posicionada de tal modo que la unión de la proteína TyrR interfiera con la unión de la RNA polimerasa al promotor. Los promotores de aroF, aroL, tyrP, aroG y tyrR están sujetos a diferentes grados de represión independiente de cofactor. En los primeros tres genes, la presencia de TyrR disminuye la actividad del promotor; en el caso de aroG y tyrR, la represión independiente de cofactor resulta de la competencia directa entre la proteína TyrR y la holoenzima de la RNA polimerasa para unirse a la región promotora.

En la presencia de L-Tir, la proteína TyrR forma un hexámero y después se une a una caja fuerte y a las cajas débiles adyacentes en aroF, aroL y tyrP. En cepas TyrR+, la expresión de aroL también es reprimida por L-Trp, a través de TrpR que se une al DNA. En la ausencia de TyrR, tal unión no tiene efecto en la expresión de aroL, lo cual sugiere que se necesita alguna interacción entre TyrR y TrpR para la represión mediada por L-Trp.

Solamente tyrB muestra represión fuerte por TyrR en la presencia de L-Tir o L-Fen. Este gen codifica una aminotransferasa involucrada en la síntesis de ambos aminoácidos. Tanto la L-Tir como la L-Fen facilitan la unión de la proteína TyrR a un par de cajas TyrR. Aunque la L-Fen facilita la unión de TyrR a las dos cajas TyrR de tyrB, la L-Tir es más efectiva. La proteína TyrR y la RNA polimerasa se pueden unir juntas al promotor tyrB. En la presencia de L-Tir la unión del hexámero previene la formación del complejo abierto, pero no interfiere con la unión de la RNA polimerasa al promotor (Pittard, 2005). TyrR reprime la expresión del gen aroP, que codifica para un transportador general de aminoácidos aromáticos, en presencia de L-Tir, L-Fen o L-Trp. Los genes aroG y pheA que codifican para las dos enzimas cuya actividad es inhibida por L-Fen han involucrado diferentes estrategias de control. Los niveles de la proteína TyrR funcional controlan la expresión de aroG, en una manera independiente de cofactor (Pittard et al. 2005. Mol. Microbiol. 55: 16).

La L-Tir es un aminoácido aromático que se utiliza principalmente como materia prima para la síntesis de un producto farmacéutico de alto valor comercial: la 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA). La L-DOPA es una droga cuyo principal uso es el tratamiento de la enfermedad del Parkinson, un desorden degenerativo asociado a la disminución del nivel de dopamina como resultado de la pérdida de células cerebrales y en lesiones neurogénicas del miocardio (Ikram et al. 2002. Bioresource Technol. 85:25). La administración de dopamina no es efectiva en el tratamiento de la enfermedad del Parkinson, ya que no cruza la barrera sangre-cerebro, mientras que la L-DOPA, el precursor metabólico de la dopamina, cruza esta barrera y se convierte en dopamina, aliviando los síntomas de la enfermedad.

La oxidación de L-Tir a L-DOPA involucra la introducción de un grupo hidroxilo al anillo aromático; en todos los organismos vivos esta reacción la catalizan dos diferentes tipos de enzimas: la tirosina hidroxilasa o la tirosinasa. La tirosina hidroxilasa (TH; tirosina 3-monooxigenasa), cataliza el paso limitante en la biosíntesis de catecolaminas. La enzima se encuentra principalmente en la medula adrenal, el sistema nervioso periférico, y en las neuronas dopaminergicas y noradrenérgicas en el sistema nervioso central de organismos superiores. Debido a que la L-DOPA es precursor de la dopamina, a partir de la cual derivan las catecolaminas norepinefrina y epinefrina, se le atribuyen amplias aplicaciones terapéuticas (Kaufman, 1995. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, 70: 03).

La tirosinasa es otra enzima capaz de catalizar la oxidación de L-Tir a L-DOPA. Esta enzima se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza en todos los reinos de la vida. Es esencial para la pigmentación y, en plantas superiores y en algunos invertebrados, es un factor importante en la respuesta inmune primaria (Huffnagle et al. 1995. J. Immunol. 155:3507). La tirosinasa es una monofenol monooxigenasa cuyo sitio activo se caracteriza por un par de iones de cobre acoplados. La función mejor conocida es la formación del pigmento biológico melanina de L-Tir vía L-DOPA. En esta reacción la tirosinasa usa su centro binuclear de cobre para unir una molécula de oxigeno atmosférico y catalizar la orfo-hidroxilación de L-Tir (monofenol) a L-DOPA (o-difenol) en su actividad cresolasa y la subsecuente oxidación de L-DOPA a dopaquinona (o-diquinona) en su actividad catecolasa, la cual reacciona espontáneamente para dar origen a las melaninas (Seo et al., 2003. J. Agrie. Food. Chem. 51 :2837) (Figura 2).

Por otro lado, en la especie Beta vulgaris, las betacianinas constituyen una clase de metabolitos secundarios donde la principal betacianina, la betanina, se sintetiza por la oxidación de L-Tir a L-DOPA por la acción de una tirosina hidroxilasa, y la siguiente oxidación de L-DOPA a dopaquinona por acción de una tirosinasa o una polifenol oxidasa. Seguido de esto viene una reacción de glucosilación dando lugar a la producción de los pigmentos amarillo (ácido betalámico), rosa-violeta (betanidina) y rojo-violeta (betanina) usados como aditivos en alimentos como colorantes naturales (Sepúlveda et al. , 2005. J. Exp. Bot. 58:605) (Figura 2).

La L-DOPA producida químicamente a una escala comercial (Knowles, 2003.

Adv. Synth. Catal. 345:3) se sintetiza de la vanillina y la hidantoina por un proceso que involucra ocho pasos de reacción; la L-DOPA también se produce por síntesis catalítica asimétrica usando el ligando difosfina DiPAPM. La síntesis química de L-DOPA es un proceso que consume tiempo e involucra varios químicos que son extremadamente costosos y que requiere catalizadores poco amigables al ambiente.

La extracción de la L-DOPA a partir de fuentes biológicas donde ésta existe abundantemente es un procedimiento alternativo a la síntesis química. Cierta variedad de plantas, como vainas de Vicia faba y más comúnmente de especies de leguminosas, donde la L-DOPA es formada como un precursor de la melanina, se han usado para su producción. Cultivos de la especie de la planta Mucura pruriens se han considerado como posibles fuentes de L-DOPA por la facilidad con la cual puede ser aislada (Huizing et al. 1985. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 4:61 ).

Por el alto costo de producción y su alto valor comercial algunos investigadores se han centrado en estudiar la bioconversión de L-Tir a L-DOPA para su explotación comercial. En contraste a la producción química, la producción enzimática de L-DOPA por microorganismos es ambientalmente amigable y permite un producto mejorado bajo procesos simples. Se han estudiado diversas rutas biológicas para la producción de L-DOPA por diferentes catalizadores, algunos de los cuales se describen a continuación.

Una enzima clave en la biosíntesis de L-DOPA es la tirosinasa. Esta enzima se ha estudiado en los hongos Neurospora crassa, Agaricus bisporous, Aspergillus oryzae y Yarrowia ¡ipolytica. Sin embargo, hay variación en la producción de L-DOPA ya que ésta se descompone rápidamente a otros metabolitos por acción de la tirosinasa, que cataliza no solamente la formación de L-DOPA si no también su oxidación a L-2,3,4-trihidroxifenilalanina, haciendo la formación estequiométrica de L-DOPA difícil de alcanzar (Ikram et al.. 2002. Bio. Technol. 85:25). Para prevenir la subsecuente conversión de L-DOPA a melanina en la presencia de tirosinasa se ha utilizado ácido L-ascórbico como un antioxidante para obtener L-DOPA como producto final (Figura 3) (Lee et al. 1998. Biotechnol. Lett. 20:479). Adicionalmente, ya que la L-DOPA y la L-Tir son estructural y químicamente similares, la presencia de L-Tir en la mezcla de reacción complica el proceso de purificación de la L-DOPA como producto final.

