JPH08504594A - 芳香族アミノ酸合成における共通経路の阻害除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 図１に示される共通経路を経由する芳香族化合物のホスト細胞中での生産の効率向上が、経路上で同定された律速段階における、基質中間体に作用する酵素種の発現を向上させることによって実現される。ホスト細胞は、律速酵素をコードするリコンビナントＤＮＡによって形質転換されて細胞形質転換体をもたらすが、この形質転換体は代謝可能な炭素源を有する細胞培養中で生育したとき、高濃度の芳香族代謝産物を産生する能力を有することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 芳香族アミノ酸合成における共通経路の阻害除去技術分野 本発明は生合成反応の効率向上に関する。より詳細には、本発明はホスト細胞 中の共通経路における芳香族化合物の生合成能を向上させる方法に関するもので あって、この方法は、前記経路中の律速反応段階を同定するとともにホスト細胞 を遺伝子工学的に操作してこれらの律速段階を効果的に阻害除去（デブロッキン グ）することによって行うものである。背景技術、産業上の利用可能性及び発明の開示 シキミ酸経路とも呼ばれる芳香族アミノ酸生合成の共通経路は、細菌や植物中 の芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンを 生産する。これらの芳香族アミノ酸に至る経路は、コリスメート分子で終わる共 通経路と、ここから分岐してフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファ ンにいたる三つの別個の末端経路とからなる。芳香族アミノ酸は、これらの化合 物を合成する能力を欠くヒトや動物の栄養における必須成分である。これらはま た多くの興味深いかつ商業的に重要な分子、たとえば２、３例を挙げると、合成 甘味料であるアスパルテーム、よく知られた染料であるインジゴ、およびパーキ ンソン病の症状に抗するために用いられる薬であるＬ−ＤＯＰＡなどの前駆体で もある。 グルコースや他の糖類などの容易に入手しうる炭素源から、芳香族アミノ酸群 やそれらの誘導体を過剰に生産する生体触媒的ルートの成否の鍵はホスト生物の 経路を経由して炭素量急増（サージ）を指向する力による。経路中で代謝阻止剤 （代謝ブロック）に遭遇することによって、その後の生体触媒的転換で生じる生 成物の収率や純度が影響を受けることがある。 芳香族生合成の共通経路における生産効率を増加させる従前の試みは、１９９ １年２月８日に出願された米国特許出願第０７／６５２９３３号に対し１９９２ 年１２月１日に許可された米国特許第５１８６０５６号に記載されており、その 記載をここに本明細書を構成する一部として援用する。この特許はＤＡＨＰシン ターゼとトランスケトラーゼの生体内触媒活性を増加させることによって経路内 への炭素の流れを増加させるという関連発明を記載している。その特許明細書は 、共通経路において各段階の反応を触媒するその他の酵素が、主要標的であるト ランスケトラーゼおよびＤＡＨＰシンターゼと共に過発現され得ることを述べて いるが、この共通経路を指向する炭素流は、基質中間体が生産される速度とほぼ 等しい速度で中間体を触媒転換させることができない一以上の経路酵素が存在し た場合にはもはや炭素流の増加をもたらさないことが判明している。つまりこの 生合成経路には一種の律速段階があり、経路上の反応段階の進行を阻害するよう に作用する。本発明はそのような阻害を除去するものである。 核磁気共鳴スペクトル法（ＮＭＲ）を用いた大腸菌株Ｄ２７０４（ｐｈｅＡ− 、ｔｙｒＡ−、ΔｔｒｐＥ−Ｃ）の培養上清の分析から、３−デヒドロキネート ・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォイルシキメート− ３−フォスフェート・シンターゼ、およびコリスメート・シンターゼが、芳香族 アミノ酸生合成の共通経路における律速酵素として同定された。ａｒｏＬ（シキ メート・キナーゼ）、ａｒｏＡ（ＥＰＳＰシンターゼ）、およびａｒｏＣ（コリ スメート・シンターゼ）をコードする遺伝子フラグメントを含有するプラスミド とプラスミドｐＫＤ１３６（これは芳香族アミノ酸生合成の共通経路への炭素の 増量をもたらすことが分かっている）とを大腸菌株Ｄ２７０４に挿入すると、培 養ブロスから律速酵素の多くの基質を除去できるとともに最終産物生成において 顕著な増収がもたらされた。図面の簡単な説 明 図１は、芳香族アミノ酸の生合成における共通経路を示す。 図２は、ｐＫＤ１３０ＡとｐＫＤ１３６のプラスミド地図である。 図３Ａと３Ｂは、大腸菌株Ｄ２７０４の共通経路における各中間体の濃度と、 この菌株のフェニルアラニンおよびフェニル乳酸の平均濃度を示す棒グラフであ る。 図４は、プラスミドｐＩＡ３２１とｐＳＵ１８からプラスミドｐＫＤ２８を構 築する様子を示す。 図５は、図４と同様、プラスミドｐＫＡＤ３１の構築を示す。 図６Ａ、６Ｂ、６ＣはａｒｏＥａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ３４の製造を示す 。 図７−１３は、図４−７に類似のものであって、それぞれプラスミドｐＫＡＤ ３８、ｐＫＡＤ４３、ｐＫＡＤ３９、ｐＫＡＤ５０、ｐＫＡＤ４４、ｐＫＡＤ５ １、およびｐＫＡＤ４２の構築を示す。 図１４は、本発明の大腸菌形質転換体の培養基における、フェニルアラニン、 フェニル乳酸、及びプレフェンの総蓄積量を示す棒グラフである。発明を実施するための最良の形態 本発明は、共通経路を経由してホスト細胞中での芳香族化合物の生合成能を向 上させる方法を提供する。その経路においては、代謝されうる炭素源は、多段階 反応シーケンスで中間体である芳香族化合物に転換されるが、このシーケンスは 、中間体基質に作用する酵素の種類によって異なる。本発明方法の一態様は前記 経路において律速段階を同定する方法を開発することを包含し、この方法はホス ト細胞の培養上清を分析して蓄積した共通経路中間体、すなわち経路における酵 素に仲介された律速段階のための基質、を同定することを含むものである。律速 段階が同定されると、ホスト細胞は、経路の律速反応段階における同定された蓄 積中間体基質に作用する酵素種をコードするＤＮＡを含有するリコンビナントＤ ＮＡで形質転換され、ホスト細胞中の酵素種の発現を増加させる。加えて律速段 階に関与する酵素種の高度の発現はまた、本分野で受け入れられている方法を用 いて内因性コントロール配列を修正するかあるいは既存の発現コントロール配列 の抑制解除に変化を起こすことによってホスト細胞を遺伝子工学的に操作し、そ のような酵素種に対する内因性遺伝子を過発現することによっても達成される。 律速酵素種の発現を高めるために用いられる正確なメカニズムが何であれ、そ れは典型的にはホスト細胞へのリコンビナント遺伝子エレメントの移行によって 影響もしくは仲介されるのではないかということが考えられる。ここでいう遺伝 子エレメントとは、共通経路において律速酵素を発現させるかまたは発現を調整 する産物、特に酵素等のタンパク、アポタンパク、またはアンチセンスＲＮＡな どの産物、を発現可能なコード配列を有する核酸（通常ＤＮＡまたはＲＮＡ）を 含む。発現されたタンパクは酵素として機能することができ、酵素活性を抑制も しくは抑制解除し、または酵素の発現をコントロールする。これらの発現可能な 配列をコードするリコンビナントＤＮＡは、染色体内（例えば相同組換えによっ てホスト細胞染色体に組み込まれたもの）または染色体外（例えばプラスミド、 コスミド、および目的とする形質転換を起こすことが可能なその他のベクターに よって担持されるもの）のいずれのものでもよい。 本発明におけるホスト細胞を転換するために用いられるリコンビナントＤＮＡ は、構造遺伝子の他に、タンパク、アポタンパク、またはアンチセンスＲＮＡに 対するコード配列の発現や抑制解除をコントロールするエンハンサー、プロモー ター、およびリプレッサーを含む発現コントロール配列を包含することができる 。