FI117940B - Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorinmuunnelman (t-PA-muunnelman) valmistamiseksi - Google Patents

Description

1 117940

MENETELMÄ IHMISEN KUDOSPLASMINOGEENIAKTIVAATTORIMUUNNELMAN (t-PA-MUUNNELMAN) VALMISTAMISEKSI

5

Keksinnön tausta 1. Keksinnön ala Tämä keksintö kohdistuu menetelmään ihmisen kudos-plasminogeeniaktivaattorimuunnelman(t-PA-muunnelman) valmis-10 tamiseksi, jolla on pitempi puoliintumisaika verenkierrossa ja oleellisesti säilynyt sitoutuminen fibriiniin tai parempi fibrinolyyttinen tehokkuus in vivo verrattuna villin tyypin ihmisen t-PA:iin.

II. Keksinnön taustan ja siihen läheisesti liittyvän alan 15 kuvaus

Kudosplasminogeeniaktivaattori (t-PA) on multido- mainiseriiniproteaasi, jonka fysiologinen tehtävä on plas- minogeenin muuttaminen plasmiiniksi ja siten fibrinolyysip- rosessin aloittaminen tai sen kiihdyttäminen.

20 Alunperin kliininen mielenkiinto kudosplas- minogeeniaktivaattoriin virisi johtuen sen suhteellisen suu- .·. : resta aktiivisuudesta fibriinin läsnäollessa verrattuna sii- • ·» hen, että fibriiniä ei ollut läsnä. Villin tyypin t-PA on • · heikko entsyymi fibriinin puuttuessa, mutta fibriinin läsnä- • * · 25 olo lisää huomiota herättävästi sen kykyä aktivoida plas- * * * : ·' minogeeni. Ilman stimulaatiota melanooman t-PA:n tai tai ih- • · · • ••I misen rekombinantti-t-PA: n (Activase® t-PA) katalyyttinen • * * : tehokkuus [katalyyttinen nopeusvakio (kcat) /Michaelis' in va kio (Km)] plasminogeenin aktivoimiseksi on likimäärin • *.. 30 1 nM'1s~1, kun taas fibriinin tai fibriinin hajoamistuottei- den läsnäollessa tämä tehokkuus (pseudonopeusvakio) on li- • · · sääntynyt monisatakertaiseksi. Tämän t-PA: n epätavallisen • · ... biokemiallisen ominaisuuden on ajateltu kääntyvän kliinises- • · **;·* ti trombolyyttiseksi tuotteeksi, joka aloittaa systemaatti- 35 sen plasminogeenin aktivoitumisen vähemmän todennäköisesti kuin ei-fibriinispesifiset trombolyytit (kuten streptokinaa-si tai urokinaasi [Sobel, B. E. et ai., Circulation 69, 983 2 117940 - 990 (1984)]. Ihmisen rekombinatti-t-PA:a käytetään hoidollisesti fibrinolyyttisenä aineena hoidettaessa akuuttia sydäninfarktia ja keuhkoveritulppaa, jotka molemmat ovat sairaustiloja, jotka ovat tavallisesti tulosta fibriiniä sisäl-5 tävän veritulpan aiheuttamasta verisuonen tukkeumasta.

Kudosplasminogeeniaktivaattorin huomiota herättävän fibriinispesifisyyden lisäksi sillä on useita muita selvästi erottuvia tunnuspiirteitä.

(a) t-PA eroaa useimmista seriiniproteaaseista siinä, 10 että molekyylin yksiketjuisella muodolla on huomattava ent-symaattinen aktiivisuus. Kaksiketjuisella t-PA:11a on suurempi aktiivisuus kuin yksiketjuisella t-PA:11a joitakin pieniä substraatteja kohtaan ja plasminogeenia kohtaan fib-riinin puuttuessa. Kuitenkin fibriinin läsnäollessa nämä 15 kaksi t-PA-muotoa ovat yhtä aktiivisia [Rijken et ai., J. Biol. Chem., 257, 2920 - 2925 (1981); Lijnen et ai., Thromb. Haemost. 64, 61 - 68 (1990); Bennet et ai., J. Biol. Chem. 266, 5191 - 5201 (1991)]. Useimmat muut seriiniproteaasit esiintyvät tsymogeeneinä ja vaativat proteolyyttisen pilk-20 koutumisen kaksiketjuiseksi muodoksi täyden entsymaattisen . aktiivisuuden vapauttamiseksi.

^ . (b) Eräs serpiini, PAI-1, voi estää t-PA:n toiminnan • »« .1 in vivo ja in vitro [Vaughan, D. E. et ai., J. Clin. In- • · t • ·’ vest., 84, 586 - 591 (1989); Wiman, B. et ai., J. Biol.

25 Chem., 259, 3644 - 3647 (1984)].

• · · • · · ί .* (c) t-PA sitoutuu fibriiniin in vitro Kd-arvon olles- » ...T sa μΜ-vaihtelualueella.

• * * · (d) t-PA puhdistuu nopeasti verestä in vivo, mikä ta pahtuu yhden tai useamman reseptorin välittämänä maksassa ·*·.. 30 [Nilsson, S. et ai., Thromb. Res. 39, 511 - 521 (1985); Bu- ;***; gelski, P. J. et ai., Throm. Res. 53, 287 - 303 (1989); Mor- ***. ton, P. A. et ai., J. Biol. Chem. 264, 7228 - 7235 (1989)].

Collen et ai. tuottivat ensimmäisinä oleellisesti * · · • · '·**’ puhtaan t-PA:n muodon luonnollisesta lähteestä ja testasivat 35 sen aktiivisuuden in vivo (US-patentti 4 752 603, myönnetty ·*·*; 21. päivä kesäkuuta, 1988) [katso myös julkaisu Rijken et • · ai., J. Biol. Chem., 256 : 7035 (1981)]. Pennica et ai. [Na- 3 117940 ture, 301 : 214 (1983)] määrittivät t-PA:n DNA-sekvenssin ja johtivat aminohapposekvenssin tästä DNA-sekvenssistä (katso . US-patentti 4 766 075, myönnetty elokuun 23. päivä, 1988).

Villin tyypin humaanisella t-PA:lla on mahdolliset N-5 sitoutuneet glykosylaatiopaikat aminohappoasemissa 117, 184, 218 ja 448. On raportoitu, että ihmisen rekombinantti-t-PA (Activase® t-PA), joka on tuotettu CHO-soluissa aikaansaadun ekspressoitumisen avulla, sisältää likimäärin 7 paino-% hiilihydraattia, joka koostuu suuren mannoosipitoisuuden omaa- Ί 10 vasta oligosakkaridista asemassa 117 ja kompleksisista oligosakkarideista asemissa Asn-184 ja Asn-448 [Vehar, G. A. et ai., "Characterization Studies of Human Plasminogen Activator produced by Recombinant DNA Technology", Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 1986; LI : 551 - 15 562]. Aseman 218 ei ole havaittu olevan glykosyloitunut al kuperäisessä t-PA:ssa. Paikat 117 ja 448 näyttävät olevan aina glykosyloituneita, kun taas paikan 184 otaksutaan olevan glykosyloitunut noin 50 %:ssa molekyyleistä. t-PA-mole-kyyleistä, jotka ovat glykosyloituneet asemaan 184 liittyen, 20 käytetään nimitystä tyypin I t-PA ja molekyyleistä, jotka eivät ole glykosyloituneet asemaan 184 liittyen, käytetään : nimitystä tyypin II t-PA. CHO-soluista peräisin olevan hu- • · maanisen t-PA:n hiilihydraattirakenteiden laajimman analyy- • · ) 1' sin ovat toteuttaneet Spellman et ai. [J. Biol, Chem., 264 .!*! 25 (24), 14100 - 14111 (1989)], jotka osoittivat, että prote- * iinista voitiin havaita vähintään 17 erilaista Asn-sitou-• · · •»•j tunutta hiilihydraattirakennetta. Nämä ulottuivat suuren • · · *.* * mannoosipitoisuuden omaavista rakenteista asemassa 117 di-, tri- ja tetra-antennaarisen N-asetyylilaktosamiinin tyyppi-: 30 siin rakenteisiin asemissa 184 ja 448. Raportoitiin, että tyypin I ja tyypin II kudosplasminogeeniaktivaattorit olivat N-glykosyloituneita identtisellä tavalla liittyen Asn-117- • · ja Asn-448-asemiin liittyen, kun ne oli eristetty samasta * · 'Ϊ solulinjasta. Lisätietojen saamiseksi katso julkaisu Parekh, 35 Raj B. et ai., Biochemistry 28, 7644 - 7662 (1989).

·· · • Kudosplasminogeeniaktivaattorin (t-PA) sekvens sianalyysi on osoittanut, että molekyylillä on viisi domai- i ' 117940 4 nia. Kukin domaini on määritetty viitaten homologisiin rakenteellisiin tai toiminnallisiin alueisiin muissa proteiineissa, kuten trypsiinissä, kymotrypsiinissä, plas-minogeenissa, protrombiinissa, fibronektiinissä ja epider-5 maalisessa kasvutekijässä (EGF). Nämä domainit on nimetty lähtien t-PA:n aminohapposekvenssin N-päätteestä sormido-mainiksi (F) aminohaposta 1 - suunnilleen aminohappoon 44, kasvutekijädomainiksi (G) aminohaposta noin 45 suunnilleen aminohappoon 91 (perustuen homologiaan EGF:n kanssa), krin-10 gle-l-domainiksi (Kl) aminohaposta noin 92 suunnilleen aminohappoon 173, kringle-2-domainiksi (K2) suunnilleen aminohaposta 180 suunnilleen aminohappoon 261 ja seriinipro-teaasidomainiksi (P) suunnilleen aminohaposta 264 karboksyy-lipäätteeseen aminohapossa 527. Nämä domainit sijaitsevat 15 olleellisesti vierekkäin ja niitä yhdistävät lyhyemmät "kyt-kytfragmentti"-alueet. Nämä kytkytfragmenttialueet saattavat kypsän polypeptidin aminohappojen kokonaismäärän 527:ään, vaikka silloin tällöin aminopäätteessä on havaittu kolme ylimääräistä jäännöstä (Gly-Ala-Arg). Tämän ylimääräisen 20 tripeptidin on yleensä otaksuttu olevan epätäydellisen pre-kursoriprosessin tulosta ja sen ei tiedetä tuottavan toimin- ; nallisuutta. Alkuperäinen t-PA voidaan halkaista asemien 275 • · · ja 276 välistä (sijaitsevat seriiniproteaasidomainissa) mo- • · * ; lekyylin 2-ketjuisen muodon tuottamiseksi.

• · * 25 Kukin domaini myötävaikuttaa eri tavalla t-PA-mole- • * · : ·* kyylin biologisesti merkitseviin yleisominaisuuksiin. Domai- nin deleetiotutkimukset osoittavat, että sormidomainin, kas- • · · V · vutekijädomainin tai kringle-2-domainin häviäminen tuottaa tulokseksi t-PA-muunnelman vähentyneen sitoutumisaf- 30 finiteetin fibriiniin [van Zonneveld, A. J. et ai., Proc.

:***: , Natl. Acad. Sei. USA 83, 4670 - 4677 (1986); Verheijen, J.

H. et ai., EMBO J. 5, 3525 - 3530 (1986)], kuitenkin myöhem- ... mät tulokset, jotka on saatu substituutiomutanteilla, osoit- • · *·;·* tavat, että kringle-2-domaini on vähemmän osallisena fib- :***: 35 riinisitoutumisessa kuin aikaisemmin on otaksuttu [Bennet, ·*· :*·*: W. F. et ai., J. Biol. Chem. 266, 5191 - 5201 (1991)]. Do- • ♦ mainideleetiotutkimukset ovat paljastaneet, että sormi- ja 117940 s kasvutekijädomainit ovat osallisina maksan aiheuttamassa puhdistumassa [Collen et ai-, Blood 71, 216 - 219 (1988);

Kalyan et ai., J. Biol. Chem. 263, 3971 - 3978 (1988); Fu et ai., Thromb. es. 50, 33 - 41 (1988); Refino et ai., Fib- 5 rinolysis 2, 30 (1988); Larsen et ai., Blood 73, 1842 - 1850 (1989); Browne et ai., J. Biol. Chem., 263, 1599 - 1602 (1988)]. Kringle-2-domaini vastaa sitoutumisesta lysiiniin. Seriiniproteaasidomaini vastaa t-PA:n entsymaattisesta aktiivisuudesta ja sisältää spesifisiä alueita, joilla tapah-10 tuneiden mutaatioiden on osoitettu vaikuttavan sekä fib-riinisitoutumiseen että fibriinispesifisyyteen (mahdollisesti suorat vuorovaikutukset fibriinin kanssa), ja muita alueita, joilla vain fibriinispesifisyys on muuttunut (mahdollisesti epäsuorat vuorovaikutukset fibriinin kanssa) (Ben-15 nett et ai., 1991, edellä). Tutkimukset mutanteilla, jotka ovat tulosta paikkaan kohdistetuista muutoksista, osoittavat t~PA:n glykosylaation osallisuuden puhdistumisessa plasmasta [Lau et ai., Bio/Technology 5, 953 - 958 (1987); Lau et ai., Bio/Technology 6, 734 (1988)].

20 Villin tyypin humaanisen t-PA:n suhteellisen nopea puhdistuma plasmasta, vaikkakin se on etu potilailla, jotka ; tarvitsevat kiireellistä väliintuloa trombolyysin jälkeen, vaatii jatkuvaa laskimonsisäistä t-PA:n antamista t-PA:n * * * * ; hoidollisen pitoisuuden ylläpitämiseksi veressä. Activase® ·, • · * *·:·* 25 t-PA:n suositeltu kokonaisannos trombolyyttistä hoitoa var- • * · ί .* ten akuutissa keuhkoveritulpassa on 100 mg aikuisilla poti- * lailla annettuna jatkuvana laskimonsisäisenä infuusiona 2 • « · V · tunnin ajan. t-PA-johdannaisia, joilla on pitempi puoliin tumisaika plasmassa (hitaampi puhdistuma), voitaisiin antaa ·*·.. 30 potilaalle bolusruiskeena ja se tuottaisi suuremmat konsent- .***. raatiot plasmassa kuin voidaan saada antamalla villin tyypin • * * . t-PA:a jatkuvana infuusiona, mistä voisi olla seurauksena tehokkaan annoksen vähentäminen. t-PA-mutantit, jotka puh- * · *·;·* distuvat plasmasta hitaammin, voisivat tarjota erityisiä :***: 35 etuja hoidettaessa sairaustiloja, kuten syvää laskimotukos- ··« ·**; ta, hoidettaessa infarktipotilasta reperfuusion jälkeen ja » i hoidettaessa keuhkoveritulppaa tai perifeeristä valtimotu- 117940 6 kosta (perifeeristä verisuonitautia).

Tarvetta t-PA-muunnelmista, joita voidaan antaa potilaalle bolusmuodossa, korostaa viimeaikainen kiinnostus villin tyypin humaanisen t-PA:n (erityisesti yksiketjuisen muo-5 don) antamiseksi boluksena tarkoituksena edistää infarktiin liittyvää sepelvaltimon varhaista avoimuutta ja parantaa sydänlihaksen säästymistä vaurioitumiselta [Verstraete et ai.,

Lancet 14, 1566 - 1569 (1989); Neuhaus, JACC 14, 1566 - 1569 (1989); Khan et ai., Am. J. Cardiol. 65, 1051 - 1056 (1990); 10 Purvis, J. A. et ai., Am. J. Cardiology 68, 1570 - 1574 (1991)]. Viimeaikaisten kliinisten tutkimusten tulokset osoittavat, että villin tyypin humaanisen t-PA:n antaminen laskimonsisäisesti bolusannoksena ei vain nopeuta trombo-lyyttisen hoidon alkua, vaan myös suhteellisen suuren t-PA-15 konsentraation saavuttaminen nopeasti lisää trombolyysiä [Neuhaus, K. L., edellä; Topol, E. J., J. Am. Coll. Car-: diol., 15, 922 - 924 (1990)].

t-PA-muunnelmia, jotka puhdistuvat hitaammin plasmasta, on valmistettu hävittämällä yksittäisiä aminohappoja, 20 domainien osia tai täydellisiä domaineja molekyylistä. Seu-raavat julkaisut edustavat yrityksiä hidastaa villin t-PA- ; tyypin puhdistumanopeutta hävittämällä osittain tai kokonaan • * · .! kasvutekijä- ja/tai sormidomaini, mahdollisesti yhdistettynä • · · * ; ' muiden mutaatioiden kanssa: Browne et ai., 1988, edellä; Jo- • · « [;·;* 25 hannessen et ai., Thromb. Haemostas., 63, 54 - 59 (1990); : ·* Collen et ai., 1988, edellä; Kalyan et ai., 1988, edellä; • r ...Y Sobel et ai., Circulation 81, 1362 - 1373 (1990); Cambier et * · · : ai., J. Cardiovasc. Pharmacol., 11 : 468 (1988); Ann. Rev.