Aproximadamente la mitad de la L-DOPA producida al año se sintetiza por un método enzimático que involucra a la tirosina fenol liasa (TPL), presente en Erwinia herbicola (E. herbicola). La TPL es una enzima inducible por L-Tir que normalmente cataliza la a, ß-eliminación de L-Tir para producir piruvato, fenol y amonio, por lo tanto permite a la bacteria utilizar L-Tir como una fuente de carbono y nitrógeno. Esta reacción es reversible y cuando el fenol se substituye por catecol, se produce L-DOPA (Figura 4) (Koyanagi et al. 2005. J. Biotechnol. 115:303). Ya que la TPL se sintetiza al ser inducida por L-Tir, la cual impide preparaciones puras de L-DOPA como producto final, se han utilizado células de E. herbicola recombinante que acarrean una mutación transcripcional del regulador TyrR, el cual es capaz de activar el promotor tpl en la ausencia de L-Tir. Ajinomoto Co. Ltd. inició la producción comercial de L-DOPA por esta nueva ruta biológica usando a la bacteria E. herbicola en un proceso de lote alimentado en el que se puede obtener una concentración final de producto de hasta 110 g G1 , y el cual presenta grandes ventajas sobre los procesos químicos clásicos. A pesar de que la reacción catalizada por la enzima TPL bajo estas condiciones favorece la formación de L-DOPA, las concentraciones de sustrato (catecol, piruvato y amonio) se deben mantener altas, lo que impone ciertas restricciones al proceso ya que el catecol en altas concentraciones es tóxico para el microorganismo, y el costo del piruvato como sustrato es alto. Adicionalmente en este proceso se genera una mezcla de L-DOPA y los sustratos iniciales como el catecol, por lo que se requiere la subsecuente separación y purificación de L-DOPA lo cual implica un alto costo de este proceso (Lee et al. 1998. Biotechnol. Lett. 20:479).

Se ha determinado que E. coli W, es la única cepa de E. coli capaz de utilizar tanto ácido fenilacético así como 3 o 4-Hidroxifenilacetato (HPA) como fuentes de carbono (Prieto et al. 1996. J. Bact. 178:111 ). La 4-HPA 3-hidroxilasa de E. coli W es una monooxigenasa aromática de dos componentes: una flavoproteína y una proteína acopladora, codificada por dos genes los cuales forman parte del mismo operón (hpaBC). El operón hpaBC, el cual forma parte de una vía degradativa de compuestos aromáticos, codifica para las proteínas HpaB y HpaC que en conjunto catalizan la oxidación efectiva del sustrato en la presencia de NADH y FAD; donde HpaC es una flavin reductasa que puede reducir FAD a FADH2 utilizando NADH, y HpaB es la monooxigenasa que utiliza FADH2 (Xun et al. 2000. Appl. Environ. Microbiol. 66:481 ). Por lo tanto la 4-HPA 3-hidroxilasa normalmente cataliza la conversión de 4-HPA a 3,4-dihidroxifenilacetato con el co-consumo de NADH y O2 (Figura 5). La 4-HPA 3-hidroxilasa es una enzima bacteriana, distinta a la tirosinasa, que se asocia a la producción de un pigmento como melanina. Este mecanismo puede ser similar al de la tirosinasa en la síntesis de melaninas. Sin embargo, el ion cobre en la tirosinasa juega un papel relevante en la unión del grupo fenol del sustrato, mientras que la 4-HPA 3-hidroxilasa no contiene cobre en su estructura, por lo que la unión del sustrato involucra un mecanismo diferente (Gibello et a/., 1995. Appl. Environ. Microbiol. 61 :4167). Debido a que la 4-HPA 3-hidroxilasa es una enzima con un amplio rango de sustratos y puede convetir 3 o 4-hidroxifenilacetato, fenol, p-cresol, e hidroquinona a su derivado dihidroxilado, indica que a la enzima le basta reconocer un grupo hidroxilo unido al anillo aromático y por tanto, puede convertir L-Tir a L-DOPA.

En una cepa de E. coli con la actividad 4-HPA 3-hidroxilasa, Lee y colaboradores (1998) desarrollaron un método para la producción de L-DOPA utilizando a la L-Tir como el substrato (Lee et al. 1998. Biotechnol. Lett. 20:479).. En este trabajo, a una suspensión de E. coli DH1 transformada con un plásmido que tiene clonado el operón hpaBC, se le adicionó 3mM de L-tirosina y se incubó a 37 °C. Como la enzima 4-HPA 3-hidroxilasa requiere NADH, se adicionó glicerol para mantener el potencial reductor dentro de la célula y regenerar así el NADH. Después de una hora de incubación, el sobrenadante se analizó por HPLC. Se obtuvo una producción de 2.66 mM de L-DOPA a una velocidad de 44 µ? /min.

Mediante la aplicación de la ingeniería genética ha sido posible desarrollar una cepa de E. coli con la capacidad de sintetizar L-DOPA a partir de glucosa. Las modificaciones en esta cepa consisten en la expresión de las enzimas DAHP sintasa insensible a inhibición alostérica, CM-PDH sensible a inhibición alostérica y 4-HPA 3-hidroxilasa. En cultivos en matraz esta cepa produjo 30 mg/L de L-DOPA en 24 hr (Kramer et al. 2006. Solicitud de Patente US 2006/0141587A1 ).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURAS Figura 1 . Diagrama que muestra las vías de síntesis de compuestos aromáticos en la bacteria Escherichia coli. PEP, fosfoenolpiruvato; E4P, eritrosa-4-fosfato; DAHP, 3-deoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato; DHQ, 3-dihidroquinato; DHS, 3-dihidroshikimato; SHIK, shikimato; S3P, shikimato-3-fosfato; EPSP, enolpiruvilshikimato-3-fosfato; COR, corismato; PPA, prefenato; PPI, fenilpiruvato; HPP, 4-hidroxifenilpiruvato; L-Trp, L-triptofano; L-Fen, L-fenilalanina; L-Tir, L-tirosina. Figura 2. Diagrama que muestra productos generados a partir de L-DOPA.

Figura 3. Diagrama que muestra el uso del ácido ascórbico para prevenir la oxidación de L-DOPA.

Figura 4. Diagrama que muestra la reacción de producción de L-DOPA por la Tirosina Fenol Liasa (TPL).

Figura 5. Diagrama que muestra las reacciones acopladas catalizadas por HpaC y HpaB.

Figura 6. Imagen que muestra la electrophoresis en gel de agarosa de los productos de PCR para verificar la inactivación del gen tyrR. Carril 1 , 1 Kb DNA Ladder O'GeneRule como marcador de tamaño; Carril 2, PCR de W3110AfyrR::Cm con oligos TyrR5-TyrR3; Carril 3, PCR de VH33Afyrf?::Cm con oligos TyrR5-TyrR3; Carril 4, PCR de W3110 con oligos TyrR5-TyrR3 (control); Carril 5, PCR de W3110Afyrf?::Cm con oligos pKD3_Cm-TyrR3; Carril 6, PCR de VH33Afyrfi::Cm con oligos pKD3_Cm-TyrR3. Figura 7. Imagen que muestra la electrophoresis en gel de agarosa de los productos de PCR para verificar la eliminación del cásete de Resistencia a Cloramfenicol (Cm). Carril 1 , 1 Kb DNA Ladder O'GeneRule como marcador de tamaño; Carril 2, PCR de W3110AfyrR con oligos TyrR5-TyrR3; Carril 3, PCR de VH33AfyrR con oligos TyrR5-TyrR3. La flecha indica el tamaño aproximado de 358 pb.

Figura 8. Gráfica que muestra: la producción de biomasa (A) y el consumo de glucosa (B), determinados en los experimentos de los cultivos realizados en matraz. Rombos, cepa W3110_L-TIR; cuadros, cepa W3110AfyrR_TIR; triángulos, cepa VH33_L-TIR; cruces, cepa VH33AfyrR_TIR.

Figura 9. Gráfica que muestra: la acumulación de ácido acético (C) y producción de L-Tir (D), determinados en los experimentos de los cultivos realizados en matraz.

Rombos, cepa W3110_L-TIR¡ cuadros, cepa W3110Aryrf?_TIR¡ triángulos, cepa VH33_L-TIR; cruces, cepa VH33Afy/-tf_TIR.

Figura 10. Imagen que muestra los plásmidos utilizados para obtener el vector e inserto en la construcción del plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheA.

Figura 11. Imagen que muestra: A) Sitios de restricción para el corte con las enzimas BamYW, BglW y Nco\ en el plásmido plrchpaBCTrctyrCpheACM y B) Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos obtenidos al cortar el plásmido plrchpaBCTrctyrCpheAcM, de cinco candidatas, con la enzima BamH\. Carril 1 , 1 Kb DNA Ladder O'GeneRule como marcador de tamaño; Carril 2-6, Candidatas 1-6 del plásmido pTrc/7paSCTrcfyrCp/7e/4CM cortado con BamH\.

Figura 12. Imagen que muestra: C) Electroforesis en gel de agarosa de los fragmentos obtenidos al cortar el plásmido pTrcfrpafíCTrcfyrCp/7e/4cM, de la candidata 1 , con la enzima BglW y ?/col. Carril 1 , 1 Kb DNA Ladder O'GeneRule como marcador de tamaño; Carril 2, Candidata 1 del plásmido pTrc 7paBCTrcfy/-Cpfte,4cM cortado con ?/col; Carril 3, Candidata 1 del plásmido pTrc/7pafíCTrcryrCp/?e \Civi cortado con BglW. Figura 13. Gráficas que muestran: El consumo de glucosa (A) y la acumulación de ácido acético (B), determinados en los experimentos de los cultivos realizados en matraz con las cepas de E. coli productoras de L-DOPA. Rombos, cepa W3110AfyrR_DOPA; cuadros, cepa W3110AfyrR_DOPAasc; triángulos, cepa VH33Afyrfi_DOPA; cruces, cepa VH33AfyrR_DOPAasc.