たとえばそのようなコントロール配列を野性型のホスト細胞に挿入して、ホス ト細胞ゲノム中に既にコードされた選択酵素の過発現を促進したり、あるいはそ れらを用いて染色体外でコードされた酵素の合成をコントロールするために用い ることができる。 リコンビナントＤＮＡは、プラスミド、コスミド、ファージ、イースト人工染 色体、その他、ホスト細胞中への遺伝子エレメントの移入の仲介を行うベクター によってホスト細胞へと導入される。これらのベクターは、ベクターおよびベク ターに担持される遺伝子エレメントの複製をコントロールするｃｉｓ−作用コン トロールエレメントとともに複製起点を有することができる。ベクター上には選 択可能なマーカーが存在してもよく、これは遺伝子エレメントが導入されたホス ト細胞の同定に役立つ。そのような選択可能なマーカーの例として、テトラサイ クリン、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、またはネオマイ シンなどの特定の抗生物質に耐性を与える遺伝子が挙げられる。 ホスト細胞に遺伝子エレメントを導入する好ましい手段は、本発明による遺伝 子エレメントが挿入された染色体外マルチコピープラスミドベクターを用いるも のである。ホスト細胞への遺伝子エレメントのプラスミドによる導入にあたって は、まず制限酵素でプラスミドベクターを切断し、本発明による標的酵素種をコ ードする遺伝子エレメントと当該プラスミドとを連結する。連結されたプラスミ ドが再環化したら、感染（例えばλファージ中へのパッケージング）その他のプ ラスミド伝達メカニズム（例えば電気穿孔法、マイクロインジェクションなど） を利用してプラスミドをホスト細胞に伝達させる。ホスト細胞に遺伝子エレメン トを挿入するのに適当なプラスミドの例としてはｐＢＲ３２２およびその誘導体 であるｐＡＴ１５３、ｐＸｆ３、ｐＢＲ３２５、およびｐＢＲ３２７、ｐＵＣベ クター群、ｐＡＣＹＣおよびその誘導体、ｐＳＣ１０１およびその誘導体、およ びＣｏｌＥ１が挙げられるがこれらに限定されるものではない。 本発明において好適に使用されるホスト細胞は、希望する芳香族化合物の工業 的生合成的生産に使用可能な属（genus）に属するものである。従って、ホスト 細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシェリキア）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ（コリネバクテリウム）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ブレヴィバク テリウム）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ（アルスロバクター）、Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ（バチルス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）、Ｓｔｒｅｐｔｏ ｍｙｃｅｓ（ストレプトマイセス）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（スタフィ ロコッカス）、およびＳｅｒｒａｔｉａ（セラチア）の各属に属する原核生物を 包含する。真核ホスト細胞も使用できるが、イースト類またはＳａｃｃｈａｒｏ ｍｙｃｅｓ（サッカロマイセス）属やＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ （シゾサッカロマイセス）属が好ましい。 より具体的には原核ホスト細胞はたとえば次の種から誘導されるがこれらに限 定されるものではない：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（エシェリキア・コ リ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（コリネバクテ リウム・グルタミカム）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｅｒｃｕｌｉｓ （コリネバクテリウム・ヘルキュリス）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉ ｖａｒｉｃａｔｕｍ（ブレヴィバクテリウム・ディヴァリカタム）、Ｂｒｅｖｉ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ブレヴィバクテリウム・ ラクトフェルメンタム）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ（ブレ ヴィバクテリウム・フラヴァム）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ（バチルス ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ（バチルス・セレウス）、Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ（バチルス・サーキュランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ ｏａｇｕｌａｎｓ（バチルス・コアギュランス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈ ｅｎｆｏｒｍｉｓ（バチルス・リシェニフォルミス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅ ｇａｔｅｒｉｕｍ（バチルス・メガテリウム）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｓｅｎ ｔｅ ｒｉｃｕｓ（バチルス・メセンテリカス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｉｓ （バチルス・ピュミリス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（バチルス・ サブチリス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナ ス・エルジノーサ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｎｇｕｌａｔａ（シュードモ ナス・アングラータ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュ ードモナス・フルオレッセンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｔａｂａｃｉ（シ ュードモナス・タバシ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎ ｓ（ストレプトマイセス・オーレオファシエンス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ（ストレプトマイセス・アヴァーミチリス）、Ｓｔｒ ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ストレプトマイセス・コエリコロ ール）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ（ストレプトマイセス・グ リセウス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｓｕｇｅｎｓｉｓ（ストレプトマ イセス・カスゲンシス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ（ ストレプトマイセス・ラヴェンジュレ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｐｍ ａｎｉｉ（ストレプトマイセス・リプマニ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ ｖｉｄａｎｓ（ストレプトマイセス・リヴィダンス）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ ｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ（スタフィロコッカス・エピデルミス）、Ｓｔａｐ ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ（スタフィロコッカス・サ プロフィチカス）、およびＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ（セラチア ・マルセッセンス）。 