, Pharmacol. Toxicol., 30 : 91 (1990); Trill et ai., Fib- 30 rinolysis 4, 131 - 140 (1990); US-patentti 4 935 237 (myön- :***; netty kesäkuun 19. päivä, 1990); EP-A 241 208 (julkaistu lo- ·. kakuun 14 päivä, 1987); EP-A 240 334 (julkaistu lokakuun 7.

päivä, 1987). Collen et ai. (Thromb. Haemost. 65, 174 - 180 • · *»··* (1991) ovat julkaisseet t-PA-muunnelman, jolla on kahdentu- 35 nut kringle-2-domaini ja raportoidusti hidastunut puhdistuma ’ j*.*. plasmasta.

On arvioitu erilaisten t-PA-muunnelrnien aminohap- 7 117940 : posubstituutioiden kyky hidastaa t-PA:n puhdistumanopeutta ja lisätä sen puoliintumisaikaa. On raportoitu, että substituutiot aminohappoalueilla 63 - 72 (ja erityisesti asemiin 67 ja 68 liittyen) ja 42 - 49 lisäävät villin tyypin hu-5 maanisen t-PA:n puoliintumisaikaa plasmassa [katso patenttijulkaisu WO 89/12681, julkaistu joulukuun 28. päivä, 1989, ja julkaisu Ahern et ai., J. Biol. Chem., 265, 5540 (1990)].

On mainittu, että arginiinin korvaaminen alkuperäisen kypsän t-PA:n asemassa 275 glutamiinihapolla tuottaa t-PA:n, jonka 10 puhdistumanopeus on noin kaksi kertaa hitaampi kuin villin tyypin humaanisen t-PA:n puhdistumanopeus [Hotchkiss et ai.,

Thromb. Haemost., 58 : 491 (1987)].

Toinen lähestymistapa t-PA:n puhdistumanopeuden hidastamiseksi ja/tai puoliintumisajan pidentämiseksi on ollut ·" 15 kompleksin muodostaminen t-PA-molekyylin ja toisen molekyylin välillä. Esimerkiksi t-PA-polyetyleeniglykolikonjugaatin on selostettu hidastavan t-PA:n puhdistumanopeutta, kuten julkaisusta EP-A 304 311 (julkaistu 22. helmikuuta, 1989) käy ilmi. On selostettu, että t-PA:n monoklonaalinen vasta-20 aine lisää t-PA:n toiminnallista puoliintumisaikaa in vivo vähentämättä sen aktiivisuutta (Katso patenttijulkaisu EP-A ι·< . 339 505, julkaistu marraskuun 2. päivä, 1989) .

.1 .* On myös tutkittu hiilihydraattien osallisuutta t-PA:n « * · * ·* puhdistumassa. On valmistettu ja tutkittu t-PA-muunnelmia, * · · · .11 |·Σ·* 25 joilla on erilainen hiilihydraattiprofiili kuin ihmisen vil- • · * : liä tyyppiä olevalla t-PA:lla.

* ..ΙΓ Esimerkkeinä tästä lähestymistavasta yksi tai useampi :,*.:*.* asemista 60, 64, 65, 66, 67, 78, 79, 80, 81, 82, 103, 105, 107 ja 250 on substituoitu sopivilla aminohapoilla molekyy- * ·*·., 30 lien luomiseksi, joilla on glykosylaatiopaikat joissakin näistä jäännöksistä tai lähellä niitä (katso patenttijulkai-• , su WO 89/11531, julkaistu 30. marraskuuta, 1989). Näistä t- ' PA-muunnelmista T103N-ekstraglykosylaatio-t-PA-mutantilla • · *···* esimerkiksi on noin 5-kertaa hitaampi puhdistuma kuin alku- ;***: 35 peräisellä t-PA:lla.

• * ·

Toinen työ on keskittynyt villin tyypin t~PA:n gly- • * kosylaatiopaikkojen muuttamiseksi ei-glykosyloituneiksi pai- 1 1 7940 8 koiksi. On selostettu, että kringle-2- ja proteaasidomai-neista koostuvan t~PA:n glykosyloitumaton muunnelma puhdistuu hitaammin plasmasta kuin villin tyypin t-PA [Martin et ai., Fibrinolysis 4 (Suppl. 3) : 9 (Abstract 26) (1990)].

5 Hotchkiss et ai. [Thromb. Haemost., 60 : 255 (1988)] poistivat valikoivasti oligosakkaridijäännökset t-PA-molekyylistä ja osoittivat, että näiden jäännösten poistaminen hidasti t-PA:n puhdistumanopeutta. Nämä tutkijat sekä Lau et ai. [(1987) edellä; (1988) edellä] tuottivat myös t-PA-muunnel-10 man N117Q (jossa asparagiini asemassa 117 villin tyypin humaanisessa t-PA:ssa oli substituoitu glutamiinilla) gly-kosylaation estämiseksi asemasssa 117. Tämä muunnelma, samaten kuin muunnelma, joka oli saatu poistamalla entsymaattisesti suuren mannoosipitoisuuden omaava oligosakkaridi 15 tästä asemasta, osoitti noin 2-kertaa hitaampaa puhdistuma-nopeutta kuin villin tyypin humaaninen t-PA. Katso myös patenttijulkaisut EP-A 238 304, julkaistu 23. syyskuuta, 1987, ja EP-A 227 462, julkaistu 1. heinäkuuta, 1987.

Seuraavissa julkaisuissa on kuvattu muita ihmisen t- 20 PA-glykosylaatiomuunnelmia ja niillä on ilmoitettu olevan hidastunut puhdistumanopeus: Ahern et ai., edellä (Q42N, φ·# . H44E,Nll7Q-t-PA) ; Collen et ai., (1988) edellä [del(C6- / 186) N117Q-t-PA ja del (C6-I86) N117Q, N184Q, N448Q-t-PA] ; Haig- : wood et ai., Prot. Engineer. 2, 611 (1989) (N117Q,N184Q -t- V':’ 25 PA) .

* * * : Olemme havainneet, että villin tyypin humaanisen t- ...Γ PA:n puoliintumisajan pidentämistä verenkierrossa lisäämällä ··· V * ' ylimääräinen glykosylaatio aminohappoasemiin 103 - 105 seu rasi myös fibriinisitoutumisaffiniteetin ja/tai plasman hyy-30 tymänhajottamisaktiivisuuden häviö. Esimerkiksi treoniinin korvaaminen asparagiinilla ihmisen villiä tyyppiä olevan t- «·» * , PA:n aminohappoasemassa 103 hidasti puhdistumanopeutta noin 5-kertaisesti, mutta johti myös t-PA:n toiminnan häviämiseen • · *"·’ siinä, että t-PA:n fibriinisitoutumisaffiniteetti ja -aktii- :***: 35 visuus vähenivät merkitsevästi. Sen seurauksena, johtuen ·*·*: . tämän glykosylaatiomuunnelman hitaammasta puhdistumasta sen * « konsentraatiot plasmassa olivat noin 4 - 5-kertaa suurempia 9 117940 kuin Activase® -t-PA:n samalla annoksella saadut konsentraa-tiot, mutta sen vähentyneestä aktiivisuudesta johtuen tehokkuudessa tai fibrinolyyttisessä tehossa in vivo saavutettu parannus oli vähäinen.

5 Tämä keksintö perustuu mm. spesifiseen menestykselli seen tutkimukseen, joka osoittaa, että t-PA:n fibriinisitou-tumisen häviö, joka johtuu muutoksesta, jonka primaarinen tarkoitus on villin tyypin t:PA:n farmakokineettisten ominaisuuksien (hidastunut puhdistuma plasmasta, pidentynyt 10 puoliintumisaika verenkierrossa) parantaminen, voidaan palauttaa toisella muutoksella vaarantamatta saavutettua hidastunutta puhdistumanopeutta tai pidentynyttä puoliintumis-aikaa plasmassa. Tämä keksintö perustuu lisäksi kokeelliseen todisteeseen, joka osoittaa, että tällaisten t-PA-muunnelmi-15 en hyytymää hajottavaa (fibrinolyyttistä) tehokkuutta in vivo voidaan merkitsevästi parantaa verrattuna villin tyypin humaanisen t-PA:n vastaavaan tehokkuuteen erityisesti, jos muutoksia t-PA:n glykosylaatiomallissa täydentävät ylimääräiset spesifiset muutokset t-PA:n proteaasidomainissa. Tu-20 loksena saadaan molekyylejä, joilla on parempi fibrinolyyt-tinen tehokkuus verrattuna villin tyypin humaanisen t-PA:n : tehokkuuteen ja jotka kykenevät myös plasman hyytymien no- • · · peampaan hajotukseen kuin villin tyypin humaaninen t-PA ja • · I niillä voi olla lisäksi parempi fibriinispesifisyys.

**** 25 Yhteenveto keksinnöstä * * · • 4 · • ♦* Olemme yllättäen havainneet, että fibriinisitoutumi- • · · ··.: sen häviö, joka on havaittu hitaasti puhdistuvilla t-PA- • * ♦ *.* * muunnelmilla, joilla on ylimääräinen glykosylaatiopaikka villin tyypin humaanisen t-PA:n aminohappoasemissa 103 - ·· _ • *.· 30 105, voidaan korjata poistamalla toiminnallinen hiilihyd- raattirakenne aminohappoasemasta 117. Nämä muutokset yhdis-tettynä sallivat t-PA-muunnelman puoliintumisajan pitenemi- « * ... sen verenkierrossa vaarantamatta sen sitoutumisaffiniteettia • · *·"* fibriiniin. Villin tyypin t-PA:n in vivo fibrinolyyttistä • 44 35 tehokkuutta (hyytymän hajotus yksikköannosta kohden) voidaan \ **: myös parantaa, erityisesti kun molekyyliin tuotetaan ylimää räinen muutos, joka parantaa fibriinispesifisyyttä.

10 1 1 7940

Siten keksintö koskee menetelmää t-PA-muunnelmien valmistamiseksi, joka on glykosyloitunut villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin mihin tahansa asemiin 103 -105 liittyen ja jolta puuttuu toiminnallinen hiilihydraatti-5 rakenne villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemasta 117 ja jolla on pitempi puoliintumisaika verenkierrossa ja oleellisesti säilynyt sitoutuminen fibriiniin tai parempi fibrinolyyttinen tehokkuus in vivo verrattuna villin tyypin ihmisen t-PA:iin.

10 Edullisessa suoritusmuodossa tällaiset t-PA-muunnel- mat osoittavat vähintään samanlaista sitoutumista fibriiniin kuin villin tyypin humaaninen t-PA.

Toisessa edullisessa suoritusmuodossa tällaisilla t-PA-muunnelmilla on lisääntynyt fibrinolyyttinen tehokkuus in 15 vivo verrattuna villin tyypin humaaniseen t-PA:iin.

Lukuunottamatta hiilihydraattia alkuperäisen t-PA-molekyylin aminohappojäännöksessä 117 tämän keksinnön t-PA-muunnelmat säilyttävät edullisesti toiminnallisen hiilihydraattirakenteen asemissa, jotka ovat glykosyloituneita vil-20 Iin tyypin humaanisessa t-PA:ssa.

Ylimääräinen glykosylaatiopaikka on edullisesti vil- ,·, · Iin tyypin humaanisen t-PA:n aminohappoasemassa 103 tai 105.

• * *

Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa ylimääräinen • * * u • · ‘ ’ glykosylaatio on N-sitoutunut ja tulokseksi saadut muunnel- « · · ]**;* 25 mat sisältävät asparagiinin missä tahansa aminohappoasemista • · * : ·' 103 - 105 Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-tripeptidyylisekvenssin • · « ...i osana, jolloin X on mikä tahansa aminohappo paitsi proliini, * · · V : joka estää glykosylaation.

Toisessa edullisessa suoritusmuodossa N-sitoutunut 30 ylimääräinen glykosylaatiopaikka on villin tyypin humaanisen :***· t-PA:n aminohappoasemassa 103 tai 105.

«··

Muussa edullisessa suoritusmuodossa toiminnallisen ·····.

• · ... hiilihydraattirakenteen poistaminen aminohaposta 117 to- » · **”’ teutetaan glykosylaatiosignaalin Asn-X-Ser/Thr (jossa x on 35 kuten edellä on määritelty) pohjana olevan DNA:n paikkaan kohdistetun mutageneesin avulla. Tulokseksi saaduissa t-PA- • # muunnelmissa villin tyypin humaanisen t-PA:n aminohapposek- 11 1 1 7940 venssin asemassa 117 oleva asparagiini korvataan toisella aminohapolla, joka on edullisesti glutamiini.

Vielä muussa suoritusmuodossa tämän keksinnön mukaisen menetelmän muunnelmilla on parannettu fibriinispesifi-5 syys verrattuna villin tyypin humaaniseen t-PA:iin.

Fibriinispesifisyyttä voidaan parantaa esimerkiksi tuottamalla ylimääräinen muutos villin tyypin humaanisen t-PA:n aminohapposekvenssin aminohappoalueelle 296 - 302 tai 274 - 277. Tämä muutos on edullisesti jokaisen asemissa 296 10 - 299 olevan aminohapon korvaaminen alaniinilla tai villin tyypin t-PA:n asemissa 274 - 277 läsnäolevien aminohappojen (fenyylialaniini, arginiini, isoleusiini, lysiini) korvaaminen vastaavasti leusiinilla, histidiinilla, seriinillä ja t.reoni inilla.

15 Muissa suoritusmuodoissa keksintö koskee DNA-sekvens- sejä, jotka koodaavat keksinnön mukaisella ratkaisulla esitetyt muunnelmat, replikoituviin ekspressiovektoreihin, jotka kykenevät ilmentämään tällaiset DNA-sekvenssit transformoidussa isäntäsolussa, transformoituihin isäntäsoluihin ja 20 menetelmään, joka käsittää isäntäsolujen viljelyn siten, että t-PA-muunnelmat koodittavat DNA:t ilmentyvät.

Keksinnön mukaisella ratkaisulla aikaansaadaan koos- • ♦ • · · *· " tumus verisuoniin liittyvän tilan tai taudin hoitamiseksi, ·· · ί 1.1 koostumuksen sisältäessä hoidollisesti tehokkaan määrän t- ♦ 25 PA-muunnelmia seoksena farmaseuttisesti hyväksyttävän kanta- : **: jän kanssa.

·;1 Keksinnöllä voidaan nyt tuottaa menetelmä verisuoniin

MM

liittyvän taudin tai tilan hoitamiseksi nisäkkäällä, jolloin mainitulle nisäkkäälle annetaan hoidollisesti tehokas määrä ·· 30 t-PA-muunnelmia.

• · * 1 1

Vielä muun näkökohdan mukaisesti keksintö koskee me- • 1 *** netelmää fibriinisitoutumisaffiniteetin häviön korjaamisek- « si, jonka on aiheuttanut ylimääräisen glykosylaation lisää-minen villin tyypin humaanisen t-PA:n sekvenssin mihin ta- » · · 35 hansa asemiin 103 - 105, poistamalla lisäksi toiminnallinen • 1 hiilihydraattirakenne aminohappoasemasta 117.