Figura 14. Gráficas que muestran: La producción de L-DOPA (C), determinados en los experimentos de los cultivos realizados en matraz con las cepas de E. coli productoras de L-DOPA. Rombos, cepa W3110Afyrft_DOPA; cuadros, cepa W3110Afyrft_DOPAasc; triángulos, cepa VH33A yrR_DOPA; cruces, cepa VH33AfyrR_DOPAasc.

Figura 15. Gráfica que muestra las cinéticas del cultivo en fermentador para la producción de L-DOPA. Rombos, cepa W3110AfyrR_DOPA; cuadros, cepa W3110Aryr _DOPAasc; triángulos, cepa VH33Afy ?_DOPA; cruces, cepa VH33Aryr _DOPAasc.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a nuevas cepas de la bacteria Escherichia coli con una combinación de modificaciones genéticas que incluyen la inactivación de un gen, así como sobreexpresion de una combinación específica de genes, dando como resultado una alta capacidad para la síntesis de 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (L-DOPA) a partir de un azúcar simple, como la glucosa.

Como se desprende de los antecedentes, existe la necesidad de la generación de nuevas cepas microbianas para la producción de L-DOPA con una alta productividad y un alto rendimiento a partir de un azúcar simple. Esto puede implicar incrementar el flujo de carbono hacía la síntesis del precursor L-Tir. Una cepa con una alta capacidad de producción de L-Tir puede ser modificada para que ahora transforme ese compuesto en L-DOPA mediante la expresión de la enzima 4-HPA 3-hidroxilasa.

La estrategia general para desarrollar cepas productoras de L-Tir consiste en redireccionar el flujo de carbono del metabolismo central hacia la vía biosintética de la L-Tir mediante la expression de versiones mutantes insensibles a inhibición alostérica de DAHP sintasa y CM-PDH. Una estrategia que puede complementar lo anterior consiste en incrementar la disponibilidad de los precursores aromáticos PEP y E4P mediante la inactivación de actividades que los consumen o incremento de actividades que los sintetizan. Además de las estrategias ya descritas, y con el propósito de generar una cepa mejorada para la producción de L-DOPA, en la presente invención se presenta una alternativa basada en eliminar la regulación transcripcional de genes que participan en la vía biosintética de L-Tir. Como se mencionó en los antecedentes, la proteína TyrR es un regulador transcripcional que reprime la expression de varios genes de la vía biosintética de L-Tir. Cepas de E. coli con el gene tyrR inactivado han sido usadas ya para la producción de compuestos aromáticos, sin embargo, no ha sido demostrado que dicha inactivación tiene un efecto positivo en las cepas de producción (Lütke-Eversloh et al., 2007. Met. Eng. 10:69). Asi mismo, ha sido demostrado que la expresión de una versión mutante del gene tyrR ocasiona la inducción del gene de la enzima tirosina fenol liasa, la cual puede ser empleada para la síntesis de L-DOPA a partir de catecol, piruvato y amonia, o catecol y serina (Kumagai et al. 2008, Patente US 7365161 B2; Kumagai et al. 2009, Solicitud de Patente US 2009/0258400 A1 ). Sin embargo, estos dos documentos no tienen relación con el desarrollo de cepas microbianas para la producción de L-DOPA a partir de azúcares simples como la glucosa.

Con el propósito de establecer el efecto de la inactivación de TyrR sobre la capacidad de producción de L-Tir y L-DOPA se generaron y caracterizaron cepas de E. coli que sobreproducen dichos compuestos. Para este efecto se empleó la cepa E. coli W3110 y su derivada VH33 que carece del sistema PTS (PTS"Glc+). El gen tyrR en las cepas de E. coli W3110 y VH33 fue inactivado, generándose las cepas mutantes W3110AfyrR y \/ 33AtyrR (para detalles ver Ejemplo 1 ). Se transformaron las cepas de E. coli W3110, VH33, W3110AfyrR y VH33AryrR con el plásmido pJLBaroGfbrtktA que contiene el gen aroGfbr, el cual codifica para una DAHPS insensible a retroinhibición (fbr), y el gen tktA, que codifica para una trancetolasa; y con el plásmido pTrctyrCpheAcM, que contiene el gen tyrC que codifica para la ciclohexadienil deshidrogenasa de Z. mobilis y un fragmento del gen pheA (pheAcivÍ), que codifica para el dominio corismato mutasa (CM) de la enzima CM-PDT. Así se generaron las cepas W3110_TIR, VH33_TIR, W3110AfyrR_TIR y VH33Aryrf?_TIR (para detalles ver Ejemplo 2). Existen otros genes que codifican para enzimas con actividad de DAHPS, algunos de los cuales son insensibles a inhibición alostérica por algunos de los aminoácidos aromáticos. Aquí se empleó el gene aroGfbr, proveniente de E. coli, pero es obvio para un experto que pudieran utilizarse genes que codifican para DAHPS provenientes de E. coli u otros organismos, con el propósito de incrementar flujo de carbono hacia la vía de síntesis de compuestos aromáticos. El gene tktA de E. coli fue expresado con el fin de evitar la limitación del precursor E4P, es posible también utilizar genes de otros organismos que codifiquen para actividad de transcetolasa, esperándose un resultado similar al reportadlo aquí. A manera de ejemplo aquí se expresaron los genes tyrCpheAcM, que en conjunto codifican para una actividad de CM-PDH insensible a inhibición alostérica. Es obvio para un experto que pueden ser utilizados genes nativos o mutantes que codifiquen para dicha actividad, los cuales tendrían un efecto similar al observado en este trabajo.

A manera de ejemplo se efectuaron cultivos a 37 °C, pero es conocido que E. coli puede crecer en un rango de temperaturas entre 8 a 48 °C, óptimamente a 37 °C en medio rico (Madigan et al., Biología de los Microorganismos, 8a. Edición revisada, Prentice Hall Iberia, Madrid, 1999), empleando glucosa como fuente de carbono, pudiéndose también emplear otras fuentes de carbono metabolizables por E. coli como lo serían la sacarosa, fructosa, lactosa, xilosa, arabinosa, glicerol, etc. Mediante cultivos en matraz se logró determinar que las cepas en las que se inactivo el gene tyrR mostraron una velocidad específica de síntesis de L-Tir a partir de glucosa en promedio 1.8 veces mayor que las cepas con el gene tyrR activo (para detalles ver Ejemplo 3).

Con el propósito de modificar las cepas productoras de L-Tir con el gen tyrR inactivado, para que ahora puedan sintetizar L-DOPA, en primer lugar se empleó la técnica de PCR para amplificar los genes del operón hpaBC que codifica para la enzima 4-HPA 3-hidroxilasa. De esta forma se logró construir el plásmido pJrchpaBC, y posteriormente el plásmido pTrcfrpafíCTrcfyrCpfre>AcM el cual fue utilizado para transformar las cepas \N3W 0 tyrR/póLBaroGfbrtktA y VHZ3 tyrR/póLBaroGfbrtktA, generando las cepas W3110Afyrf?_DOPA y VH33Afy ?_DOPA (para detalles ver Ejemplo 4). Existen otros microorganismos además de E. coli que poseen en su genoma genes con una alta similitud hacia hpaBC. Para un experto es obvio que la expresión de genes similares a hpaBC de un origen diferente al de E. coli tendrían un efecto similar al reportado en el Ejemplo 5. Con estas cepas se efectuaron cultivos en matraz con glucosa como fuente de carbono en los cuales se midió la producción de L-DOPA y otros metabolitos. En este estudio se determinó que las cepas W3110AfyrR_DOPA y VH33AfyrR_DOPA produjeron 269 y 320 mg/L de L-DOPA, respectivamente (para detalles ver Ejemplo 5). Los resultados anteriores demostraron que la cepa VH33Afy/ ?_DOPA fue la mejor productora de L-DOPA. Con esta cepa se realizó un cultivo tipo lote en fermentador utilizando parámetros de fermentación que favorecen el desempeño de la cepa de producción para L-DOPA. Al final del cultivo se observó la acumulación de 1.51 g/L de L-DOPA (para detalles ver Ejemplo 6). Es obvio para un experto en el estado de la técnica, que hay una gran libertad en la elección de los valores de estos parámetros como la temperatura, aireación, agitación, geometría del termentador, concentración de oxígeno disuelto, pH, etc. y que la elección de un conjunto de valores dependerá de la cepa, el medio de cultivo y de la experiencia del operador.