好ましい真核ホスト細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ（サッカロマイセス・セレヴィシエ）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ（サッカロマイセス・カールスベルゲンシ ス）が挙げられる。 コリスメート（芳香族アミノ酸など）からの一次代謝物を工業的に生産するた めには、代謝生合成経路において一以上の酵素をフィードバック阻害しない上述 の種の非調整（deregulated）突然変異株が好ましい。そのような株はランダム または特異的突然変異によって生成されるかあるいは商業的に入手可能である。 ＤＡＨＰシンターゼ、プレフェン酸デヒドラターゼ、あるいはコリスミ酸ムター ゼ のフィードバック阻害を除去した大腸菌の例は、Ｔｒｉｂｅ（トライブ）に許可 された米国特許第４６８１８５２号およびＢｅｃｋｍａｎ（ベックマン）に許可 された米国特許第４７５３８８３号に記載されており、これらの開示を本明細書 の一部を構成するものとしてここに援用する。 本発明の好ましい実施態様においては、ホスト細胞中の律速酵素種の高発現が ホスト細胞の形質転換によって達成されるが、この形質転換は次の酵素種、すな わち３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、および５−エ ノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰシンターゼ） 、をコードするＤＮＡを含有するプラスミドベクターによってなされる。より好 ましくは、形質転換ベクターはさらにコリスミ酸シンターゼをコードするＤＮＡ を含有する。本発明方法における最も好ましい実施態様においては、大腸菌株は 、次の酵素をコードするＤＮＡを含有するリコンビナントＤＮＡで形質転換され てホスト細胞中のそれら酵素の発現を増加させる：トランスケトラーゼ（ｔｋｔ ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ ＤＡＨＰシンターゼ）、３−デヒドロキネート・シンターゼ（ＤＨＱシンターゼ ）、シキメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸 シンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼ。 典型的には、リコンビナントＤＮＡは、上記酵素種をコードするＤＮＡを含有 する一以上のリコンビナントプラスミドベクターの一部としてホスト細胞中に導 入される。 本発明の他の実施例には、本発明方法によって調製される細胞形質転換体およ び、そのような細胞形質転換体を用いて炭素源から芳香族化合物を生物触媒的に 生産する方法が含まれる。この方法は、炭素源の存在下、共通経路において当該 炭素源を利用しうる本発明の細胞形質転換体を、経路における炭素源の使用を助 成する条件下において培養する段階を包含するものである。本発明のその他の実 施態様には、共通芳香族生合成経路の２以上の律速酵素に対する構造遺伝子を包 含するプラスミド構造体が含まれる。例えば、好ましい構造体としてシキメート ・キナーゼとＥＰＳＰシンターゼに対する構造遺伝子を含有するものが挙げられ 、より好ましくはコリスミ酸シンターゼに対する構造遺伝子も含有される。その よ うなプラスミド構造体で形質転換された微生物もまた本発明に含まれる別の一態 様である。 すでに述べたように、ホスト細胞中の共通経路から導かれる化合物の生合成能 を高めるために、その経路上での反応を促進するタンパクの発現を増加させるこ とが従前なされてきた。本発明は、共通経路を経由してホスト細胞中の芳香族化 合物を生成するにあたりその生成効率を目ざましく改善するものである。これま での報告では、共通経路のトランスケトラーゼ単独もしくはトランスケトラーゼ と他の酵素、例えばＤＡＨＰシンターゼ、ＤＨＱシンターゼさらにはシキミ酸シ ンターゼとの組み合わせでの濃度を高めることによって経路の上流端（反応シー ケンス開始点）への炭素の流れを増加させることができることが知られている。 しかし、律速酵素種が同定できること、および、この同定結果を利用してホスト 細胞を形質転換して律速酵素種を過発現させ芳香族経路中の炭素流の顕著な増加 をもたらしうること、についてはなんらの示唆もなされていない（このことは形 質転換ホスト細胞の培養基中の「プロセス内」芳香族代謝産物の濃度によってわ かる）。このように本発明は共通経路から得られる化合物の生合成収率を向上さ せるという従前なされてきた努力をさらにつぎの（１）、（２）のように改善す るものと見ることができる：（１）前記経路における律速反応段階を同定するこ と、および（２）その経路において同定された律速段階を触媒するタンパクの発 現を増大させること。本発明においては、発現の増大は、好ましくはホスト細胞 を形質転換して当該タンパク触媒（酵素）をコードする構成的外因性遺伝子を発 現させ、これによってホスト細胞中のタンパクの濃度を増加させることによって 達成される。本発明による改良点が特に顕著に現れるのは、ホスト細胞が、シキ ミ酸キナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼおよびコリスミ酸シンターゼに対する遺伝子 を包含する外因性構造遺伝子を発現するように形質転換された大腸菌の菌株の場 合である。 ｐｈｅＡ−、ｔｙｒＡ−、およびΔｔｒｐＥ−Ｃである大腸菌株、Ｄ２７０４ は、理論的にはコリスミ酸が生成可能なはずである。なぜならフェニルアラニン 、チロシン、およびトリプトファンへと続く末端経路がそれぞれ阻害（ブロック ）されているからである（図１）。この株を用いて、経路に炭素流の急増が起こ っ たとき、大腸菌中で芳香族アミノ酸生合成の共通経路の阻害を除去することを計 画した。ここで阻止の指標としてコリスメートの蓄積増加を用いた。富化した培 地中でＤ２７０４細胞を成長させた後、最小塩蓄積培地中への再懸濁で、ほとん どもしくは全くコリスメートが蓄積しなくなり、一方フェニルアラニンのレベル が目ざましく向上した。フェニルアラニンの生成は、非酵素的なコリスミ酸から プレフェン酸へのクライゼン再転位の後、フェニルピルビン酸を生成する脱水工 程を経ることで説明される。酵素であるコリスミ酸ムターゼはコリスメートから プレフェネートへの転換を３７℃で２ｘ１０⁶倍加速するが、この反応は酵素の 不存在下でも起こりうる。報告によれば、プレフェン酸は通常の細胞培養におい て創出されるような温和な酸性条件下で非酵素的にフェニルピルベートを生成す る。フェニルピルビン酸の生成と共に微生物は、ｔｙｒＢでコードされた完全ア ミノトランスフェラーゼによって、フェニルアラニンを合成できるはずである。 しかしながら非常に多量のフェニルラクテートが培養上清の幾つかに観察された 。 