♦ · » ·1 Lyhyt kuvaus piirroksista 1 1 7940 12

Kuvat 1 ja 2 esittävät tämän keksinnön mutaatioiden vaikutusta tulokseksi saatujen t-PA-muunnelmien fib-riinisitoutumiseen. Fibriinisitoutumisen häviö johtuen ylimääräisestä glykosylaatiosta villin tyypin humaanisen t-PA:n 5 aminohappoasemassa 103 voitiin korjata poistamalla hiilihydraattirakenne villin tyypin humaanisen t-PA-molekyylin asemasta 117.

Kuvat 3, 4, 5 ja 6 esittävät tuloksia, jotka saatiin in vivo hyytymän hajotusmäärityksestä kaniinilla käyttäen 10 valtimo-laskimo-oikovirtaustrombolyysimallia.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus I. Määritelmät

Termit "t-PA", "humaaninen t~PA" ja "ihmisen kudos- plasminogeeniaktivaattori" viittaavat ihmisen ulkopuoliseen 15 (kudostyyppiseen) plasminogeeniaktivaattoriin, jolla on fib- rinolyyttinen aktiivisuus ja tyypillisesti viisi domainia (sormi-, kasvutekijä, kringle-1-, kringle-2- ja proteaasido- mainit) käsittävä rakenne, vaikka sillä voi olla vähemmänkin domaineja tai jotkut sen domaineista voivat toistua, jos se 20 yhä toimii trombolyyttisenä aineena. Vähimmillään t-PA-koos- tuu proteaasidomainista, joka kykenee muuttamaan plas- , . minogeenin plasmiiniksi, ja N-terminaalisen alueen uskotaan • · · *· *· olevan ainakin osittain vastuussa sitoutumisesta fibriiniin.

·· » «aa • ·* Siten nämä termit käsittävät polypeptidit, jotka sisältävät 25 nämä toiminnalliset domainit polypeptidin aminohapposekvens- • · * • sin osana. t-PA:n biologisesti aktiivisia muotoja voidaan ^j* tuottaa rekombinanttisoluviljelyjärjestelmien avulla muo- :*·*: doissa, jotka sisältävät molekyylin kaksi toiminnallista aluetta ja mitä tahansa muita t-PA:n osuuksia, jotka ovat 30 muuten luontaisia t-PA-lähteelle. On ymmärrettävä, että • * * ,···. luonnollisia alleelisia muunnelmia esiintyy ja ne voivat il- • · metä yksilöillä, kuten kunkin yksilön t-PA:n aminohappose-* * kvenssissä esiintyvät yhden tai useamman aminohapon erot a a * :.,,i osoittavat.

.··*. 35 Termit "villin tyypin t-PA", "alkuperäinen t-PA", • · ··]·, "villin tyypin humaaninen t-PA" ja "alkuperäinen humaaninen ♦ · t-PA" viittaavat alkuperäisen sekvenssin omaavaan ihmisen 13 117940 kudosplasminogeeniaktivaattoriin, so. cDNA-sekvenssin koodaamaan kudosplasminogeeniaktivaattoriin, kuten on selostettu US-patentissa 4 766 075, myönnetty elokuun 23. päivä, 1988. Aminohapon paikkanumerot tai asemat t-PA-molekyylissä 5 on leimattu US-patentin 4 766 075 mukaisesti. t-PA voi olla mistä tahansa luontaisesta lähteestä. Lisäksi t-PA:a voidaan saada mistä tahansa rekombinantista ekspressiojärjestelmäs-tä, mukaan luettuna esimerkiksi kiinalaisen hamsterin mu-nasarjasolut (CHO-solut) tai ihmisen sikiön munuaisen 293-10 solut.

Termi "sitoutuminen fibriiniin" ja "sitoutumisaf-finiteetti fibriiniin" viittaa t-PA-molekyylin kykyyn sitoutua fibriinihyytymiin tavanomaisissa fibriinisitoutumisko-keissa, kuten menetelmässä, joka on kuvattu julkaisussa Rij-15 ken et ai., J. Biol. Chem., 257, 2920 - 2925 (1982), tai sen muunnetussa versiossa, joka on julkaistu esimerkissä 2.

Termit "(t-PA:n) biologinen aktiivisuus", biologisesti aktiivinen", "aktiivisuus" ja "aktiivinen" viittaavat t-PA-molekyyli^n kykyyn muuttaa plasminogeeni plasmiiniksi mi-20 tattuna 2-2251-määrityksen avulla plasmahyytymän läsnänol-lessa tai fibriinin läsnäollessa, S-2288-määrityksen avulla, # , plasmahyytymän hajotusta koskevan määrityksen avulla tai • i t ** / muun sopivan määrityksen avulla. Määritys (määritykset) voi- t i · ί ·' daan toteuttaa mahdollisten aktiivisuuden modulaattoreiden, 25 kuten fibriinin, fibrinogeenin, plasman ja/tai plasmahyyty- «· · ; mien, läsnäollessa tai ilman niitä.

44*:* Ilmaisuja "f ibrinolyyttinen aktiivisuus", "trombo- lyyttinen aktiivisuus" ja "hyytymän hajotusta koskeva aktii- « visuus" käytetään vaihtovuoroisesti ja ne viittaavat t-PA- Ϊ*. 30 molekyylin kykyyn hajottaa hyytymä, olipa se peräisin puh- .···. distetusta fibriinistä tai plasmasta, käyttäen mitä tahansa « · ’** in vitro hyytymän hajotusmääritystä, joka tunnetaan alalla, ’* * kuten puhdistetun hyytymän hajotusmääritystä, joka on selos- • · · :...· tettu julkaisussa Carlson, R. H. et ai., Anal. Biochem., • - -.···. 35 168, 428 - 435 (1988), ja sen muunnettua muotoa, jonka ovat :V, selostaneet Bennett, W, F. et ai., 1991, edellä.

• »

Ilmaisut "spesifinen fibrinolyyttinen aktiivisuus", 117940 14 "spesifinen trombolyyttinen aktiivisuus" ja "spesifinen hyytymän hajotusaktiivisuus" viittaavat hyytymän hajotukseen plasmassa plasman vakiotilapitoisuuden yksikön vaikutuksesta määritettynä minkä tahansa alalla tunnetun in vitro hyytymän 5 hajotusmäärityksen avulla, kuten edellä mainittujen määritysten avulla.

Ilmaisuja "in vivo fibrinolyyttinen tehokkuus", "in vivo trombolyyttinen tehokkuus" ja "in vivo hyytymän hajo-tustehokkuus" käytetään vaihtovuoroisesti ja ne viittaavat 10 hyytymän hajotukseen t-PA:n yksikköannosta kohden. "In vivo fibrinolyyttinen tehokkuus" määritetään käyttäen hyytymän hajotusmäärityksen mitä tahansa hyväksyttyä eläinmallia, mukaan luettuna hamsterin keuhkoveritulppamalli (Collen, D. et ai., 1991, supra) ja kaniinin kaulalaskimon veritulppamalli 15 [Collen, D. et ai., J. Clin. Invest., 71, 368 (1983)]. Jälkimmäisen mallin erityisen edullinen muunnelma on kuvattu esimerkissä jäljempänä.

Ilmaisu "säilyttää oleellisesti sitoutumisen (affiniteetin) fibriiniin" (verrattuna villin tyypin humaani-20 seen t-PA:iin) ja sen kieliopilliset muunnelmat, kuten niitä käytetään tässä, tarkoittavat, että muunnetun t-PA-molekyy-* , Iin sitoutumisaffiniteetti fibriiniin (todellinen Kd-arvo) 4 · · t* .* on noin kaksinkertainen villin tyypin humaanisen t-PA:n fib- 4*4 • ·* riinisitoutumisaffiniteetista (Kd-arvo) määritettynä samassa * ·*♦ *.!.· 25 määrityksessä. Ilmaisu "oleellisesti parannettu sitoutuminen

Il f • ',· fibriiniin" viittaa t-PA-muunnelman enemmän kuin noin nelin- *i* kertaiseen fibriinisitoutumisaffiniteetin (todellisen Kd-ar- von) lisääntymiseen, jonka on aiheuttanut ylimääräisen mutaation tai mutaatioiden sarjan sisällyttäminen t-PA-muun- !*, 30 nelmaan. Termi "parannettu in vivo f ibrinolyyttinen tehok- .···. kuus" verrattuna villin tyypin t-PA:n tehokkuuteen viittaa * · *** vertailukelpoiseen in vivo hyytymän hajotukseen, joka on * * f saatu aikaan antamalla potilaalle t-PA-muunnelmaa noin yksi ··· kolmasosa tai vähemmän villin tyypin t-PA-annoksesta.

.***. 35 Termit "puhdistumanopeus" tai "puhdistuma" viittaavat • * · ··,·. nopeuteen, jolla t-PA-molekyyli poistuu verivirrasta. Puh-

4 I

: distuma (nopeus) mitataan suhteessa alkuperäiseen t~PA:iin 117940 15 siten, että hidastunut puhdistuma (nopeus) osoittaa, että t-PA-muunnelma puhdistuu hitaammin kuin alkuperäinen t-PA, ja lisääntynyt puhdistuma (nopeus) osoittaa, että t-PA-muunnel-ma puhdistuu nopeammin kuin alkuperäinen t-PA.

5 Ilmaisu "fibriinispesifisyys" viittaa mutantin aktii visuuteen, kun mutantti osoittaa fibriinistä riippuvaisen spesifisen aktiivisuuden ja fibrinogeenistä riippuvaisen spesifisen aktiivisuuden suurempaa suhdetta S-2251-määrityk-sessä kuin villin tyypin humaaninen rt-PA, ja edullisesti 10 suhde on vähintään 1,5.

Ilmaisu "plasmahyytymäspesifisyys" viittaa mutantin aktiivisuuteen, kun mutantti osoittaa plasmahyytymästä riippuvaisen spesifisen aktiivisuuden ja plasmasta riippuvaisen spesifisen aktiivisuuden välistä suurempaa suhdetta S-2251-15 määrityksessä kuin villin tyypin rt-PA, ja edullisesti suhde on vähintään 1,5.

Termejä "tsymogeeni", "tsymogeeninen" ja "tsymogeeni-nen aktiivisuus" käytetään tässä, kuten ne on määritelty julkaisussa W0 90/02798, julkaistu 22. maaliskuuta, 1990.

20 Tämän määritelmän mukaan entsymaattisen aktiivisuuden puuttuminen kokonaan ei ole vaatimus.

j Ilmaisu "funktionaalisen hiilihydraattirakenteen ♦ · * ,! .* puuttuminen villin tyypin humaanisen t-PA:n aminohappo- • · * * asemasta 117" tarkoittaa hiilihydraatin täydellistä poista- • · · ]···’ 25 mistä aminohappo jäännöksestä 117, kuten silloin kun paikkaan ♦ ·*· ί ·’ kohdistettu mutageneesi on tuhonnut glykosylaatiosignaalin, ♦ kuten on kuvattu jäljempänä, tai poistamista olennaisilta *«· V · osin, kuten käsittelemällä t-PA endoglykosidaasilla, joka voi jättää jäljelle koskemattoman N-asetyyiglukosamiinijään-·*·.. 30 nöksen sitoutuneena asemaan Asn 117.

·**'. Termit "aminohappo" ja "aminohapot" viittaavat kaik- • * * *, kiin luonnossa esiintyviin L-a-aminohappoihin. Tämän määri- • · · * * telmän on tarkoitus sisältää norleusiini, ornitiini ja homo-• · · ' -> • · ,, *···* kysteiini. Aminohapot identifioidaan käyttäen yhden kirjai- :***: 35 men tai kolmen kirjaimen muodostamia nimityksiä: • · # ·*«*. Asp D asparagiinihappo Ile I isoleusiini • ·*

Thr T treoniini Leu L leusiini 117940 16

Ser S seriini Tyr Y tyrosiini

Glu E glutamiinihappo Phe F fenyylialaniini

Pro P proliini His H histidiini

Gly G glysiini j Lys K lysiini 5 Ala A alaniini Arg R arginiini

Cys C kysteiini Trp W tryptofaani

Vai V väliini Gin Q glutamiini

Met M metioniini Asn N asparagiini Nämä aminohapot voidaan luokitella niiden sivuketju-10 jen kemiallisen koostumuksen ja ominaisuuksien mukaan. Ne on jaettu laajasti kahteen ryhmään, varattuihin ja ei-varattui-hin. Kumpikin näistä ryhmistä on jaettu alaryhmiin aminohappojen luokittelemiseksi tarkemmin: I. Varatut aminohapot 15 Happamat jäännökset: asparagiinihappo, glutamiinihap- po

Emäksiset jäännökset: lysiini, arginiini, histidiini II. Ei-varatut aminohapot

Hydrofiiliset jäännökset: seriini, treoniini, aspara-20 giini, glutamiini

Alifaattiset jäännökset: glysiini, alaniini, väliini, . . leusiini, isoleusiini « » · / Ei-polaariset jäännökset: kysteiini, metioniini, pro- liini *·ί·* 25 Aromaattiset jäännökset: fenyylialaniini, tyrosiini, · · : .· tryptofaani.

Termit "muuttaminen", "aminohapposekvenssin muuttami- ij*: nen", "muunnelma" ja "aminohapposekvenssin muunnelma" viit- taavat t-PA-molekyyleihin, joiden aminohapposekvensseissä on 30 joitakin eroja verrattuna alkuperäiseen kudosplas- .*··. minogeeniaktivaattoriin. Tavallisesti muunnelmilla on vähin- • · ··· tään 80 %:n homologia niiden alkuperäisen t-PA:n domainien

kanssa, jotka ovat säilyttäneet rakenteensa, ja edullisesti ·*· J

ne ovat vähintään noin 90-%:isesti homologisia tällaisten * .***. 35 domainien kanssa. t-PA:n glykosylaatiomuunnelmat, jotka kuu- • · · luvat tämän keksinnön piiriin, sisältävät myös mahdollisesti • ·* substituutioita, deleetioita ja/tai insertioita niiden li- 117940 π saksi, jotka ovat tulosta spesifisistä muutoksista t-PA:n glykosylaatiomallissa.

Substituoidut t-PA-muunnelmat ovat muunnelmia, joissa vähintään yksi alkuperäisen t-PA-sekvenssin aminohappojään-5 nös on poistettu ja sen paikalle on insertoitu erilainen aminohappo samaan asemaan. Substituutiot voivat olla yksinkertaisia, jolloin vain yksi aminohappo molekyylissä on sub-stituoitu , tai ne voivat olla moninkertaisia, jolloin kaksi tai useampia aminohappoja on substituoitu samassa mole-10 kyylissä.

t-PA-molekyylin aktiivisuuden oleellisia muutoksia voidaan saada substituoimalla aminohappo sivuketjulla, joka on merkitsevästi erilainen varaukseltaan ja/tai rakenteeltaan kuin alkuperäinen aminohappo. Tämän tyyppisen substi-15 tuution olettaisi vaikuttavan polypeptidirungon rakenteeseen ja/tai molekyylin varaukseen tai hydrofobisuuteen substituution alueella.

t-PA-molekyylin aktiivisuuden kohtalaisia muutoksia voidaan saada substituoimalla aminohappo sivuketjulla, joka 20 on samanlainen varaukseltaan ja/tai rakenteeltaan kuin alkuperäinen molekyyli. Tämän tyyppisen substituution, jota kut- #»t . sutaan säilyttäväksi substituutioksi, ei olettaisi muuttavan * * * ,* oleellisesti polypeptidirungon rakennetta eikä molekyylin • · · • ** varausta tai hydrofobisuutta substituution alueella.