Una cepa de E. coli con la capacidad de convertir glucosa en L-DOPA ha sido reportada recientemente. Las modificaciones genéticas en esta cepa consisten en la expresión de las enzimas DAHP sintasa insensible a inhibición alostérica, CM-PDH sensible a inhibición alostérica y 4-HPA 3-hidroxilasa. En cultivos en matraz, se reporta que esta cepa produce 30 mg/L de L-DOPA en 24 hr (Kramer et al. 2006, Solicitud de Patente US 2006/0141587A1 ). En la presente invención se logró la generación de cepas con la capacidad de producir en 40 hr alrededor de 10 veces la cantidad de L-DOPA reportada por Kramer et al. 2006 (Tabla 3 y Figura 11). Este resultado proviene de una combinación particular de modificaciones genéticas que incluyen la inactivación del gene tyrR, la expresión de las enzimas DAHP sintasa insensible a inhibición alostérica, CM-PDH insensible a inhibición alostérica, trancetolasa y 4-HPA 3-hidroxilasa. Asimismo, dichas modificaciones pueden llevarse a cabo en una cepa que carezca de actividad en el sistema PTS, lo cual tiene un impacto positivo en los parámetros de producción de L-DOPA.

MATERIALES Y MÉTODOS Los plásmidos empleados se describen en la Tabla .

Tabla 1. Plásmidos utilizados en la realización de éste trabajo.

Los plásmidos utilizados en este trabajo se enlistan en la Tabla 1. El plásmido pMBaroGfbrtktA (Balderas et al., 2009) porta el gen aroGfbr que codifica para una DAHP sintasa insensible a retroinhibición (fbr) por L-Fen, bajo el control del promotor lacUV5 y el gen tktA que codifica para la transcetolasa A, bajo el control de su promotor nativo. El plásmido pTrctyrCpheACM porta el operón tyrCpheA que codifica para la ciclohexadienil deshidrogenasa de Zymmomonas mobilis y un fragmento del gen pheA que corresponde al dominio corismato mutasa de la enzima CM/PDT, bajo el control del promotor trc (Chávez-Béjar et al. 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74:3284).

El plásmido pTrchpaBC porta el operón hpaBC que codifica para la 4-HPA 3-hidroxilasa de la cepa Escherichia coli W bajo el control del promotor trc. El plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheAcM se construyó a partir de los plásmidos pJrchpaBC y plrctyrCpheAcM, porta el operón hpaBC además del operón tyrCpheAcu, cada uno bajo el control del promotor trc.

Tabla 2. Cepas de E. coli utilizadas en este trabajo Cepa Características relevantes Referencia W3110 Escherichia coli K-12 F- ?- ATCC27325 VH33 W3110 Aptsl, ptsH, crr.kan Alad, Balderas et al., lacZv.loxP, PgalPv.Ptrc 2009. icrob. Cell. Fact. 8:1 E. coli W genes hpaBC en cromosoma Lee et al. 1998.

Biotechnol. Lett. 20:479 W3110AtyrR W3 0 MyrR Este trabajo VH33AtyrR VH33 MyrR Este trabajo W3110_TIR W3110 transí, con pJLBaroGfbrtkt Este trabajo y pTrcfyrCp/7e/4CM VH33_TIR VH33 transí, con pJLBaroGfbrtktA Este trabajo y pTrcfy/-Cp/7e AcM W3110AtyrR_TIR W3110AtyrR transí, con pJLBaroGfbrtktA Este trabajo y pTrcfyrCp/7e/\CM VH33AtyrR_TIR VH33AtyrR transí, con pJLBaroGfbrtktA Este trabajo y pTrcíyrCp/je AcM W3110AtyrR_DOPA W3110AfyrR transí, con pJLBaroGfbrtktA Este trabajo y pTrc ?pa6CTrcryrCp/7e \cM VH33AtyrR_DOPA VH33Afyrf? transf.con pJLBaroGfbrtktA Este trabajo y pT^ aBCTrcf rC ieyAQi^i Las cepas empleadas en este trabajo se enlistan en la Tabla 2. La cepa E. coli W3110 (PTS+) y su derivada VH33 (PTS'Glc+) su utilizaron para la construcción de las cepas sobreproductoras de L-Tir y L-DOPA. La cepa W3110 es una cepa F" ?" derivada de Escherichia coli K-12. La cepa VH32 derivada de W31 0, es una Aprs/, ptsH, crr::kan (PTS") Alad, lacZr.loxP a la cual se le reemplazó el promotor del gen galactosa permeasa (galP) por el promotor trc dando como resultado la expresión constitutiva de galP (GalP+), con lo cual se incrementó la capacidad de transportar glucosa (fenotipo PTS"Glc+) (De Anda et al. 2006. Met. Eng. 8:281 ). A esta cepa se le escindió el cásete de resistencia a cloramfenicol localizado en el cromosoma por los sitios FRT con ayuda del plásmido pCP20 y se le nombró VH33.

La cepa W3110AfyrR y la cepa VH33Afyrfi se generaron al inactivar en cromosoma el gen tyrR. Las cepas W3110, VH33, W3110AíyrR y VH33Afyrf? se transformaron con el plásmido pJLBaroGfbrtktA y posteriormente con el plásmido pTrctyrCpheAcM dando lugar a las cepas W3110_TIR, VH33_TIR, W3110Aryrf?_TIR y VH33Afy/ ?_TIR. Las cepas W3 10AfyrR y VH33AryrR, transformadas con el plásmido pJLBaroGfbrtktA, se transformaron con el plásmido pTrc/ipaSCTrcfyrCphe^c generando las cepas W3110Aíyr/?_DOPA y VH33AíyrR_DOPA.

Medios de Cultivo Se utilizaron diferentes medios de cultivo líquidos y sólidos cuya composición se detalla a continuación: Medio Luria-Bertani (LB): es un medio de cultivo líquido utilizado de forma habitual para el crecimiento bacteriano. Su composición por litro es: 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de NaCI.

LB agar: es el medio de cultivo sólido utilizado de forma habitual y consiste en añadir 5g de agar a 1 L de medio LB especificado antes.

Medio mineral M9: Es el medio mínimo que se utilizó en los cultivos de producción de L-Tir y L-DOPA. La composición del medio contiene por litro: 6 g de Na2HP0 , 5 g de NaCI, 3 g de KH2HP04, 1 g de NH4CI, 246.5 mg de MgS04 , 14.7 mg de CaCI2 , 10 pg de Vitamina B1. La glucosa se adicionó como única fuente de carbono.

Medio YENB: Medio de cultivo líquido bajo en sales utilizado para la preparación de células electrocompetentes. La composición por litro es de: 7.5 g de extracto de levadura y 8 g de caldo nutritivo.

Medio SOB: Medio de cultivo líquido utilizado para el crecimiento bacteriano en la inactivación de genes cromosomales utilizando fragmentos de PCR. Este medio se compone, por litro, de: 20 g de peptona trípsica de caseína, 5 g de extracto de levadura, 0.58 g de NaCI, 0.19 g de KCI y 20 mM de MgCI2 + MgS04.

Medio SOC: Medio de cultivo que se utilizó como medio de recuperación de las células después de la electroporación. Su composición por litro es de: 20 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levadura, 2.5 g de MgS04l 2 g de MgCI2, 0.58 g de NaCI y 93.18 g de KCI. Los diferentes medios de cultivo, en caso de ser necesario, se suplementaron con antibióticos para el mantenimiento de los plásmidos.

Ampicilina (Ap): se preparó una solución concentrada a 100 mg/mL.

Carbamicina (Cb): se preparó a una concentración de 100 mg/mL.

Kanamicina (Km): la solución concentrada se preparó a 30 mg/mL.

Tetraciclina (Te): se preparó a una concentración de 30 mg/mL.

Cloramfenicol (Cm): la solución concentrada se preparó a 30 mg/mL.

Métodos de transferencia genética La incorporación de DNA a células de E. coli se llevó a cabo por electroporación. Obtención de células competentes: Se creció un preinóculo de la cepa deseada en medio YENB y se incubó a 37 °C por 12 horas. Se inoculó el medio YENB con el preinóculo y se incubó nuevamente hasta que las células alcanzaron una DO6oo entre 0.5 y 0.9. Las células se recolectaron por centrifugación (a 4000 rpm, durante 10 min) a 4 °C. Se desechó el sobrenadante y se lavó la pastilla de células dos veces con agua fría. Finalmente las células se resuspendieron en glicerol al 10%.

Electroporación: Se mezclaron alícuotas de 50 pL de células con 1 -5 pL de la suspensión con el DNA y a continuación se depositó entre los dos electrodos de la cubeta de electroporación. El electroporador utilizado en este caso fue marca Eppendorf modelo 2510, con las siguientes condiciones de electroporación: temperatura a 4 °C, modo de resistencia de alto voltaje de 600 O, voltaje de la descarga de 2,500 V y una duración del pulso de 5 mseg.

Una vez realizada la descarga eléctrica se añadió 1 mL de medio SOC y se incubó a 37 °C durante una hora para permitir la expresión de los genes de resistencia a antibióticos. Las células transformadas se seleccionaron en medio sólido suplementado con el antibiótico correspondiente.

