JPH104960A - 新しい血栓溶解タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 天然ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子
（ｔ−ＰＡ）と比較して、改良された繊維素溶解性を有
する活性血栓溶解タンパク質を提供する。 【解決手段】（ａ）ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列中、２
４５位のアミノ酸がＭｅｔ又はＶａｌであり、（ｂ）少
なくとも１個のＮ−結合性グリコシル化部位が、コンセ
ンサスＮ−結合性グリコシル化部位以外のものに修飾さ
れており、そして（ｃ）Ｇｌｙ−（−３）からＴｈｒ−
９１までの領域内で１個以上のアミノ酸が置換してい
る、ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列と実質的に同じペプチ
ド配列を有することを特徴とする、組織プラスミノーゲ
ン活性化因子型活性を有する血栓溶解タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、組織プラスミノー
ゲン活性化因子（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅ
ｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）型活性を有する新規な血栓溶
解タンパク質（ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅ
ｉｎｓ）（ｔ−ＰＡ）に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】本願発明のＤＮＡ分子によって得られる
組換えｔ−ＰＡタンパク質は、天然ヒトｔ−ＰＡと比較
して、改良された繊維素溶解性を有するように意図され
た活性血栓溶解剤である。これは、フィブリン（ｆｉｂ
ｒｉｎ）への親和性の増大、ｔ−ＰＡの阻害剤との反応
性の減少、血栓溶解速度の増加、繊維素溶解性の増大、
および／または、生物学的半減期の長期化として示され
る。また、本発明のＤＮＡ分子によって得られるタンパ
ク質は、天然ヒトｔ−ＰＡよりも、均質な形で容易に調
製し得ることも意図されている。薬物動力学的側面の全
体的な向上が、該タンパク質の目的とされている。

【０００３】天然ヒトｔ−ＰＡの構造は、約９１アミノ
酸残基のアミノ（Ｎ−）末端、二個のいわゆる“クリン
グル（Ｋｒｉｎｇｌｅ）”領域、および、セリンプロテ
アーゼ型カルボキシ末端ドメインから構成されるものと
して見ることができる。我々は、Ｎ末端が機能的役割、
とりわけ、フィブリン結合およびｉｎ ｖｉｖｏでの同
タンパク質の浄化、を行なういくつかのサブドメインを
含むことを見いだした。最近、天然Ｎ末端および最初の
クリングル領域を欠く、別の型のｔ−ＰＡの発見が報告
された（ヨーロッパ公開特許出願第０１９６９２０号
（１９８６年１０月８日公開）参照）。同報告によれ
ば、同不完全型ｔ−ＰＡは、天然ヒトｔ−ＰＡのＡｌａ
−１６０から開始しており繊維素溶解性の活性を有す
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】以下に詳細に述べるよ
うに、本発明は、天然ヒトｔ−ＰＡの双方のクリングル
領域を有するが、Ｎ末端領域内に修飾を含む、ヒトｔ−
ＰＡの新しい類似タンパク質を与えるものである。ある
態様においては、修飾はＮ末端の欠失を含み、第一のク
リングル領域は元の状態であり、また、Ｎ末端の欠失は
９４アミノ酸よりも大きくてはならない。ほとんどの態
様では、顕著に短い欠失および／または、アミノ酸置換
を含む。天然ヒトｔ−ＰＡの構造をより多く含むことに
より、本発明のタンパク質が、より徹底的に修飾したｔ
−ＰＡ類似物質よりも、天然ヒトｔ−ＰＡの望ましい生
物学的活性を選択的に保持し、より低い免疫原性を有す
ることが意図されている。従って、本発明のタンパク質
は、天然ヒトｔ−ＰＡおよび不完全型Ａｌａ−１６０
ｔ−ＰＡの双方、および他の修飾型ｔ−ＰＡに比較し
て、改善された繊維素溶解性および薬物動力学的側面を
有する。

【０００５】天然ヒトｔ−ＰＡのポリペプチド骨格は、
４個のコンセンサスＡｓｎ結合性グリコシル化部位も含
んでいる。これらの部位のうち二つ、すなわち、Ａｓｎ
１１７およびＡｓｎ４４８は、黒色腫由来哺乳動物細胞
由来のｔ−ＰＡにおいては、一般的にグリコシル化され
ている。Ａｓｎ１８４はしばしばグリコシル化されてお
り、Ａｓｎ２１８は一般的にグリコシル化されていな
い。黒色腫由来哺乳動物細胞由来のｔ−ＰＡ、例えばボ
ウズ細胞（Ｂｏｗｅｓ ｃｅｌｌｓ）も、ここでは天然
ヒトｔ−ＰＡと呼ぶ。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上述のよう
に、ｔ−ＰＡ型繊維素溶解活性を有する、新しいヒトｔ
−ＰＡ類似タンパク質に関するものである。本発明のタ
ンパク質は、ペプチド配列中の以下の部位に修飾を含む
点で、ヒトｔ−ＰＡと構造上異なる：（i）天然ｔ−Ｐ
Ａに存在するＡｓｎ結合性グリコシル化部位のうち３か
所まで；（ii）天然ｔ−ＰＡの成熟Ｎ末端９４アミノ酸
に対応する、該タンパク質のＮ末端領域内；及び／ある
いは（iii）Ａｒｇ２７５およびＩｌｅ２７６にかか
る、タンパク質分解切断部位。本発明のタンパク質のこ
れらの特徴は、以下に詳細に述べる。多様な修飾に関わ
らず、表１の一文字記号配列に示したアミノ酸番号を用
いるものとする。

【０００７】Ａ．Ｎ末端領域の修飾 本発明によれば、該タンパク質は、天然ヒトｔ−ＰＡと
比較して、Ｇｌｙ−（−３）あるいはＳｅｒ−１からＴ
ｈｒ−９１にわたるペプチド領域内の１−９４アミノ酸
の欠失によって特徴づけられる。例えば、一つの態様で
は、天然ｔ−ＰＡのＣｙｓ−５１からＡｓｐ−８７まで
が欠失している。別の二つの特異的な態様では、Ｃｙｓ
−６からＳｅｒ−５０まで、およびＣｙｓ−６からＩｌ
ｅ−８６までが、それぞれ欠失している。他の態様で
は、該タンパク質のＮ末端領域では、より変化の少ない
修飾が行われている。例えば、本発明のあるタンパク質
は、下に示す２以上の別々に分離した短い領域の内の、
一つ以上のアミノ酸の欠失あるいは置換を含む： Ｇｌｙ−（−３）からＴｈｒ−９１にわたるＮ末端領域
内の上記修飾および他の修飾については、以下で詳細に
述べる。

【０００８】Ｂ．Ｎ結合性グリコシル化部位の修飾 本発明のタンパク質誘導物質は、さらにＮ結合性炭水化
物部分は含まないか、あるいは天然ヒトｔ−ＰＡと比較
して、部分的にしかグリコシル化されていない。本明細
書で用いられる“部分的グリコシル化”とは、完全にグ
リコシル化された天然ヒトｔ−ＰＡよりも少ないＮ結合
性炭水化物部分を含むタンパク質を意味する。上記グリ
コシル化の欠失あるいは部分的にグリコシル化は、天然
ｔ−ＰＡ分子に存在する１個以上のコンセンサスＮ−結
合性グリコシル化認識部位でのアミノ酸置換あるいは欠
失によるものである。我々は、一個以上のＮ−結合性グ
リコシル化部位で上記修飾を具体的に行なった本発明の
多様なタンパク質は、ある場合にはより高い繊維素溶解
活性とともにｔ−ＰＡ型血栓溶解活性を保持し、天然ｔ
−ＰＡよりも均質な形で容易に生産でき、多くの場合天
然ｔ−ＰＡよりも長いｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を有す
ることを見い出した。

【０００９】Ｎ−結合性グリコシル化認識部位は、適当
な細胞性グリコシル化酵素によって特異的に認識される
トリペプチド配列から成ると現在は考えられている。上
記トリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−スレオニ
ン、あるいは、アスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかで
あり、Ｘは通常いかなるアミノ酸でもよい。ｔ−ＰＡペ
プチド配列中の上記トリペプチド配列の位置を、表１に
示す。グリコシル化認識部位の３個の位置のうち１個以
上での、多様なアミノ酸置換あるいは欠失は、該修飾配
列での非グリコシル化を引き起こす。例として、ある態
様においてはｔ−ＰＡのＡｓｎ１１７およびＡｓｎ１８
４が双方ともＴｈｒで置換され、別の態様ではＧｌｕで
置換された。少なくとも二箇所のＧｌｕ置換の場合に
は、得られた糖タンパク質（Ｇｌｎ１１７ Ｇｌｎ１８
４）は、天然ｔ−ＰＡの場合のように２箇所あるいは３
箇所のＮ−結合性炭水化物部分を有するのではなく、た
だ一個所の同部分（Ａｓｎ４４８）を含むはずである。
上と同等のＡｓｎ４４８モノグリコシル化された類似糖
タンパク質は、１１７位および１８４位の他のアミノ酸
との置換および／または、それぞれのグリコシル化認識
部位内の他の位置における１個以上のアミノ酸の欠失あ
るいは置換、例えば、上述の、Ｓｅｒ１１９およびＳｅ
ｒ１８６、および／または一個所以上のトリペプチド部
位の“Ｘ”部位における置換、あるいはより望ましくは
欠失によって、調製されるであろうことは、当業者には
理解されるであろう。他の態様においては、１１７，１
８４，および４４８位のＡｓｎがＧｌｎと置換されてい
る。得られた誘導物質は、天然ｔ−ＰＡの場合のような
２個所あるいは３個所のＮ−結合性炭水化物部分を含む
のではなく、同部分を全く有さないはずである。別の態
様では、潜在的なグリコシル化部位が独立に修飾され、
例として、一つの現在推奨される態様においては１１７
位のＡｓｐが、別の態様では１８４位のＡｓｐが、さら
に別の態様では４４８位のＡｓｐが、例えばＧｌｎと個
々に置換されている。本発明は、上記のような、非グリ
コシル化、モノグリコシル化、ジグリコシル化、および
トリグリコシル化ｔ−ＰＡ変異体を含む。

【００１０】本発明の多様な態様に見られる、３個所の
コンセンサスＮ−結合性グリコシル化配列、Ｒ¹，Ｒ²，
およびＲ³の１個所以上での修飾例を、以下に示す： −，−−，および−−−はペプチド結合 ＊はアミノ酸 ＵはＡｓｎ，ＴｈｒあるいはＳｅｒ以外のいずれかのア
ミノ酸 ＶはＡｓｎ以外のいずれかのアミノ酸、あるいはペプチ
ド結合 ＷはＳｅｒ以外のいずれかのアミノ酸、あるいはペプチ
ド結合 ＸはＧｌｙ以外のいずれかのアミノ酸、あるいはペプチ
ド結合 ＹはＡｒｇ以外のいずれかのアミノ酸、あるいはペプチ
ド結合 ＺはＴｈｒあるいはＳｅｒ以外のいずれかのアミノ酸、
あるいはペプチド結合 ｗｔは野性型、すなわち、ミュータジェネシス前

【００１１】Ｃ．Ａｒｇ−２７５／Ｉｌｅ−２７６切断
部位の修飾 本発明によれば、変異体は、Ａｒｇ−２７５の欠失ある
いはＡｒｇと他のアミノ酸との置換、望ましくはＬｙｓ
あるいはＨｉｓ以外のアミノ酸との置換によって、Ａｒ
ｇ−２７５とＩｌｅ−２７６にかかるタンパク質分解切
断部位が任意に修飾される。Ｔｈｒは、本発明の多様な
態様において、Ａｒｇ−２７５に対する現在特に望まし
い置換アミノ酸である。天然ｔ−ＰＡのＡｒｇ−２７５
におけるタンパク質分解切断によって、本分野では知ら
れている、いわゆる「２本鎖」分子が得られる。上記切
断部位での修飾によって特徴づけられる本発明のタンパ
ク質は、切断部位修飾がない対応するタンパク質より
も、均質の形でより容易に産生され、また、おそらくよ
り重要なことであるが、改善された繊維素溶解性および
薬物動力学的特徴を有するでであろう。

【００１２】上記のように、本発明は、ヒトｔ−ＰＡに
関連した一群の新しい血栓溶解タンパク質を与える。こ
の群は、数種のタンパク質を含む。

【００１３】ひとつの態様では、該タンパク質は、ヒト
ｔ−ＰＡのペプチド配列と実質的に同じペプチド配列
で、その中でＡｒｇ−２７５が欠失しているか、あるい
は他のアミノ酸、望ましくはリジンあるいはヒスチジン
以外のもの、と置換されており、少なくとも一個所のコ
ンセンサスＡｓｎ−結合性グリコシル化部位が欠失して
いるか、コンセンサスＡｓｎ−結合性グリコシル化配列
以外のものになるように修飾される。本発明の典型的な
タンパク質は、以下の表１に示されている 。ここで用
いる「ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列と実質的に同等なペ
プチド配列を特徴とする」という表現は、ヒトｔ−ＰＡ
のペプチド配列は、あるいは、ヒトｔ−ＰＡをコードす
るＤＮＡ配列あるいは厳しいハイブリッド形成条件下で
同配列にハイブリッドし得るＤＮＡ配列によってコード
されるペプチド配列を意味する。上記のように、本発明
のタンパク質は、ここに明示する多様な修飾あるいは修
飾の組み合わせによって特徴づけられるｔ−ＰＡ類似体
を含み、他の変異、例えば、アリル変異あるいは、上記
タンパク質をコードするＤＮＡ（発明の修飾以前）がヒ
トｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ配列と厳格な条件下でハ
イブリッド形成し得る限り、依然として繊維素溶解活性
を保存するような、アミノ酸のさらなる欠失、置換、あ
るいは挿入をも含む。

【００１４】

【表１】 ＪはＡｒｇ以外、望ましくはＡｒｇ，ＨｉｓあるいはＬ
ｙｓ以外のアミノ酸、Ｒ¹，Ｒ²，Ｒ³はペプチド結合、
アミノ酸、ジペプチドあるいはトリペプチドから成る群
から独立に選択され、Ｒ¹，Ｒ²，およびＲ³のうち少な
くとも一つはコンセンサスＮ結合性グリコシル化配列以
外のものである；“−”，“−−”，“−−−”はペプ
チド結合を表わす。

【００１５】第２の態様においては、該タンパク質は、
Ｇｌｙ−（−３）からＴｈｒ−９１にわたるＮ末端領域
内での１個以上のアミノ酸が欠失し、また（ａ）１箇所
以上のＡｓｎ−結合性グリコシル化部位が任意に欠失さ
れ、もしくはコンセンサスＡｓｎ結合性グリコシル化部
位以外のものになるように修飾され、および／または
（ｂ）Ａｒｇ−２７５が任意に欠失されるか他のアミノ
酸、望ましくはリシンあるいはヒスチジン以外に置換さ
れている、ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列と実質的に同等
のペプチド配列によって特徴づけられる。本態様の典型
的なタンパク質を、以下に示す。