* · « *·!·* 25 t-PA:n insertiomuunnelmat ovat muunnelmia, joissa on : .* yksi tai useampi aminohappo on insertoitu välittömästi tie- ,,** tyssä asemassa olevan aminohapon viereen alkuperäisessä t- : PA-molekyylissä. Välittömästi aminohapon viereen tarkoittaa sitä, että lisätty aminohappo on kytketty aminohapon joko ·*·,, 30 funktionaaliseen α-karboksi- tai α-aminoryhmään. Insertio .*·*. voi käsittää yhden tai useamman aminohapon. Tavallisesti in- ··* •> sertio koostuu yhdestä tai kahdesta säilyttävästä aminoha posta. Aminohapot, jotka ovat varaukseltaan ja/tai raken- • · · *...* teeltaan samanalaisia kuin aminohapot, jotka ovat insertio- ·*"; 35 paikan vieressä, määritellään säilyttäviksi. Vaihtoehtoises- ·** ti tämä keksintö sisältää aminohapon insertion, kun aminoha- * · polla on varaus ja/tai rakenne, jotka ovat oleellisesti eri- .; is 11 7940 laisia kuin insertiopaikan viereisillä aminohapoilla.

Deleetiomuunnelmat ovat muunnelmia, joissa alkuperäi- , sen t-PA-molekyylin yksi tai useampi aminohappo on poistettu. Tavallisesti deleetiomuunnelmilta puuttuu yksi tai kaksi 5 aminohappoa t-PA-molekyylin tietyltä alueelta.

Merkitsemistavat, joita on käytetty kaikkialla tässä patenttihakemuksessa t-Pa-aminohapposekvenssin muunnelmien kuvaamiseksi kuvataan seuraavassa. Tietyn aminohapon sijain- 1,1 ‘ ti t-PA:n polypeptidiketjussa ilmaistaan numerolla. Numero 10 viittaa aminohapon asemaan kypsän, villin tyypin humaanisen t-PA-polypeptidin aminohapposekvenssissä, kuten on julkaistu US-patentissa 4 766 075, myönnetty 23. elokuuta, 1988. Tässä patenttihakemuksessa samalla tavoin sijaitsevat jäännökset t-PA-muunnelmissa on osoitettu näillä numeroilla, vaikka to-15 dellinen jäännöksen numero ei olekaan näin numeroitu johtuen deleetioista tai insertioista molekyylissä. Tämä ilmenee esimerkiksi paikkaan kohdistetun deleetion tai insertion omaavissa muunnelmissa. Aminohapot on identifioitu käyttäen yhden kirjaimen koodia. Substituoidut aminohapot on osoitet-20 tu ilmoittamalla villin tyypin aminohappo numeron vasemmalla puolella numeron osoittaessa tuon aminohapon asemaa polypep- . . tidiketjussa ja ilmoittamalla substituoitu aminohappo nume- * « · - / ron oikealla puolella.

« · · : Esimerkiksi treoniini-aminohapon (T) korvaaminen as- 25 paragiinilla (N) villin tyypin humaanisen t-PA-molekyylin * · · • *.· aminohappoasemassa 103 tuottaa t-PA-muunnelman, jolle on an- #>‘j’ nettu nimitys T103N t-PA. Samaten t-PA-muunnelma, joka on saatu substituoimalla lisäksi asparagiini (N) glutamiinilla (Q) villin tyypin humaanisen t-PA-molekyylin aminohappo-30 asemassa 117, on nimetty T103N,N117Q t-PA:ksi.

.···. Deleetiomuunnelmat on identifioitu osoittamalla ami- • · nohappoj äännös ja asema deleetion kummassakin päässä ja : : asettamalla kreikkalainen delta-kirjain "Δ" osoitettujen ·...· aminohappojen vasemmalle puolelle. Esimerkiksi t-PA-muunnel- .··*. 35 ma, joka sisältää aminohappojen 296 - 299 deleetion, voitai- ··.·. siin osoittaa seuraavalla merkinnällä AK296-H297-R298-R299- ♦ · t-PA, jossa K, H ja R osoittavat aminohappoja lysiini, his- 19 1 1 7940 tidiini ja arginiini. Yksittäisen aminohapon deleetio, esimerkiksi K296, voitaisiin osoittaa merkinnällä ΔΚ296. t-PA:n insertiomuunnelmat on osoitettu käyttämällä sulkumerkkejä "[]" lisättyjen aminohappojen ympärillä ja insertiopaikka on 5 merkitty osoittamalla aminohapon asema insertion kummallakin puolella. Esimerkiksi alaniini-aminohapon (A) insertio asemassa 94 olevan glutamiinihapon ja asemassa 95 olevan aspa-ragiinihapon väliin voitaisiin osoittaa merkinnällä E94[A]D95. Lukemisen helpottamiseksi pilkkua käytetään 10 erottamaan moninkertaiset mutaatiot, jotka ilmenevät yksittäisessä molekyylissä, ja puolipistettä käytetään yksittäisten muodostettujen t-PA-muunnelmamolekyylien erottamiseksi, kun useita t-PA-muunnelmamolekyylejä on luetteloitu yhdessä.

15 Termit "DNA-sekvenssi, joka koodaa", "DNA, joka koo- daa" ja "nukleiinihappo, joka koodaa" viittaavat deoksiri- bonukleotidien järjestykseen tai sekvenssiin pitkin deoksi- ribonukleiinihappojuostetta. Näiden deoksiribonukleotidien järjestys määrää aminohappojen järjestyksen pitkin polypep- 20 tidiketjua. DNA-sekvenssi koodaa siten aminohapposekvenssin.

; Termit "replikoituva ekspressiovektori" ja "ekspres- . . siovektori" viittaavat DNA:n, tavallisesti kaksijuosteisen, • · ♦ *mm / palaseen, joka on insertoitu vieraaseen DNA:n palaseen. Vie- • · * : ·’ ras DNA määritellään heterologisena DNA:na, joka tarkoittaa 25 DNA:ta, jota ei luonnollisesti tavata isäntäsolusta. Vekto- · · • ria käytetään vieraan tai heterologisen DNA:n kuljettamiseksi:* si sopivaan isäntäsoluun. Kun vektori on joutunut isän- :*·*: täsoluun, se voi replikoitua riippumatta isännän kro- mosomaalisesta DNA:sta, ja vektorista ja sen insertoidusta J·.^ 30 (vieraasta) DNA: sta voi syntyä useita kopioita. Lisäksi .···. vektori sisältää välttämättömät elementit, jotka tekevät » · *Γ mahdolliseksi vieraan DNA:n translaation polypeptidiksi.

Vieraan DNA:n koodaaman polypeptidin monta molekyyliä voi- ··* daan siten syntetisoida nopeasti.

.··*. 35 Nukleiinihappo on "toiminnallisesti kytketty", kun se • · · li, on sijoitettu toiminnalliseen suhteeseen toisen nukle- • · iinihapposekvenssin kanssa. Esimerkiksi DNA esisekvenssiä 117940 20 tai erittävää leader-jaksoa varten on kytketty toiminnallisesti DNA:hän, joka koodaa polypeptidin, jos se ilmentyy eriproteiinina, joka ottaa osaa polypeptidin erittymiseen; promoottori tai voimistaja on toiminnallisesti kytketty koo-5 daavaan sekvenssiin, jos se vaikuttaa sekvenssin transkriptioon; tai ribosomin sitoutuspaikka on toiminnallisesti kytketty koodaavaan sekvenssiin, jos se sijaitsee niin, että se helpottaa translaatiota. Yleisesti "toiminnallisesti kytketty" tarkoittaa, että kytketyt DNA-sekvenssit ovat vierek-10 kärsiä ja erittävän leader-jakson tapauksessa vierekkäisiä ja luentavaiheessa. Kuitenkaan voimistajien ei tarvitse olla vierekkäisiä. Sitoutuminen toteutetaan liittämällä tarkoituksenmukaisissa restriktiopaikoissa. Jos tällaisia paikkoja ei ole, niin sitten käytetään synteettisiä oligonukleoti-15 diadaptoreita tai kytkyt-fragmentteja tavanomaisen käytännön mukaisesti.

Tämän keksinnön yhteydessä ilmaisuja "solu", "solu-linja" ja "soluviljely" käytetään vaihtovuoroisesti ja kaikkiin tällaisiin nimityksiin sisältyvät jälkeläiset.

20 Termit "transformoitu (isäntä)solu", "tranformantti" ja "transformoitu" viittaavat DNA:n tuomiseen soluun. Solua .·, · kutsutaan "isäntäsoluksi". Soluun tuotu DNA on tavallisesti • * * vektorin muodossa, joka sisältää insertoidun DNA-palasen, * * ’ l Soluun tuodun DNA:n sekvenssi voi olla samasta lajista kuin • ♦ · *·*·’ 25 isäntäsolu tai se voi olla eri lajista kuin isäntäsolu tai * · * : ·’ se voi olla hybridi-DNA-sekvenssi, joka sisältää jonkin ver- ...Γ ran vierasta ja jonkin verran homologista DNA: ta. Sanat • · · : transformantit ja transformoidut (isäntä) solut sisältävät primaarisen kohdesolun ja siitä johdetut viljelmät riippu- 30 matta siirtojen lukumäärästä. On myös ymmärrettävä, että :***. kaikki jälkeläiset eivät ehkä ole tarkoin identtisiä DNA- • · * * , sisällöltään johtuen tarkoituksellisista ja tahattomista mu- taatioista. Mutanttijälkeläiset, joilla on sama toiminta tai • · *··** biologinen ominaisuus kuin alunperin transformoidulla solul- :***: 35 la, sisältyvät mukaan.

• · · **·*; "Plasmidit" on merkitty pikkukirjaimella p, jota seu- • · raa aakkosnumeerinen nimitys. Tässä keksinnössä käytettävät

117940 I

21 τ lähtöplasmidit ovat joko kaupallisesti saatavissa, julkisesti saatavissa rajoittamattomalta pohjalta tai ne voidaan muodostaa tällaisista saatavissa olevista plasmideista käyttäen julkaistuja menetelmiä. Lisäksi muut vastaavat plasmi-5 dit ovat tunnettuja alalla ja ovat ilmeisiä alan ammattilaiselle.

II. Yleiset menetelmät A. Muunnelmien valinta

Polypeptidien glykosylaatio on tyypillisesti joko N-10 sitoutunutta tai O-sitoutunutta. N-sitoutunut viittaa hiili-hydraattiosuuden kiinnittymiseen asparagiinijäännöksen sivu-ketjuun. Tripeptidisekvenssit, asparagiini-X-seriini ja as-paragiini-X-treoniini, joissa X on mikä tahansa aminohappo paitsi proliini, ovat tunnistamissekvensseja hiilihydraat-15 tiosuuden kiinnittämiseksi entsymaattisesti asparagiinisivu-ketjuun. O-sitoutunut glykosylaatio viittaa yhden sokereista N-asetyyligalaktosamiini, galaktoosi tai ksyloosi kiinnittymiseen hydroksiaminohappoon, joka on yleisimmin seriini tai treoniini, vaikka 5-hydroksiproliini tai 5-hydroksilysiini 20 voivat myös olla osallisina O-sitoutuneessa glykosylaatios- sa, . Nisäkkäiden tuottamien proteiinien glykosylaatiomal- • · · .] lit on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa The Plasma • * · * ;* Proteins: Structure, Function and Genetic Control, toim.

• · · 25 Putnam, F. W., 2. painos, osa 4, Academic Press, New York, * • 1984, erityisesti sivut 271 - 315. Tässä luvussa käsitellään asaparagiinisitoutuneita oligosakkarideja, mukaan luettuna * · · V ί niiden alajako vähintään kolmeen ryhmään, joilla on komplek sinen rakenne, suuren mannoosipitoisuuden käsittävä rakenne 30 ja hybridirakenne, sekä glykosidisesti sitoutuneita oli- .·**. gosakkaride j a .

* « * * Hiivan tuottamien proteiinien glykosylaatiomallit on » · » » · ] ' kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa Tanner ja Lehle, *...* Biochim. Biophys. Acta. 906 (1), 915 - 944 (1987).

:***· 35 Nisäkkäiden solujen ja hiivan tuottamien proteiinien « · « j*.‘. tyypillisiä N-sitoutuneita glykosylaatiomalleja on verrattu • · kuvassa 1 patenttijulkaisussa WO 89/11531, julkaistu 30.

117940 . 22 marraskuuta, 1989.

Bowes melanoma -soluista puhdistetun alkuperäisen t-PA:n (melanooma-t-PA, mt-PA) hiilihydraattirakenteita koskevat alustavat tutkimukset osoittivat suuren mannoosipitoi-5 suuden omaavien oligosakkaridien läsnäolon asemassa Asn 117 ja kompleksityyppisten oligosakkaridien asemissa Asn 184 ja Asn 448 [Pohl et ai., Eur. J. Biochem., 170, 69 - 75 (1987)]. Tyypin I t-PA:lla kaikki kolme N-sitoutunutta asemaa on substituoitu hiilihydraatilla, kun taas tyypin II t-10 PA:lla ei ole hiilihydraattia kiinnittyneenä asemaan 184, siten tämä asema on glykosyloitunut vain noin 50 %:lla alkuperäisistä t-PA-molekyyleistä. Yksi yksityiskohtainen selonteko [Parekh et ai., Biochemistry 28, 7644 - 7662 (1989)] vahvisti nämä havainnot ja lisäksi havaittiin, että 30 % 15 oligosakkarideista oli sulfatoitu.

Transfektoiduista kiinalaisen hamsterin munasar-jasoluista (CHO) puhdistetun villin tyypin rekombinantti-t-PA:n (rt-PA tai Activase® t-PA) olikosakkaridit on myös määritetty [Spellman et ai., J. Biol. Chem., 264, 14100 - 14111 20 (1989)] ja niillä havaittiin olevan samanlainen glykosylaa- tiomalli: suuren mannoosipitoisuuden omaavat olisakkaridit . asemassa Asn 117, kompleksiset oligosakkaridit asemissa Asn 184 ja Asn 448, jolloin Asn 184 -paikka on glykosyloitunut • ♦ * • ·* vain 50 %:lla molekyyleistä.

Φ · · *·;.* 25 Keksinnön mukaisella menetelmällä saatujen muunnel- • · * : *.· mien täytyy sisältää vähintään yksi aminohapposekvenssi, * ..*·* jolla on kyky tuottaa glykosylaatio N- tai O-sidoksen kautta villin tyypin humaanisen t-PA:n missä tahansa aminohappoase-massa 103, 104 ja 105.

30 Jos tarkoituksena on N-sitoutunut glykosylaatio, .··*. muunnelmassa glykosylaatiopaikka on tripeptidyylisekvenssi, * · *’* jolla on kaava: asparagiini-X-seriini tai asparagiini-X- * * treeniini, jolloin asparagiini on akseptorissa ja X on mikä tahansa 20 geneettisesti koodatusta aminohaposta lukuunot- » .·**. 35 tamatta proliinia, jonka tiedetään estävän glykosylaatiota.

* · ·

Katso julkaisut Struck, D. K. ja Lennarz, W. J., The Bioche- • « misty of Glycoproteins and Proteoglycans, toim. W. J. Len- 117940 23 i narz, Plenum Press, 1980, sivu 35; Marshall, R. D.; Biochem.

Soc. Symp., 40, 17 (1974); ja Winzler, R. J., Hormonal Proteins and Peptides, toim. Li, C. I., Academic Press, New I

York, 1973, sivut 1-15. Aminohapposekvenssimuunnelmat täs-5 sä on muunnettu joko insertoimalla sopiva aminohappo (sopivat aminohapot) sopivaan paikkaan (sopiviin paikkoihin) gly-kosylaation aikaansaamiseksi (kuten lisäämällä asparagiini-X-seriini/treoniini-tripeptidi aseman 103 jälkeen pin-tasilmukan tekemiseksi suuremmaksi ja enemmän alttiiksi) tai 10 substituoimalla aminohappo (aminohapot) sopivassa paikassa (sopivissa paikoissa) sopivilla aminohapoilla glykosylaation aikaansaamiseksi.

Jos on tarkoitus käyttää O-sitoutunutta glykosylaa-tiota, O-glykosidinen sidos esiintyy eläinsoluissa N-asetyy-15 ligalaktosamiinin, galaktoosin tai ksyloosin ja yhden hyd-roksiaminohapon välillä, joka on valittu useista aminohapoista, useimmiten seriinistä tai treoniinista, mutta joissakin tapauksissa myös 5-hydroksiproliini- tai 5-hydroksi-lysiinijäännöksestä, kun ne sijaitsevat sopivalla molekyylin 20 alueella.