Inactivación de genes cromosomales usando productos de PCR.

Este método permitió la sustitución del gen tyrR, localizado en cromosoma, por un gen que codifica para un cásete de resistencia al antibiótico Cm flanqueado por sitios FRT, obtenido por PCR (Datsenko y Wanner, 2000. PNAS 97: 6640). Para amplificar el cásete de resistencia a Cm se diseñaron oligonucleótidos con extremos idénticos al principio y fin del gen tyrR. Estos extremos permitieron la recombinación mediante el sistema de recombinasa Red, proveído antes a las cepas W3110 y VH33, en las regiones flanqueantes al gen tyrR. Una vez llevado a cabo el evento de recombinación, las mutantes se seleccionan por resistencia al antibiótico. Finalmente fue posible eliminar el cásete de resistencia al antibiótico mediante un plásmido que expresa la recombinasa FLP, actuando sobre los sitios FRT adyacentes al gen de resistencia.

El plásmido pKD3 se utilizó como templado para amplificar, por PCR, el cásete de resistencia a Cm. Para ello se diseñaron dos oligonucleótidos con una región de 22 pb idéntica al plásmido pKD3 y una región de 50 pb con identidad al gen tyrR. Los oligos finalmente obtenidos fueron nombrados en la presente invención como TyrR Fw (SEC ID NO 1) y TyrR_Rv (SEC ID NO 2), estos oligonucleótidos permitieron amplificar un producto de PCR de 1 ,241 pb, correspondientes al cásete de resistencia a Cm flanqueado por los sitios FRT. Después de la amplificación, el producto de PCR se purificó.

Preparación de células competentes.

Las cepas W3110 y VH33 se transformaron con el plásmido pKD46, el cual contiene genes del sistema de recombinasa Red del fago ? bajo el control de un promotor inducible por L-arabinosa. Este plásmido es resistente a carbenicilina (Cbe, 100 pg/mL) y presenta un origen de replicación termosensible que puede ser eliminado fácilmente a 43 °C. La recombinsa Red, además de favorecer la recombinación inhibe a la exonucleasa V, permitiendo así la entrada a la célula de un fragmento de PCR sin que éste sea digerido.

Ambas cepas, previamente transformadas con el plásmido pKD46, se crecieron a 30 °C en medio SOB suplementado con Cb (100 pg/mL) y 10 mM de arabinosa para la inducción. Una vez alcanzada la fase exponencial (DO60o 0.6), se cosecharon las células por centrifugación (a 8,000 rpm, durante 10 min) y se lavaron tres veces con agua fría. Finalmente las células se concentraron en agua fría y se mantuvieron en hielo hasta el momento de la electroporación.

Se utilizaron alícuotas de 50 µ?_ de células competentes para electroporar con 4- 5 µ?_ del producto de PCR previamente purificado. La selección de las mutantes se llevó a cabo en medio solido LB suplementado con Cm (30 g/mL) a 37 °C. El resto de las transformantes se incubaron a temperatura ambiente hasta el siguiente día. Pasado ese tiempo se sembraron en el mismo medio sólido y se incubaron por 24 horas. Las colonias se replicaron en placas de LB suplementadas con Cm y Cb y se incubaron a 42 °C para eliminar el plásmido pKD46 termosensible.

Para verificar que se llevó a cabo el evento de recombinación y que, por lo tanto, el gen tyrR se substituyó por el cásete de resistencia a Cm, se realizaron amplificaciones por PCR con oligonucleótidos diseñados fuera de la región interrumpida y dentro del cásete de resistencia a Cm. Dichos oligos fueron nombrados en la presente invención como TyrR5 (SEC ID NO 3), TyrR3 (SEC ID NO 4) y pKD3_Cm (SEC ID NO 5).

Una vez comprobada la sustitución del gen tyrR por PCR, se eliminó el cásete de resistencia a Cm al transformar con el plásmido pCP20 el cual codifica para la recombinasa FLP, resistente a ampicilina (Ap), y con origen de replicación termosensible. Las transformantes se sembraron en medio sólido con Ap y se incubaron a 30 °C durante 6 horas. Las colonias recuperadas se sembraron en medio sólido no selectivo a 42 °C para favorecer la pérdida del plásmido. Se hicieron sucesivas estrías a 42 °C en medio sólido para asegurar la eliminación del plásmido. Finalmente se comprobó por PCR la eliminación en cromosoma del cásete de resistencia a Cm.

Construcción del plásmido pTrchpaBC El plásmido pTrchpaBC se construyó al ligar un fragmento de 2,127 pb correspondiente al operón hpaBC con un fragmento de 4,155 pb originado de la doble digestión del plásmido pTrc99A, dejando al operón hpaBC bajo el control del promotor fuerte trc, el cual es inducible por IPTG. Para la construcción se diseñaron oligonulceótidos específicos para la amplificación por PCR del operón hpaBC utilizando como templado el DNA cromosomal de la cepa E. coli W. Los oligonucleótidos se diseñaron de tal manera que presentaran una región de 22 pb idéntica al operón hpaBC y una región de 7 pb cuya secuencia presentara sitios de restricción para el corte con las enzimas EcoRI (Fw) y BamH\ (Rv), nombrados en la presente invención como como 5'EcoRI_HpaBC (SEC ID NO 6), 3'BamHI_HpaBC (SEC ID NO 7).

Después de realizar la doble digestión del producto de PCR y del vector de clonación pTrc99A, con las enzimas EcoRI y Bam \, se llevó a cabo la reacción de ligación con la enzima T4 ligasa de Biolabs para generar el plásmido plrchpaBC. Posteriormente se purificó para transformar la cepa E. coli XL1-Blue. Después de la electroporación y de la recuperación, se sembró en cajas de LB suplementadas con 100 g/mL de Cb y se incubó a 37 °C. La cepa se estrió nuevamente para la obtención de colonias aisladas y se seleccionaron diez de éstas que presentaron resistencia al antibiótico como candidatas. De las colonias seleccionadas se extrajo DNA plasmídico y se llevó a cabo la reacción de digestión con la enzima EcoRV para comprobar la construcción. Todas presentaron el patrón de restricción deseado. Se llevó a cabo el diseño de oligonucleótidos para amplificar y secuenciar el operón hpaBC del plásmido plrchpaBC extraído de tres de las colonias candidatas y comparar contra la secuencia del operón hpaBC del DNA cromosomal de la cepa E. coli W, con el fin de comprobar la identidad del operón clonado.

Construcción del plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheAcm Se construyó un nuevo plásmido al ligar el operón tyrCpheACM con el plásmido plrchpaBC previamente construido. Se utilizaron las enzimas PVÍVII y Seal para obtener, del plásmido pTrctyrCpheAcw, el inserto tyrCpheAcm bajo el promotor tre, y la enzima PvuW para cortar y linearizar el plásmido plrchpaBC utilizado como vector.

Tanto el vector plrchpaBC, digerido con PvuW, como el inserto JrctyrCpheA obtenido por doble digestión con Pwvll y Seal, se purificaron a partir de geles de agarosa, después de una electrophoresis en gel de agarosa, el DNA se visualiza con la ayuda de un transiluminador a baja intensidad (Foto/prep II de Fotodyne). Se recortó el fragmento de agarosa y se procedió a la purificación por el kit "Gel extraction systems" de Marligen Bioscience y, en algunos casos, se utilizó el kit "DNA Clean-up & Concentrator" de Zymo Research para concentrar DNA. Se llevó a cabo la reacción de ligación para generar el plásmido pTrchpaBCJrctyrCpheAcM, dejando cada operón bajo el control de su propio promotor trc. Se purificó el producto de la ligación para transformar la cepa E. coli XL1-Blue. Después de la electroporacion y recuperación, se sembró en cajas de LB suplementadas con 100 pg/mL de Cb y se incubó a 37 °C. Se estrió nuevamente en cajas de LB con Cb para obtener colonias aisladas, de las cuales se seleccionaron veinte como candidatas al presentar resistencia al antibiótico.

Condiciones de cultivo Para comprobar la adecuada expresión del operón hpaBC en el plásmido construido pJrchpaBC, se llevaron a cabo cultivos con la adición de L-Tir exógena para la producción de L-DOPA siguiendo la metodología descrita por Lee (1998) (Lee et al. 1998. Biotechnol. Lett. 20:479).

Preinóculo: Del stock almacenado a -70 °C, se estrió la cepa XL1-Blue/pTrcfrpaBC en cajas de LB suplementado con 100 pg de Cb y se incubó a 37 °C por 12 horas. Las células se resuspendieron en 1 mL de LB para ser usadas en la preparación del inoculo.

Inoculo: Se tomó el volumen necesario del preinóculo para subcultivar 50 mL de LB suplementado con 100 pg de Cb contenido en matraces con deflectores de 250 mL, e iniciar a una D06oo de 0.1. Los inóculos se incubaron a 37 °C y 300 rpm hasta alcanzar una D06oo de 0.8 para la inducción con 0.1 mM de IPTG y se incubó por 3 horas más. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 rpm por 20 min y se lavaron dos veces con buffer Trís-HCI (20 mM, pH 8) para ser usadas cómo inoculo de los cultivos.