【００１６】Ｎ末端欠失を有するタンパク質の実例 以下のタンパク質は、Ｒ¹，Ｒ²，およびＲ³はｗｔトリ
ペプチド配列を示すがＮ末端（Ｇｌｙ−（−３）からＴ
ｈｒ−９１）が次の配列と置換されている、表１に示さ
れたペプチド配列を有するものである： “−”はアミノ酸欠失部位を示す

【００１７】本態様は、Ｇｌｙ−（−３）からＴｈｒ−
９１の領域から１から約９４アミノ酸が欠失し、１箇所
以上のＡｓｎ−結合性グリコシル化部位が欠失している
か、もしくは前述のようにコンセンサスＡｓｎ−結合性
グリコシル化配列以外の配列に修飾されている、タンパ
ク質の亜属を含む。またＧｌｙ−（−３）からＴｈｒ−
９１までの領域から１から約９４アミノ酸が欠失し、Ａ
ｒｇ−２７５が欠失しているか他のアミノ酸、望ましく
はリシンあるいはヒスチジン以外のものと置換されてい
る、化合物の亜属も含まれる。本態様に含まれる、さら
に別の亜属は、Ｇｌｙ−（−３）からＴｈｒ−９１の領
域内での１から約９４アミノ酸の欠失、１箇所以上のＡ
ｓｎ−結合性グリコシル化部位の欠失あるいは修飾（例
えば７頁の表参照）、およびＡｒｇ−２７５の欠失ある
いはＡｒｇ−２７５と他のアミノ酸との置換によって特
徴づけられる、上記亜属の典型的なタンパク質は、以下
の表２および表２．５に示される。

【００１８】本態様はまた、Ｎ末端領域の欠失が、Ｓｅ
ｒ−１からＳｅｒ−５０までの領域中の、１から約４５
アミノ酸の欠失から成るタンパク質の亜属も含む。また
Ｓｅｒ−１からＳｅｒ−５０までの領域中で１から約４
５アミノ酸が欠失し、１箇所以上のグリコシル化領域が
前述のように修飾されている、タンパク質の亜属も含ま
れる。更に別の亜属は、Ｓｅｒ−１からＳｅｒ−５０ま
での領域中での１から約４５アミノ酸の欠失を有し、Ａ
ｒｇ−２７５が欠失しているか他のアミノ酸と置換され
ているタンパク質から成る。さらにまた、Ｓｅｒ−１か
らＳｅｒ−５０までの領域内での１から約４５アミノ酸
の欠失を有し、（ａ）１箇所以上のグリコシル化部位、
および（ｂ）Ａｒｇ−２７５、の双方が前述のように任
意に修飾されている亜属が含まれている。これらの亜属
の典型的なタンパク質は、表２，表２．５と同様、以下
の表３に示されている。

【００１９】

【表２】

【表３】 ＊はｗｔＮ−末端と比較して少なくとも１アミノ酸が異
なるＮ末端領域を示し、その具体例は以下に示す表２．
５および表３−５と６−Ｂに示される；“＃”はペプチ
ド結合あるいはアルギニン（Ｒ）以外のアミノ酸を表
す；“−”はペプチド結合を示す；ＵはＡｓｎ，Ｔｈ
ｒ，あるいはＳｅｒ以外のアミノ酸；Ｗはペプチド結合
あるいは、Ｓｅｒ以外のアミノ酸；Ｚはペプチド結合あ
るいは、ＴｈｒあるいはＳｅｒ以外のアミノ酸；∧はい
ずれかのアミノ酸；そしてｗｔは野生型を示す。

【００２０】

【表４】

【表５】

【００２１】本発明の特異的なタンパク質は、表２の化
合物番号、次にＮ末端領域の名称、そして２７５位の明
示からなる、３部分名称によって命名される。例えば、
化合物番号２−１１／Ｎ−６／Ａｒｇは、３グリコシル
化部位が欠失し（“２−１１”，表２参照）、Ｃ−３６
からＣ−４３までが欠失し（Ｎ末端＃Ｎ−６）、そして
Ａｒｇ−２７５が保持されているタンパク質を表す。

【００２２】 表３：Ｓｅｒ−１からＳｅｒ−５０までの領域中に１−４５アミノ酸の欠失を有 し、（ａ）Ａｒｇ−２７５と（ｂ）少なくとも１カ所のＮ−結合性グリコシル化部位の一方あるいは双方が修飾されている、典型的なタンパク質 （一般的配列は表１参照） 具体的なタンパク質は、表２で定義されたものと同様で
あるが、以下のＮ末端で野生型（ｗｔ）配列のＧｌｙ−
（−３）からＴｈｒ−９１を置換したものである：

【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【００２３】表３に示される、修飾されたＮ末端領域を
参照して、１個以上のアミノ酸が欠失されるであろうこ
とは、理解されるべきである。多数のアミノ酸が欠失す
る場合は、それらは互いに隣接しているか、あるいは１
個以上の他のアミノ酸によって分離されている。上記の
ようなＮ末端領域を有する化合物を示す際に、欠失して
いるアミノ酸の数を“ｎ”として、“Δｎ”によって欠
失の大きさを示す。例えば、表３に示されるように１ア
ミノ酸が欠失したＮ末端＃２４は、“Ｎ−２４Δ１”と
呼ばれる。２個のアミノ酸、例えばＳ−１およびＹ−２
が欠失している場合、Ｎ末端は“Ｎ−２４Δ２”のよう
に呼ぶ。欠失の組み合わせがある場合、例えば、Ｓ−
１，Ｙ−２，およびＩ−５が欠失している場合には、Ｎ
末端は”Ｎ−２４Δ２，Ｎ−２８Δ１”とする。表２．
５に続く本文中に示したように、特異的な化合物は、表
２の化合物番号、それに続くＮ末端領域の名称＃、例え
ば表２．５のもの、および次に２７５位の状態の明示か
ら成る３要素の記号によって表される。従って、化合物
２−２６／Ｎ−２４Δ２，Ｎ−２８Δ１／−は、３箇所
のグリコシル化部位全て；Ｒ−２７５；Ｓ−１，Ｙ−
２，およびＩ−５が欠失しているタンパク質を示す。

【００２４】本態様はさらに、Ｃｙｓ−５１からＴｈｒ
−９１までの領域から、１から約４１アミノ酸が欠失し
ているタンパク質の亜属を含む。本亜属のタンパク質
は、Ａｒｇ−２７５が欠失するか、あるいは、別のアミ
ノ酸、望ましくはリシンあるいはヒスチジン以外のアミ
ノ酸との置換などのように任意に修飾されうる。本亜属
のタンパク質は、Ａｒｇ−２７５における修飾の代わり
として、あるいは、Ａｒｇ−２７５における修飾に加え
て、（ａ）前述のように、１箇所以上のＮ−結合性グリ
コシル化部位をなくし、および／または、（ｂ）Ｇｌｙ
−（−３）からＳｅｒ−５０までの領域内での１個以上
のアミノ酸を欠失させるように、修飾し得る。本亜属の
典型的なタンパク質は、表２および表３に示されるもの
と同様であるが、下の表４に示されるようなＮ末端領域
を含む。

【００２５】 表４：Ｃｙｓ−５１からＴｈｒ−９１までの領域内の１−４１アミノ酸の欠失を有する典型的なタンパク質 （一般的配列は表１参照） 具体的なタンパク質は、表２で定義されたものと同様で
あるが、以下のＮ末端領域が野生型（ｗｔ）配列のＧｌ
ｙ−（−３）からＴｈｒ−９１までと置換されている：

【表１０】

【表１１】

【表１２】

【表１３】

【表１４】

【００２６】上の表４を参照して、いくつかのタンパク
質亜属が明示されることに注目すべきである。例えばＣ
ｙｓ−５１からＡｓｐ−８７までで、１−３７アミノ酸
の欠失（独立に、連続的に、あるいは組み合わせて）を
含むタンパク質が示され、同様に、Ｃｙｓ−５１からＡ
ｓｐ−８７までで１−３７アミノ酸の欠失を含み、Ｇｌ
ｙ−（−３）からＣｙｓ−５１までの領域内で一個以上
のアミノ酸の欠失を含むタンパク質も示される（Ｎ−７
６参照）。Ｎ末端Ｎ−７６からＮ−１１１までの中から
選択されたＮ末端を含む化合物を参照して、一個以上の
アミノ酸が欠失していてもよいことは、理解されるべき
である。例えば、１アミノ酸が欠失しているＮ−７７
は、表４に示されるように、“Ｎ−７７Δ１”として示
される。６アミノ酸の欠失、例えば、Ｓ−５２からＦ−
５７の欠失の場合は、Ｎ末端は“Ｎ−７７Δ６”と呼ば
れる、など。特異的タンパク質は、表２および表３に続
いて示されたように表される。３箇所のグリコシル化部
位およびＡｒｇ−２７５が欠失している例を以下に示
す：化合物の名称 欠 失 ２−２６／Ｎ−７５／− Ｃ−５１からＤ−８７ ２−２６／Ｎ−７４Δ／６／− Ｃ−５１からＣ−５６ ２−２７／Ｎ−７４Δ１，Ｎ−７６Δ６１／− Ｃ−５１，Ｅ−５３から Ｎ−５８

【００２７】グリコシル化領域に修飾はないが、多様な
欠失を含む化合物の例を以下に示す：化合物の名称 修飾：欠失 ２−０／Ｎ−４２４／Ａｒｇ Ｐ−４７からＳ−５０ ２−０／Ｎ−４２５／Ａｒｇ Ｌ２６およびＶ−３１ ２−０／Ｎ−４２６／Ａｒｇ Ｖ−２５，Ｌ−２６，Ｖ−３１ およびＥ−３２ ２−０／Ｎ−４２７／Ａｒｇ Ｑ−１７，Ｌ−２６および Ｖ−３１ ２−０／Ｎ−４２８／Ａｒｇ Ｙ−１５，Ｑ−１６，Ｖ−２５ ，Ｌ−２６，Ｖ−３１および Ｅ−３２ ２−０／Ｎ−６３Δ２，Ｎ−９２Δ３／Ａｒｇ Ｒ−４０，Ａ−４１，Ｙ−６７ ，Ｆ−６８およびＳ−６９ ２−０／Ｎ−６３Δ１，Ｎ−９３Δ２／Ａｒｇ Ｒ−４０，Ｙ−６７およびＦ− ６８ ２−０／Ｎ−６３Δ１，Ｎ−９２Δ１／Ａｒｇ Ｒ−４０およびＹ−６７

【００２８】上と同じ欠失を有するが、最初のＮ−結合
性グリコシル化部位でも修飾をうけ、ここではＡｓｎ−
１１７をＧｌｎで置換した化合物の例を下に示す： ２−１／Ｎ−４２４／Ａｒｇ ２−１／Ｎ−４２５／Ａｒｇ ２−１／Ｎ−４２６／Ａｒｇ ２−１／Ｎ−４２７／Ａｒｇ ２−１／Ｎ−４２８／Ａｒｇ ２−１／Ｎ−６３Δ２，Ｎ−９２Δ３／Ａｒｇ ２−１／Ｎ−６３Δ１，Ｎ−９２Δ２／Ａｒｇ ２−１／Ｎ−６３Δ１，Ｎ−９２Δ１／Ａｒｇ

【００２９】上記と同様の欠失を有するが、３箇所のグ
リコシル化部位全ても修飾され、ここではＡｓｎがＧｌ
ｎで置換されている化合物の例を以下に示す： ２−７／Ｎ−４２４／Ａｒｇ ２−７／Ｎ−４２５／Ａｒｇ ２−７／Ｎ−４２６／Ａｒｇ ２−７／Ｎ−４２７／Ａｒｇ ２−７／Ｎ−４２８／Ａｒｇ ２−７／Ｎ−６３Δ２，Ｎ−９２Δ３／Ａｒｇ ２−７／Ｎ−６３Δ１，Ｎ−９２Δ２／Ａｒｇ ２−７／Ｎ−６３Δ１，Ｎ−９２Δ１／Ａｒｇ

【００３０】以上のように、本態様は、Ｇｌｙ−（−
３）からＴｈｒ−９１までの領域内に約２０アミノ酸よ
り少ない、１個以上の欠失を含むタンパク質の亜属をさ
らに含む。この亜属のタンパク質は、Ａｒｇ−２７５お
よび／または、１箇所以上のＡｓｎ−結合性グリコシル
化部位も修飾されていてもよい。本亜属の典型的なタン
パク質は表２から表４に示されたものと同様であるが、
野生型Ｎ末端領域のかわりに、以下の表５に示されるよ
うなＮ末端を含む。本亜属のさらに別の典型的な化合物
も、３要素記号表示によって上に示されている。

【００３１】該タンパク質の第３の態様は、Ｇｌｙ−
（−３）からＴｈｒ−９１までの領域内で１−９４個の
アミノ酸が、他のアミノ酸と置換されている。ヒトｔ−
ＰＡのペプチド配列と実質的に同等のペプチド配列によ
って特徴づけられる。この態様は、上述のＮ末端領域内
の１個以上のアミノ酸の置換、上述のＡｒｇ−２７５の
修飾によって特徴づけられる化合物の亜属を含む。ま
た、上述のＮ末端領域内の１個以上のアミノ酸の置換、
および、上述のような１箇所以上のコンセンサスＡｓｎ
−結合性グリコシル化部位の修飾によって特徴づけられ
る化合物の亜属も含む。本態様のさらに別の亜属は、Ｎ
末端領域内の１個以上のアミノ酸の置換、および、前述
のような、Ａｒｇ−２７５および１箇所以上のＮ−結合
性グリコシル化部位の双方の修飾によって特徴づけられ
る。本態様の一つの局面において、アミノ酸置換は、Ｇ
ｌｙ−（−３）からＳｅｒ−５０までの領域内であり、
Ａｒｇ−２７５および／または１箇所以上のＮ−結合性
グリコシル化部位における修飾を有する、あるいは、有
さない。別の局面においては、アミノ酸置換は、Ｃｙｓ
−５１からＴｈｒ−９１までの領域内であり、上と同様
に、Ａｒｇ−２７５および／または、１箇所以上のＮ−
結合性グリコシル化部位における修飾を有する、あるい
は有さない。さらに別の局面では、以下に示す領域１箇
所以上の中で、１個から約１１個の、望ましくは、１個
から約６個のアミノ酸が置換され、また上と同様に、他
の上述の修飾をうけている、あるいは、うけていない：

【００３２】本態様のさらに別の局面では、置換は次の
領域のうち１箇所以上に存在する：Ｒ−７からＳ−２
０，Ｗ−２１からＹ−３３，Ｎ−３７からＱ−４２，お
よび、Ｈ−４４からＳ−５０。本態様のまた別の局面で
は、Ｎ末端領域が、上と同様に、１箇所以上の上で定義
された領域内で、１個から約１１個、望ましくは、１個
から約６個のアミノ酸置換によって修飾され、さらに、
１個から９３個の、望ましくは１個から約４５個の、よ
り望ましくは１個から１５個のアミノ酸の欠失によって
修飾される。