Yhdessä edullisessa suoritusmuodossa N-sitoutunut ^ . glykosylaatiopaikka on lisätty alkuperäisen humaanisen t- • ·« PA:n aminohappoasemiin 103 - 105. O-sitoutunutta glykosylaa- • · · • tiota varten yksi tai useampi aminohappo näillä alueilla *·ί·* 25 korvataan tai täydennetään seriini-, treoniini- tai 5-hyd- * · · : .* roksilysiinijäännöksellä.

* Tällaiset t-PA-muunnelmat on julkaistu patentissa WO :T: 89/11531, edellä.

Esitetyt t-PA-muunnelmat ovat lisäksi tunnettuja 30 toiminnallisen hiilihydraattirakenteen puuttumisesta amino- .·*·. happojäännöksestä 117. Edullisen suoritusmuodon mukaisesti • toiminnallinen hiilihydraattirakenne säilyy kaikissa muissa •**t| aminohappoasemissa, jotka ovat glykosyloituneita ai- * · · kuperäisessä t-PA-molekyylissä. Tällainen toiminnallisen 35 hiilihydraattirakenteen valikoiva poistaminen asemasta 117 *·* saavutetaan edullisesti aminohapposubstituution avulla kor- * « vaarnalla vähintään yksi jäännös villin tyypin humaanisen t- 24 117940

PA-aminohapposekvenssin Asn-Ser-Ser-glykosylaatiosignaalissa asemissa 117 - 119. Erityisen edullisessa muunnelmassa aspa-ragiini (N) aminohappoasemassa 117 korvataan muulla aminohapolla, jolloin edullinen substituentti on glutamiini (Q) 5 (katso esim. patenttijulkaisut EP 238 304 edellä ja WO

. 89/04368.

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla muunnelmilla . treoniini on korvattu asparagiinilla asemassa 103 tai serii-ni asemassa 105 samoin asparagiinilla, samalla kun alaniini 10 on korvattu seriinillä alkuperäisen humaanisen t-PA:n asemassa 107, ja asparagiini (N) asemassa 117 on korvattu millä tahansa muulla aminohapolla, jolloin edullinen substituentti : on glutamiini (Q).

Nämä plasminogeeniaktivaattorit edellä mainittujen 15 alkuperäisen t-PA:n glykosylaatiomallin muunnosten lisäksi sisältävät myös mahdollisesti jäännösten substituutioita, deleetioita tai insertioita alkuperäisen t-PA-sekvenssin muilla alueilla tiettyjen molekyylin ominaisuuksien parantamiseksi. Tällaiset muunnelmat ovat alalla hyvin tunnettuja. 20 Plasminogeeniaktivaattoreita ja niiden toisen sukupolven johdannaisia koskeva yleiskatsaus löytyy julkaisuista Har- . t [ ' ris, Protein Engineering, 1 : 449 - 458 (1987) ja Lijnen, H.

• · # . R. ja Collen, D., Thromb. Haemost. 66 (1), 88 - 110 (1991).

• « · ! Muihin t-PA-muunnelmia koskeviin katsauksiin sisältyvät jul- 25 kaisut Pannekoek et ai., Fibrinolysis, 2 : 123 - 132 (1988), • · » • \· Ross et ai., Annual Reports in Medicinal Chemistry, voi. 23, /l· luku 12 (1988) ja Higgins ja Bennett, 1990, edellä.

Esimerkiksi sormidomainin ja/tai kasvutekijädomainin poistaminen osittain tai kokonaan tämän keksinnön t-PA-muun-30 nelmista on keino puhdistumanopeuden ja/tai puoliintumisajan • A* parantamiseksi edelleen. Vaihtoehtoisesti tai edellä esite- • 9 tyn lisäksi nämä t-PA-muunneIinat voivat olla resistenttejä proteolyyttistä pilkkoutumista vastaan aminohappoasemissa 99 9 276 ja 276 tai lähellä niitä ja/tai niillä voi olla amino-35 happornuunnelmia t-PA:n kringle-2-domainin otaksutussa lysii- • · · ;·.·. nin sitoutumispaikassa.

• 9

Pidettiin erityisen toivottavana tuottaa t-PA-muun- 117940 25 nelmia, jotka ovat spesifisempiä fibriinin suhteen kuin villin tyypin t-PA, sen lisäksi että ne puhdistuvat hitaammin plasmasta. Tällaiset t-PA-muunnelmat toimivat valikoivammin fibriinihyytymän paikassa kuin muuntamaton t-PA ja sen vuok-5 si niiden odotetaan aiheuttavan vähemmän sivuvaikutuksia, jotka liittyvät verenkierrossa olevan plasminogeenin aktivoimiseen, esimerkiksi vähemmän ankaria ja harvemmin toistuvia verenvuotokomplikaatioita.

Keksinnön mukaisesti valmistettujen t-PA-muunnelmien 10 fibriinispesifisyyttä voidaan parantaa minkä tahansa lisämuutoksen avulla, joka tunnetaan alalla.

Keksinnön mukaisesti valmistetun t-PA-muunnelman fib-riinispesifisyyden parantamiseksi sille voidaan aiheuttaa esimerkiksi mutaatio seriiniproteaasidomainin aminohap-15 poasemissa 296 - 302, edullisesti aminohappoasemissa 296 -299. Edullisessa muunnelmassa kukin aminohapoista lysiini (K) , histidiini (H) , arginiini (R) ja arginiini (R) villin tyypin t-PA:n asemissa 296 - 299 on korvattu alaniinilla. Muussa edullisessa muunnelmassa arginiinit asemissa 298 ja 20 299 on molemmat korvattu glutamiinihapolla. Muussa edulli sessa muunnelmassa lysiini (K) , histidiini (H) ja proliinin ^, (P) villin tyypin t-PA:n aminohappoasemissa 296, 297 ja 301 ,* ,* on lisäksi korvattu vastaavasti glutamiinilla (Q), aspara- • * · • ·' giinilla (N) ja seriinillä (S). Muussa edullisessa suoritus- • · · *·ί·* 25 muodossa tämän keksinnön t-PA-muunnelmien f ibriinispesif i- ·· ♦ : V syyttä parannetaan korvaamalla fenyylialaniini (F), arginii- .,1” ni (R), isoleusiini (I) ja lysiini (K) villin tyypin hu- IJ*: maanisen t-PA:n aminohapposekvenssin aminohappoasemissa 274, 275, 276 ja 277 vastaavasti aminohapoilla leusiini (L), his- •*.t> 30 tidiini (H), seriini (S) ja treoniini (T) . Jälkimmäinen muu- .·*·. tos tuottaa tulokseksi plasmiinin pilkkoutumiskohdan häviä- ·* misen; sen vuoksi muunnelmat ovat oleellisesti yksiketjui- ···*♦ * * sessa muodossa.

• · · ·...* Lisäksi tämän keksinnön molekyylit voivat olla subs- ·**·. 35 tituoituja tai ne voivat sisältää deleetioita tietyissä ase- • · · missä muiden haluttujen ominaisuuksien, mukaan luettuna tsy-mogeenisen luonteen, saamiseksi. Ihmisen t-PA:ssa nämä ase- 117940 26 mat sisältävät esimerkiksi lysiinin, histidiinin ja gluta-miinihapon korvaamisen alaniinilla asemissa 416 - 418 ja glutamiinihapon, arginiinin, lysiinin ja glutamiinihapon korvaamisen alaniinilla asemissa 426, 427, 429 ja 430 vas-5 taavasti, kuten on kuvattu esimerkiksi patenttijulkaisussa WO 90/02798, julkaistu 22. maaliskuuta, 1990.

Esimerkkejä sopivista moninkertaisista mutanteista ovat: T103N,N117Z-t-PA; S105N,A107S,N117Z-t-PÄ; T103N, N117Z,KHRR(296-299)AAAA-t-PA; S105N,A107S,N117Z,KHRR(296-10 299)AAAA-t-PA; T103N,N117Z,R298E,R299E-t-PA; S105N,A107S, N117Z,R298E,R299E-t-PA; T103N,N117Z,K296Q,H297N,P301S-t-PA; ' S105N,A107S,N117Z,K296Q, H2 97N, P301S-t-PA; T103N,N117Z, FRIK(274-277)LHST-t-PA; S105,A107S,N117Z,FRIK(274-277)LHST- 1 t-PA; joissa Z tarkoittaa mitä tahansa 20 luonnossa esiinty-15 västä aminohaposta lukuunottamatta arginiinia. Erityisen edullisia ovat t-PA-muunnelmat, joissa asemassa 117 aspara-giini (N) on substituoitu glutamiinilla (Q).

B. Muunnelmien muodostaminen

Ylimääräisen glykosylaation lisääminen alkuperäiseen 20 t-PA-molekyyliin ja toiminnallisen hiilihydraattirakenteen poistaminen aminohappojäännöksestä 117 voidaan toteuttaa t«# · käyttäen mitä tahansa alalla tunnettua menetelmää.

4 · * .* Glykosidien kemiallinen ja entsymaattinen kytkentä * * · * * proteiineihin voidaan toteuttaa käyttäen erilaisia aktivoi- • · · ]···* 25 tuja ryhmiä, jollaiset on kuvattu esimerkiksi julkaisussa • ·* Alpin ja Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., sivut 259 - 306 ..!i* (1981). Kemiallisen kytkentätekniikan etuna on, että se on • · 4 ί.ΐ ί suhteellisen yksinkertaista eikä tarvitse monimutkaista ent- - symaattista koneistoa, jota tarvitaan luonnolliseen O- ja Μι*·,. 30 sitoutuneeseen glykosylaatioon. Riippuen käytetystä kytken- .***. tamallista sokeri (t) voidaan kiinnittää (a) arginiiniin ja • 44 * , histidiiniin, (b) vapaisiin karboksyyliryhmiin, kuten gluta miinihapon ja asparagiinihapon vapaisiin karboksyyliryhmiin, 4 m *...* (c) vapaisiin sulfhydryyliryhmiin, kuten kysteiinin vapai- 35 siin sulfhydryyliryhmiin, (d) vapaisiin hydroksyyliryhmiin, ··· kuten seriinin, treoniinin tai hydroksiproliinin vapaisiin • · hydroksyyliryhmiin, (e) aromaattisiin jäännöksiin, kuten fe- 27 1 1 7940 nyylialaniinin, tyrosiinin tai tryptofaanin aromaattisiin jäännöksiin tai (f) glutamiinin amidiryhmään. Nämä menetelmät on kuvattu patenttijulkaisussa WO 87/05330 (julkaistu syyskuun 11. päivä, 1987).

5 Hiilihydraattirakenne ihmisen alkuperäisen t-PA:n aminohappoasemasta 117 voidaan poistaa oleellisesti esimerkiksi käyttämällä endoglykosidaasia, kuten Endoglycosidase H:ta (Endo-H). Endo-H kykenee poistamaan (osittain) vain suuren mannoosipitoisuuden omaavia oligosakkarideja ja hyb-10 ridioligosakkarideja. Siten sopivissa olosuhteissa Endo-H kykenee poistamaan (oleellisesti) suuren mannosipitoisuuden omaavan hiilihydraattirakenteen alkuperäisen t-PA:n aminohappo jäännöksestä 117 (Asn) vaikuttamatta toiminnallisesti monimutkaisiin rakenteisiin aminohappojäännöksissä 184 15 448. Tämä käsittely toteutetaan käyttäen sinänsä tunnettua tekniikkaa, esimerkiksi menetelmien mukaan, jotka on kuvattu julkaisuissa Tarentino et ai., J. Biol. Chem., 249, 811 (1974), Trimble et ai., Anal. Biochem., 141, 515 (1984) ja Little et ai., Biochem., 23, 6191 (1984).

20 Keksinnön mukaisesti valmistetut t-PA-muunnelmat muo dostetaan edullisesti aiheuttamalla mutaatio villin tyypin . , t-PA:n koodaavaan DNA-sekvenssiin ja ekspressoimalla mutaa- • * · • * * ,* tion omaava DNA-sekvenssi sopivassa isäntäsolussa.

9 * · • ·’ Muuntaminen sopivan aminohapon (sopivien aminohappo- 4 · * 25 jen) vaihtamiseksi alkuperäisessä molekyylissä tai lisäämi- • * · • *.* seksi siihen haluttujen sekvenssimuunnelmien aikaansaamisek- „*·* si toteutetaan käyttäen mitä tahansa alalla tunnettua kei- noa, kuten esimerkiksi paikkaan kohdistettua mutageneesiä tai sopivan sekvenssin liittämistä DNA:han, joka koodaa asi-;*.it 30 aankuuluvan proteiinin, kuten jäljempänä on kuvattu.

,···, Vaikka voidaan käyttää mitä tahansa alalla tunnettua • · "** tekniikkaa paikkaan kohdistetun mutageneesin toteuttamisek- * * si, esimerkiksi kuten Sambrook et ai. ovat julkaisseet [Mo- ·*· lecular Cloning: A Laboratory Manual, toinen painos, Cold .··*. 35 Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)], oligonuk- * t * , leotidiin kohdistettu mutageneesi on edullinen menetelmä tä- • * : män keksinnön t-PA-muunnelmien valmistamiseksi. Tämä mene- 117940 28 telmä, joka tunnetaan alalla hyvin [Adelman et ai., DNA, 2 : 183 (1983), Sambrook et ai., edellä], on erityisen sopiva substituutiomuunnelmien valmistamiseksi, mutta sitä voidaan käyttää myös deleetio- ja insertiomuunnelmien valmistamisek-5 si tarkoituksenmukaisesti.

Oligonukleotidit syntetisoidaan helposti käyttäen tekniikkaa, joka tunnetaan alalla hyvin, kuten esimerkiksi tekniikkaa, joka on kuvattu julkaisussa Crea et ai., Proc.

Nat'l. Acad. Sei. USA, 75 : 5765 (1978)].

10 Mutantteja, joissa useampi kuin yksi aminohappo on korvattu, voidaan muodostaa käyttäen yhtä monista tavoista.

Jos aminohapot sijaitsevat lähellä toisiaan polypeptidiket-jussa, niihin voidaan aiheuttaa mutaatio samanaikaisesti käyttäen yhtä oligonukleotidiä, joka koodaa kaikki halutut 15 aminohapposubstituutiot. Jos kuitenkin aminohapot sijaitsevat jonkin verran etäällä toisistaan (jolloin niitä erottaa esimerkiksi enemmän kuin 10 aminohappoa), on vaikeampi muodostaa yhtä oligonukleotidiä, joka koodaa kaikki halutut muutokset. Sen sijaan voidaan käyttää toista kahdesta vaih-20 toehtoisesta menetelmästä. Ensimmäisessä menetelmässä muo- .

dostetaan erillinen oligonukleotidi jokaista korvattavaa « , aminohappoa varten. Sitten oligonukleotidit sulautetaan yk- • 9 · / sijuosteiseen templaatti-DNA:han samanaikaisesti ja toinen • * · • ·* DNA-juoste, joka syntetisoidaan templaatista, koodaa kaikki • · · 25 halutut aminohapposubstituutiot. Vaihtoehtoinen menetelmä ·· · : koskee kahta tai kolmea mutageneesikierrosta halutun mutan- tf*·* tin tuottamiseksi.

: :*: Toinen menetelmä mutaatioiden tuottamiseksi villin tyypin t-PA:n tai alalla tunnetun muunnelmamolekyylin koo- j*.f> 30 daavaan DNA-sekvenssiin esimerkiksi uuden glykosylaatiopai- .···. kan lisäämiseksi tämän keksinnön mukaisesti käsittää lähtö- * » • aine-t-PA-molekyylin koodaavan DNA-sekvenssin katkaisemisen sopivasta asemasta hajottamalla se restriktioentsyymien • · · avulla, ottamalla talteen sopivasti pilkottu DNA, synte- ;*’*j 35 tisoimalla oligonukleotidi, joka koodaa halutun aminohap- • · · posekvenssin glykosylaatiota ja sivualueita varten, kuten polylinkkereitä varten, joilla on tylpät päät (tai polylink- 117940 29 kereiden sijasta synteettisen oligonukleotidin hajottaminen restriktioentsyymien avulla pilkkoi myös t-PA:n koodaavan DNA:n luoden koossapysyvät pääteryhmät), ja liittämällä synteettinen DNA t-PA:n koodaavan rakennegeenin jäljellä ole-5 vaan osaan.