ｔｙｒＢでコードされた芳香族アミノトランスフェラーゼは、窒素供与体とし てグルタメートを、コエンザイムとしてピリドキサルリン酸を用いて芳香族ケト 酸アミノ酸をアミノ基転移させる［Ｍａｖｒｉｄｅｓ，Ｃ．Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ；アカデミック社：サンディエゴ、１９８７年、 １４２、２５３−２６７ページ］。フェニル乳酸の生成は、細胞中のグルタメー ト供給が不十分でフェニルピルビン酸を完全にアミノ基転移できないことによる ものであろう。フェニルピルビン酸のフェニル乳酸への還元が起こって、細胞内 のＮＡＤ⁺の供給を再びもたらす可能性がある。また、酵素である乳酸デヒドロ ゲナーゼ［Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｊ．；Ｌｉｌｊａｓ，Ａ．；Ｓｔｅｉｎｄｅ ｌ，Ｓ．Ｓ．；Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．Ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ；Ｂ ｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．編；アカデミック・プレス：ニューヨーク、１９７５；第１ １巻、第４章］によって触媒される、ピルベートから乳酸への同様な還元が嫌気 条件下で起こり、ＮＡＤ⁺の供給を再び起こして解糖機能を継続させることが知 られている。 芳香族アミノトランスフェラーゼの活性もまた、Ｄ２７０４におけるｐｈｅＡ 突然変異の存在によって制限される可能性がある。ｐｈｅＡによってコードされ る、二機能性の酵素であるコリスミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドラターゼは 、フェニルピルベートの存在下で芳香族アミノトランスフェラーゼと反応し、大 腸菌内で複合体を形成する［Ｐｏｗｅｌｌ，Ｊ．Ｔ．；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ． Ｆ；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９７９年、５６８、４６７ −４７４］。Ｄ２７０４はｐｈｅＡであるので、これは複合体形成に必要なコリ スミ酸ムターゼ−プレフェン酸デヒドロラターゼ酵素を生成できないはずである 。酵素−酵素間の相互反応の役割は判明していないが、複合体を形成できないこ とがアミノトランスフェラーゼ活性に影響し、細胞内でフェニルピルビン酸の蓄 積をもたらす可能性がある。この仮説はもっともらしく聞こえるが、フェニルラ クテートの蓄積の理由は未だに実験的には解明されていない。しかしながら、フ ェニルラクテートの蓄積が共通経路からの阻害が除去されたグルコース等価物を 表すとみることには問題はない。よって芳香族アミノ酸生合成の共通経路から代 謝阻害がうまく除去できたときの除去量を、以下に記す研究によってフェニルア ラニンとフェニル乳酸の総蓄積の和として測定した。培養上清における共通経路 中間体の蓄積を利用して、共通経路を下る炭素流中の律速段階である酵素を同定 したが、これは蓄積中間体が律速酵素の基質であるという考えに基づくものであ った。 適切な薬剤を含有するＬＢ培地を用いて各株５ミリリットルの出発培養を１０ 時間生育した。容積４リットルのエルレンマイヤー・フラスコにＬＢ培地１リッ トルを入れ、さらに必要に応じてイソプロピルＢ−Ｄ−チオガラクトピラノシド （ＩＰＴＧ）（０．２ｍＭ）、クロラムフェニコール（２０ｍｇ／Ｌ）、および アンピシリン（５０ｍｇ／Ｌ）を加えたものに上記出発培養を接種した。培養（ １リットル）を３７℃で１２時間、攪拌しながら生育させた（２５０ＲＰＭ）。 細胞を収穫し（３０００ｇ、５分、４℃）、Ｍ９塩で３回洗浄した［Ｍ９塩は１ リットル当たりＮａ₂ＨＰＯ₄を６ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄を３ｇ、ＮａＣｌを０．５ｇ、 ＮＨ₄Ｃｌを１ｇ含有する］（各サンプルを３００ｍｌで洗浄）。グルコース（ １０ｇ）、ＭｇＳＯ₄（１ｍＭ）、およびチアミン（３０ｍｇ）を含有させた１ リットルのＭ９蓄積培地を４リットルのエルレンマイヤー・フラスコにいれ、さ らに必要な場合にはこれにクロラムフェニコール、アンピシリン、およびＩＰＴ Ｇを 添加し、これに細胞沈殿物を再懸濁した。細胞は、さらに４８時間の間、３７℃ で攪拌しながら蓄積培地中でインキュベートした（２５０ＲＰＭ）。分割量（２ ５ｍｌ）を２４時間および４８時間の間隔で取り出して遠心分離した（６０００ ｇ；５分；４℃）。分離された上清１０ミリリットルを各サンプルから集め、真 空下で水分を除去した。サンプルを重水で二回交換し、¹Ｈ−ＮＭＲで分析した 。３−（トリメチルシリル）プロピオン−２，２，３，３−ｄ₄酸のナトリウム 塩を内部標準として用いて中間体と蓄積過程で生成した産物を定量した。全培養 は三重に用意して生育させ、蓄積した分子の平均値およびその標準偏差を得た。 芳香族アミノ酸生合成の共通経路を通る炭素サージを起こすためには、トラン スケトラーゼ（ｔｋｔ）を含有するプラスミド及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノ −ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ）のチロシン 感受性アイソザイム（ａｒｏＦ）を用いた。トランスケトラーゼは、芳香族アミ ノ酸の生産において細胞が利用できるエリスローズ４−リン酸のレベルを増大さ せることが知られている一方、ＤＡＨＰシンターゼは経路における最初の不可逆 的段階である。ｔｋｔ、ａｒｏＦプラスミドｐＫＤ１３０Ａ（図２）、アンピシ リン耐性完全遺伝子を有するｐＢＲ３２５誘導体、および複製起点ｐＭＢ１は、 ３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸（ＤＡＨＰ）、３ −デヒドロシキメート（ＤＨＳ）、シキメート、およびシキメート−３−リン酸 という共通経路中間体を蓄積した。総フェニルアラニンおよびフェニル乳酸蓄積 量は、Ｄ２７０４へ導入されたとき５．６＋／−０．７ｍＭであった（図３）。 ４８時間のインキュベーションの後、ＤＡＨＰに関する¹Ｈ−ＮＭＲ共鳴を測定 した結果は次の通りである：δ１．７９（ｄｄ、１３、１３Ｈｚ、１Ｈ）、δ２ ．２０（ｄｄ、１３、５Ｈｚ、１Ｈ）、δ３．４６（ｄｄ、９、９Ｈｚ、１Ｈ） 、およびδ３．８３（ｍ、２Ｈ）。培地中のシキメートの存在は、共鳴によって δ４．４１（ｄｄ、４、４Ｈｚ、１Ｈ）およびδ６．４７（ｍ、１Ｈ）において 示される。シキメート−フォスフェートの共鳴はδ６．４７（ｍ、１Ｈ）にある 。フェニルアラニンの共鳴はδ３．１４（ｄｄ、１４、８Ｈｚ、１Ｈ）、δ３． ２９（ｄｄ、１４、５Ｈｚ、１Ｈ）、およびδ７．３０−７．４９（ｍ、５Ｈ） に見いだされる。フェニル乳酸の共鳴はδ４．２７（ｄｄ、８、４Ｈｚ、１Ｈ） お よびδ７．３０−７．４９（ｍ、５Ｈ）で観察される。ＤＨＳは２４〜４８時間 の間に蓄積培地から消失する。培養上清中のＤＡＨＰ、ＤＨＳ、シキメート、お よびシキメート−３−フォスフェートの蓄積から、３−デヒドロキネート・シン ターゼ（ＤＨＱシンターゼ）、シキメート・デヒドロゲナーゼ、シキメート・キ ナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ（ ＥＰＳＰシンターゼ）のそれぞれが律速酵素であるといえる。ＤＨＱシンターゼ とシキメート・デヒドロゲナーゼは従前共通経路における律速段階であると同定 されていたが［Ｄｒａｔｈｓ，Ｋ．Ｍ．；Ｆｒｏｓｔ，Ｊ．Ｗ；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ ｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９０年、１１２、９３６０−９６３２；Ｄｒａｔｈｓ，Ｋ ．