【００３３】アミノ酸置換の具体例は、以下の表６−Ａ
に示し、典型的なタンパク質は表６−Ｂに示す。Ｒ−４
０，Ａ−４１およびＱ−４２に対する置換では、ＳがＲ
−４０のために望ましい置換であり、Ａ−４１およびＱ
−４２に対しては、それぞれＶおよびＬが望ましい置換
である。表６ＡのＲ−４０，Ａ−４１，およびＱ−４２
について明示された置換を具体化する本発明のタンパク
質は、それ自体、あるいは本態様の他の局面および亜属
でのように、他の置換、および／または、Ｎ末端領域に
おける欠失、および／または、Ｒ−２７５および／また
は少なくとも１箇所のグリコシル化部位における修飾と
組み合わせであることが現在望ましい。我々のタンパク
質が欠失でなく、置換によって修飾されている限りで
は、我々のタンパク質は、天然ｔ−ＰＡの立体構造の多
くを保持し、また、天然ｔ−ＰＡの望ましい生物学的活
性の多くを選択的に保持することを意図されている。

【００３４】

【表１５】

【表１６】

【００３５】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【００３６】アミノ酸置換によって具体化される本発明
のタンパク質は、前述のように３要素記号によって呼ば
れうる。１個以上のｗｔアミノ酸が置換されているであ
ろうことは、当然理解されるべきである。上述のような
Ｎ末端領域を有する化合物の命名の際に、我々は、
“ｎ”を例えば、表６−Ａに示されたような（しかし制
限されるものではない）置換アミノ酸と、置換されたア
ミノ酸の数として、“Ｓｎ”によって置換数を示す。例
えば、Ｎ末端領域＃Ｎ−１２２Ｓ１が、表６−Ｂに示さ
れたＮ末端領域１２２を表し、Ｎ末端領域＃Ｎ−１２２
Ｓ４は、Ｓ−１がＧと置換され、続く３個のｗｔアミノ
酸が別のアミノ酸と置換されているＮ末端領域を表す。
多数のアミノ酸置換を含む、本態様のタンパク質は、以
下のように、特異的置換を示す一連のＮ末端領域名によ
って表される：Ａｓｎ−１１７がＧｌｕと置換され、Ａ
ｒｇ−２７５が、Ｔｈｒと置換されている、多数のＮ末
端領域の置換を含む化合物の具体例： 置換： 化合物＃ ｗｔ 置換アミノ酸 ２−１６／Ｎ−１５９，Ｎ−１６１／Ｔｈｒ Ｓ−３８ Ｐ Ｒ−４０ Ｓ ２−１６／Ｎ−１６１，Ｎ−１６３／Ｔｈｒ Ｒ−４０ Ｓ Ｑ−４２ Ｌ ２−１６／Ｎ−１６１，Ｎ−１７２／Ｔｈｒ Ｒ−４０ Ｓ Ｋ−４９ Ｔ ２−１６／Ｎ−１３８，Ｎ−１４２／Ｔｈｒ Ｑ−１７ Ｌ Ｗ−２１ Ｙ ２−１６／Ｎ−１３３，Ｎ−１３８／Ｔｈｒ Ｑ−１２ Ｌ Ｑ−１７ Ｌ ２−１６／Ｎ−１２８，Ｎ−１３３／Ｔｈｒ Ｒ−７ Ｔ Ｑ−１２ Ｌ ２−１６／Ｎ−１３１，Ｎ−１６２／Ｔｈｒ Ｋ−１０ Ｔ Ａ−４１ Ｖ ２−１６／Ｎ−１６５，Ｎ−１７０／Ｔｈｒ Ｈ−４４ Ｓ Ｋ−４９ Ｄ ２−１６／Ｎ−１４３，Ｎ−１４６／Ｔｈｒ Ｌ−２２ Ｅ Ｖ−２５ Ｙ ２−１６／Ｎ−１７３，Ｎ−１６５／Ｔｈｒ Ｅ−３２ Ｑ Ｈ−４４ Ｓ ２−１６／Ｎ−１６５，Ｎ−１７２／Ｔｈｒ Ｈ−４４ Ｓ Ｋ−４９ Ｔ ２−１６／Ｎ−１４８，Ｎ−１５１／Ｔｈｒ Ｒ−２７ Ｓ Ｒ−３０ Ｓ ２−１６／Ｎ−１４３，Ｎ−１５３／Ｔｈｒ Ｌ−２２ Ｅ Ｅ−３２ Ｓ ２−１６／Ｎ−１６１，Ｎ−１７０／Ｔｈｒ Ｒ−４０ Ｓ Ｋ−４９ Ｄ ２−１６／Ｎ−１５３，Ｎ−１６１／Ｔｈｒ Ｅ−３２ Ｓ Ｒ−４０ Ｓ ２−１６／Ｎ−１２９，Ｎ−１３１／Ｔｈｒ Ｄ−８ Ｎ Ｋ−１０ Ｔ ２−１６／Ｎ−１３１，Ｎ−１４３／Ｔｈｒ Ｋ−１０ Ｔ Ｌ−２２ Ｅ ２−１６／Ｎ−１２８，Ｎ−１３１／Ｔｈｒ Ｒ−７ Ｔ Ｋ−１０ Ｔ ２−１６／Ｎ−１２８，Ｎ−１６１／Ｔｈｒ Ｒ−７ Ｔ Ｒ−４０ Ｓ ２−１６／Ｎ−１７５，Ｎ−１７６／Ｔｈｒ Ｌ−６６ Ｋ Ｙ−６７ Ａ ２−１６／Ｎ−１７６，Ｎ−１７８／Ｔｈｒ Ｙ−６７ Ａ Ｆ−６８ Ｇ ２−１６／Ｎ−１７７，Ｎ−１７０／Ｔｈｒ Ｙ−６７ Ｇ Ｄ−７０ Ｆ ２−１６／Ｎ−１７７，Ｎ−１７９／Ｔｈｒ Ｙ−６７ Ｇ Ｆ−６８ Ａ ２−１６／Ｎ−１８１，Ｎ−１８２／Ｔｈｒ Ｐ−５４ Ｇ Ｋ−８２ Ｈ ２−１６／Ｎ−２０２，Ｎ−１８３／Ｔｈｒ Ｒ−５５ Ｓ Ｋ−８２ Ｑ ２−１６／Ｎ−１８５，Ｎ−１８４／Ｔｈｒ Ｅ−７７ Ｔ Ｋ−８２ Ｎ ２−１６／Ｎ−１８４，Ｎ−１８６／Ｔｈｒ Ｋ−８２ Ｎ Ｄ−８７ Ｈ ２−１６／Ｎ−１８７，Ｎ−１８６／Ｔｈｒ Ｒ−５５ Ｔ Ｄ−８７ Ｈ ２−１６／Ｎ−１８８，Ｎ−２０１／Ｔｈｒ Ｌ−６６ Ｎ Ｄ−７０ Ｓ ２−１６／Ｎ−１８９，Ｎ−１９０／Ｔｈｒ Ｒ−５５ Ｈ Ｎ−５８ Ｖ ２−１６／Ｎ−１９１，Ｎ−１８９／Ｔｈｒ Ｅ−５３ Ｔ Ｒ−５５ Ｈ ２−１６／Ｎ−１９３，Ｎ−１９２／Ｔｈｒ Ｋ−４９ Ｈ Ｅ−５３ Ｑ ２−１６／Ｎ−１６１，Ｎ−１７５／Ｔｈｒ Ｒ−４０ Ｓ Ｌ−６６ Ｋ ２−１６／Ｎ−１４８，Ｎ−１９４／Ｔｈｒ Ｒ−２７ Ｓ Ｆ−６８ Ｈ ２−１６／Ｎ−１３１，Ｎ−１８４／Ｔｈｒ Ｋ−１０ Ｔ Ｆ−６８ Ｈ ２−１６／Ｎ−１７４，Ｎ−１９５／Ｔｈｒ Ｄ−８ Ｎ Ｆ−６８ Ｉ ２−１６／Ｎ−１４４，Ｎ−１９５／Ｔｈｒ Ｒ−２３ Ｇ Ｆ−６８ Ｉ ２−１６／Ｎ−１５１，Ｎ−１９６／Ｔｈｒ Ｒ−３０ Ｓ Ｆ−６８ Ｐ ２−１６／Ｎ−１６１，Ｎ−１９８／Ｔｈｒ Ｒ−４０ Ｓ Ｓ−６９ Ｉ ２−１６／Ｎ−１９９，Ｎ−２００／Ｔｈｒ Ｑ−４２ Ｌ Ａ−６５ Ｅ ２−１６／Ｎ−１６１，Ｎ−１９７／Ｔｈｒ Ｒ−４０ Ｓ Ｆ−６８ Ｒ

【００３７】特別の関心が持たれる一つの亜属は、Ｇｌ
ｙ−（−３）からＬ−６６までの１個以上のアミノ酸の
任意の欠失、および／あるいは、任意の置換を有し、１
箇所以上のグリコシル化部位および／あるいはＡｒｇ−
２７５における前述のような修飾を含むか、あるいは含
まないＹ−６７からＳ−６９までの１個以上の置換によ
って特徴化される。

【００３８】本発明の一つの局面において、該タンパク
質は、哺乳類糖タンパク質に特徴的な、少なくとも一つ
のいわゆる“複合炭水化物”糖部分を含む。以下に詳し
く例示するように、上記のような“複合炭水化物”糖タ
ンパク質は、哺乳動物宿主細胞中で望みのポリペプチド
配列をコードするＤＮＡ分子を発現させることによって
産生し得る。適当な哺乳動物宿主細胞および、形質転
換、培養、増幅、スクリーニング、および産物産生と精
製の方法は、本分野で既知である。例えば、ゲシング
（Ｇｅｔｈｉｎｇ）およびサムブルック（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ），Ｎａｔｕｒｅ ２９３：６２０−６２５（１９
８１），あるいは、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）他，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌｅｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ５（７）：１７５０−１７５９（１９８
５）、あるいは、ハウレー（Ｈｏｗｌｅｙ）他の，米国
特許第４，４１９，４４６号参照。

【００３９】本発明のさらに別の局面は、各々の炭水化
物部分が、昆虫細胞産生糖タンパク質に特徴的な初期ド
リコール結合性オリゴサッカライトのプロセッシングを
うけた型であって、哺乳類由来ｔ−ＰＡを含む哺乳動物
由来糖タンパク質に特徴的な“複合炭水化物”置換基で
はない、上で定義されたｔ−ＰＡ変異体に関するもので
ある。上記昆虫細胞型グリコシル化は、ここでは簡単の
ために“高マンノース”炭水化物と呼ぶ。本開示の目的
のために、複合体および高マンノース炭水化物は、コル
ンフェルト（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：６３１−６４（１９８５）に定
義されたものとする。本発明による“高マンノース”変
異体は、少なくとも１箇所の使用されるＮ−結合性グリ
コシル化部位を含む上述のような変異体ポリペプチド骨
格によって特徴づけられる。上記変異体は、該変異体を
コードするＤＮＡ配列の、昆虫宿主細胞内における発現
によって産生しうる。本発明の本局面を実施する際に有
用な、適当な昆虫宿主細胞および、形質転換／形質導
入、昆虫細胞培養、スクリーニングおよび産物産生と精
製の材料と方法は、本分野で既知である。本発明の本局
面の変異体は、炭水化物部分の末端アシル酸あるいはガ
ラクトース置換基、あるいは、哺乳動物由来糖タンパク
質に特有の他のタンパク質修飾を含まないという点で、
上記のように産生された糖タンパク質は天然ｔ−ＰＡと
も、哺乳動物細胞内で組み換え工学技術によって前述の
ように産生されたｔ−ＰＡとも異なる。

【００４０】Ｎ−結合性炭水化物部分を全く含まない本
発明のタンパク質も、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母あ
るいは細菌宿主細胞、そして、現在望ましいとされてい
る真核宿主細胞中で、例えば表１の化合物１−６から１
−１１などの、望みの変異体をコードするＤＮＡ分子を
発現させることによって産生できる。上に示したよう
に、適当な哺乳動物宿主細胞および昆虫宿主細胞、さら
に適当な酵母宿主細胞および細菌宿主細胞、また、本発
明の本局面を実施する際に有用な形質転換／形質導入、
細胞培養、スクリーニングおよび産物産生と精製の方法
および材料もまた、本分野では知られている。

【００４１】さらに、本分野の一般的な技術に通じた者
には明らかなように、本発明はまた、Ｇｌｙ−₃あるい
はＳｅｒ₁からＴｈｒ₉₁までの域内のアミノ酸欠失によ
るのではなく、同領域、特にＡｒｇ₇からＳｅｒ₅₀まで
の領域内での１個以上のアミノ酸置換、あるいは、欠失
と置換によって特徴づけられる他のｔ−ＰＡ変異体をも
意図する。これらの化合物をコードするｃＤＮＡは、例
えば、ここに述べる適当なミュータジェネシスオリゴヌ
クレオチドを用いたミュータジェネシス法とかなり類似
した方法によって、容易に調製し得る。ｃＤＮＡは、Ｒ
¹，Ｒ²およびＲ³のコドン１個以上、および／あるい
は、Ａｇｒ−２７５において任意にミュータジェナイズ
を行ない、ここに示す方法によって発現ベクターに挿入
し、宿主細胞内で発現させることができる。これらのタ
ンパク質は本発明の他の化合物の有利な薬物動力学的性
質を共有し、また、おそらくここに示されるものと類似
の薬学的調製において、投与の際の不必要な抗原性を避
けられるであろうということが予想される。

【００４２】以上から明らかなように、本発明の全ての
変異体は、天然ヒトｔ−ＰＡと比較して潜在的グリコシ
ル化部位をより少なく有するか、あるいは全く有さず、
および／または、Ａｒｇ−２７５の欠失あるいは置換を
含む類似物質をコードするＤＮＡ配列を用いて、組み換
え技術によって調製される。上記ＤＮＡ配列は、ｔ−Ｐ
ＡをコードするＤＮＡ配列の、慣習的な部位特異的ミュ
ータジェネシスによって作製することができる。