PCR-mutageneesi on myös sopiva tämän keksinnön mukaisesti valmistettujen t-PA-muunnelmien tekemiseksi, esimerkiksi kuten on kuvattu US-patentissa 4 683 195, myönnetty 28. heinäkuuta, 1987, ja julkaisussa Current Protocols in 10 Molecular Biology, toim. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, osa 2, luku 15, 1991.

Keksinnön mukaisesti t-PA-muunnelmat koodaava cDNA inserotidaan replikoituvaan vektoriin edelleen kloonausta tai ilmentymistä varten.

15 Sopivat vektorit valmistetaan käyttäen tavanomaisia rekombinantti-DNA-menetelmiä. Eristetyt plasmidit ja DNA-fragmentit pilkotaan, räätälöidään ja liitetään toisiinsa spesifisessä järjestyksessä haluttujen vektoreiden muodostamiseksi.

20 Liittämisen jälkeen vektorilla, johon on nyt inser- toituna vieras geeni, transformoidaan sopiva isäntäsolu.

,·/* Transformoidut solut valitaan sen perusteella, miten ne kas- • · · .ly vavat antibiootilla, yleisesti tetrasykliinillä (tet) tai • · * · ampisilliinillä (amp), jota vastaan ne on muutettu resisten- • · · 25 teiksi johtuen vektorissa olevien tet- ja/tai amp-resistens- • · · • ·' sigeenien läsnäolosta. Jos liittämisseoksella on transfor- ♦..Γ moitu eukaryoottinen isäntäsolu, transformoidut solut voi- ···.· V · daan valita DHFR/MTX-järjestelmän avulla. Transformoituja soluja kasvatetaan viljelmässä ja sitten eristetään plasmi- 30 di-DNA (plasmidi viittaa vektoriin, joka on liitetty mielen- .***. kiinnon kohteena olevaan vieraaseen geeniin) . Tämä plasmidi- ««· ·. DNA analysoidaan sitten restriktiokartoituksen ja/tai DNA- sekvensoinnin avulla. DNA-sekvensointi toteutetaan yleensä • · *···* käyttäen joko Messingin et ai. menetelmää (Nucleic Acids :***: 35 Res., 9 : 309 (1981) tai Maxamin et ai., menetelmää (Methods ·«» ·*·*; of Enzymology, 65 : 499 (1980) .

•

Prokaryootit ovat edullisia isäntäsoluja tämän kek- 1 1 7940 30 sinnön ensimmäisiä kloonausvaiheita varten. Ne ovat erityisen käyttökelpoisia DNA:n suurten määrien nopeaan tuotantoon, paikkaan kohdistettuun mutageneesiin käytettävien yksi juosteisten DNA-templaattien tuotantoon, monien mutanttien 5 seulomiseen samanaikaisesti ja muodostettujen mutanttien DNA-sekvensointiin. Sopiviin prokaryoottisiin isäntäsoluihin sisältyvät E: coli K12 kanta 294 (ATCC no 31 446), E. coli kanta W3110 (ATCC no 27 325), E. coli X1776 (ATCC no 31 537) ja E. coli B; kuitenkin yhtä hyvin voidaan käyttää monia 10 muitakin E. coli'n kantoja, kuten kantoja HB101, JM101, NM522, NM538, NM539, ja monia muita prokaryoottien lajeja ja sukuja. Näiden on tietysti tarkoitus olla kuvaavia pikemmin ' kuin rajoittavia.

Näiden isäntien kanssa käytetään plasmidivektoreita, 15 jotka sisältävät replikoni- ja kontrollisekvenssit, jotka ovat peräisin lajeilta, jokta ovat yhteensopivia isäntäsolun kanssa. Vektorilla on tavallisesti replikaatiopaikka, mark-kerigeenit, jokta tuottavat fenotyyppisen valinnan transformoiduissa soluissa, yksi tai useampi promoottori ja poly-20 linkkerialue, joka sisältää useita restriktiopaikkoja vie- .. raan DNA:n insertoimiseksi. E. colin transformaatioon tyy pillisesti käytettyihin plasmideihin sisältyvät pBR322, *· ” pUC18, pUCl9, pUCH8, pUC119 ja Bluescript M13, jotka kaikki : on kuvattu edellä mainitussa Sambrook'in et ai. julkaisussa 25 osissa 1.12 - 1.20. Kuitenkin monta muuta sopvaa vektoria on • * * *,ϊ myös saatavissa. Nämä vektorit sisältävät geenejä, jotka koodaavat ampisilliini- ja/tai tetrasykliiniresistenssin, :*·*: mikä tekee mahdolliseksi sen, että näillä vektoreilla trans- : formoidut solut kasvavat näiden antibioottien läsnäollessa.

**. 30 Promoottoreihin, joita käytetään tavallisimmin proka- • ·» *.··φ ryoottisissa vektoreissa, sisältyvät β-laktamaasi- (penisil- • · T Iinaasi) ja laktoosipromoottorijärjestelmät [Chang et ai.,

Nature, 375 : 615 (1978); Itakura et ai., Science, 198 : 1056 (1977); Goeddel et ai., Nature, 281 : 544 (1979)] ja .·*·. 35 tryptofaanipromoottorijär jestelmä (trp-promoottorijär jes- • · telmä) [Goeddel et ai., Nucl. Acids Res., 8 : 4057 (1980); EPO Appi. Pubi. No. 36 776)] ja emäksiset fosfataasijärjes- 117940 31 telmät. Vaikka nämä ovat tavallisimmin käytettyjä, muitakin mikrobipromoottoreita on käytetty ja niiden nukleotidisek- venssejä koskevat yksityiskohdat on julkaistu, mikä tekee alan ammattilaiselle mahdolliseksi niiden liittämisen toi- 5 minnallisesti plasmidivektoreihin [katso julkaisu Siebenlist et ai., Cell, 20 : 269 (1980)].

Keksinnön mukaisesti valmistettujen t-PA-muunnelmien ilmentymistä varten käytetään eukaryoottisia isäntiä, kuten eukaryoottisia mikrobeja (hiivaa) ja monisoluisia organisme- 10 ja (nisäkkään soluviljelmiä).

Saccharomyces cerevisiae, eli yleinen leivontahiiva, on yleisimmin käytetty alempien eukaryoottisten isäntämikro- organismien joukosta. Kuitenkin joukko muita sukuja, lajeja ja kantoja on yleisesti saatavissa ja ne ovat tässä käyttö- 15 kelpoisia, kuten Schizosaccharomyces pombe [Beach ja Nurse,

Nature, 290 ; 140 (1981); EP 139 383, julkaistu toukokuun 2.

päivä, 1985]; Kluyveromyces -isännät (US-patentti 4 943 529;

Fleer et ai, edellä) kuten esim. K. lactis [MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et ai., J. Bacteriol., 737 (1983)], K.

20 fraqilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K.

wickeramii (ATCC 24 178); K. waltii (ATCC 56 500), K. dro- . , sophilarum (ATCC 36 906; Van den Berg et ai., edellä), K.

• *#* ,* ,· thermotolerans ja K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); « · a • Pichia pastoris [EP 183 070; Sreekrishna et ai., J. Basic **ϊ·* 25 Microbiol., 28 : 265 - 278 (1988)]; Candida; Trichoderma • # a : reesia (EP 244 234); Neurospora erässä [Case et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 76 : 5259 - 5263 (1979)]; Schwanniomy-ces, kuten Schwanniomyces occidentalis (EP 394 538, julkaistu 31. lokakuuta, 1990); ja lankamaiset sienet, kuten esim. 30 Neurospora-, Penicillium-, Tolypocladium- (WO 91/00357, jul- .*··. kaistu tammikuun 10. päivä, 1991) ja Aspergillus-isännät, • ^ kuten A, nidulans [Ballance et ai., Biochem. Biophys. Res.

Commun., 112 : 284 - 289 (1983); Tilburn et ai., Gene, 26 : * · ·

205 - 221 (1983); Yelton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 35 81 : 1470 - 1474 (1984)] ja A. niger [Kelly ja Hyner, EMBO

J., 4 : 475 - 479 (1985) ] . , .

* • ·

Sopiviin promoottorisekvensseihin hiivavektoreissa 32 ' ί 117940 sisältyvät promoottorit 3-fosfoglyseraattikinaasia varten [Hitzeman et ai., J. Biol. Chem., 255 : 2073 (1980)] tai muita glykolyyttisiä entsyymejä varten [Hess et ai., J. Adv. ;

Enzyme Req., 7 : 149 (1968) ja Holland et ai-, Biochemistry, 5 17 : 4900 (1978)], kuten enolaasia, glyseraldehydi-3-fos- faattidehydrogenaasia, heksokinaasia, pyruvaattidekarboksy-laasia, fosfofruktokinaasia, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraa-sia, 3-fosfoglyseraattimutaasia, pyruvaattikinaasia, tri-oosifosfaatti-isomeraasia, fosfoglukoosi-isomeraasia ja glu-10 kokinaasia varten. Sopivia ekspressioplasmideja muodostettaessa näihin geeneihin yhteydessä olevat terminaatiosekvens-sit liitetään myös sekvenssin ekspressiovektoriin 3', jonka halutaan ekspressoituvan mRNA:n polyadenylaation ja ter-minaation tuottamiseksi. Muu promoottori, jolla on lisäetuna 15 kasvuolosuhteiden kontrolloima transkriptio, on alkoholide-hydrogenaasi 2:n, isosytokromi C:n, happofosfataasin, typ-. piaineenvaihduntaan liittyvien hajottavien entsyymien, edellä mainitun glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin ja maltoosin ja galaktoosin käytöstä vastaavien entsyymien pro-20 moottorialue. Mikä tahansa plasmidivektori, joka sisältää hiivan kanssa yhteensopivan promoottorin, replikaation aloi- , , tuskohdan ja terminaation sekvenssit, on sopiva.

* · · '· *· Monisoluisista organismeista peräisin olevia soluvil- • » · • ♦' jelmiä voidaan käyttää isäntinä tämän keksinnön harjoittami- « 25 seksi. Vaikka sekä selkärangattomien että selkärankaisten • · ♦ • soluviljelmät ovat hyväksyttäviä, selkärankaisten soluvil-jelmät, erityisesti nisäkkään soluviljelmät, ovat edullisia. Esimerkkeihin sopivista solulinjoista sisältyvät apinan mu-nuaisen CVI-linja, joka on transformoitu SV40:llä (COS-7, 30 ATCC CRL 1651); ihmisen sikiön munuaisen linja 293S [Graham * ·* .···. et ai., J. Gen. Virol., 36 : 59 (1977)], vastasyntyneen • · hamsterin munuaissolut (BHK, ATCC CCL 10); kiinalaisen hams-terin munasarjasolut (CHO) [Urlab ja Chasin, Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 77 : 4216 (1980)], hiiren sertolisolut [TM4, .···. 35 Mather, Biol. Reprod., 23 : 243 (1980)]; apinan munuaissolut (CVI-76, ATCC CCL 70); afrikkalaisen vihreän apinan munuais- • · solut (VERO-76, ATCC CRL-1587); ihmisen kohdunkaulasyövän 33 1 1 7940 solut (HELA, ATCC CCL 2) ; koiran munuaissolut (MDCK, ATCC CCL 34); buffalorotan maksasolut (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ihmisen keuhkosolut (W138, ATCC CCL 75); ihmisen maksasolut (Hep G2, HB 8065); hiiren maitorauhasen kasvainsolut (MMT 5 060562; ATCC CCL 51); rotan maksakasvainsolut [HTC, MI.54,

Baumann et ai., J. Cell Biol., 85 : 1 (1980)]; ja TRI-solut [Mather et ai., Annals N. Y. Acad. Sei., 383 : 44 (1982)]. Näiden solujen ekspressiovektoreihin sisältyvät tavallisesti (mikäli tarpeen) DNA-sekvenssit replikaation aloituskohtaa 10 , varten, promoottori, joka sijaitsee ekspressoitavan geenin edessä, ribosomin sitoutumispaikka, RNA:n pujontaliitospaik-ka, polyadenylaatiopaikka ja transkription terminaatiopaik-ka.

Promoottorit, joita käytetään nisäkkään ekspres-15 siovektoreissa, ovat usein viruksesta peräisin. Nämä virus-promoottorit ovat yleensä peräisin polyomaviruksesta, Adenovirus 2:sta ja useimmiten Simian Virus 40:stä (SV40). SV40-virus sisältää kaksi promoottoria, joita kutsutaan varhaisen ja myöhäisen vaiheen promoottoreiksi. Nämä promootto-20 rit ovat erityisen käyttökelpoisia, koska ne saadaan molemmat helposti viruksesta yhtenä DNA-fragmenttina, joka sisäl-. . tää myös replikaation viraalisen aloituskohdan [Fiers et **]· ai., Nature, 273 : 113 (1978)]. Voidaan myös käyttää pienem- • · · • ·* piä tai suurempia SV40:n DNA-fragmentteja, edellyttäen, että « • 4 « 25 ne sisältävät suunnilleen 250-bp-sekvenssin, joka ulottuu ** * • V Hindlll-paikasta kohti Bqll-paikkaa ja sijaitsee replikaati- *:* on viraalisessa aloituskohdassa.

·»«·

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää promoottoreita, jot- k ka liittyvät luonnostaan vieraaseen geeniin (homologiset :·. 30 promoottorit), edellyttäen, että ne ovat yhteensopivia isän- .··«. täsolulinjan kanssa, joka on valittu transformaatioon.

• * "t* Replikaation aloituskohta voidaan saada eksogeenises- *"** tä lähteestä, kuten SV40-viruksesta tai muusta viruksesta • · » (esim. Polyomasta, Adenosta, VSV:stä, BPV:stä) ja insertoida 35 kloonausvektoriin. Vaihtoehtoisesti replikaation aloituskoh- • · • ♦ * ta voidaan tuottaa isäntäsolun kromosomaalisen replikaa- • · tiomekanismin avulla. Jos vieraan geenin sisältävä vektori 34 117940 on yhdistetty isäntäsolun kromosomiin, jälkimmäinen on usein riittävä.

Transformoidut soluviljelmät tuottavat tyydyttäviä määriä ihmisen t-PA:a. Kuitenkin sekundaarisen DNA:n koo-5 daussekvenssin käyttö voi lisätä tuotantomääriä. Sekundaarinen koodaussekvenssi käsittää tyypillisesti dihydrofolaat-tireduktaasisentsyymin (DHFR). DHFR:n villin tyypin muotoa estää normaalisti kemiallinen metotreksaatti (MTX). DHFR:n ekspressoitumisen taso solussa vaihtelee riippuen MTX:n mää-10 rästä, joka on lisätty viljeltyihin isäntäsoluihin. DHFR:n lisäominaispiirre, joka tekee sen erityisen käyttökelpoiseksi sekundaarisena sekvenssinä, on se, että sitä voidaan käyttää valintamarkkerina transformoitujen solujen identifioimiseksi.

15 On saatavissa DHFR:n kaksi muotoa käytettäväksi se kundaarisina sekvensseinä, nimittäin villin tyypin DHFR ja MTX-resistentti DHFR. Määrätyssä isäntäsolussa käytettävän DHFR:n tyyppi riippuu siitä, onko isäntäsolulla puute DHFR:stä (siten, että se joko tuottaa hyvin pieniä pitoi-20 suuksia DHFR:ää endogeenisesti tai se ei tuota lainkaan toiminnallista DHFR:ää). Solulinjat, joilla on DHFR-puute, ku- , . ten CHO-solulinja, joka on kuvattu julkaisussa Urlaub ja * · · I* " Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei (USA), 77 : 4216 (1980), • · · • ·* transformoidaan villin tyypin DHFR:n koodaussekvensseillä.