Ｍ．Ｐｈ．Ｄ．、スタンフォード大学論文、１９９１年６月］、シキメート・ キナーゼとＥＰＳＰシンターゼが律速段階であるとの同定はこれまでに文献記載 がない。 培養上清からＤＡＨＰの蓄積をなくするために、Ｄ２７０４にｔｋｔ、ａｒｏ Ｆ、ａｒｏＢプラスミドｐＫＤ１３６（図２）が導入された。ｐＫＤ１３６を用 いるとＤＡＨＰが培養上清から成功裏に取り除かれＤＨＳ、シキメート、および シキメート−３−リン酸の蓄積増加をもたらしたが、フェニルアラニンおよびフ ェニルラクテートは増加しなかった（図３）。図３Ａは最小培地中で２４時間生 育させた後のＤ２７０４株中に蓄積した共通経路中間体の濃度を示す。図３Ｂは 最小培地中で２４時間および４８時間生育させた後のＤ２７０４株中に蓄積した フェニルアラニンとフェニルラクテートの総蓄積量を示す。本実験に使用した株 は次のものを含む：１）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３０Ａ；２）Ｄ２７０４／ｐＫＤ １３６；３）Ｄ２７０４／ｐＫ１３６／ｐＫＤ２８；４）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１ ３６／ｐＫＡＤ３４；５）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３１；６）Ｄ２ ７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３８；７）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡ Ｄ４３；８）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３９；９）Ｄ２７０４／ｐＫ Ｄ１３６／ｐＫＡＤ５１；１０）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４４；１ １）Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０。このように、経路から律速段階 を取り除いても、最終産物の蓄積増加は観察されなかった。 ｐＫＤ１３６へのａｒｏＥの挿入に関して好便なユニーク制限部位がないこと により、残る阻害除去実験においては二つのプラスミド系を使うことになった。 この系はｐＫＤ１３６および、ｐＳＵ２７１８／ｐＳＵ２７１９［Ｍａｒｔｉｎ ｅｚ，Ｅ．；Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ，Ｂ．；ｄｅ ｌａ Ｃｒｕｚ、Ｆ．Ｇｅｎｅ 、１９８８年、６８、１５９−１６２］から誘導されたプラスミドであるｐＳＵ １８とｐＳＵ１９（これはクロラムフェニコール耐性を有する）、ｌａｃプロモ ーター、および複製起点ｐ１５Ａからなるものであり、これに残りの阻害除去遺 伝子を挿入した。ｐＳＵ１８に基づくａｒｏＥプラスミドであるｐＫＤ２８［Ｄ ｒａｔｈｓ，Ｋ．Ｍ．Ｐｈ．Ｄ．スタンフォード大学論文、１９９１年６月］を 作成したが、これはｐＩＡ３２１［Ａｎｔｏｎ，Ｉ．Ａ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ ．Ｒ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８８年、２４９、３１９−３２６］からの ａｒｏＥ遺伝子およびｔａｃプロモーターを含有する１．６ｋｂのフラグメント を単離し、さらに図４に示すｐＳＵ１８へと連結することによって行った。Ｄ２ ７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ２８はＤＨＳ蓄積レベルを低下させない一方、培 養上清から中間体を完全には除去しなかった。シキメートとシキメート−３−リ ン酸は培養ブロスに存在し続けた。フェニルアラニンとフェニルラクテートの総 生産は生育４８時間後で２．１＋／−０．９ｍＭへと減少した（図３）が、これ はａｒｏＥでの阻害除去による炭素流の増加によって最終物質がそれ以上蓄積す ることがなかったことを意味している。 シキメート・キナーゼの律速特性を除去するため、ａｒｏＬとａｒｏＥａｒｏ Ｌの両プラスミドを構築した。ａｒｏＬは、機能が未知の遺伝子であるａｒｏＭ ［ＤｅＦｅｙｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｐｉｔｔａｒｄ，Ｊ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ ｌ．、１９８６年、１６５、２２６−２３２］を有する転写ユニットに位置して いる。この転写ユニットを含む２．７ｋｂのフラグメントは既に単離されており 、これはｐＢＲ３２２にクローニングされてプラスミドｐＭＵ３７１［ＤｅＦｅ ｙｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．；Ｐｉｔｔａｒｄ，Ｊ．、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９ ８６年、１６５、２２６−２３２］を形成する。ａｒｏＬを含有するｋＢフラグ メントをプラスミドｐＭＵ３７１から単離し、ベクターｐＳＵ１９に挿入して３ ．３ｋｂのａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ３１（図５）を製作する。４．９ｋｂの ａｒｏＥａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ３４をｐＫＤ２８からのａｒｏＥ遺伝子の フ ランキング制限部位の操作によって得たのち、それを単離してｐＫＡＤ３１のユ ニークなＸｂａＩおよびＢａｍＨ部位へと連結する（図６）。 ａｒｏＥａｒｏＬ構成体（construct）であるＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐ ＫＡＤ３４はＤＨＳとシキメートを培養上清から完全に除去することができ、蓄 積された共通経路中間体としてシキメート−３−リン酸を残すのみである。フェ ニルアラニンとフェニル乳酸の総生産は３．４＋／−０．２ｍＭであった。これ はＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ２８という最終産物からのわずかな上昇 にとどまったが、なおＤ２７０４／ｐＫＤ１３０ＡとＤ２７０４／ｐＫＤ１３６ の両者で観察されるフェニルアラニンとフェニルラクテートよりもまだ顕著に少 ないものであった（図３）。 ａｒｏＬ構成体であるＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ３１もまたＤＨＳ とシキメートを培養ブロスから完全に除去することができ、ただ一つの過生産さ れた遺伝子を有するシキメート・デヒドロゲナーゼおよびシキメート・キナーゼ 両者の律速特性をから解放している。したがってシキメート・デヒドロゲナーゼ の律速特性はシキメート蓄積の人為結果（アーティファクト）であると思われる 。シキメート・デヒドロゲナーゼの律速特性において培養基からシキメートを除 去することの重要性は、シキメートが酵素に対して何らかの阻害効果を有するか も知れないことを示唆するものである。シキメート−３−リン酸の蓄積はなお観 察され、またフェニルアラニンとフェニルラクテートの総生産は５．６＋／−０ ．５ｍＭであることが判明した。これは、Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３０ＡおよびＤ ２７０４／ｐＫＤ１３６で最初に観察された最終産物生成レベルである（図３） 。