【００４３】ｔ−ＰＡをコードするＤＮＡ配列を含むＤ
ＮＡ配列は、クローン化され、解析されている。例え
ば、Ｄ．ペニカ（Ｐｅｎｎｉｃａ）他，Ｎａｔｕｒｅ
（Ｌｏｎｄｏｎ）３０１：２１４（１９８３）および、
Ｒ．カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ
ｌ．Ｂｉｏｌ．５（７）：１７５０（１９８５）参照。
血栓溶解活性を有するｔ−ＰＡ類似物質をコードする一
つのクローン、ＡＴＣＣ３９８９１は、２４５位にＶａ
ｌでなくＭｅｔ残基を含む点で、独特である。一般的
に、該ＤＮＡ配列は、プロセッシングされる、すなわ
ち、宿主に認識され、除去される、リーダー配列をコー
ドし、続いて、Ｇｌｙ．Ａｌａ．Ａｒｇ．Ｓｅｒ．Ｔｙ
ｒ．Ｇｌｎ．．．で始まるタンパク質全長のアミノ酸残
基をコードしている。ＤＮＡ配列が発現される培地およ
び宿主細胞に依存して、上述のように生成されたタンパ
ク質は、Ｇｌｙ．Ａｌａ．Ａｒｇアミノ末端から始まる
か、あるいはさらにプロセッシングされて最初の３アミ
ノ酸残基がタンパク質分解的に除去される。後者の場
合、成熟タンパク質は、Ｓｅｒ．Ｔｙｒ．Ｇｌｎ．Ｌｅ
ｕ．．．から成るアミノ末端を有する。いずれのアミノ
末端を有するｔ−ＰＡ変異体も、血栓溶解活性を持ち、
本発明に含まれる。本発明による変異体はまた、他の変
異体、例えば、アリル変異や他のアミノ酸置換あるいは
欠失などと同様に、Ｍｅｔ２４５あるいはＶａｌ２４５
のいずれかを有するタンパク質を含み、同タンパク質は
なお、血栓溶解活性を保持している。

【００４４】本発明はまた、Ａｓｎ−２１８からＴｈｒ
−２２０にわたるポリペプチド領域中にさらに修飾を含
む、上述のような化合物も含む。特に、本態様の化合物
は、２１８位のＡｓｎ以外のアミノ酸あるいはペプチド
結合、および／あるいは、２１９位のＰｒｏ以外のアミ
ノ酸あるいはペプチド結合、および／あるいは、２２０
位のＳｅｒあるいはＴｈｒ以外のアミノ酸あるいはペプ
チド結合によって、さらに特徴づけられる。以上のよう
に、本態様の化合物は、黒色腫由来哺乳動物細胞によっ
て産生されたｔ−ＰＡでは一般的にグリコシル化されて
いないコンセンサスＮ−結合性グリコシル化部位を欠
く。

【００４５】上述のように、本発明の各々の変異体をコ
ードするＤＮＡ配列は、ヒトｔ−ＰＡあるいはその類似
物質あるいはその変異体をコードするＤＮＡ配列の慣習
的な部位特異的導入によって作製される。このような変
異導入法は、ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）およびスミス（Ｓ
ｍｉｔｈ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８
３）；およびＤＮＡ ３：４７９−４８８（１９８４）
の、一本鎖ＤＮＡを用いるＭ１３系、および、ヘテロ二
重鎖ＤＮＡを用いる、モリナガらの方法、Ｂｉｏ／ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ，６３６−６３９（１９８４年７月）
を含む。上記方法に従って、Ｎ末端領域における欠失を
生じさせるため、あるいは、例えば、アスパラギン残基
をスレオニンあるいはグルタミンに換えるために用いる
いくつかの典型的なオリゴヌクレオチドを、表７に示
す。本発明の各々の糖タンパク質をコードするＤＮＡ
は、適切に選択されたオリゴヌクレオチドを用いた部位
特異的変異導入により、本技術に熟達した者によって同
様に生成されるであろうことは、当然理解されるべきで
ある。哺乳動物、酵母、細菌、あるいは昆虫宿主細菌系
における慣習的な方法による上記ＤＮＡの発現により、
望みの変異体が得られる。哺乳動物発現系およびそれに
よって得られた変異体が、目下のところ望ましい。

【００４６】ここに示す哺乳動物細胞発現ベクターは、
本分野に熟達した者にはよく知られた技術によって合成
される。細菌のレプリコン、選択遺伝子、エンハンサ
ー、プロモーターなどのベクターの要素は、天然供給源
から得るか、あるいは既知の方法によって合成する。カ
ウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）他，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１５９：５１−５２１（１９８２）；カウフマ
ン，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：６
８９−６９３（１９８５）参照。

【００４７】トランスフォームされた細胞系を含む、確
立された細胞系は、宿主として適切である。正常二倍体
細胞、一次組織のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養液由来細胞系、
および初代組織片（造血幹細胞などの比較的未分化の細
胞を含む）も、適切である。選択遺伝子が優性に働く限
りは、候補となる細胞は選択遺伝子に関して遺伝子型が
欠失している必要はない。

【００４８】宿主細胞は確立されている哺乳動物細胞系
であることが望ましいであろう。双方とも慣習的方法に
よって行なわれる、ベクターＤＮＡの染色体ＤＮＡへの
安定な組込み、および、それに続く組込まれたベクター
ＤＮＡの増幅のために、ＣＨＯ（チャイニーズハムスタ
ー卵巣）細胞が現在のところ望ましい。あるいは、ベク
ターＤＮＡがウシパピローマウイルスゲノム（ラスキー
（Ｌｕｓｋｙ）他，Ｃｅｌｌ，３６：３９１−４０１
（１９８４））の全体あるいは一部を含み、安定なエピ
ソーム性要素としてＣ１２７マウス細胞のような細胞系
内に保持されることも可能である。他の有用な哺乳動物
細胞には、ＨｅＬａ，サルのＣＯＳ−１細胞、マウスＬ
−９２９細胞、スイス，Ｂａｌｂ−ｃ，あるいは、ＮＩ
Ｈマウス由来の３Ｔ３系、ＢＨＫあるいはＨａＫハムス
ター細胞系などが含まれる。

【００４９】次に、安定な形質転換体について、標準的
な免疫学的アッセイあるいは酵素アッセイによって、産
物の発現に関してスクリーニングを行なう。タンパク質
変異体をコードするＤＮＡの存在は、サザンブロッティ
ング法などの標準的方法によって検出することができ
る。サルＣＯＳ−１細胞などの適当な宿主細胞への発現
ベクターＤＮＡ導入後数日間の、上記変異体をコードす
るＤＮＡの一時的な発現は、培地中のタンパク質の活性
あるいは免疫学的アッセイによる選択を行わずに測定す
る。

【００５０】細菌における発現の場合には、本分野では
知られているように、変異体をコードするＤＮＡを、細
菌での発現のために異なるコドンを含むようにさらに修
飾し、望ましくは、これも本分野では既知であるが、細
菌での発現、分泌、および成熟タンパク質変異体のプロ
セッシングを可能にする分泌リーダーポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列に読み枠内で、実効的に連結
する。哺乳動物、昆虫、酵母、あるいは細菌の各宿主細
胞で発現した化合物は、次に、全て既知の方法によっ
て、回収し、精製し、および／あるいは、物理化学的、
生化学的、および／または、臨床的要素に関して解析を
行なう。

【００５１】これらの化合物は、ヒトｔ−ＰＡに対する
モノクローナル抗体に結合することが明らかとなり、従
って、同様な抗体を用いた免疫アフィニティークロマト
グラフィーによって回収および／あるいは精製を行うこ
とが可能である。さらに、本分野で既知のプラスミン色
素産生基質Ｓ−２２５１を用いた間接的アッセイで測定
されるように、これらの化合物はｔ−ＰＡ型酵素活性を
有する。すなわち、本発明の化合物はフィブリンの存在
下でプラスミノーゲンを効果的に活性化し、繊維素溶解
を引き起こす。

【００５２】本発明はまた、薬学的に許容される非経口
的キャリアと混和した治療上効果的な量の上記変異体か
ら成る血栓溶解治療のための混合物も含む。同混合物
は、ヒトｔ−ＰＡについて示されたものと同様に用いる
ことができ、ヒト、あるいは、イヌ、ネコ、および血栓
症性心血管障害にかかりやすいことが知られている他の
哺乳動物などの下等動物に対して有用なはずである。該
混合物は、治療および望ましくは血栓症の予防の双方に
用いられることが意図されている。正確な投与量および
投与方法は、特定の化合物の有効性および薬物動力学的
局面、また、例えば体重、性、食事、投薬時間、薬剤の
組成、反応感受性、特定の症例の重度などの、薬剤の働
きを修飾する多様な要素に依存して、治療医の参加によ
って決定されるであろう。

【００５３】以下の例は、本発明の態様を具体的に示す
ために掲げるものである。これらの例は具体例を示すも
のであることは理解されるべきであり、本発明は、添付
される請求の範囲で示されるものを除いては、それによ
って制限されるとは考えられるべきでない。

【００５４】昆虫細胞での発現に関する各々の実施例で
は、用いた核多角形病ウイルス（ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏ
ｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）は、オートグラフ
ァ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉｃａ）のＬ−１変異体であり、用いた昆虫細
胞系は、スポドプテラ・フルジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔ
ｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）ＩＰＬＢ−ＳＦ２１細
胞系（Ｊ．Ｌ．ヴォーン（Ｖａｕｇｈｎ）他，Ｉｎ Ｖ
ｉｔｒｏ（１９７７）１３，２１３−２１７）である。
細胞およびウイルスの操作は、文献に詳述されている
（Ｇ．Ｄ．ペノック（Ｐｅｎｎｏｃｋ）他，前出；Ｄ．
Ｗ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｐ．サファー（Ｓａｆｅ
ｒ）および、Ｌ．Ｋ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），Ｇｅｎ
ｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，２７７
−２９８，編集者Ｊ．Ｋ．セットロー（Ｓｅｔｌｏｗ）
およびＡ．ホランダー（Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ），プレ
ナム出版社（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ），１９８
６）。ＲＦｍ１３ベクター、ｍｐ１８およびｍｐ１１
は、ニュー・イングランド・バイオラブ社から商業的に
入手可能である。しかしながら、本発明に関連する分野
の通常の技術を有する者は、上述のように、他のウイル
ス、菌系、宿主細胞、プロモーターおよび関連したｃＤ
ＮＡを含むベクターも本発明の各々の態様の実施の際に
用いうることを理解するであろう。用いたＤＮＡ操作
は、特にここに述べない限り、マニアティス（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ）ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ１９８２）に従う
ものである。

【００５５】

【表２４】 ＊ 括弧で示された変異のスクリーニングに用いた（ス
クリーニングオリゴヌクレオチドが示されていない場合
には、同じオリゴヌクレオチドを変異導入とスクリーニ
ングのために用いた）。置換アミノ酸のコドンは下線で
示し、▲は欠失部位を示す。本技術に熟達した者には理
解されるように、１個以上のアミノ酸の欠失あるいは望
みの部位に異なる（すなわち、置換）アミノ酸を挿入す
る目的で、それぞれオリゴヌクレオチド中のコドンの欠
失あるいは望みの置換アミノ酸のコドンとの置換によっ
て、オリゴヌクレオチドを容易に構成することができ
る。別の変異導入オリゴヌクレオチド、換えようとする
元のコドンの置換あるいは欠失を含み、望みの部位にか
かる約２０−５０ヌクレオチド配列を基に考案すること
ができる。

【００５６】プラスミド誘導 多様なアミノ酸をコードするコドンでのｃＤＮＡの変異
導入は、ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）とスミス（Ｓｍｉｔ
ｎ）の方法によって、Ｍ１３プラスミド中のｃＤＮＡの
適当な制限断片を用いて行なう。ｃＤＮＡ内の欠失は、
Ｍ１３ベクター内あるいはプラスミドｐＳＶＰＡ４のヘ
テロ二重鎖ループ・アウトによるｃＤＮＡの適当な制限
断片、例えばＳａｃＩ断片を用いたループ・アウト変異
導入によって行なった。

【００５７】プラスミドｐＳＶＰＡ４は哺乳動物細胞中
でｔ−ＰＡを発現させるために構成された。このプラス
ミドは、まずプラスミドｐｓｐＬＴ５（Ｚ．チュー（Ｚ
ｈｕ）ら，１９８４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５１：１
７０−１８０）からＳＶ４０ラージＴポリペプチドをコ
ードするＤＮＡを除去することによって作製された。こ
れは、ＸｈｏＩ完全切断後、部分的ＢａｍＨＩ制限エン
ドヌクレアーゼ切断によって行なわれる。ｐｓｐＬＴ５
内のＳＶ４０ラージＴコード領域を、プラスミドＪ２０
５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９５６８）をＳａｌＩとＢａｍ
ＨＩで切断して単離した粘着端ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ
ｔ−ＰＡコード配列を上記のように調製した親ＸｈｏＩ
／ＢａｍＨＩ切断ベクターｐｓｐＬＴ５に連結させるこ
とにより、ヒトｔ−ＰＡコード配列と置換した。結果と
して、ｔ−ＰＡは哺乳動物細胞に導入されるとＳＶ４０
後期プロモーターの制御下でベクター内で転写される。
この最終構造をｐＳＶＰＡ４と呼ぶ。

【００５８】プラスミドｐＬＤＳＧはＣＨＯ細胞のよう
な哺乳動物細胞中でのｔ−ＰＡ発現のための増幅可能な
ベクターである。ｐＬＤＳＧはアデノウイルス２型主要
後期プロモーター（ＭＬＰ）を利用するマウスＤＨＦＲ
ｃＤＮＡ転写単位、サルウイルス４０（ＳＶ４０）エ
ンハンサーおよび複製起点、ＳＶ４０後期プロモーター
（アデノウイルスＭＬＰと同じ向き）、テトラサイクリ
ン耐性コード遺伝子およびアデノウイルス２型ＭＬＰに
関して適当な向きでヒトｔ−ＰＡ（Ｍｅｔ−２４５）を
コードするｃＤＮＡを含む。ｐＣＶＳＶＬ２（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３９８１３）とｔ−ＰＡコードｃＤＮＡからの
ｐＬＤＳＧの調製は、ＣＨＯ細胞中でのｐＬＤＳＧとの
共形質転換およびｐＬＤＳＧの増幅として詳細に示され
ている。カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）他，Ｍｏｌ．ａ
ｎｄ Ｅｌｌ．Ｂｉｏ．５（７）：１７５０−１７５９
（１９８５）。

【００５９】プラスミドｐＷＧＳＭは、挿入ｃＤＮＡが
Ｖａｌ−２４５ヒトｔ−ＰＡをコードする点を除いて
は、ｐＬＤＳＧと同等である。ｐＷＧＳＭはプラスミド
Ｊ２０５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９５６８）あるいはｐＩ
ＶＰＡ／１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８９１）由来のｃＤ
ＮＡを用いて作製される。上で述べたように、ｐＷＧＳ
ＭはＶａｌ−２４５タンパク質を産生し、ｐＬＤＳＧは
Ｍｅｔ−２４５タンパク質を産生するが、本開示を通じ
てｐＷＧＳＭとｐＬＤＳＧは互換性を持って用いられ
る。

【００６０】ｐＩＶＰＡ／１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８
９１）はｔ−ＰＡコードｃＤＮＡを含むバキュロウイル
ス性転移ベクター（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ ｔｒａｎ
ｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｖｅｃｔｏｒ）である。ｐＩＶ
ＰＡ／１およびその変異導入した誘導体は、望みのｃＤ
ＮＡをバキュロウイルスのゲノムに挿入し、ｃＤＮＡを
バキュロウイルスのポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉ
ｎ）プロモーターの転写制御下におくために用いられ
る。