Cultivo: Las células obtenidas del inoculo se resuspendieron en matraces de 250 mL conteniendo 25 mL de buffer Tris-HCI (100mM, pH 8). Se adicionó L-Tir a una concentración de 3mM y se incubó por 1 h a 37 °C con agitación de 120 rpm. La reacción se detuvo al remover las células por centrifugación a 10,000 rpm por 5 min. El sobrenadante se acidificó con 5pL de HCI 5N y se guardó a 4 °C para el análisis.

Cultivos en matraz para la producción de L-Tir Preinóculo: Las cepas W3110_TIR, VH33_TIR, W3110Afy/ ?_TIR y VH33Afy/f?_TIR se crecieron en cajas de LB suplementadas con 100 pg de Cb y 30 pg de Te. Las cajas se incubaron a 37 °C por 12 horas. Las células se resuspendieron en 1 mL de LB para ser usadas en la preparación del inoculo.

Inoculo: Las células obtenidas del preinóculo se subcultivaron en matraces con deflectores de 250 mL conteniendo 20 mL de medio M9 suplementado con 2 g/L de glucosa y se adicionó 100 pg de Cb y 30 pg de Te para el mantenimiento de los plásmidos. Se inició a una D06oo de 0.1 y se incubó a 37 °C y 300 rpm. Una vez que las células alcanzaron 1 DO6oo se cosecharon por centrifugación (a 5,000 rpm, durante 5 min) y se resuspendieron en 5 mL de medio M9 para ser usadas cómo inoculo en los cultivos de producción.

Cultivo: El medio para los cultivos de producción fue el mismo que el utilizado en los inóculos pero en este caso la glucosa se utilizó a una concentración de 10 g/L y se adicionó IPTG a una concentración de 0.1 mM para la inducción de los genes aroGfbrtktA y tyrCpheAcM- De los inóculos se tomó el volumen necesario para inocular 50 mL del medio de cultivo e iniciar a una ??ß?? de 0.1 . Se tomó muestra cada 2 horas por un periodo de 12 horas después de las cuales se tomó muestra cada 6 horas hasta completar un total de 50 horas. Las muestras se acidificaron con 15pL de HCI 5N y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes se recuperaron por centrifugación a 11 ,000 rpm, por 5 min y se guardaron a 4 °C para el análisis.

Cultivos en matraz para la producción de L-DOPA Preinóculo: Las cepas W3110Afyrft_DOPA y VH33Afy ?_DOPA se crecieron en cajas de LB suplementadas con 00 pg de Cb y 30 pg de Te. Se incubó a 37 °C por 12 horas. Las células se resuspendieron en 1 mL de LB para la preparación del inoculo.

Inoculo: Los preinóculos se subcultivaron en matraces con deflectores de 250 mL conteniendo 100 mL de medio LB con 10 g/L de glucosa; se adicionó 100 pg de Cb y 30 pg de Te para el mantenimiento de los plásmidos. Se inició a una ??ß?? de 0.1 y se incubó a 37 °C y 250 rpm. Después de 1 .5 horas, se adicionó IPTG a una concentración 0.1 mM para la inducción de los genes aroGfbrtktA y hpaBCtyrCpheACM- Se dejó crecer por tres horas más después de la inducción. Las células se recolectaron por centrifugación (6,000 rpm, 20 min) a 4 °C y se lavaron dos veces con M9 para ser usadas como inoculo en los cultivos de producción.

Cultivo: Las células obtenidas del inoculo se resuspendieron en 35 mL de medio M9 suplementado con 10 g/L de glucosa como única fuente de carbono y se adicionó cloramfenicol (50 pg/mL) para arrestar el crecimiento celular. Los cultivos se iniciaron a una concentración de biomasa de 1 ± 0.2 g/L y se incubó a 37 °C y 120 rpm. Se tomó muestra cada 2 horas por un periodo de 10 horas después de las cuales se tomó muestra cada 6 horas hasta completar un total de 50 horas. Se adicionó ácido ascórbico (0. 5 g/L) a las 0, 10 y 25 horas. Las muestras se acidificaron con 15 pL de HCI 5N y se incubaron por 30 min a temperatura ambiente.

Cultivos en termentador para la producción de L-DOPA Los cultivos se realizaron en fermentadores de 1 litro usando un volumen de operación de 500 mL. El medio de cultivo empleado fue LB supplementado con 50 g/L de glucosa, 0.203 g/L MgS04, 0.0147 g/L CaCI2, tiamina 0.0001 g/L y 1 mL/L de elementos traza. La solución de elementos traza contiene 27 g/L FeC , 2 g/L ZnC , CoCI2 6H20, 2 g/L Na2Mo04 2H20, 2 g/L CaCI2 2H20, 0.5 g/L H3BO3 y 100 mL/L HCI. Los fermentadores se incularon a una OD6oo de 0.1. El pH se mantuvo a 6.0 mediante la adición automática de 2.9 % (v/v) NH4OH y 3.0 N H3P04. La temperatura se controló a 37 °C y al flujo de aire se mantuvo a 1 WM. La tensión de oxígeno disuelto se mantuvo por arriba del 20% mediante la modificación de la velocidad deagitación. El inductor IPTG se agregó al cultivo cuando la densidad celular fue de 6.75 g/l.

Métodos analíticos De los cultivos se tomaron muestras de 1.5 mL periódicamente y se centrifugaron a 11 ,000 rpm por 5 min (Eppendorf 5410) para remover las células. Los sobrenadantes se colectaron y se filtraron con membranas de 0.45 pm, y se almacenó a -20°C para su posterior análisis.

La concentración de la biomasa se determinó en función de la turbidez midiendo la densidad óptica (absorbancia) a 600 nm (D06oo) en un espectrofotómetro marca Beckman DU-70 (Palo Alto, CA). La DO se convirtió a peso seco de células (DCW: dry celular weigth) considerando que 1 DO6oo= 0.37 gow L.

Se determinaron los metabolitos de los sobrenadantes utilizando un equipo de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detectores de índice de refracción y de arreglo de fotodiodos (Waters, Milford, MA). Además se utilizó un sistema de HPLC conectado a un detector de masas (ESIMCHPLC) modelo Agilent 1100.

La determinación de glucosa, ácido acético, DHS y SHIK se llevó a cabo por cromatografía ¡socrática empleando un equipo HPLC con una columna tipo Aminex HPX-87H (300x7.8 mm; Bio-Rad, Hercules, CA), utilizando como fase móvil H2SO 5mM, a un flujo de 0.5 mL/min y a una temperatura de 50 °C. Bajo estas condiciones la glucosa y el ácido acético se midieron por índice de refracción. Los otros metabolitos se midieron por un detector de arreglo de fotodiodos: a 235 nm para DHS y 210 para SHIK. Adicionalmente, la determinación de glucosa se llevó a cabo por el método de azúcares reductores del ácido 3,5-dinitrosalicílico.

Para la determinación de L-Tir y L-DOPA se utilizó un sistema HPLC modelo Agilent 1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) equipado con una columna Phenomenex Synergy Hydro C18 (150x 4.6 mm; 4pm, Torrance, CA) unido a un sistema de detección de espectrometría de masas de electroespray (ESIMCHPLC). Las muestras se eluyeron con metanol 10% en ácido acético 0.1 % en agua a un flujo de 0.5 mL/min. La detección se hizo por arreglo de diodos a 220 nm.

EJEMPLOS EJEMPLO 1.- Inactivación cromosomal del gen tyrR en las cepas W310 y VH33.

Para eliminar la regulación transcripcional de genes relevantes involucrados en la síntesis de L-Tir, se llevó a cabo la inactivación cromosomal del gen tyrR en las cepas de £. CO// W3110 y VH33 por un método basado en la utilización de productos de PCR. La amplificación, por PCR, del cásete de resistencia a Cm con extremos idénticos al gen tyrR generó un producto de 1 ,241 pb. Después de transformar con el producto de PCR las cepas W3110/pKD46 y VH33/pKD46 (expresando el sistema de recombinasa Red) y sembrarlas en medio selectivo, el mismo día se observó el crecimiento de pocas colonias (5 colonias por 200 pl_ de cultivo). Del resto de las células que se mantuvieron a temperatura ambiente por toda la noche, y sembradas al día siguiente, se obtuvieron la mayoría de las mutantes potenciales. De las colonias seleccionadas como mutantes potenciales (CmR) se verificó, por PCR, la inactivación del gen tyrR con las parejas de oligonucleótidos TyrR5-TyrR3 y pKD3_cm-TyrR3 cuyos tamaños obtenidos fueron de 1 ,360 pb y 519 pb, respectivamente (Figura 6). Como control se amplificó el gen tyrR de la cepa silvestre W3110 con los oligonucleótidos TyrR5-TyrR3, obteniendo un producto de ,880 pb. A las cepas generadas, una vez que se verificó la mutación, se les nombró W3110AryrR::Cm y VH33Afyrft::Cm. Finalmente, se eliminó el cásete de resistencia a Cm con ayuda del plásmido pCP20, lo cual se comprobó por PCR utilizando los oligonucleótidos TyrR5-TyrR3. El tamaño obtenido del producto de PCR fue de 358 pb aproximadamente (Figura 7). Una vez eliminado el cásete de resistencia, las cepas se nombraron W3110Afyrf? y VH33Afyr EJEMPLO 2.- Generación de cepas productoras de L-Tir mediante la expresión de una transcetolasa y versiones insensibles a inhibición de las enzimas DAHP sintasa y CM/PDH.