このようにＤＨＱシンターゼ、シキメート・デヒドロゲナーゼ、およびシキメ ート・キナーゼの代謝阻止を除去した時、経路の最終産物の総蓄積量は、理由不 明の阻害除去されたグルコース同等物を別として顕著な増加はなかった。 ＥＰＳＰはＥＰＳＰシンターゼの前進反応の阻害剤であることが報告されてお り［Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．；Ｌｅｗｅｎｄｏｎ，Ａ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ． ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９８４年、１６５、１２１−１２７］、これは当 該酵素が律速特性を遵守することに対する一説明を示唆するものである。シキメ ート−３−リン酸を培養上清から除去するために、ａｒｏＡプラスミドおよびａ ｒｏ ＡａｒｏＬプラスミドを構築した。ａｒｏＡ遺伝子は、セリンの生合成経路酵素 である３−フォスフォセリン・アミノトランスフェラーゼをコードするｓｅｒＣ を有するオペロン上に存在する。ｓｅｒＣａｒｏＡオペロンをコードする４．７ ｋｂのフラグメントを単離し配列決定した［Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．；Ｃｏｇｇｉｎ ｓ，Ｊ．Ｒ．、Ｂｌｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８６年、２３４、４９−５７；Ｄｕ ｎｃａｎ，Ｋ．；Ｌｅｗｅｎｄｏｎ，Ａ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．、ＦＥＢ Ｓ Ｌｅｔｔ．、１９８４年、１７０、５９−６３］。４．７ｋｂのａｒｏＡプ ラスミドｐＫＡＤ３８を作成するために、２．４ｋｂのａｒｏＡフラグメントを プラスミドｐＫＤ５０１から単離し［Ｄｕｎｃａｎ，Ｋ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ，Ｊ ．Ｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８６年、２３４、４９−５７］、外部ｌａ ｃプロモーターの直後にあるベクターｐＳＵ１８に連結した（図７）。ｓｅｒＣ ａｒｏＡの転写ユニットからのａｒｏＡの除去は、発現のために外部プロモータ ーの後ろにそれが配置されることを必要とする。ｓｅｒＣとａｒｏＡ遺伝子の間 に位置しａｒｏＡの発現を自然に減衰させると信じられている、ｒｈｏと独立の 転写ターミネーターは、２．４ｋｂのａｒｏＡフラグメント上に完全な形で残存 するが、この理由は、除去に好都合な制限部位がないからである。外部ｌａｃプ ロモーターの後方の転写ターミネーターでのトランケートされたａｒｏＡ遺伝子 はなおあるレベルのＥＰＳＰシンターゼの過発現をもたらす。５．７ｋｂのａｒ ｏＡａｒｏＬプラスミドであるｐＫＡＤ（図８）は２．４ｋｂのａｒｏＡ遺伝子 をフランキングＰｓｔＩと平滑末端化部位による単離および等価な部位を有する ように操作されたｐＫＡＤ３１ベクターへの連結によって作成された。 Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＤ３８株の評価の結果、総フェニルアラニン およびフェニルラクテート生産量の顕著な増加が判明した。この生産量は４８時 間蓄積後で７．９＋／−１．３ｍＭであった（図３）。上清に蓄積した経路の中 間体はＤＨＳ、シキメート、およびシキメート−３−リン酸であった。Ｄ２７０ ４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３株は９．７＋／−０．３ｍＭのフェニルアラニ ンとフェニルラクテートを生産したが、唯一の共通経路中間体、シキメート−３ −リン酸が蓄積したのみであった。ａｒｏＡプラスミドが阻害除去されたグルコ ース等価物から最終産物への転換が成功したことを最初に示した。ａｒｏＡ遺伝 子がシキメート−３−リン酸蓄積を完全に取り除くことができないことは、ＥＰ ＳＰシンターゼによって触媒される反応の可逆性から来るものと考えられえる。 コリスミ酸シンターゼは不可逆的であってかつ恐らくは律速酵素であろうとい うことが示唆されている［Ｐｉｔｔａｒｄ，Ａ．Ｊ．Ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；Ｎ ｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．、Ｉｎｈｇｒａｈａｍ，Ｊ．Ｌ．、ｌｏｗ，Ｋ．Ｂ ．、Ｍａｇａｓａｎｉｋ，Ｂ、Ｓｃｈａｅｃｈｔｅｒ，Ｍ、Ｕｍｂａｒｇｅｒ， Ｈ．Ｅ．、編、アメリカ微生物学会：ワシントンＤ．Ｃ．、１９８７年；ｖｏｌ ．、第４章］。もし蓄積されたＥＰＳＰが引き続きＥＰＳＰシンターゼによって シンターゼ−３−リン酸へと転換されるならば、コリスミ酸シンターゼの律速特 性によって、シキメート−３−リン酸は引き続き存在するであろう。培養上清か らシキメート−３−リン酸を完全に除去するために、ａｒｏＡａｒｏＣａｒｏＬ プラスミドを構築した。まずｐＧＭ６０２からの平滑末端化部位とＳａｌＩによ ってフランキングされたａｒｏＣフラグメントの単離によってａｒｏＣプラスミ ドを構築した［Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｊ．；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｇ．；Ｃｏｇｇｉｎｓ， Ｊ．Ｒ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９８８年、２５１、３１３−３２２］。こ れはコリスミ酸シンターゼをコードする１．６９ｋｂのフラグメントを含有する プラスミドである。ｐＳＵ１９のユニークなＳａｌＩおよびＳｍａＩ部位への連 結によって４ｋｂのプラスミドｐＫＡＤ３９を作成した（図９）。７．４ｋｂの ａｒｏＣａｒｏＣａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ５０を作成するために、１．６９ ｋｂのａｒｏＣフラグメントをｐＫＡＤ３９からＳａｌＩ／平滑末端化フラグメ ントとして単離し、等価な末端を有するように操作されたｐＫＡＤ４３ベクター へと連結した（図１０）。 Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株は１２．３＋／−２．２ｍＭのフ ェニルアラニンとフェニルラクテートを産生したが、これはＤ２７０４／ｐＫＤ １３６／ｐＫＡＤ４３のＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３と比べて最終 物質生産量において目ざましい増加である（図３）。Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６ ／ｐＫＡＤ５０はなおいくらかのシキメート−３−リン酸を蓄積したが、その総 蓄積量はＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ４３より少なかった。４８時間後 のＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０蓄積をＮＭＲにより測定すると、δ ３．２９（ｄｄ、１４、５Ｈｚ、１Ｈ）、δ４．０（ｄｄ、８、５Ｈｚ、１Ｈ） 、およびδ７．２５−７．４９（ｍ、５Ｈ）における共鳴でフェニルアラニンの 存在が示される。フェニル乳酸の共鳴は、δ２．８８（ｄｄ、１４、８Ｈｚ、１ Ｈ）、δ４．２７（ｄｄ、８、４Ｈｚ、１Ｈ）、およびδ７．２５−７．４９（ ｍ、５Ｈ）である。少量のＤＨＳもまた培養ブロス中に存在し、これはδ６．４ （ｄ、３Ｈｚ、１Ｈ）での共鳴で示される。阻害除去プラスミドにａｒｏＣを加 えた時に観察された最終産物の増収は、蓄積されたＥＰＳＰがシキメート−３− リン酸に転換される可能性を仮定すると、律速酵素としてのコリスミ酸シンター ゼの作用であるといえる。 