【００６１】ヘテロ二重鎖変異導入 ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＳＶＰＡ４の特異的領域のヘ
テロ二重鎖ＤＮＡによる変異導入は、次の過程を含む： アンピシリン感受性ｐＳＶＰＡ４ ＤＮＡの調製 １．プラスミドｐＳＶＰＡ４（１５μｇ）をＰｖｕＩで
完全に直鎖状にした。同混合液をフェノール／クロロホ
ルムで抽出し、ＤＮＡを０．１Ｍ ＮａＣｌ存在下で２
倍量のエタノールで沈殿させた。 ２．ＤＮＡを、２１μｌの水、１μｌ ｄＮＴＰ溶液
（２ｎＭ ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰを
含む）、２．５μｌ １０×ニックトランスレーション
緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ・ｐＨ７．５，０．
１Ｍ Ｍｇｓｏ₄，１０ｍＭ ＤＴＴ，５００μｇ／ｍ
ｌ）および０．５μｌ（２ユニット）ＤＮＡポリメラー
ゼ１−大フラグメント（ニュー・イングランド・バイオ
ラブズ）に再懸濁した。同混合液を室温で３０分間イン
キュベートし、続いてフェノール／クロロホルム抽出を
行ない、次に上述のようにエタノール沈殿を行なった。 ３．沈殿させたＤＮＡは７５μｌの水を加えることによ
り０．２μｇ／μｌになるように再懸濁した。

【００６２】アンピシリン耐性ｐＳＶＰＡ４ ＤＮＡの
調製 １．プラスミドｐＳＶＰＡ４（１５μｇ）を、ｔ−ＰＡ
コード配列内で２箇所同プラスミドを切断するＳａｃＩ
で切断し、２種類の制限断片、１．４ｋｂｐｔ−ＰＡコ
ード制限断片と親ベクターを得た。制限切断に続いて、
１μｌ（２８ユニット）の仔ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を加え、３７℃で５
分間インキュベートした。同混合液を０．７％アガロー
スゲルに流すことにより、二本のバンドを分離した。親
ベクター制限断片をゲルから切り出し、４℃でシリカゲ
ルに吸着させて抽出し、続いて３７℃で３０分間５０ｍ
ＭＴｒｉｓ／１ｍＭ ＥＤＴＡに溶出させた。溶出した
ＤＮＡは最終濃度０．２μｇ／μｌに調製した。

【００６３】ヘテロ二重鎖アニーリング １．６μｌ（１．２μｇ）のアンピシリン感受性ｐＳＶ
ＰＡ４ ＤＮＡを６μｌ（１．２μｇ）のアンピシリン
耐性ｐＳＶＰＡ４ ＤＮＡと混合する。 ２．等量（１２μｌ）の０．４Ｍ ＮａＯＨを加える。
室温で１０分間インキュベートする。 ３．緩やかに、４．５倍量（１０８μｌ）の０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５／２０ｍＭ ＨＣｌを加え
る。 ４．５０ピコモル（５μｌ）のリン酸化変異導入用オリ
ゴヌクレオチドを４５μｌのヘテロ二重鎖混合液に加え
た。 ５．同混合液を６８℃で２時間インキュベートし、次に
緩やかに室温まで冷却した。

【００６４】変異導入 １．各々の変異導入反応液は、ヘテロ二重鎖混合液に以
下の濃度組成の溶液を７μｌ加えることによって調製し
た：２ｍＭ ＭｇＣｌ／０．２ｍＭ ＡＴＰ／６０μＭ
ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ／４ｍＭ
ＤＴＴ／４０ユニット／ｍｌ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉクレノー断片（Ｂ．Ｒ．Ｌ．），２０００ユニット／
ｍｌＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎ．Ｅ．Ｂ．）．上記混合液
を室温で２時間インキュベートした。 ２．反応液は次にフェノール／クロロホルムで抽出し、
続いてエタノール沈殿を行なった。沈殿したＤＮＡを１
２μｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／１ｍＭＥＤＴＡに
再懸濁した。そのうち４μｌをＨＢ１０１コンピテント
細胞の形質転換に使用した。 ３．アンピシリン耐性のコロニーを、５Ｘ ＳＳＣ，
０．１％ＳＤＳ，５Ｘデンハルト試薬、および１００μ
ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中の１×１０⁶ｃｐｍ／ｍ
ｌの³²Ｐ標識スクリーニングオリゴヌクレオチドでスク
リーニングを行なった。 ４．オリゴヌクレオチドプローブの計算された融点より
も５°低い温度において、フィルターを５Ｘ ＳＳＣ、
０．１％ＳＤＳで洗浄した。 ５．ＤＮＡをポジティブにハイブリッド形成したクロー
ンから調製し、まず異なる制限酵素による切断およびア
ガロースゲル電気泳動によって分析した。ＤＮＡをニト
ロセルロースに転移させ、フィルターを調製し、変異誘
オリゴヌクレオチドが正しいフラグメントに導入された
ことを確認するためにスクリーニングプローブとハイブ
リッド形成させた。 ６．次に、ＤＮＡを大腸菌に再形質転換し、アンピシリ
ン耐性コロニーをスクリーニングオリゴヌクレオチドと
ハイブリッド形成させるためにスクリーニングを行なっ
た。 ７．最終的な変異は、ＤＮＡ配列決定法（サンガー法）
によって確定した。

【００６５】変異を導入したｃＤＮＡの調製：Ｍ１３法 以下に示す制限酵素地図は、ヒトｔ−ＰＡをコードする
ｃＤＮＡ（上）と、特異的なエンドヌクレアーゼを示す
切断部位（下に示す）とを図示したものである： 開始コドンＡＴＧ，および、（ａ）、Ｒ¹，Ｒ²およびＲ
³をコードするｃＤＮＡ領域が示されている。こりよう
に、Ｎ末端領域における変異導入は、例えば、ＳａｃＩ
断片あるいはＢｇｌII／ＮａｒＩ断片を用いて行なうこ
とができる。Ａｒｇ−２７５および／あるいはＲ¹およ
び／あるいはＲ²における変異導入は、例えばＳａｃＩ
断片あるいはＢｇｌII／ＳａｃＩ断片を用いて行なえ
る。Ｒ³での変異導入は、ＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩあるい
はＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩ断片を用いて行なうことが可能
である。制限断片の選択は変異導入および／あるいは発
現ベクター構成のため特定のベクターを使用する際の有
利さを基に決定する。

【００６６】一般的に、変異を導入されるｃＤＮＡ制限
断片は、上で示したエンドヌクレアーゼ酵素を用いて、
例えばｐＷＧＳＭ，ｐＩＶＰＡ／１あるいはｐＳＶＰＡ
４など、存在する全長ｃＤＮＡから切り出し、次に、表
７に示されるオリゴヌクレオチド、あるいは、望みの変
異導入のために考案された別のオリゴヌクレオチドを用
いて変異を導入する。

【００６７】上記のように調製される、典型的な、変異
を導入したｃＤＮＡ断片を、以下の表８に示す。

【００６８】

【表２５】 ＊は変異導入部位を示す；ｃＤＮＡ断片ＩからIVは、ｐ
ＷＧＳＭあるいはｐＳＶＰＡ４をＳａｃＩで切断し、Ｓ
ａｃＩ断片をＭ１３ベクターに挿入し、望みのオリゴヌ
クレオチドで変異を導入し、変異を導入したＭ１３／ｔ
−ＰＡ ＤＮＡをＳａｃＩで切断することによって調製
する；もしくは、Ｉ−IVは、変異を導入したＭ１３／ｔ
−ＰＡからＢｇｌIIとＳａｃＩで切り出し、Ｎ末端、Ｒ
¹，Ｒ²およびＡｒｇ−２７５にかかるペプチドドメイン
をコードする該ＢｇｌII／ＳａｃＩ断片をＢｇｌII／Ｓ
ａｃＩ断片ｐＩＶＰＡに挿入する；ｃＤＮＡ断片Ｖは後
述の実施例２のように調製する。

【００６９】変異導入後、上記断片は、さらに変異導入
を行ない、あるいは行なわず、次にＭ１３ベクターから
切り出し、Ｍ１３ベクターから変異を導入した断片を切
り出すために用いたものと同じ酵素であらかじめ切断し
たｃＤＮＡ全長あるいは部分を含む発現ベクターに再連
結する。本方法により、望ましくは変異が導入された全
長ｃＤＮＡは、制限断片カセットとして１個以上の変異
導入断片を用いて再構成することができる。

【００７０】次に示す化合物（９ページの表、および、
表２、表２．５、表３参照）をコードするｃＤＮＡは、
以下のように、表８の変異導入断片から調製される：化合物 経 路 Ｄ−６ （ａ）変異導入ｃＤＮＡ断片Ｉ（オリゴヌクレオチ Ｄ−１ ド＃８，１０，あるいは１２を用いて調製） Ｄ−３ をＳａｃＩ切断ｐＳＶＰＡ４に連結、あるい は、変異導入Ｍ１３／ｔ−ＰＡからＢｇｌII ／ＳａｃＩ断片として断片Ｉを切り出し、同 様にＢｇｌII／ＳａｃＩ切断ｐＩＶＰＡ／１ に挿入。 ２−１／Ｎ−２３／Ａｒｇ （ｂ）変異導入ｃＤＮＡ断片IIを（オリゴヌクレオ ２−１／Ｎ−２１／Ａｒｇ チド＃８，１０あるいは１２，およびオリゴ ２−１／Ｎ−２２／Ａｒｇ ヌクレオチド＃３）をＳａｃＩ切断ｐＳＶＰ Ａ４に連結、あるいは変異導入Ｍ１３／ｔ− ＰＡからＢｇｌII／ＳａｃＩ断片として断片 IIを切り出し、ＢｇｌII／ＳａｃＩ断片ｐＩ ＶＰＡ／１に挿入。 ２−２／Ｎ−２３／Ａｒｇ （ｃ）変異導入ｃＤＮＡ断片III（オリゴヌクレオ ２−２／Ｎ−２１／Ａｒｇ チド＃８，１０，あるいは１２，および、オ ２−２／Ｎ−２２／Ａｒｇ リゴヌクレオチド＃５）をＳａｃＩ ｐＳＶ ＰＡ４に連結、あるいは変異導入Ｍ１３／ｔ −ＰＡからＢｇｌII／ＳａｃＩ断片として断 片IIIを切り出し、ＢｇｌII／ＳａｃＩ断片 ｐＩＶＰＡ／１に挿入。 ２−３／Ｎ−２３／Ａｒｇ （ｄ）経路（ａ）によって生成した変異導入ｐＩＶ ２−３／Ｎ−２１／Ａｒｇ ＰＡ／１あるいはｐＳＶＰＡ４をＥｃｏＲＩ ２−３／Ｎ−２２／Ａｒｇ （部分切断）およびＸｍａＩ（ＳｍａＩ）あ るいはＡｐａＩ（完全切断）で切断して野生 型Ｒ³コード領域を除去し、それに変異導入 ｃＤＮＡ断片Ｖ（オリゴヌクレオチド＃７を 用いて調製）をＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩあるい はＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ（ＳｍａＩ）断片と して連結。 ２−４／Ｎ−２３／Ａｒｇ （ｅ）経路（ｃ）のように調製した変異導入ｐＩＶ ２−４／Ｎ−２１／Ａｒｇ ＰＡあるいはｐＳＶＰＡをＥｃｏＲＩ（部分 ２−４／Ｎ−２２／Ａｒｇ 切断）および、ＸｍａＩ（ＳｍａＩ）あるい はＡｐａＩ（完全切断）で切断して野生型 Ｒ³コード領域を除去し、それにｃＤＮＡ断 片Ｖ（オリゴヌクレオチド＃７を用いて調製 ）をＥｃｏＲＩ／ＡｐａＩあるいはＥｃｏＲ Ｉ／ＸｍａＩ（ＳｍａＩ）断片として連結。 ２−５／Ｎ−２３／Ａｒｇ （ｆ）経路（ｄ）によって調製した変異導入ｐＩＶ ２−５／Ｎ−２１／Ａｒｇ ＰＡあるいはｐＳＶＰＡ４をＥｃｏＲＩ（部 ２−５／Ｎ−２２／Ａｒｇ 分切断）および、ＸｍａＩ（ＳｍａＩ）ある いはＡｐａＩ（完全切断）で切断し、それに 変異導入ｃＤＮＡ断片Ｖ（オリゴヌクレオチ ド＃７を用いて調製）をＥｃｏＲＩ／Ａｐａ ＩあるいはＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ（ＳｍａＩ ）断片として連結。 ２−６／Ｎ−２３／Ａｒｇ （ｇ）変異導入ｃＤＮＡ断片IV（オリゴヌクレオチ ２−６／Ｎ−２１／Ａｒｇ ド＃８，１０，あるいは１２，および、オリ ２−６／Ｎ−２２／Ａｒｇ ゴヌクレオチド＃３および５を用いて調製） をＳａｃＩ切断ｐＳＶＰＡ４に連結、あるい は、変異導入Ｍ１３／ｔ−ＰＡから断片IVを ＢｇｌII／ＳａｃＩ断片として切り出し、Ｂ ｇｌII／ＳａｃＩ切断ｐＩＶＰＡ／１に連結 。 ２−７／Ｎ−２３／Ａｒｇ （ｈ）変異導入ｃＤＮＡ断片IV（オリゴヌクレオチ ２−７／Ｎ−２１／Ａｒｇ ド＃８，１０あるいは１２，およびオリゴヌ ２−７／Ｎ−２２／Ａｒｇ クレオチド＃３および５から調製)を経路( ｄ），（ｅ）あるいは（ｆ）によって調製し たＳａｃＩ切断ｐＳＶＰＡ４に連結、あるい は、ＢｇｌII／ＳａｃＩ断片として調製した 断片IVを経路（ｄ），（ｅ），あるいは（ｆ ）によって作成したＢｇｌII／ＳａｃＩ切断 ｐＩＶＰＡに連結。

【００７１】プラスミドｐＩＶＰＡあるいはｐＳＶＰＡ
４は、発現ベクターとしての使用に加え、いかなる変異
導入部位の望みの置換も有する、ｃＤＮＡ構成の際の
“貯蔵所（ｄｅｐｏｔ）”としても使用し得る。このよ
うに、Ｎ末端領域をコードするｃＤＮＡ領域に望みの修
飾を含んだ変異導入プラスミド（Ｍ１３あるいはヘテロ
二重鎖による）、“ｐＩＶＰＡ／Δ”あるいは“ｐＳＶ
ＰＡ４／Δ”をＮａｒＩ（部分）およびＸｍａＩ（Ｓｍ
ａＩ）（完全）で切断し、Ｒ¹，Ｒ²およびＲ³にわたる
タンパク質領域を除去する。もしも望むならば、Ａｒｇ
−２７５，Ｒ¹，Ｒ²およびＲ³コード領域のいかなる組
み合わせにおいても変異導入（Ｍ１３あるいはヘテロ二
重鎖による）を行なった、第２のプラスミドｐＩＶＰＡ
あるいはｐＳＶＰＡ４を次にＮａｒＩ（完全）およびＸ
ｍａＩ（ＳｍａＩ）（完全）で切断し、続いてＮａｒＩ
／ＸｍａＩ（ＳｍａＩ）断片を同定、単離し、ＮａｒＩ
／ＸｍａＩ（ＳｍａＩ）切断ｐＩＶＰＡ／Δあるいはｐ
ＳＶＰＡ４に連結する。例えばＮａｒＩ／ＸｍａＩ（Ｓ
ｍａＩ）制限断片カセットの上記のような使用は、ｐＩ
ＶＰＡあるいはｐＳＶＰＡ４における望みの変異導入ｃ
ＤＮＡの構成を可能にする。変異導入ｃＤＮＡは次に、
例えばＢｇｌII／ＸｍａＩ制限断片カセットとして、望
むならば、哺乳動物での発現のためにＢｇｌII／Ｘｍａ
Ｉ切断ｐＷＧＳＭに転移する。