25 Transformaation jälkeen nämä solulinjat, joilla on DHFR-puu- * * * • V te, ilmentävät toiminnallisen DHFR:n ja kykenevät kasvamaan 4>’j* elatusaineessa, josta puuttuvat ravinteet hypoksantiini, f glysiini ja tymidiini. Tässä elatusaineessa solut, joita ei ole transformoitu, eivät säily hengissä.

:*. 30 DHFR:n MTX-resistenttiä muotoa voidaan käyttää keino- j * · · * .···. na transformoitujen isäntäsolujen valitsemiseksi niistä • · *1* isäntäsoluista, jotka tuottavat endogeenisesti normaaleja määriä toiminnallista DHFR:ää, joka on MTX-herkkää. CHOK1- »·♦ solulinjalla (ATCC no. CL 61) on nämä ominaispiirteet ja si-35 ten se on käyttökelpoinen solulinja tähän tarkoitukseen.

MTX:n lisääminen soluviljelmän elatusaineeseen tekee mahdol-liseksi sen, että vain ne solut kasvavat, jotka on transfor- 117940 35 moitu DNA:11a, joka koodaa MTX-resitentin DHFR:n. Solut, joita ei ole transformoitu, ovat kykenemättömiä säilymään elossa tässä elatusaineessa.

Nisäkäsisantäsoluja, joita on käytetty tämän keksin- 5 non muunnelmien tuottamiseksi, voidaan viljellä erilaisissa elatusaineissa. Kaupasta saatavat elatusaineet, kuten Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM, Sigma), RPMI- 1640 (Sigma) ja Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM,

Sigma) ovat sopivia isäntäsolujen viljelemiseksi. Lisäksi 10 mitä tahansa elatusainetta, joka on kuvattu julkaisuissa Ham ja Wallace, Meth. Enz., 58 : 44 (1979), Barnes ja Sato,

Anal. Biochem., 102 : 255 (1980), US-patentit 4 767 704, 4 ! 657 866, 4 927 762 tai 4 560 655, WO 90/03430, WO 87/00195, 1 U.S. Pat. Re. 30 985, voidaan käyttää elatusaineena isän- 15 täsolujen viljelemiseksi. Mikä tahansa näistä elatusaineista voidaan täydentää tarvittaessa hormoneilla ja/tai muilla kasvutekijöillä (kuten insuliinilla, transferriinillä tai epidermaalisella kasvutekijällä), suoloilla (kuten natrium- kloridilla, kalsiumilla, magnesiumilla ja fosfaatilla), pus- 20 kureilla (kuten HEPESiillä), nukleosideilla (kuten adenosii- nilla ja tymidiinilla), antibiooteilla (kuten Genta- ; mycin'illä), hivenaineilla (määritettynä epäorgaanisina yh- • *» .* .* disteinä, jotka tavallisesti ovat läsnä loppukonsentraatioi- * [ na mikromolaarisella alueella) ja glukoosilla tai vastaaval- • · « #”** 25 la energialähteellä. Mitä tahansa muita välttämättömiä li- • · · • ·* säyksiä voidaan myös sisällyttää sopivina konsentraatioina, jotka ovat alan ammattilaisten tiedossa.

• · · ·.· : Solusta normaalisti eritetyt monet eukaryoottiset proteiinit sisältävät endogeenisen signaalisekvenssin amino-30 happosekvenssin osana. Tämä sekvenssi kohdentaa proteiinin ·***; kuljetettavaksi solusta solulimakalvoston ja Golgin laitteen • f · * . kautta. Signaalisekvenssi sijaitsee tyypillisesti proteiinin aminohappopäätteessä ja on pituudeltaan noin 13 - 36 amino- • · *···* happoa. Vaikka todellinen sekvenssi vaihtelee proteiinien 35 osalta, kaikki tunnetut eukaryoottiset signaalisekvenssit ·*·’. sisältävät vähintään yhden positiivisesti varautuneen jään- • · nöksen ja 10 - 15 aminohapon erittäin hydrofobisen jakson : ; 36 ! 117940 (stretch) (tavallisesti se sisältää runsaasti aminohappoja leusiini, isoleusiini, alaniini, väliini ja fenyylialaniini) lähellä signaalisekvenssin keskusta. Signaalisekvenssi puuttuu normaalisti proteiinin erittyneestä muodosta, koska sen 5 pilkkoo solulimakalvoston pinnalla oleva signaalipeptidaasi proteiinin siirron aikana solulimakalvostoon. Proteiinia, johon on yhä kiinnittyneenä signaalisekvenssi, kutsutaan usein "esiproteiiniksi" tai proteiinin epäkypsäksi muodoksi.

Kuitenkaan kaikki erittyneet proteiinit eivät sisällä 10 aminoterminaalista signaalisekvenssiä, joka lohkaistaan pois. Jotkut proteiinit, kuten ovalbumiini, sisältävät signaalisekvenssin, joka sijaitsee proteiinin sisäalueella. Tätä sekvenssiä ei pilkota normaalisti pois siirtymisen aikana .

15 Solulimasta normaalisti tavattavat proteiinit voidaan kohdentaa eritettäväksi kytkemällä signaalisekvenssi proteiiniin. Tämä toteutetaan helposti liittämällä signaalisekvenssin koodaava DNA proteiinin koodaavan DNA:n 5'-päähän ja sitten ekspressoimalla tämä fuusioproteiini sopivassa isan-20 täsolussa. Signaalisekvenssin koodaava DNA voidaan saada re-striktiofragmenttina mistä tahansa geenistä, joka koodaa . . signaalisekvenssin sisältävän proteiinin. Siten tässä voi- • * * .* ,* daan käyttää prokaryoottista signaalisekvenssiä, hiivan sig- « · · • ·* naalisekvenssiä ja eukaryoottista signaalisekvenssiä riip- • « m '•h* 25 puen isäntäsolun tyypistä, jota käytetään keksinnön har- · »

: *.· joittamiseksi. Geenin signaalisekvenssiosuuden koodaava DNA

poistetaan käyttäen sopivia restriktioendonukleaaseja ja : sitten liitetään eritettävän proteiinin, so. t-PA:n, koodaa- vaan DNA:hän.

30 Funktionaalisen signaalisekvenssin valinta edellyt- .·*·. tää, että isäntäsolun signaalipeptidaasi tunnistaa signaa- ·* lisekvenssin siten, että tuon signaalisekvenssin pilkkominen * * pois ja proteiinin erittyminen tapahtuvat. DNA ja aminohap- posekvenssi, jotka koodaavat useiden eukaryoottisten geenien 35 signaalisekvenssiosuuden, mukaan luettuna esimekriksi ihmi- • ♦ ♦ sen kasvuhormoni, proinsuliini ja proalbumiini, ovat tunnettuja [katso julkaisu Stryer, Biochemistry, W. H. Freeman and

117940 I

37 ! ' ϊ

Company, New York (1988), sivu 769] ja niitä voidaan käyttää ' signaalisekvensseinä sopivissa eukaryoottisissa isäntäso- : luissa. Hiivan signaalisekvenssejä, kuten esimerkiksi happo- : fosfataasia [Arima et ai., Nuc. Acids Res., 11 : 1657 (19- : 5 83)], alfa-tekijää, emäksistä fosfataasia ja invertaasia voidaan käyttää suoraan erittämiseen hiivaisäntäsoluista. Prokaryoottisia signaalisekvenssejä, jotka ovat peräisin geeneistä, jotka koodaavat esimerkiksi LamB:n tai OmpF:n [Wong et ai., Gene, 68 : 193, (1988)], MalE:n, PhoA:n tai 10 betalaktamaasin, sekä muista geeneistä, voidaan käyttää proteiinien kohdentamiseksi prokaryoottisista soluista viljelmän elatusaineeseen.

Vaihtoehtoinen tekniikka mielenkiinnon kohteena olevan signaalisekvenssin sisältävän proteiinin tuottamiseksi, 15 siten että se voidaan erittää, on signaalisekvenssin koo-daavan DNA:n syntetisoiminen kemiallisesti. Tässä menetelmässä valitun signaalisekvenssin koodaavan oligonukleotidin molemmat juosteet syntetisoidaan kemiallisesti ja sitten liitetään toisiinsa kaksinkertaisen juosteen muodostamisek-20 si. Kaksijuosteinen oligonukleotidi liitetään sitten proteiinin koodaavan DNA:n 5'-päähän.

, . Rakennelma, joka sisältää DNA:n, joka koodaa proteii- • · · » ·« .* ,* nin, johon on liitettynä signaalisekvenssi, voidaan sitten • · · • ·* , liittää sopivaan ekspressiovektoriin. Tällä ekspres- • · « 25 siovektorilla transformoidaan sopiva isäntäsolu ja mielen- * * * • '.· kiinnon kohteena oleva proteiini ilmentyy ja erittyy.

« „*·* Viljelmät, jotka koostuvat nisäkäsisäntäsoluista ja :|Γ: muista isäntäsoluista, joilla ei ole jäykkiä solumem- braaniesteitä, transformoidaan tavallisesti käyttäen kal- Ϊ*. t 30 siumfosfaattimenetelmää, kuten se on alunperin kuvattu jul- » ,*··. kaisussa Graham ja Van der Eb, Virology, 52 : 546 (1978) ja *·* muunnettu, kuten on kuvattu edellä mainitussa Sambrook'in et ai. julkaisussa luvuissa 16.32 - 16.37. Kuitenkin voidaan ··· käyttää myös muita menetelmiä DNA:n tuomiseksi soluihin, ku- 35 ten Polybrene-menetelmää [Kawai ja Nishizawa, Mol. Cell.

Biol., 4 : 1172 (1984)], protoplastif uusiota [Schaffner, * *

Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77 : 2163 (1980)], elektroporaa- 117940 ! 38 i i tiota [Neumann et ai., EMBO J., 1 : 841 (1982)] ja suoraa mikroinjektiota tumiin [Capecchi, Cell, 22 : 479 (1980)].

Hiivasolut transformoidaan yleensä käyttäen polyety- ; leeniglykolimenetelmää, kuten se on kuvattu julkaisussa Hin- ; 5 nen, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75 : 1929 (1978)].

Prokaryoottiset isäntäsolut tai muut isäntäsolut, joillla on jäykät soluseinät, transformoidaan edullisesti käyttäen kalsiumkloridimenetelmää, kuten on kuvattu edellä mainitussa Sambrook'in et ai. julkaisussa luvussa 1.82.

10 Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää elektroporaatiota näiden solujen transformoimiseksi.

Edullisesti t-PA-muunnelma otetaan talteen viljelmän elatusaineesta erittyneenä proteiinina, vaikka se voidaan ottaa talteen myös isäntäsolun lyysituotteista, kun ekspres-15 sio tehdään suoraan ilman erityssignaalia. Kun muunnelma on ekspressoitunut rekombinanttisolussa, joka on muusta kuin ihmisestä peräisin, muunnelma on siten täysin vapaa ihmisestä peräisin olevista proteiineista. Kuitenkin muunnelman puhdistaminen rekombinanttisolun proteiineista on välttämä-20 töntä, jotta saadaan valmisteita, jotka on oleellisesti homogeenisia proteiinin suhteen. Ensimmäisenä vaiheena viljel- t.# . män elatusaine tai solujen lyysituote sentrifugoidaan hieno- » ·· .* jakoisten solun jäännösten poistamiseksi.

• · · * i Sitten muunnelma puhdistetaan saastuttavista liukoi- ···'·· *·*·* 25 sista proteiineista esimerkiksi fraktioimalla immunoaf- ·· · · • · * Ϊ .* finiteetti- tai ionivaihtopylväiden avulla, saostamalla eta- nolilla, käänteisf aasi-HPLC: n avulla, kromatograf oimalla ·«« ί,ί ! käyttäen silikaa tai kationinvaihtohartsia, kuten DEAE:ta, kromatofokusoimalla, SDS-PAGE:n avulla, saostamalla am- ·*·,. 30 moniumsulf aatilla tai geelielektroforeesin avulla. Prote- .***. aasiestäjä, joka ei häiritse t-PA:n aktiivisuutta, kuten fe- • ·· • 4 nyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF) voi myös olla käyt- ] * tökelpoinen proteolyyttisen hajoamisen estämiseksi puhdista- • · *.·· misen aikana ja antibiootteja voidaan sisällyttää satunnais- ♦ ·***; 35 ten epäpuhtauksien kasvun estämiseksi. Alan ammattilainen «·« ymmärtää, että puhdistusmenetelmät, jotka ovat sopivia alku- • · peräisen t-PA:n puhdistamiseksi, voivat vaatia muuntamista 117940 39 t-PA:n tai sen muunnelmien luonteessa tapahtuneiden muutosten ottamiseksi huomioon ekspressoitumisen jälkeen rekom-binantissa soluviljelmässä.

Edullisessa suoritusmuodossa t-PA-muunnelma erittyy, 5 talteenotettu soluviljelmän neste diasuodatetaan ja t-PA-muunnelma puhdistetaan käyttäen lysiiniaffiniteettikromato-grafiaa. Vaihtoehtoisesti soluviljelmän päällysneste voidaan kyljettaa PBS-esisopeutetun pylvään läpi, joka sisältää la-sihelmiä, jotka on kytketty polyklonaaliseen anti-t-PA-vuo-10 hi-A6-vasta-aineeseen, sen jälkeen pylväs tasapainotetaan puskurilla ja t-PA-muunnelma eluoidaan.

Yhdisteet voidaan formuloida tunnettujen menetelmien mukaisesti farmaseuttisesti käyttökelpoisten koostumusten valmistamiseksi, jolloin t-PA-tuote yhdistetään seoksessa 15 farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa. Sopivat kantajat ja niiden valmisteet on kuvattu julkaisussa Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. painos, 1980, Mack Publishing Co., toim. Oslo et ai. Nämä koostumukset sisältävät tyypillisesti tehokkaan määrän t-PA-muunnelmaa, esimerkiksi 20 noin 0,5-5 mg/ml, yhdessä sopivan määrän kanssa kantajaa farmaseuttisesti hyväksyttävien koostumusten valmistamisek-. , si, jotka ovat sopivia annettavaksi tehokkaasti potilaalle.

• I ( / t-PA-muunnelmat voidaan antaa parenteraalisesti potilaille, i « « • ·* jotka sairastavat kardiovaskulaarisia tauteja tai tautitilo- • ·*· *·ί.* 25 ja, tai käyttäen muita menetelmiä, jotka varmistavat niiden ·» * : *.· vapautumisen verivirtaan tehokkaassa muodossa.

..*·* Koostumuksiin, jotka sopivat erityisen hyvin t-PA- :[Γ: muunnelmien antamiseksi kliinisesti ja joita on käytetty tä män keksinnön harjoittamiseksi, sisältyvät steriilit vesity 30 liuokset tai steriilit kostutettavat jauheet, kuten pakkas- .*··. kuivattu proteiini. Tyypillisesti valmisteessa käytetään • · myös sopivaa määrää farmaseuttisesti hyväksyttävää suolaa * * valmisteen muuttamiseksi isotoniseksi. Tyypillisesti tuot- teeseen sisällytetään myös puskuri, kuten arginiiniemäs yh- > .***. 35 distelmänä fosforihapon kanssa, konsentraation ollessa tar- • · · ··.·. koituksenmukainen sopivan pH-arvon, yleensä 5,5 - 7,5, yl- ; • · läpitämiseksi. Lisäksi tai vaihtoehtoisesti valmisteeseen j 40 117940 voi sisältyä yhdiste, kuten glyseroli, varastointi-iän ylläpitämisen helpottamiseksi.