さらに良くコリスミ酸シンターゼの役割を理解するために、ａｒｏＣ（ｐＫＡ Ｄ３９；図９）、ａｒｏＡａｒｏＣ、およびａｒｏＣａｒｏＬをＤ２７０４／ｐ ＫＤ１３６中に構築し、評価した。６．３９ｋｂのａｒｏＣａｒｏＡプラスミド ｐＫＡＤ４４（図１１）を、フランキングＰｓｔＩおよび平滑末端部位を有する ａｒｏＡフラングメントを単離することにより製作し、次いで等価な平滑末端部 位を含有するように操作したｐＫＡＤ３９ベクター中に連結した。５ｋｂのａｒ ｏＣａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ５１（図１２）はＳａｌＩ平滑末端フラグメン トとしてａｒｏＣを単離し、等価な部位を含有するように操作したｐＫＡＤ３１ ベクター中に連結した。図３から明らかなように、ｐＫＡＤ３９、ｐＫＡＤ４４ 、ｐｋＡＤ５１は、ａｒｏＡａｒｏＣａｒｏＬプラスミドｐＫＡＤ５０がＤ２７ ０４／ｐＫＤ１３６へと挿入された時の最終物質蓄積レベルに至らなかった。従 ってＤ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株が最終産物の生産量を最大に する最適な株であることが決定された。 この最適なＤ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株中のトランスケトラ ーゼの役割を決定するために、ＢａｍＨＩによる分解でプラスミドｐＫＡＤ１３ ６から遺伝子を除去し、次いで再連結してａｒｏＦｔｋｔプラスミドｐＫＡＤ４ ２を製作した（図１３）。Ｄ２７０４／ｐＫＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０の培養の結 果、多量のアセテートとラクテートが蓄積したがこれは細胞死を招いた。この問 題に対して蓄積培地のｐＨを４８時間のインキュベーションの間モニターし、必 要なときには５ＮのＮａＯＨで中和した。中性ｐＨに保持することによって、Ｄ ２７０４／ｐＫＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０の２４時間および４８時間の両時点でプ レフェン酸が高度に蓄積したが、この理山は恐らく中性ｐＨでのフェニルピルベ ートへの転位能が低いことによるものであろう。このように、Ｄ２７０４／ｐＫ ＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０とＤ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０とで共通 経路末端に成功裏にもたらされる炭素流の量を比較するために、フェニルアラニ ン、フェニル乳酸、およびプレフェン酸の総量を考察した。 図１４に示すように、Ｄ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０株によって 生産される最終産物の量はＤ２７０４／ｐＫＡＤ４２／ｐＫＡＤ５０株によって 生産される量よりも遥に多い。このことは、芳香族アミノ酸およびその誘導体へ と炭素サージをうまく向わせるためには、共通経路で利用可能な炭素レベルを上 昇させＤＡＨＰシンターゼ、ＤＨＱシンターゼ、シキメート・キナーゼ、ＥＰＳ Ｐシンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を増加させるた めにトランスケトラーゼの染色体コピーが余分に必要とされ、その結果意図する 最終産物へのサージを成功裏に指向することができることを示している。 ＮＭＲスペクトルによる細胞上清の分析の結果、ＤＨＱシンターゼ、シキメー ト・キナーゼ、ＥＰＳＰシンターゼ、およびコリスミ酸シンターゼが芳香族アミ ノ酸生合成の共通経路における代謝阻害剤であることが判明した。従前、シキメ ート・デヒドロゲナーゼが代謝阻害剤であるとして同定されていたが、これは培 地中でのシキメートの蓄積による人為結果であると考えられる。生物触媒的過程 によって生産される芳香族アミノ酸およびその誘導体の収率および純度の両者を 、大腸菌の２つのプラスミド系の利用によって向上させることができる。プラス ミドｐＫＡＤ１３６またはその機能上の等価物は芳香族アミノ酸生合成の共通経 路への炭素流増加をもたらす必須要件であって、一方プラスミドｐＫＡＤ５０ま たはその機能上の等価物は当該共通経路の終点へと炭素流のサージを確実に向け るための必須要件である。阻害除去遺伝子ａｒｏＢ、ａｒｏＬ、ａｒｏＡ、およ びａｒｏＣの導入時に観察される最終産物の純度の向上は、Ｄ２７０４／ｐＫＤ １３０ＡおよびＤ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０のＮＭＲデータにおい て容易に識別することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年６月２３日 【補正内容】 請求の範囲 １．大腸菌細胞形質転換体において、当該細胞に対し外因性の芳香族アミノ酸生 合成共通経路を経由して芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、当 該方法は、代謝可能な炭素源を含有する培地中で当該炭素源の代謝を促す条件下 で前記細胞形質転換体を培養する段階を包含するものであって、前記細胞形質転 換体は共通経路酵素種をコードする外因性ＤＮＡ配列を包含し、当該酵素種は、 基本的に次の酵素、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ 、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンターゼ、および コリスミ酸シンターゼからなるものである、芳香族化合物を生物触媒的に生産す る方法。 ２．細胞形質転換体が、トランスケトラーゼ酵素をコードする外因性ＤＮＡ配列 をさらに包含するものである、請求項１に記載の方法。 ３．一以上のリコンビナント・プラスミド・ベクターが、前記酵素種をコードす る外因性ＤＮＡ配列を包含するものである、請求項１に記載の方法。 ４．次の酵素種、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナーゼ、 ５−エノールピルヴォイル−シキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコリス ミ酸シンターゼをコードする構造遺伝子の発現向上を特徴とする、大腸菌形質転 換体。 ５．さらに次の酵素種、トランスケトラーゼおよび３−デオキシ−Ｄ−アラビノ −ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼの発現向上を特徴とする、請求項４ に記載の大腸菌形質転換体。 ６．炭素源から芳香族化合物を生物触媒的に生産する方法であって、当該方法は 、前記炭素源の代謝を促す条件下で代謝可能な炭素源を含有する培地中で請求項 ５に記載の細胞形質転換体を培養する段階を包含するものである方法。 ７．共通経路酵素種に対する構造遺伝子を含有するプラスミド構成体であって、 当該酵素種は基本的に３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメート・キナー ゼ、５−エノールピルヴォイル−シキメート−３−リン酸シンターゼ、およびコ リスミ酸シンターゼからなるものである、プラスミド構成体。 ８．