【００７２】実施例 実施例１ Ｇｌｎ₁₁₇欠失変異体の調製

【００７３】Ａ．Ｇｌｎ₁₁₇短縮ｃＤＮＡの調製 化合物２−１／Ｎ−２１／Ａｒｇ，２−１／Ｎ−２２／
Ａｒｇおよび２−１／Ｎ−２３／Ａｒｇのポリペプチド
配列をコードするｃＤＮＡ分子をゾラーとスミスのオリ
ゴヌクレオチド特異的変異導入法を用いて調製した。特
に、ｔ−ＰＡ遺伝子を含む変異導入ベクターＲＦ Ｍ１
３／ｔ−ＰＡは、哺乳動物ｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＳ
ＶＰＡ４から構成した。ＲＦ Ｍ１３／ｔ−ＰＡは、ま
ず、ｐＳＶＰＡ４を制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩで
完全に切断して作製した。約１，４３６塩基対（ｂｐ）
のＳａｃＩ断片は、ｔ−ＰＡポリペプチド配列の大部分
をコードし、アスパラギン１１７，１８４，および２１
８を含むコンセンサスＮ−結合性グリコシル化部位をコ
ードするヌクレオチド配列を含んでいる。上記１，４３
６ｂｐ（以後１．４ｋｂｐとする）断片は、調製用アガ
ロースゲル電気泳動によって精製した。

【００７４】上で、ＳａｃＩ断片として得たｔ−ＰＡ
ｃＤＮＡのＳａｃＩ断片を、あらかじめＳａｃＩで切断
した直鎖状二重鎖ＲＦ Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡベクター
に連結した。連結混合液は細菌ＪＭ１０１形質転換コン
ピテント細胞の形質転換に用いた。形質転換細胞から産
生されたｔ−ＰＡ由来ＤＮＡを含むＭ１３プラークを分
析的ＤＮＡ制限分析および／あるいはプラークハイブリ
ダイゼーションによって同定、単離した。表１に示され
たｔ−ＰＡをコードするヌクレオチド配列のＳａｃＩ制
限部位内由来の放射性標識オリゴヌクレオチド（〜１７
量体、陽極性のもの）を、ｔ−ＰＡ ＤＮＡを含むウイ
ルス性プラークの検出するフィルターハイブリダイゼー
ションを行なう際のプローブとして使用した。全てのオ
リゴヌクレオチドは、制作者の指示に従い、アプライド
・バイオシステムズＤＮＡ合成機を用いた自動的合成に
よって調製した。

【００７５】制限分析あるいはハイブリッド形成分析に
よって検出されたポジティブなプラークのうち数個を、
次に、慣習的なプラーク精製によってさらにクローニン
グを行なった。プラーク精製法によって得られた精製Ｍ
１３／ｔ−ＰＡバクテリオファージを、ＪＭ１０１細胞
への感染に使用した。これらの感染細胞は細胞質性二重
鎖“ＲＦ”Ｍ１３／ｔ−ＰＡプラスミドＤＮＡを産生す
る。感染細胞はまた、ｔ−ＰＡの１．４Ｋｂｐ Ｓａｃ
Ｉ断片およびＭ１３ ＤＮＡを相補する一本鎖ＤＮＡを
含むバクテリオファージを培地中に産生する。一本鎖Ｄ
ＮＡは培地から単離したＭ１３／ｔ−ＰＡ含有ファージ
から精製した。上記一本鎖Ｍ１３／ｔ−ＰＡ ＤＮＡ
は、表７のオリゴヌクレオチド＃３を用いたゾラーとス
ミスの方法による変異導入反応において、鋳型として用
いた。この変異導入は、ＤＮＡ配列を“ＡＡＣ”から
“ＣＡＧ”に変えることにより結果的に得られるＤＮＡ
コード配列の１１７位のＡｓｎコドンをＧｌｎコドンに
変える。変異導入反応に続いて、上記ＤＮＡを細菌株Ｊ
Ｍ１０１に形質転換した。変異導入ｃＤＮＡを同定する
ために、形質転換体プラークを表７の放射性標識オリゴ
ヌクレオチド＃４を用いたＤＮＡハイブリダイゼーショ
ンによってスクリーニングを行なった。表７の全ての典
型的なオリゴヌクレオチドは陽極性、すなわち、ＤＮＡ
の非コード鎖でなく、コード鎖部分を示す。ハイブリダ
イゼーションでの全てのポジティブなプラークは、変異
導入ＤＮＡを含むＭ１３ファージでＪＭ１０１細胞への
連続的な２次感染によってさらに精製した。

【００７６】ＲＦ Ｍ１３／ｔ−ＰＡプラスミドＤＮＡ
は、変異導入ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡを含む精製Ｍ１３ファ
ージを感染させたＪＭ１０１細胞から精製した。上記の
ように得たＲＦ Ｍ１３／ｔ−ＰＡプラスミドは、ｔ−
ＰＡ ＤＮＡのＧｌｎ₁₁₇変異導入ＳａｃＩ制限断片を
含む。この変異導入制限断片は、再度ゾラーとスミスの
方法によって、しかし以下に述べるオリゴヌクレオチド
を用いてさらに変異を導入することが可能である。以下
に述べるオリゴヌクレオチドは、Ｎ末端領域をコードす
るｃＤＮＡ領域内の欠失（“ループ・アウト（ｌｏｏｐ
ｏｕｔ）”）を誘導するために考案された。

【００７７】欠失変異導入１： 表７のオリゴヌクレオ
チド＃８は、総括して、Ｃｙｓ₆からＣｅｒ₅₀をコード
するｃＤＮＡ欠失を誘導した。この第２の変異導入反応
に続いて、該ＤＮＡをＪＭ１０１細胞に形質転換する。
変異を導入したｃＤＮＡを同定するために、形質転換プ
ラークについて、上述のように、しかし、表７の放射性
標識オリゴヌクレオチド＃９を用いてスクリーニングを
行なった。ハイブリッド形成でポジティブなプラーク
は、二度変異を導入したｔ−ＰＡ ｃＤＮＡを含むＭ１
３ファージを連続的に二度ＪＭ１０１細胞へ感染させる
ことによってさらに精製することが可能である。この変
異導入制限断片を含む、以下に示すように調製したｃＤ
ＮＡは、Ｉｌｅ−５がＣｙｓ−５１とペプチド結合で共
有結合的に結合している化合物２−１／Ｎ−２１／Ａｒ
ｇをコードする。

【００７８】欠失変異導入２： 表７のオリゴヌクレオ
チド＃１０は、総括して、Ｃｙｓ₆からＩｌｅ₈₆までを
コードするｃＤＮＡ欠失を誘導する。この第２の変異導
入反応後、該ＤＮＡをＪＭ１０１細胞を形質転換する。
変異を導入したｃＤＮＡを同定するために、形質転換体
プラークについて、上記のように、しかし、表７の放射
性標識オリゴヌクレオチド＃１１を用いてスクリーニン
グを行なった。ハイブリッド形成でポジティブとプラー
クは、二度変異導入を行なったｔ−ＰＡ ｃＤＮＡを含
むＭ１３ファージをＪＭ１０１細胞に連続的に二度感染
させることにより、さらに精製することが可能である。
上記変異導入断片を含む、以下のように調製したｃＤＮ
Ａは、Ｉｌｅ₅がＡｓｐ₈₇とペプチド結合によって共有
結合している化合物２−１／Ｎ−２２／Ａｒｇをコード
する。

【００７９】欠失変異導入３： 表７のオリゴヌクレオ
チド＃１２は、総括的に、Ｃｙｓ₅₁からＡｓｐ₈₇までを
コードするｃＤＮＡの欠失の生成に使用できる。上記第
２の変異導入反応後、該ＤＮＡをＪＭ１０１細胞に形質
転換する。変異を導入したｃＤＮＡを同定するために、
表７の放射性標識オリゴヌクレオチド＃１３を用いて、
上記のように形質転換体プラークのスクリーニングを行
なった。ハイブリッド形成でポジティブなプラークは、
二度変異を導入したｔ−ＰＡ ｃＤＮＡを含むＭ１３フ
ァージをＪＭ１０１細胞に連続的に二度感染させること
によってさらに精製することができる。上記変異導入制
限断片を含む、以下のように調製したｃＤＮＡは、Ｓｅ
ｒ₅₀がＴｈｒ₈₈とペプチド結合で共有結合している化合
物２−１／Ｎ−２３／Ａｒｇをコードする。

【００８０】これらの変異導入制限断片の各々は、実施
例＃３Ｂに示す方法と類似の方法で、ＳａｃＩカセット
として哺乳動物発現ベクターｐＳＶＰＡ４に連結しなお
すか、あるいは修飾ＲＦ Ｍ１３／ｔ−ＰＡ ＤＮＡ由
来ＢｇｌII／ＳａｃＩカセットとして、昆虫細胞発現ベ
クターｐＩＶＰＡ／１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３９８９１）
へ挿入するために調製することが可能である。

【００８１】Ｂ．高マンノースＧｌｎ₁₁₇欠失変異体の
発現に用いるベクターの調製 上述のように調製された修飾および短縮ｔ−ＰＡ ｃＤ
ＮＡを含む精製ＲＦＭ１３／ｔ−ＰＡは、制限エンドヌ
クレアーゼＢｇｌIIおよびＳａｃＩで切断可能である。
約１．２ｋｂｐのＢｇｌII／ＳａｃＩ制限断片を慣習的
な調製用ゲル電気泳動によって精製した。上のように得
られたＢｇｌII／ＳａｃＩ断片は、翻訳タンパク質のア
ミノ末端およびカルボキシ末端をコードするＤＮＡの
５’および３’末端部分を欠く変異導入カセットを構成
する。

【００８２】昆虫発現ベクターｐＩＶＰＡ／１（ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．３９８９１）は、ポリヘドリンプロモーター
および、バキュロウイルス隣接ＤＮＡ配列に実際的に連
鎖する、野性型ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ挿入物を含む。ｐＩ
ＶＰＡ／１を、ＢｇｌIIおよびＳａｃＩで切断し、それ
によってＮ末端領域、Ｒ¹およびＲ²にわたるｔ−ＰＡコ
ード領域を切り出す。変異を導入した、Ｎ末端を修飾し
たｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ断片を含むＢｇｌII／ＳａｃＩカ
セットは、次に、あらかじめＢｇｌIIとＳａｃＩでの切
断後に精製したｐＩＶＰＡ／１発現ベクターＤＮＡに各
々連結することもできる。得られたプラスミド、ｐＩＶ
ＰＡ／Δ ＦＢＲ；Ｇｌｎ₁₁₇，ｐＩＶＰＡ／ΔＦＢＲ
／Δ ＥＧＦ；Ｇｌｎ₁₁₇；ｐＩＶＰＡ ＥＧＦ，Ｇｌ
ｎ₁₁₇は、各々化合物２−１／Ｎ−２１／Ａｒｇ，２−
１／Ｎ−２２／Ａｒｇおよび２−１／Ｎ−２３／Ａｒｇ
を含むはずであり、ポリヘドリンプロモーターと実際的
に連鎖しているはずである。各々の変異導入ｃＤＮＡ挿
入物のヌクレオチド配列は、プラスミドを基質としたス
ーパーコイルシークエンス法によって確認されるであろ
う。例えば、Ｅ．Ｙ．チェン（Ｃｈｅｎ）他，１９８
５，ＤＮＡ ４（２）：１６５−１７０参照。

【００８３】Ｃ．変異導入したｃＤＮＡの昆虫ウイルス
への導入 変異導入ｃＤＮＡを含むｐＩＶＰＡプラスミドの各々
は、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）細胞中の野
生型ＡｃＮＰＶとともに共形質転換することにより、昆
虫ウイルスに導入することが可能である。１μｇの精製
オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈ
ａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）ＮＰＶ ＤＮＡおよび１
０μｇの望みのｐＩＶＰＡ ＤＮＡを、リン酸カルシウ
ム形質導入法によって、組織培養皿上で増殖しているス
ポドプテラ細胞に導入する（Ｋ．Ｎ．ポッター（Ｐｏｔ
ｔｅｒ）、およびＬ．Ｋ．ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），
Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．Ｐａｔｈ，（１９８０），３
６ ４３１−４３２）。これらのＤＮＡの細胞への共導
入の結果、ｐＩＶＰＡプラスミド（変異導入ｃＤＮＡを
含む）とウイルス性ＤＮＡとの間で、２つの間の相同的
領域で二重組み換えが起きる；すなわち、組み換え反応
により、子孫ウイルスのポリヘドリン遺伝子領域がｐＩ
ＶＰＡプラスミド由来変異導入ｃＤＮＡ挿入物を含む。

【００８４】本発明のタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含むウイルスの単離形質導入を行なった細胞
をおおう培地中に存在する子孫ウイルスを、数種の異な
る希釈によって新鮮な単層細胞上にプラークを作らせ
る。プラークをアッセイし、組み換え体を以下のように
ＰＩＢ−マイナスの表現型によって選択する：ポリヘド
リン遺伝子を失なったウイルスは、変異が導入されたｃ
ＤＮＡを含むウイルスであると考えられ、ＰＩＢを産生
しない。ＰＩＢ欠損を示すプラークを選択し、切り出
し、新鮮な細胞内で増幅させる。これらの細胞の上清を
次にｔ−ＰＡ型酵素活性についてアッセイする。ポジテ
ィブなアッセイ結果は、糖タンパク質が実際に産生され
ていることを示唆する。

【００８５】プラークリフティング法による、別のウイ
ルス精製法は上述の過程と若干異なり、それを以下に述
べる。適当な希釈をした形質導入による子孫ウイルス
を、細胞培養皿上で溶菌させる。細胞単層およびウイル
スプラークのニトロセルロースレプリカを調製する。培
養皿のアガロース上層を、次の段階の結果が得られた後
のウイルス源として保存しておく。

【００８６】ニトロセルロースフィルターを、ウイルス
染色体中に存在する遺伝子を代表する放射性活性ＤＮＡ
をプローブとして調べる。ポジティブなものを外来遺伝
子を含むものと見なす。上記フィルターを、外来性ＤＮ
Ａで置換されて除去されたウイルス染色体部分を代表す
る放射性活性ＤＮＡをプローブとして再度検索する。ポ
ジティブなものが依然としてポリヘドリン遺伝子を有す
ると見なすことができる。