Una vez obtenidas las cepas mutantes en el gen tyrR (AfyrR), se transformaron las cepas de E. cotí W3110, VH33, W3110Afy/ ? y VH33AfyrR con el plásmido pJLBaroGfbrtktA que contiene el gen aroGfbr, el cual codifica para una DAHPS insensible a retroinhibición (fbr), y el gen tktA, que codifica para una trancetolasa; y con el plásmido pTrcfyrCp/?e>Ac/w, que contiene el gen tyrC que codifica para la ciclohexadienil deshidrogenasa de Z. mobilis y un fragmento del gen pheA (pheAcivi), que codifica para el dominio corismato mutasa (CM) de la enzima CM-PDT (reconstruyendo una variante insensible a inhibición por L-Tir de la enzima CM-PDH). Con esto se generaron las cepas W3110_TIR, VH33_TIR, W3110Afyrf?_TIR y VH33AfyA"f?_TIR.

EJEMPLO 3.- Caracterización de cepas productoras de L-Tir mediante la expresión de una transcetolasa y versiones insensibles a inhibición de las enzimas DAHP sintasa y CM/PDH.

De las cepas W3110_TIR, VH33_TIR, W3110AíyrR_TIR y VH33AfyrR_TIR, generadas en el ejemplo anterior, se evaluaron los parámetros cinéticos y de producción de L-Tir realizando cultivos en matraces de 250 mi conteniendo 50 mi de medio M9 suplementado con 10 g/l de glucosa e IPTG 0.1 mM para la inducción de los genes aroGfbr, tyrC y pheACM- En la Tabla 3 se muestran: la velocidad específica de crecimiento (µ), el rendimiento de biomasa en glucosa (Yeiom/Glc), la velocidad específica de consumo de glucosa (C/GIC), la tasa específica de producción de L-Tir o productividad específica (qi.

T¡r) y el rendimiento de producción de L-Tir a partir de glucosa (Y|_-Tir/Glc), así como los valores del título (g L- L).

Tabla 3. Parámetros de producción de L-Tir de las cepas TIR Cepas </Glc t/L-Tir YL-Tir/GIC g L-Tir/L Las tasas específicas de consumo de glucosa (C/GIC) se calcularon de los datos de concentración de biomasa y glucosa (Figura 8). La qfGic para las cepas W3110 TIR y W31 0Afyrf?_TIR fue de 0.37 ± 0.02 y 0.47 ± 0.02 gGic/gDW*h respectivamente, mientras que en las cepas VH33_TIR y VH33AfyrR_TIR la qGic disminuyó a 0.28 ± 0.02 y 0.18 ± 0.03 gGic gDW*h. Las cepas PTS"Glc+ y PTS"GlcAfy/ ? mostraron una disminución significativa en la tasa específica de consumo de glucosa correspondiendo a un decremento del 24 y 62% con respecto a las cepas PTS y PJSMyrR. Como se muestra en la Figura 8, las cepas W3110_TIR y W3110AfyrR_ TIR consumieron la glucosa casi por completo a las 30 hrs, lo cual no sucede para el caso de las cepas VH33_TIR y VH33Afyrf?_TIR, cuyo consumo de glucosa es mínimo.

Los datos y las tasas de producción de L-Tir (Figuras 8 y 9) y la concentración de biomasa se usaron para calcular la tasa específica de producción de L-Tir (gi_-Tir). Las qi.ju más bajas fueron observadas en las cepas W3110_TIR y W3110AíyrR_TIR siendo de 0.012 y 0.020 gL-T¡r/gDW*h, mientras que las mayores QL-??G se observaron en las cepas VH33_TIR y VH33AryrR_TIR siendo de 0.033 y 0.065 gL-Tir/gDW*h respectivamente. De acuerdo a estos resultados la qf|_-Tir fue 1.7 y 2.2 veces mayor en las cepas PTS"Glc+ y PTS"Glc+AfyrRcon respecto a las cepas PTS y PJSMyrR.

Considerando sólo el efecto de la eliminación de tyrR, la cepa W3110Aíyrf?_TIR presentó un incremento en la qfL-T¡r del 67% con respecto a la cepa W3110_TIR, mientras que en la cepa VH33AryrR_TIR este incremento fue del 97% con respecto a la VH33_TIR. De lo anterior se deduce que la eliminación de tyrR causa un efecto positivo en la productividad específica de L-Tir.

Los rendimientos absolutos de L-Tir a partir de glucosa (YL-Tir/Glc) se calcularon usando los datos de las tasas específicas de acuerdo a la siguiente ecuación: YL-Tir/Glc = qfL-Tír QGic- Se observó que las cepas W3110_TIR y W3110AryrR_TIR mostraron los rendimientos más bajos, de 0.0314 y 0.041 g/g respectivamente, al comparar con las cepas VH33_TIR y VH33Afy/f?_TIR, cuyos rendimientos fueron de 0.120 y 0.360. Es evidente que el YL-T¡r/Glc incrementó significativamente en el fondo PTS"Glc+ y PTS" Glc+AfyrR siendo 2.8 y 7.8 veces mayor que en el fondo PTS. Considerando estas observaciones, los rendimientos mejoraron con la eliminación de tyrR; así el YL-T¡r/Glc en la cepa W3110AryrR_TIR incrementó en un 31 % con respecto a la cepa W3110_TIR, mientras que el YL-Tir/Glc en la cepa VH33Aíyrf?_TIR fue mayor en un 200% con respecto a la cepa VH33_TIR. El YL-T GIC para la cepa VH33A/yrf?_TIR corresponde al 65% del rendimiento máximo teórico (Ymax teórico= 0.553 g/g). De las cepas con el fondo PTS"Glc+ y PTS Glc^íyr/?, se obtuvieron los mejores rendimientos con respecto a las cepas PTS y PTSAfyrR, así mismo se observaron incrementos significativos con la eliminación de tyrR demostrando un efecto positivo en el rendimiento de L-Tir.

EJEMPLO 4.- Construcción de los plásmidos pTrchpaBC, pTrchpaBCTrctyrCpheACM y las cepas de E. coli productoras de L-DOPA.

Para la construcción del plásmido pTrchpaBC se amplificó, por PCR, el operón hpaBC utilizando como templado el DNA cromosomal de la cepa E. coli W. El tamaño obtenido del producto de PCR fue de 2,135 pb de los cuales 2,093 pb correspondieron al operón hpaBC y 42 pb a los oligonucleótidos cuya secuencia cuenta con sitios de restricción para el corte con las enzimas EcoRI (Fw) y BamHI (Rv). Después de realizar la doble digestión del producto de PCR y del vector de clonación pTrc99A con las enzimas EcoRI y BamH\, se llevó a cabo la reacción de ligación para generar el plásmido pTrc/ipaSC de 6,282 pb, correspondiente a los 4,155 pb del vector pTrc99A más 2,127 pb correspondientes al operón hpaBC (Figura 10). En las cajas donde se sembró la cepa E. coli XL1-Blue transformada con el producto de ligación, después de 20 hrs de incubación a 37°C, se observó una coloración café indicando la posible oxidación de L-DOPA. Estas observaciones fueron la primera evidencia de la ligación exitosa del operón hpaBC con el vector, bajo el control del promotor trc. De las diez colonias seleccionadas como candidatas, se extrajo DNA plasmídico y se llevó a cabo la reacción de digestión con la enzima EcoRV, cuyos sitios de corte se encuentran tanto dentro del vector de clonación como del operón hpaBC. De los diez plásmidos se obtuvieron dos fragmentos: uno de 4,139 pb y uno de 2,143 pb, correspondientes a los tamaños esperados.