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（エシエリキア）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ（コリネバクテリウム）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ（ブレヴィバクテリア ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ（アルスロバクター）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（バチ ルス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（シュードモナス）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ ｓ（ストレプトマイセス）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（スタフィロコッカ ス）、およびＳｅｒｒａｔｉａ（セラチア）の各属に属する原核生物からなる群 から選択され、次の酵素種、トランスケトラーゼ、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ −ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ、３−デヒドロキネート・シンター ゼ、シキメート・キナーゼ、５−エノールピルヴォイル−シキメート−３−リン 酸シンターゼおよびコリスミ酸シンターゼをコードする外因性構造遺伝子の発現 を特徴とする、原核生物細胞形質転換体。 ９．プラスミドｐＫＡＤ５０。 １０．大腸菌株Ｄ２７０４／ｐＫＡＤ１３６／ｐＫＡＤ５０。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (71)出願人 ジェネンコー インターナショナル，イン コーポレイテッド アメリカ合衆国・ニューヨーク州 14618・ロチェスター・サウス ウィント ン ロード 1870・フォー ケンブリッジ プレイス (72)発明者 フロスト，ジョン，ダブリュー. アメリカ合衆国・インディアナ州 47905・ラファイエット・ツイン オーク ス レーン 1805 (72)発明者 デル，クリスティー，エー. アメリカ合衆国・インディアナ州 47907・ウェスト ラファイエット・アパ ートメント 311・アンドリュー プレイ ス 101 (72)発明者 ドレイス，カレン，エム. アメリカ合衆国・インディアナ州 47905・ラファイエット・ツイン オーク ス レーン 1805 (72)発明者 ベリー，アラン アメリカ合衆国・ニューヨーク州 14468・ヒルトン・サンド ペブル レー ン 144

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ホスト細胞において、当該ホスト細胞に対し外因性の芳香族アミノ酸生合成 共通経路を経由して芳香族化合物の生合成を向上させる方法であって、当該方法 は、炭素源が中間体基質に作用する酵素種によって特徴付けられる多段階反応シ ーケンスによって芳香族化合物に転換されるものであって、かつ当該方法は、 当該ホスト細胞の培養上清を分析して蓄積した共通経路中間体基質を同定し、 これによって共通経路中の律速段階を同定する段階と、 当該ホスト細胞中に、前記経路における律速反応段階での前記同定された蓄積 中間体基質に作用する酵素種をコードするＤＮＡを含むリコンビナントＤＮＡを 導入し、当該ホスト細胞中の前記酵素種の発現を向上させる段階、 とを包含する、芳香族化合物の生合成向上方法。 ２．ホスト細胞が大腸菌株である、請求項１に記載の方法。 ３．同定された共通経路中間体が３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネー ト−７−リン酸（ＤＡＨＰ）、３−デヒドロシキメート、シキメート、およびシ キメート−３−フォスフェートである、請求項２に記載の方法。 ４．ホスト細胞が、次の酵素種、３−デヒドロキネート・シンターゼ、シキメー ト・キナーゼ、および５−エノールピルヴォイルシキメート−３−リン酸シンタ ーゼ（ＥＰＳＰシンターゼ）をコードするＤＮＡを包含するリコンビナントＤＮ Ａで形質転換されるものである、請求項３に記載の方法。 ５．ホスト細胞が、さらにコリスミ酸シンターゼをコードするＤＮＡを含有する リコンビナントＤＮＡで形質転換され、ホスト細胞中でコリスミ酸シンターゼの 発現を向上させるものである、請求項４に記載の方法。 ６．ホスト細胞が、次の酵素、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、３−デオキシ− Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ ）、３−デヒドロキネートシンターゼ（ＤＨＱシンターゼ）、シキメート・キナ ーゼ、５−エノールピルヴォイル−シキメート−３−リン酸シンターゼおよびコ リスミ酸シンターゼをコードするＤＮＡを包含するリコンビナントＤＮＡで形質 転換され、当該酵素のホスト細胞中における発現を向上させるものである、請求 項３に 記載の方法。 ７．ホスト細胞が前記酵素種をコードするＤＮＡを包含する一以上のリコンビナ ント・プラスミド・ベクターで形質転換される、請求項１に記載の方法。 ８．ホスト細胞が前記酵素種をコードするＤＮＡを包含する一以上のリコンビナ ント・プラスミド・ベクターで形質転換される、請求項６に記載の方法。 ９．請求項２に記載の方法によって調製した細胞形質転換体。 １０．請求項７に記載の方法によって調製した大腸菌形質転換体。 １１．次の酵素種、トランスケトラーゼ（ｔｋｔ）、３−デオキシ−Ｄ−アラビ ノ−ヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼ（ＤＡＨＰシンターゼ）、３−デ ヒドロキネートシンターゼ（ＤＨＱシンターゼ）、シキメート・キナーゼ、５− エノールピルヴォイル−シキメート−３−リン酸シンターゼおよびコリスミ酸シ ンターゼに対する外因性構造遺伝子の発現向上を特徴とする、大腸菌形質転換体 。 １２．炭素源から生物触媒的に芳香族化合物を生産する方法であって、当該方法 は、前記経路において前記炭素源の使用を促す条件の下、かつ前記炭素源の存在 下で、前記炭素源をその共通経路で利用することができる請求項１２の細胞形質 転換体を培養する段階を包含するものである方法。 １３．シキメート・キナーゼおよびＥＰＳＰシンターゼに対する構造遺伝子を包 含するプラスミド構造体。 １４．さらにコリスミ酸シンターゼに対する構造遺伝子を包含する、請求項１３ に記載のプラスミド構造体。 １５．プラスミドｐＫＡＤ５０。 １６．大腸菌株Ｄ２７０４／ｐＫＤ１３６／ｐＫＡＤ５０。 １７．ホスト細胞に対し外因的である芳香族アミノ酸生合成の共通経路から得ら れる化合物の生合成を当該経路中の反応を触媒するタンパクの発現を高めること によって向上させる方法において、次の段階： 当該ホスト細胞の培養上清中の蓄積された共通経路中間体を同定することによ って当該経路における律速段階を同定する段階と、 当該経路中の、前記同定された律速反応段階を触媒するタンパクの発現を向上 させる段階、 とを包含する改良がなされたものである方法。 １８．律速反応におけるタンパク触媒の発現が、ホスト細胞を形質転換して当該 タンパク触媒をコードする外因性遺伝子を発現させ、構造的にホスト細胞中での 当該タンパクの濃度を上昇させるものである、請求項１７に記載の改良。 １９．ホスト細胞が大腸菌株であって、当該ホスト細胞はシキメート・キナーゼ 、ＥＰＳＰシンターゼ、およびコリスミ酸・シンターゼに対する遺伝子を包含す る外因性構造遺伝子を発現するように形質転換されるものである、請求項１８に 記載の改良。 ２０．多段階の酵素によって仲介された多段階の反応段階を有する公知の生合成 経路を経由してホスト細胞中で化合物の生合成を向上させる方法であって、当該 方法は、 蓄積された経路中間体を同定することによって当該経路における律速段階を同 定する段階と、 当該ホスト細胞中にリコンビナントＤＮＡを導入し、前記律速反応段階を仲介 する酵素種の発現を向上させる段階、 とを包含するものである、化合物の生合成向上方法。