【００８７】ハイブリッド形成したプローブを除去す
る。ポリヘドリン遺伝子の状態にかかわらずウイルスプ
ラークを同定するであろう放射性活性ＤＮＡ断片をプロ
ーブとして、上記フィルターを再度検索する。適当な断
片は、ＥｃｏＲＩ断片である。これらを子孫ウイルスで
あると判断できる。外来遺伝子ＤＮＡプローブに対して
ポジティブであり、ポリヘドリン遺伝子プローブに対し
てネガティブであり、ウイルスＤＮＡプローブにポジテ
ィブであるこれらのプラークを選択する。これらは、望
みの遺伝子型の強い候補となる。

【００８８】Ｄ．高マンノース糖タンパク質の産生およ
び解析 感染細胞の細胞外培地中の多様なタンパク質の存在を示
すために抗体を用いた。上述のように調製した組み換え
ウイルスを、標準培地添加剤である１０％ウシ胎児血清
のかわりに５０％卵巣補給剤（全体積の１％まで）（ス
コット・バイオロジカルズ社）を用いた通常のＴＣ−１
００（ギブコ社）栄養塩溶液で培養した細胞への感染に
用いる。以前の実験により、上記の条件下のほうがより
完全なタンパク質が得られることが示された。感染細胞
上清を、天然ヒトｔ−ＰＡに対するモノクローナル抗体
が結合しているアフィニティーカラムで分画する。カラ
ムに特異的に保持されるタンパク質を溶出し、ｔ−ＰＡ
酵素活性についてアッセイを行なう。同タンパク質の一
定活性ユニット量と、対照となるｔ−ＰＡ調製物をアク
リルアミドゲルで分離する。同ゲルを次に、タンパク質
パターンを示すために、銀試薬で染色する。これによっ
て、昆虫細胞への感染により、ウイルスがｔ−ＰＡ型活
性を有するタンパク質を細胞外に産生するようになるこ
とが示される。

【００８９】さらに解析するために、まず、ウイルス
（ｍ．ｏ．ｉ．＝１）で感染させたスポドプテラ・フル
ギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ）を４８時間インキュベートすることにより、放射性
標識タンパク質を産生する。次に、培養皿をメチオニン
欠損培地で洗浄する。続いて、³⁵Ｓ−メチオニンを添加
したメチオニン欠損培地を培養皿に加える。細胞培養液
を４時間インキュベートする。放射性標識糖タンパク質
を含む上清は、昆虫細胞内で同様に産生された野生型
（すなわち、全長で完全にグリコシル化されたもの）ｔ
−ＰＡに対して、また、例えばカウフマン他，Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５（７）：１７５０（１９８５）
らの方法で、チュニカマイシン存在下で（非グリコシル
化）産生した哺乳動物ｔ−ＰＡに対して、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（７．５％）によって分析し得る。実施例１で産生
された、部分的グリコシル化短縮タンパク質は、完全グ
リコシル化類似体および非グリコシル化全長類似体と比
較して、増大したゲル泳動度を有するはずである。

【００９０】実施例２ 本発明の別のタンパク質の調製

【００９１】Ａ．別のｃＤＮＡの調製 実施例１の変異導入法は、元来のｔ−ＰＡ ＤＮＡ配列
を修飾する、慣習的に調製した別の合成オリゴヌクレオ
チドを用いて、Ｎ末端領域で修飾し、および／あるい
は、任意にＮ−結合性グリコシル化部位および／あるい
はＡｒｇ−２７５を修飾し、上述のように適切なコドン
変換を含むタンパク質の産生に用いることができる。例
えば、前述の“変異導入ｃＤＮＡの調製：Ｍ１３法”お
よび経路（ａ）−（ｈ）参照。

【００９２】例えば、化合物Ｄ−６，Ｄ−１およびＤ−
３をコードするｃＤＮＡは、Ｍ１３／ｔ−ＰＡのＳａｃ
Ｉ制限断片を用い、各々オリゴヌクレオチド＃８，１
０，および１２で変異を導入して調製し得るが、オリゴ
ヌクレオチド＃３は用いない。Ａｒｇ−２７５は、オリ
ゴヌクレオチド１４あるいは１５を用いてそれぞれ欠失
あるいは、例えばＴｈｒによって置換することができ
る。ベクター構成、形質導入および発現は、昆虫細胞に
ついては実施例１のように、あるいは、哺乳動物細胞に
ついては以下に述べる実施例３のように行なえる。

【００９３】実施例１のように調製された、Ｍ１３変異
導入ベクター（ＲＦ Ｍ１３／ｔ−ＰＡ）から生成した
一本鎖ＤＮＡは、部位特異的な型で、Ａｒｇ−２７５お
よび／あるいはグリコシル化部位Ｒ¹あるいはＲ²あるい
は双方において、変異導入のための鋳型としても使用可
能である。Ａｓｎ₂₁₈を含むコンセンサストリペプチド
をコードする領域も同様に変異が導入される。これらの
部位で多数のタンパク質修飾を調製するために、反復的
な過程が用いられる。例えば、修飾Ｒ¹部位を含むＭ１
３ファージの同定、精製の後、該修飾部位を含む一本鎖
を、ファージから精製し、Ｒ²部位および／あるいはＡ
ｒｇ−２７５における二巡目の変異導入を開始するため
の鋳型として使用可能である。この過程は、全ての望み
の修飾が得られるまで繰り返される。このように、化合
物２−２／Ｎ−２３／Ａｒｇ，２−２／Ｎ−２１／Ａｒ
ｇをコードするｃＤＮＡは、実施例１の方法で、変異導
入オリゴヌクレオチド＃５をオリゴヌクレオチド＃３の
かわりにスクリーニングオリゴヌクレオチド＃６をオリ
ゴヌクレオチド＃４の代わりに用いて調製することがで
きる。化合物２−６／Ｎ−２１／Ａｒｇ，２−６／Ｎ−
２２／Ａｒｇおよび２−６／Ｎ−２３／Ａｒｇをコード
するｃＤＮＡは、実施例１に述べられたようなＳａｃＩ
断片へ２回変異導入し、オリゴヌクレオチド＃５および
＃６を用いてさらに変異導入し、スクリーニングを行な
い、調製できる。ベクター構造、形質導入および発明
が、昆虫細胞の場合には実施例１のように、あるいは、
哺乳動物細胞の場合は以下に述べるように行なう。経路
（ａ）−（ｈ）、前出参照。

【００９４】ＲＦ Ｍ１３／ｔ−ＰＡ変異導入ベクター
がＲ³，タンパク質のカルボキシ末端に最も近いｔ−Ｐ
ＡのＮ−結合性グリコシル化部位をコードするＤＮＡ配
列を含まない。従って、その部位でＤＮＡ修飾を作製す
るため、Ｍ１３／ｔ−ＰＡ：Ｒ１−ＸｍａＩと呼ばれ
る、新しいＭ１３／ｔ−ＰＡ変異導入ＲＦベクターを作
製した。該ベクターは、Ｍ１３ベクターＭ１３ｍｐ１１
をＥｃｏＲＩとＸｍａＩで完全に切断することによって
構成する。該Ｒ１−ＸｍａＩ切断Ｍ１３ベクターを、グ
リコシル化部位Ｒ³を含むポリペプチド領域をコードす
る精製したＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ ｔ−ＰＡ制限断片
（約４３９ｂｐ、ここでは０．４ｋｂｐに連結した。該
０．４ｋｂｐ制限断片は、プラスミドｐＷＧＳＭをＥｃ
ｏＲＩとＸｍａＩで切断後精製した。ｔ−ＰＡ遺伝子を
コードする哺乳動物発現プラスミドｐＷＧＳＭは、カウ
フマンら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１７５０
−１７５９（１９８５）に述べられたプラスミドｐＬＤ
ＳＧと、４３９ｂｐ ＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ切断内で同
等である。

【００９５】連結混合液を、細菌ＪＭ１０１コンピテン
ト細胞の形質転換に使用した。数個のプラークを選択
し、標準的ＤＮＡ制限断片分析によって、０．４ｋｂｐ
ｔ−ＰＡ ＥｃｏＲＩ／ＸｍａＩ断片の存在について
分析した。二重鎖ＲＦ Ｍ１３ＤＮＡを０．４ｋｂｐ
ｔ−ＰＡ断片を含む細胞から精製した。該ＤＮＡをＲＦ
Ｍ１３／ｔ−ＰＡ：Ｍ１３／ｔ−ＰＩ：ＲＩ−Ｘｍａ
Ｉ変異導入ベクターと呼んだ。実施例１Ａで示されたよ
うに、該ベクターは、コンピテントＪＭ１０１細胞に形
質転換した場合、一本鎖Ｍ１３／ｔ−ＰＡ：ＲＩ−Ｘｍ
ａＩが精製できる。Ｍ１３／ｔ−ＰＡ：ＲＩ−ＸｍａＩ
ファージの作製に用いられる。この一本鎖ＤＮＡは、Ｎ
−結合性グリコシル化部位を修飾するために、部位特異
的変異導入反応におけるプライマーとして用いられる。

【００９６】修飾Ｒ³コード配列は、実施例１で調製し
た修飾ｐＩＶＰ／１（短縮形および／あるいは、Ｒ¹お
よび／あるいはＲ²での修飾）あるいは野生型ｐＩＶＰ
／１プラスミドＤＮＡに存在する野生型Ｒ³配列のいず
れかに存在する野生型Ｒ³配列との置換に使用できる。
これは、まず、Ｒ³修飾Ｍ１３／ｔ−ＰＡ：ＲＩ−Ｘｍ
ａＩ変異導入プラスミドベクターをＳａｃＩ／ＡｐａＩ
で完全に切断し、そのように生成されたＲ³修飾１６５
塩基対ｔ−ＰＡ制限断片を単離することによって行なう
ことができる。例えば実施例１のような、昆虫発現ベク
ターｐＩＶＰ／１あるいはｐＩＶＰ／１の修飾ＤＮＡ
を、同様にＳａｃＩとＡｐａＩで完全に切断し、修飾さ
れていないＲ³部位をコードする１６５ｂｐ野生型ｔ−
ＰＡ制限断片を切り出す。１６５ｂｐを欠く精製した昆
虫発現ベクターの修飾Ｒ³１６５ｂｐ断片に連結し、新
しい昆虫発現ベクターを産生する。ベクターの発現によ
り、Ｒ³部位が、いかなるあるいは全ての天然ｔ−ＰＡ
に存在する別のコンセンサスＮ−結合性グリコシル化部
位および／あるいはＡｒｇ−２７５と同様に修飾された
短縮型タンパク質を産生する。

【００９７】修飾ｃＤＮＡを含むｐＩＶＰＡプラスミド
は、Ｒ¹，Ｒ²およびＲ³をコードする領域と同様にＮ末
端領域内の欠失部分にわたる修飾ｔ−ＰＡ ｃＤＮＡの
ＢｇｌII／ＡｐａＩ断片、あるいはＲ¹，Ｒ²，Ｒ³にわ
たるＮａｒＩ／ＸｍａＩ断片の生成に使用できる。これ
らの断片のいずれも、実施例３に示されるようにｐＳＶ
ＰＡ４あるいはｐＷＧＳＭのような哺乳動物発現ベクタ
ーに挿入可能である。

【００９８】実施例３ 哺乳動物内の化合物Ｄ−６，Ｄ−１，およびＤ−３の調
製

【００９９】Ａ．ｃＤＮＡの調製 化合物Ｄ６，Ｄ１，およびＤ３のポリペプチド配列は、
それぞれ変異導入オリゴヌクレオチド＃８，１０，およ
び１２，および実施例１のＭ１３法あるいはヘテロ二重
鎖変異導入法（モリナガヘテロ二重鎖変異導入法；双
方、前出）による鋳型としてのｔ−ＰＡ ｃＤＮＡ Ｓ
ａｃＩ断片を用いて調製した。スクリーニングオリゴヌ
クレオチド９，１１，１３をそれぞれ用いたＤＮＡハイ
ブリダイゼーションによって選択した変異体は、修飾し
たＤＮＡ配列が正しいかＤＮＡ配列分析によって確認し
た。

【０１００】Ｂ．修飾ｔ−ＰＡベクターの調製 実施例１Ａ（Δ，Ｇｌｎ₁₁₇）あるいは３Ａ（Δ）で調
製された各々の修飾ｃＤＮＡを、まず、ベクターをＳａ
ｃＩで完全切断することにより、Ｍ１３変異導入ベクタ
ーＲＦ Ｍ１３／ｔ−ＰＡから除去した。各々の変異導
入ｃＤＮＡの約１．４ｋｂｐ制限断片を、ゲル電気泳動
によって精製し、次に、以下のようにｐＳＶＰＡ４に連
結した。まず、ｐＳＶＰＡ４をＳａｃＩで切断し、野生
型ｔ−ＰＡ １．４ｋｂｐ制限断片を除去した。Ｓａｃ
Ｉ切断ｐＳＶＰＡ４の残りの部分を次に変異導入ｃＤＮ
Ａの１．４ｋｂｐ制限断片に連結した。この連結反応に
よって、挿入断片の向きが２種類生成される。各々の場
合の正しい向きは、慣習的な分析的制限酵素分析での酵
素としてＥｃｏＲＩおよびＲｖｕIIを用いて同定し得
る。この置換により、ＳａｃＩ断片を、ＲＦ Ｍ１３／
ｔ−ＰＡ変異導入ベクターとｐＳＶＰＡ４哺乳動物発現
ベクターとの間のカセット断片として用いることが可能
になる。修飾Ｍ１３ ＳａｃＩ断片（短縮型および任意
にＲ¹および／あるいはＲ³で修飾）は、望むならば前も
ってあるいは引き続いてＲ³で修飾したＳａｃＩ切断ｐ
ＳＶＰＡ４ ＤＮＡに挿入する。もしくは、Ｒ¹，Ｒ²お
よび／あるいはＲ³であらかじめ修飾したＤＮＡを、ｐ
ＩＶＰＡあるいはｐＳＶＰＡなどのベクターからＮａｒ
Ｉ／ＡｐａＩあるいはＮａｒＩ／ＸｍａＩ断片として切
り出すことができる。こうして得られた断片を次に、あ
らかじめＮａｒＩ（部分）およびＡｐａＩあるいはＸｍ
ａＩ（完全）で切断したｐＳＶＰＡ４あるいはｐＷＧＳ
Ｍなどのベクターに挿入する。本方法により、Ｎ末端領
域欠失および／または置換および／またはグリコシル化
部位変異導入および／またはＡｒｇ−２７５変異導入の
いかなる組み合わせも行なわれる。