El plásmido pTrc/?paBCTrcryrCp ?eAcM se construyó al ligar el operón tyrCpheAcM con el plásmido pTrchpaBC. El inserto se obtuvo al digerir el plásmido pTrcfy/-Cpfte>4c con la enzima PvuU y Seal obteniendo un fragmento de 2,494pb, mientras que el plásmido pTr hpaBC, utilizado como vector, se linearizó al cortar con la enzima PvuU generando un fragmento de 6,189 pb. Después de llevar a cabo la reacción de ligación y transformar la cepa E. coli XL1-Blue, se seleccionaron veinte colonias resistentes a Cb como candidatas, de las cuales sólo una mostró los fragmentos esperados al realizar las digestiones de comprobación: un fragmento de 8,683 pb al linearizar el plásmido con la enzima fíamHI, dos fragmentos (uno de 6,845 y otro de 1 ,838 pb) al cortar con la enzima BglW y cuatro fragmentos (de 5342, 1509, 985 y 847 pb) al cortar con la enzima ?/col (Figuras 11 y 12). Una vez construido el plásmido pTrchpaBCTrctyrCpheA, se transformaron las cepas \NWO tyrR/pJLBaroGfbrtktA y VH33AfyrR/pJLBaroGftffW\, generando las cepas W3110AfyrR_DOPA y VH33Afy/ ?_DOPA.

EJEMPLO 5.- Caracterización de cepas productoras de L-DOPA.

Con las cepas W3110Afyr/?_DOPA y VH33AfyrR_DOPA se evaluó la capacidad de producir L-DOPA a partir de glucosa bajo condiciones de células en reposo. En primer lugar se cultivaron las cepas en medio LB suplementado con 10 g/l de glucosa e IPTG para la inducción, con el fin de favorecer el crecimiento (el cual se vio afectado en los cultivos de producción de L-Tir); una vez que las células alcanzaron fase exponencial tardía, se subcultivaron en medio mínimo M9 suplementado con 10 g/l de glucosa y Cm (eliminando el consumo de glucosa para generar biomasa) para evaluar la producción de L-DOPA. Los cultivos en medio M9 se iniciaron a una concentración de biomasa de 1 ± 0.2 gDW/l y se mantuvieron así durante todo el cultivo. Adicionalmente se realizaron cultivos con la adición de ácido ascórbico con el fin de prevenir la oxidación de L-DOPA. Se tomó muestra cada 2 horas por un periodo de 10 hrs después de las cuales se tomó muestra cada 6 hrs hasta completar un total de 50 hrs (Figuras 13 y 14).

En la Tabla 4 se muestra la velocidad específica de consumo de glucosa (QGIC), el rendimiento de producción de L-DOPA a partir de glucosa (YL-DOPA/GIC), así como los valores del título (gL-DOPA/L).

Tabla 4. Parámetros estequiométricos determinados de los cultivos de producción de L-DOPA Cepas Ac. ascorb QGIc YL- Título (g/i) DOPA/GIC 9L-DOPA/L j W3110Afyr/?_DOPA 0 ' : 0.344 0.0368 0.235 i W3110Afyrfl DOPAasc 0.45 : ¦ oiM: 0.0408 0.269 ¡ VH33Af ríTDoeA : }z¿ ' ¾ t 0.0517 < 0.313 I VH33Afyr _DÓP¾asc TI 1 0.45 0.0547 - 0.320 La QGIC de la cepa W3110_DOPA fue de 0.344 gGic/gDW*h, mientras que con la cepa VH33Afyrfi_DOPA la qGic disminuyó a 0.259 gGic/gDW*h. Con la adición de ácido ascórbico (ase) la Q/GIC disminuyó ligeramente en ambas cepas, correspondiendo a un decremento del 20% para la cepa W3110_DOPAasc y del 12% para la cepa VH33AryrR_DOPAasc.

El inicio en la acumulación de L-DOPA y el tiempo total de producción fue diferente para cada una de las cepas estudiadas (Figura 11). Durante el periodo de producción de L-DOPA para cada cepa, se determinaron los rendimientos absolutos (YL-DOPA/GIC). La cepa W3110AíyrR_DOPA presentó un YL-DOPA/GIC de 0.0368 g/g, mientras que la cepa VH33Aíyrf?_DOPA presentó un incremento del 40% en el YL- DOWGIC siendo de 0.0517 g/g. El YL-DOPA/GIC mas alto fue observado en la cepa VH33Afy/"R_DOPAasc, correspondiendo al 9.1% del rendimiento máximo teórico para L-DOPA (YMAX teórico= 0.602 g/g). El título de L-DOPA alcanzado por la cepa VH33AfyrR_DOPA fue de 0.313 g L-DOPA/L, superior al de la cepa W3 10Afyrft_DOPA que fue de 0.235 gL-DOPA/L. Asi mismo se observaron concentraciones de 0.269 gi_-DOPA L para la cepa W3110AfyrR_DOPAasc y de 0.320 gL- DOPA/L para la cepa VH33Afy ?_DOPAasc EJEMPLO 6.- Cultivo en fermentador de una cepa productora de L-DOPA.

Los resultados anteriores indicaron que la cepa VH33AfyrR_DOPA muestra los mejores parámetros de producción de L-DOPA. Esta cepa fue crecida bajo condiciones controladas en fermentador para la producción de L-DOPA. Se empleó medio de cultivo LB supplementado con 50 g/l de glucosa y sales minerales. El pH del medio se mantuvo a 6.0, la temperatura a 37 °C, el flujo de aire a 1 vvm. La tensión de oxígeno disuelto se mantuvo por arriba del 20% mediante la modificación de la velocidad de la hélice. El inductor IPTG se agregó al cultivo durante el fin de la fase exponencial de crecimiento o sea al inicio de la fase estacionaria. Bajo estas condiciones de cultivo se produjeron 1.51 g/l de L-DOPA en 50 horas (Figura 15).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1 . Una cepa de Escherichia coli con capacidad para la producción de L-DOPA a partir de azúcares simples, caracterizada porque comprende las siguientes modificaciones genéticas: a) tyrR, es decir la inactivación del gen codificante para la proteína reguladora TyrR; b) La sobreexpresión de un gene que codifique para una enzima con actividad de 3-desoxi-D-arao no-heptulosonato 7-fosfato (DAHP) sintasa insensible a inhibición alostérica; c) La sobreexpresión de un gene que codifique para una enzima con actividad de trancetolasa; d) La sobreexpresión de genes que codifiquen para enzimas con actividad de corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa insensibles a inhibición alostérica; e) La sobreexpresión de genes que codifiquen para una enzima con actividad de 4-hidroxifenilacetato (HPA) 3-hidroxilasa.

2. La cepa de la reivindicación 1 , caracterizada porque el gene que codifica para una enzima con actividad de 3-desoxi-D-arab//7o-heptulosonato 7-fosfato (DAHP) sintasa insensible a inhibición alostérica es aroGfbr.

3. La cepa de la reivindicación 1 , caracterizada porque el gene que codifica para una enzima con actividad de trancetolasa es tktA.

4. La cepa de la reivindicación 1 , caracterizada porque los genes que codifican para una enzima con actividad de corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa insensible a inhibición alostérica son tyrC y pheACM.

5. La cepa de la reivindicación 1 , caracterizada porque los genes que codifican para una enzima con actividad de 4-hidroxifenilacetato (HPA) 3-hidroxilasa son hpaBC.

6. La cepa de la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende adicionalmente las modificaciones genéticas Aptsl; ptsH; Acrr, es decir la inactivación de genes codificantes para proteínas del sistema de fosfotransferasa (PTS), además de la sobreexpresión del gene galP que codifica para la proteína galactosa permeasa (GalP) transportadora también de glucosa.

7. La cepa de la reivindicación 1 , caracterizada porque el azúcar simple a partir del cual produce L-DOPA es glucosa.

8. Un proceso para producir L-DOPA a partir de glucosa u otros azúcares simples, caracterizado por el cultivo de una cepa de Escherichia coli con capacidad para la producción de L-DOPA a partir de un azúcar simple, que comprende las modificaciones genéticas: AtyrR; la sobreexpresión de los genes que codifican para enzimas con actividades de: 3-desoxi-D-arab/V?o-heptulosonato 7-fosfato (DAHP) sintasa insensible a inhibición alostérica; trancetolasa; corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa insensible a inhibición alostérica; 4-hidroxifenilacetato (HPA) 3-hidroxilasa, en un medio de cultivo que comprenda azucares simples preferentemente glucosa; a un pH de 6.0; en un rango de temperaturas entre 8 a 48 °C y en condiciones aeróbicas.

9. El proceso de la reivindicación 8, caracterizado porque la cepa, comprende adicionalmente las modificaciones genéticas: Aptsl; LptsH; Acrry la sobreexpresión del gene galP.

10. El proceso de la reivindicación 8, caracterizado porque durante el fin de la fase exponencial de crecimiento o el inicio de la fase estacionaria, se inducen los genes que codifican a las enzimas con actividades de: 3-desoxi-D-ara£>/7io-heptulosonato 7-fosfato (DAHP) sintasa insensible a inhibición alostérica; trancetolasa; corismato mutasa-prefenato deshidrogenasa insensible a inhibición alostérica; 4-hidroxifenilacetato (HPA) 3-hidroxilasa.