【０１０１】Ｃ．ＣＯＳ（ＳＶ４０形質転換アフリカミ
ドリザル腎臓）細胞の形質転換 ＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５０）に、Ｍ．
Ａ．ロパタ（Ｌｏｐａｔａ）他，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ．Ｒｅｓ．１２：５７０７−５７１７（１９８４）の
方法によって、実施例３Ｂで調製したベクター、すなわ
ち修飾したｐＳＶＰＡ４で形質導入を行なった。血清含
有培地を形質導入し２４時間後無血清培地と交換し、調
節した培地を、形質導入後４８時間後および７２時間後
に、色素産生基質Ｓ−２２５１を用いてプラスミノーゲ
ン活性化活性の存在、あるいは、ＥＬＩＳＡアッセイに
よってｔ−ＰＡ抗原の存在の双方についてアッセイし
た。

【０１０２】Ｄ．ＣＶ１（アフリカミドリザル腎臓）細
胞におけるウイルス増殖 修飾複合炭水化物タンパク質は、ＣＶ１細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ７０）に、ゲッシング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）とサ
ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）（Ｎａｔｕｒｅ ２９
３：６２０−６２５，１９８１）に示されたようにＳＶ
４０ウイルスストックで感染させることにより産生され
る。これはまず、修飾ｐＳＶＰＡ４を制限エンドヌクレ
アーゼＢａｍＨＩで完全に切断し、ＳＶ４０ウイルスＤ
ＮＡから細菌シャトルベクターｐＸｆ３を除去して行な
った。このＤＮＡをＣＶ１細胞に形質導入する前に、ヘ
ルパーウイルスＳＶ４０−ｒＩＮＳ−ｐＢＲ３２２ Ｄ
ＮＡ（以下に述べる）とともに、ＢａｍＨＩで直鎖状に
したＳＶ４０／ｔ−ＰＡを、希釈したＤＮＡ濃度（１μ
ｇ／ｍｌ）で連結させ、環状にする。この過程を、イン
シュリン含有ＳＶ４０ベクターＳＶ４０−ｒＩＮＳ−ｐ
ＢＲ３２２（Ｍ．ホロウイッツ（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ）
ら，１９８２，Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖ
ｅｃｔｏｒｓ，４７−５３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）について繰り返し
た。ＳＶ４０−ｒＩＮＳ−ｐＢＲ３２２中の細菌シャト
ルベクターｐＢＲ３２２を、完全ＥｃｏＲＩ切断によっ
て除去した。次に、直鎖状インシュリン／ＳＶ４０ウイ
ルスＤＮＡを、ＤＮＡ濃度１μｇ／ｍｌで連結させ、環
状にした。ウイルスストックを生成するために、等モル
量の環状連結ｐＳＶＰＡ４およびＳＶ４０−ｒＩＮＳ
ＤＮＡでＣＶ−１細胞の形質導入を行なうことが必要で
ある。ＳＶ４０−ｒＩＮＳは“後期”ＳＶ４０タンパク
質を供給するために使用され、ｐＳＶＰＡ４はウイルス
ＤＮＡ産生の必須の“初期”ＳＶ４０タンパク質を与
え、また本発明のタンパク質もコードしている。結果と
して、ゲッチングとサムブルックが示したこれらのＤＮ
Ａ双方で細胞の形質導入を行なうと、いずれかのウイル
スベクター由来のＤＮＡを含むＳＶ４０ウイルスが生成
する。ＣＶ１細胞に増幅したウイルスを連続的に感染さ
せると、実施例３Ｃで示したように感染後７２時間でア
ッセイし得るｔ−ＰＡ型活性を有するタンパク質が産生
された。

【０１０３】実施例４ 他のタンパク質の調製 本発明の多様なタンパク質をコードするｃＤＮＡは、実
施例１，２および３の方法によって調製された。次に、
ＢｇｌII／ＸｍａＩ制限断片カセットを、短縮型タンパ
ク質をコードし、１箇所以上のグリコシル化部位の修飾
を有する、あるいは有さないｃＤＮＡを含むｐＩＶＰＡ
あるいはｐＳＶＰＡ４ベクターのいずれかから切り出
す。続いて、切り出したＢｇｌII／ＸｍａＩ断片を、哺
乳動物細胞への導入のために、ＢｇｌII／ＸｍａＩ切断
ｐＳＶＰＡ４あるいはｐＷＧＳＭに連結する。哺乳動物
宿主での上記ｃＤＮＡの発現により、例えば、実施例３
の方法あるいはカウフマンらの方法、前出（ＣＨＯ宿主
細胞）、あるいはハウレー（Ｈｏｗｌｅｙ）らの方法、
米国特許第４，４１９，４４６号（１９８３）（ＢＰＶ
発現系）によって、対応する哺乳動物由来短縮タンパク
質が得られる。このように、化合物２−１／Ｎ−２１／
Ａｒｇ（ΔＦＢＲ，Ｇｌｎ₁₁₇）および２−１／Ｎ−２
２／Ａｒｇ（ΔＦＢＲ／ＥＧＦ，Ｇｌｎ₁₁₇）をコード
するｃＤＮＡを調製し、上述のようにｐＳＶＰＡ４に挿
入した。化合物２−１／Ｎ−２３／Ａｒｇ（ΔＥＧＦ，
Ｇｌｎ₁₁₇）をコードするｃＤＮＡは変異導入オリゴヌ
クレオチド＃１２およびスクリーニングオリゴヌクレオ
チド＃１３を用いるが、１１７位にあらかじめ変異を導
入したｐＳＶＰＡ４（上述）を鋳型として上述のヘテロ
二重鎖法によって調製した。同様に、化合物Ｄ−１（Δ
ＦＢＲ）およびＤ−３（ΔＥＧＦ／ＦＢＲ）をコードす
るｃＤＮＡは上述のようにＭ１３変異導入法によって調
製し、ＳａｃＩ断片として、ＳａｃＩ切断ｐＳＶＰＡ４
に挿入した。化合物Ｄ−６（ΔＥＧＦ）をコードするｃ
ＤＮＡは、ｐＳＶＰＡ４を鋳型とし、変異導入オリゴヌ
クレオチド＃１２を用い、オリゴヌクレオチド＃１３で
スクリーニングを行ない、上述のヘテロ二重鎖法によっ
て調製した。

【０１０４】哺乳動物細胞中での増幅および発現のため
のタンパク質をコードするｃＤＮＡを調製するために、
ｐＳＶＰＡ４あるいはｐＩＶＰＡに含まれるｃＤＮＡを
ＢｇｌII／ＸｍａＩ断片として切り出し、精製したＢｇ
ｌII／ＸｍａＩ切断ｐＷＧＳＭに連結する。それぞれの
場合、得られたｐＷＧＳＭベクターをＣＨＯ細胞に導入
し、カウフマンの方法、前出の方法により増幅する。形
質転換し、増幅したＣＨＯ細胞は化合物Ｄ−６，Ｄ−
１，Ｄ−３，２−１／Ｎ−２３／Ａｒｇ，２−１／Ｎ−
２１／Ａｒｇおよび２−１／Ｎ−２２／Ａｒｇをそれぞ
れ産生し、それらはヒトｔ−ＰＡ特異的抗体によって培
地中に検出された。続いて化合物は回収され、イムノア
フィニティークロマトグラフィーによって精製される。

【０１０５】実施例５ 実施例４は、Ｎ末端領域内および／またはＲ−２７５で
修飾され、Ｒ¹，Ｒ²および／あるいはＲ³における修飾
を有するか、あるいは有さないタンパク質をコードする
ｃＤＮＡを用いて繰り返され、望みのタンパク質がＣＨ
Ｏ細胞中に産生される。変異導入ｃＤＮＡは上述のよう
に調製される。このように、化合物２−７／Ｎ−２３／
Ａｒｇ，２−７／Ｎ−２１／Ａｒｇおよび２−７／Ｎ−
２２／Ａｒｇは実施例２で述べられたように、ｐＩＶＰ
Ａ内で調製される。次に、ｃＤＮＡをＢｇｌII／Ｘｍａ
Ｉ断片として切り出し、精製したＢｇｌII／ＸｍａＩ切
断ｐＷＧＳＭに連結し、得られたベクターを実施例４の
ようにＣＨＯ細胞に形質転換し増幅させ、化合物２−７
／Ｎ−２３／Ａｒｇ，２−７／Ｎ−２１／Ａｒｇおよび
２−７／Ｎ−２２／Ａｒｇが産生される。

【０１０６】実施例６ 各種改変体の活性 以下の表９に示す改変体を作製して本願発明のｔ−ＰＡ
改変体の活性を測定した。表９に記載の各改変体は以下
のように特定される：すなわち、アミノ酸置換は、改変
すべき天然型アミノ酸の同定（例えば、Ｆ１改変体にお
いて、”Ｅ９”は位置９におけるグルタミン酸）とそれ
に続く矢印で示される置換アミノ酸（例えば、Ｆ１改変
体においては”Ｒ”、すなわちアルギニン）で示す。し
たがって、Ｆ１改変体は位置９におけるグルタミン酸に
代えてアルギニンを含む。改変体において削除されたア
ミノ酸は”ｄ”の文字とそれに続く位置で示す。したが
って、Ｆ９改変体においては、位置４０−４２のアミノ
酸が削除されている。なお、表９に示したタンパク質ア
ッセイはｔ−ＰＡに特異的なＥＬＩＺＡ法を用いて実施
した。プラスミノーゲン活性化活性は、プラスミノーゲ
ン、プラスミノーゲンに対する基質（Ｓ−２２５１）、
および刺激剤としてのフィブリノーゲン分解ペプチドの
存在下にｔ−ＰＡ改変体をインキュベートすることによ
り測定した。ｔ−ＰＡの活性はＳ−２２５１の加水分解
による４０５ｎｍにおける吸光度の増加率から計算し
た。表９に示すように、各種改変体はプラスミノーゲン
活性を示した。

【表２６】

【０１０７】改変体の半減期およびフィブリノーゲン溶
解性 本願発明の改変体の半減期およびフィブリノーゲン溶解
性を野生型と比較して測定した。改変体は本発明のタン
パク質２−１／Ｎ−２２／Ａｒｇ（以下、△ＦＥ１Ｘと
いう）；２−７／Ｎ−２２／Ａｒｇ（以下、△ＦＥ３Ｘ
という）およびＤ−３（以下、△ＦＥという：△ＦＥは
Ｎ−グリコシル部位での修飾を全くもたない改変体）で
ある。半減期はコレンら（Collen et al., 1988, Blood
71:216-219）に記載のウサギモデルを用いて測定し
た。結果を表１０に示す。表１０から明らかなように、
本願発明のタンパク質は野生型に比較してｉｎ ｖｉｔ
ｒｏでの改良された半減期を有し、これは治療レベルに
おける血栓溶解活性の保持を示す。次に、上記各タンパ
ク質５１ｎＭ溶液と３７℃で４時間インキュベーション
した後のヒト血漿中に残る基底フィブリノーゲンレベル
の％として表したフィブリノーゲン溶解性を表１０に併
せて示す。これらの結果は、△ＦＥ１Ｘや△ＦＥ３Ｘタ
ンパク質のような複数の構造修飾を組み合わせた改変体
の方が△ＦＥのような単一の修飾をもつ改変体よりも有
利であることを示唆する。

【０１０８】 表１０：半減期およびフィブリノーゲン溶解性 改変体 半減期＊ フィブリノーゲン溶解性＊＊ 野生型ｔ−ＰＡ ４分 〜５％ △ＦＥ ２５分 〜５％ △ＦＥ１Ｘ ４２分 ３２％ △ＦＥ３Ｘ １４分 ６１％

【０１０９】改変体の血栓溶解性 野生型ｔ−ＰＡ、△ＦＥ、△ＦＥ１Ｘおよび△ＦＥ３Ｘ
の血栓溶解性を比較した。新鮮凍結クエン酸化ヒト血漿
中の各種濃度における全クロット溶解率（％）を３７℃
でのインキュベーション時間を関数として測定した。試
験したタンパク質濃度は０．５、１．７、５．１、１７
および５１ｎＭである。図１はインキュベーション１．
５時間後に測定したタンパク質の用量応答曲線である。

【０１１０】改変体のフィブリン結合性 本願発明の改変体および野生型ｔ−ＰＡのフィブリン結
合性を図２に示す。この試験ではメラノーマｔ−ＰＡ、
△ＦＥ、△ＦＥ１Ｘおよび△ＦＥ３Ｘのフィブリン結合
性を比較した。簡単に述べると、少量のｔ−ＰＡまたは
改変体と各種濃度のフィブリノーゲンを混合し、フィブ
リノーゲンをフィブリンに変換するためのトロンビンを
加えてアッセイを実施した。次いで混合物を遠心し、フ
ィブリンクロットに結合したｔ−ＰＡまたは改変体の％
を、上清の抗原濃度から計算する。図２から明らかなよ
うに、野生型ｔ−ＰＡは試験したすべての濃度で△ＦＥ
または△ＦＥ１Ｘよりもフィブリンとよく結合した。△
ＦＥ３Ｘは△ＦＥや△ＦＥ１Ｘよりも結合性が高く、最
大フィブリン濃度では野生型ｔ−ＰＡに比較してやや結
合性が低かった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本願発明のＤＮＡ分子を用いて得られるｔ−Ｐ
Ａ改変体の血栓溶解性を示す図である。

【図２】本願発明のＤＮＡ分子を用いて得られるｔＰＡ
改変体のフィブリン結合性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ８８２０５１ (32)優先日 1986年７月３日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 アハーン，ティム・ジェイ アメリカ合衆国マサチューセッツ州02139, ケンブリッジ，パイン・ストリート 104

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列中、２
   ４５位のアミノ酸がＭｅｔ又はＶａｌであり、 （ｂ）少なくとも１個のＮ−結合性グリコシル化部位
   が、コンセンサスＮ−結合性グリコシル化部位以外のも
   のに修飾されており、そして （ｃ）Ｇｌｙ−（−３）からＴｈｒ−９１までの領域内
   で１個以上のアミノ酸が置換している、 ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列と実質的に同じペプチド配
   列を有することを特徴とする、組織プラスミノーゲン活
   性化因子型活性を有する血栓溶解タンパク質。
2. 【請求項２】（ａ）ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列中、２
   ４５位のアミノ酸がＭｅｔ又はＶａｌであり、 （ｂ）少なくとも１個のＮ−結合性グリコシル化部位
   が、コンセンサスＮ−結合性グリコシル化部位以外のも
   のに修飾されており、そして （ｃ）Ｇｌｙ−（−３）からＳｅｒ−５０までの領域内
   で１個以上のアミノ酸が置換している、 ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列と実質的に同じペプチド配
   列を有することを特徴とする、組織プラスミノーゲン活
   性化因子型活性を有する血栓溶解タンパク質。
3. 【請求項３】（ａ）ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列中、２
   ４５位のアミノ酸がＭｅｔ又はＶａｌであり、 （ｂ）少なくとも１個のＮ−結合性グリコシル化部位
   が、コンセンサスＮ−結合性グリコシル化部位以外のも
   のに修飾されており、そして （ｃ）Ｃｙｓ−５１からＴｈｒ−９１までの領域内で１
   個以上のアミノ酸が置換している、 ヒトｔ−ＰＡのペプチド配列と実質的に同じペプチド配
   列を有することを特徴とする、組織プラスミノーゲン活
   性化因子型活性を有する血栓溶解タンパク質。