Farmaseuttisten koostumusten annostukset ja halutut lääkekonsentraatiot voivat vaihdella riippuen kysymyksessä 5 olevasta muunnelmasta ja aiotusta nimenomaisesta käytöstä. Sopivan annostuksen määrittäminen sisältyy hyvin lääkärin taitoihin ottaen erityisesti huomioon laaja kokemus villin tyypin humaanisen rekombinantti-t-PÄ:n käytöstä. Johtuen tämän keksinnön t-PA-muunnelmien pidentyneestä puoliintu-10 misajasta plasmassa ne ovat erityisen sopivia annettavaksi bolus-annoksena. Edullisen lääkkeenanto-mallin mukaisesti tämän keksinnön t-PA-muunnelmat annetaan aluksi laskimon-sisäisenä bolus-annoksena, joka kyllästää oleellisesti t-PA:n puhdistumamekanismin ja jota seuraa mahdollisesti li-15 säbolus ja/tai jatkuva antaminen laskimonsisäisesti. Muunnelmien tapauksessa, jotka ovat biologiselta aktiivisuudeltaan verrattavissa villin tyypin t-PA:iin, kokonaisannos on : edullisesti noin 100 mg. Aktiisemmat muunnelmat tuottavat saman vaikutuksen pienemmällä annoksella. Muunnelmia, joilla 20 on parannettu fibriinispesifisyys, voidaan antaa suurempina annoksina lisäämättä merkitsevästi verenvuotokom- : plikaatioiden vaaraa.

#. · Yleisenä sääntönä annostus ja annostellun lääkkeen » · · -f • · l määrä aikayksikköä kohden voivat olla samansuuntaisia tai « · · • · · ,*** 25 suurempia kuin mitä tällä hetkellä on käytössä muiden kar- * * * • i* diovaskulaaristen, trombolyyttisten aineiden kliinisissä • · * tutkimuksissa, esimerkiksi noin 1-2 mg/kg laskimonsisäise- ·· ·.· * nä tai valtimonsisäisenä annoksena 1,5 - 12 tunnin kuluessa ihmispotilailla, jotka sairastavat sydäninfarktia, keuhkove-30 ritulppaa jne.

·***: Esimerkiksi hoidettaessa syvää laskimotukosta tai pe- ««« * . rifeeristä verisuonitautia, "bolus"-annokset, jotka ovat ····* • · ... suuruusluokaltaan noin 0,05 - 0,2 mg/kg, ovat tyypillisesti i i *·;*’ edullisia seuraavien annosten ollessa suuruusluokaltaan noin ί ϊ 35 0,1 - 0,2 mg/kg melko vakiona pysyvän pitoisuuden ylläpitä- I’·*: miseksi veressä, mainitun pitoisuuden ollessa edullisesti • * suurusluokaltaan noin 3 pg/ml.

117940 41

Yhtenä esimerkkinä sopivasta annostusmuodosta, lasi-pulloon, joka sisältää 50 mg t-PA:a, arginiinia, fosforihap-poa ja polysorbaatti 80:ntä, lisätään 50 ml steriiliä vettä pullossa olevan seoksen muodostamiseksi uudelleen alkuperäi-5 seen koostumukseensa ruisketta varten ja saatuun liuokseen sekoitetaan sopiva tilavuus 0,9-%:ista natriumkloridia.

Keksinnön mukaisesti valmistetut t-PA-muunnelmat ovat myös käyttökelpoisia fibriinin saostumisen tai kiinnikkeen muodostumisen tai uudelleen muodostumisen estämiseksi. Tämän 10 käytön yksi suoritusmuoto on kuvattu EPO-patenttijulkaisussa 297 860, joka on julkaistu 4. tammikuuta, 1989. Yleensä tämän tyyppinen käsittely koskee koostumuksen antamista paikallisesti mahdollisen fibriinin tai kiinnikkeen muodostumisen paikkaan, jolloin koostumus sisältää hoidollisesti te-15 hokkaan määrän t-PA-muunnelmaa niukkaliukoisessa muodossa, jolloin se vapautuu jatkuvasti tuossa paikassa noin kolmen päivän - kahden viikon ajan. Tyypillisesti t-PA-muunnelma annetaan annoksena, joka on riittävä fibriinin saostumsien tai kiinnikkeen muodostumisen estämiseksi leikkauksen, in-20 fektion, vamman tai tulehduksen jälkeen. Tavallisesti tämä määrä on 0,02 mg/g geeliä - 25 mg/g geeliä, edullisemmat ^ ♦ määrät ovat 0,20 mg/g geeliä - 2,5 mg/g geeliä, edullisimmat .1 .2 määrät ovat 0,25 mg/g geeliä - noin 1,0 mg/g geeliä. Kukin • · · • ·1 t-PA-muunnelma, jota käytetään kiinnikkeen muodostumisen « · « *·ί.2 25 ja/tai fibriinin saostumisen estämiseksi, formuloidaan tyy- ·· » : .· pillisesti puolikiinteään, limaiseen, farmaseuttiseen kanta- ,.1·2 jaan entsyymin sijoittamiseksi mahdollisen kiinnikkeen muo- il : dostuksen paikalle. Kantaja sisältää pitkäketjuisia hiilive tyjä tai kasviöljyjä ja vahoja, jotka koostuvat muunnettu-·1·.. 30 jen, tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien rasvahappoglyseri- .···, dien seoksista tai muunnettujen tyydyttyneiden ja tyydytty- ···2 • mättömien rasvahappoglyseridien seoksista. Esimerkkeihin si- 1 sältyvät puolikiinteät vehikkelit, kuten vaseliini, tai puo- 2 ··2 lisynteettiset glyseridit, polyhydroksiliuottimet, kuten .3. 35 glyseroli, pitkäketjuiset hiilivedyt, biologisesti hajoavat 3 «1· polymeerit tai liposomit.

• ·

Seuraavat esimerkit kuvaavat pelkästään parasta mal- 117940 42 lia, joka nyt on mahdollinen keksinnön harjoittamiseksi käytännössä, mutta niitä ei pitäisi tulkita keksintöä rajoittaviksi.

Esimerkki 1 5 fc—pa—muunnelmien tuotanto rekombinanttitekniikan avulla I. Vektorin muodostaminen ja mutageneesi Tämän keksinnön uudet t-PA-muunnelmat muodostettiin t-PA-ekspressiovektorissa pRK7-t-PA (katso esim. patenttijulkaisut WO 90/02798, julkaistu maaliskuun 22. päivä, 1990, 10 ja WO 92/02612, julkaistu helmikuun 20. päivä, 1992). Tätä vektoria, joka sisälsi mutantti-t-PA:n tai villin tyypin t-PA:n, käytettiin transfektioon ja ekspressioon ihmisen sikiön munuaissoluissa (293c).

t-PA cDNA:n paikkaan kohdistettu mutageneesi to-15 teutettiin menetelmän avulla, joka on kuvattu julkaisussa Taylor et ai., Nucl. Acids Res., 13 : 8765 (1985), käyttäen menetelmässä tarvittavaa pakkausta, joka hankittiin yhtiöltä Amersham Corporation (luettelo no RPN 1253) . Haluttujen mu-tanttien muodostamiseksi halutut aminohapposubstituutiot 20 koodaavien sekvenssien oligonukleotidit syntetisoitiin ja niitä käytettiin alukkeina. Nämä oligonukleotidit liitettiin . yksijuosteiseen pRK7-t-PA:iin, joka oli valmistettu käyttäen • t · .* tavanomaisia menetelmiä [Viera et ai., Meth. Enz., 143 : 3 • (1987) ] .

• · · '·'··' 25 Jotkut t-PA-muunnelmista valmistettiin käyttäen Kun- • · · : kelin mutageneesiä [Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA, 82, 488 - 492 (1985) ja Kunkel, T. A. et ai., Meth. En- :T: zymol., 154, 367 - 382 (1987)].

Kolmen deoksiribonukleotidin, deoksiriboadenosiinin 30 (dATP), deoksiriboguanosiinin (dGTP) ja deoksiribotymidiinin ♦ ,*·*. (dTTP) , seos yhdistettiin muunnetun tiodeoksiribosytosiinin • # kanssa, joka sisältyi pakkaukseen ja jota pakkauksen valmis taja kutsui nimellä dCTP (aS), ja saatu seos lisättiin yksi- ··· * juosteisiin pRK7-t-PA: iin, johon oligonukleotidi oli liitet- :***: 35 ty.

··♦ j\\ Kun DNA-polymeraasi oli lisätty tähän seokseen, muo dostui DNA-juoste, joka oli identtinen pRK7-t-PA:n kanssa 117940 •1 i lukuunottamatta mutaation avulla muunnettuja emäksiä. Lisäksi tämä uusi DNA-juoste sisälsi dCTP:n sijasta dCTP (aS):n, joka suojasi sitä restriktioendonukleaasin hajotukselta. Sen jälkeen kun kaksijuosteisen heterodupleksin templaattijuoste 5 oli kiinnitetty sopivaan restriktioentsyymiin, templaatti-juoste hajotettiin ExoIII-nukleaasin toimesta alueen ulkopuolelta, joka sisälsi mutageenisen oligomeerin. Sitten re- 1 aktio pysäytettiin, jolloin jäljelle jäi molekyyli, joka oli vain osittain yksijuosteinen. Sitten muodostettiin täy-10 dellinen kaksijuosteinen DNA-homodupleksimolekyyli DNA-poly-meraasin avulla kaikkien neljän deoksiribonukleotiditrifos-faattien, ATP:n ja DNA-ligaasin läsnäollessa.

Nämä oligonukleotidit, joita käytettiin alukkeina pRK7-t-PA-molekyylien muodostamiseksi, esitetään seuraavassa 15 taulukossa 1.

Taulukko 1.

Mutaatio Oligonukleotidisekvenssi (yksi sijaintikohta)a (luenta 5' - 3')

T103N TGTGCTCCAATTGCCCCTGTAGCT

20 (SEQ. ID. NO: 1)

S105N,A107S GCCACTCTCGGATGTATTCCACGTGCCCCT

. . · (SEQ. ID. NO: 2) • · ·

" N117Q CGCGCTGCTTTGCCAGTTGGTGCA

• · « : ·' ' (SEQ. ID. NO: 3) 117940 ;

44 I

Edellä kuvattua menetelmää vähän muunnettuna käytettiin muiden moninkertaisten mutanttien valmistamiseksi. Jäi- ; jempänä kuvattujen mutanttien tapauksessa templaatti-DNA ei ollut villin tyypin t-PA (pRK7-t-PA). Sen sijaan käytetyt j 5 templaatit olivat templaatteja, jotka sisälsivät vähintään yhden yksinkertaisen mutaation, so. DNA tuotettu muodostettaessa edellä taulukossa 1 esitettyjä mutantteja. Templaat-tina käytetty DNA ja oligonukleotidi, jota käytettiin ylimääräisten mutaatioiden muodostamiseksi kunkin "kaksoispai-10 kan" omaavan mutantin tapauksessa, esitetään jäljempänä taulukossa 2. Kunkin oligonukleotidin DNA-sekvenssi on esitetty edellä taulukossa 1. Tähdet osoittavat muunnelmia, jotka kuvaavat tätä keksintöä.

Taulukko 2.

15 Mutantit (kaksi Oligonuk- sijaintipaikkaa)b Templaatti leotidi

T103N,N117Q* T103N N117Q

S105N,A107S,N117Q S105N,A107S

Nil 7 Q

20 T103N,KHRR(295-299)AAAA KHRR(296-299)AAAA

. . T103N

• · · S105N,A107S, KHRR (296-

• V 299)AAAA KHRR(296-299)AAAA S105N,A107S

25 N117Q, KHRR (296-299) AAAA KHRR (296-299) AAAA

: N117Q

Kaksi sijaintipaikkaa käsittävät mutantit tuotet-tiin käyttäen DNA:ta, joka koodaa t-PA:n yhden sijaintipaikan omaavan mutantin, templaattina mutageneesiä varten.

j*. 30 Seuraavat moninkertaiset ("kolmen sijaintipaikan") * .*··. mutantit muodostettiin oleellisesti edellä esitetyn menetel- • · ** män mukaisesti käyttäen moninkertaisia mutantteja, jotka on * * osoitettu templaattisarakkeessa templaatteina. Kunkin oli- • · · gonukleotidin sekvenssi on esitetty edellä taulukossa 1.

35 Tähdet osoittavat muunnelmia, jotka kuvaavat tätä keksintöä.

• « · ··.·. Taulukko 3 • ·

Mutantit (kolme 1 1 7940 45 sijaintipaikkaa)* Templaatti Olionukleotidi T103N,N117Q,KHRR(296-

299)AAAA* N117Q,KHRR(296-299)AAAA T103N

S105N,A107S,N117Q,

5 KHRR(296-299)AAAA* S105N,A107S,N117Q,KHRR N117Q

c Kolmen sijaintipaikan omaavat mutantit tuotettiin käyttäen DNA:ta, joka koodaa t-PA:n kaksi sijaintipaikkaa omaavan mutantin, templaattina mutageneesiä varten.

II. Bakteerin transformaatio ja DNA:n valmistus 10 Mutantti-t-PA-rakennelmat, jotka tuotettiin edellä esitetyn pöytäkirjan mukaisesti, transformoitiin E. coli -isäntäkantaan MM294tonA käyttäen tavanomaista CaCl2-menetel-mää (osat 1.76 - 1.84, Sambrook et ai., edellä) kelvollisten solujen valmistamiseksi ja transformoimiseksi. E. coli kanta 15 MM294tonA (joka on resistentti Tl-faagille) valmistettiin insertoimalla ja sen jälkeen leikkaamalla epätarkasti TnlO-transposoni tonA-geeniin. Sitten tämä geeni insertoitiin käyttäen transposoni-insertiomutageneesiä [Kleckner et ai., J. Mol. Biol., 116 : 125 - 159 (1977)] E. coli -isäntään 20 MM294 (ATCC 31 44 6) .

DNA uutettiin bakteeritransformanttien yksittäisistä ,·, · kolonioista käyttäen tavanomaista miniprep-menetelmää, joka * · · on kuvattu edellä mainitussa Maniatisin et ai. julkaisussa.

* % · * * Plasmidit puhdistettiin edelleen kuljettamalla ne Sephacryl • * * 25 CL6B-pyörrepylvään läpi ja sitten ne analysoitiin sekvensoi- ) * * * .

: ·* maila ja hajottamalla endonukleaasi-restriktioentsyymin avulla ja käyttämällä agaroosigeelielektroforeesia.

• · · 1 Vaihtoehtoisesti sekvenssi määritettiin yksijuostei- sella tasolla ja kaksijuosteiset plasmidit puhdistettiin ·*·.. 30 bakteeritransformanteista Qiagen-plasmidipakkauksen avulla pakkauksen valmistajan ohjeiden mukaisesti.

·♦· * . III. Ihmisen sikiön munuaisen 293-solujen transformaatio ] Ihmisen sikiön munuaisen 293-soluja kasvatettiin 70 * · · *···* %:n konf luoitumiseen β-kuoppaisilla maljoilla. Liuotettiin

:***; 35 2, 5 pg t-PA-mutantin koodaavaa plasmidia 150 pl:aan 1 mM

* · · seokseen lisättiin (tipoittain samalla sekoittaen) 150 μΐ 50 ·'**. Tris-HCl-puskuria, 0,1 M EDTA:a ja 0,227 m CaCl2:a. Tähän • · : 46 117940 nM HEPES-puskuria (pH-arvo 7,35), 280 mM NaCl:a, 1,5 mM Na-P04:a ja sakan annettiin muodostua 10 minuutin ajan 25 °C:n lämpötilassa. Suspendoitu sakka lisättiin sitten soluihin yksittäisissä kuopissa 6-kuoppaisessa maljassa ja seoksen 5 annettiin asettua yön aikana inkubaattorissa. Elatusaine imettiin sitten pois ja lisättiin 1 ml 20-%:ista glyserolia PBS-liuoksessa (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos). Sitten lisättiin 3 ml tuoretta, seerumia sisältämätöntä ela-tusainetta ja soluja inkuboitiin viiden päivän ajan. Elatus-10 aine kerättiin talteen ja analysoitiin.

Tämän keksinnön t-PA-muunnelmien transfektio suuren mittakaavan tuotantoa ja puhdistusta varten käyttäne 293-soluja voidaan toteuttaa, kuten on kuvattu esimerkiksi patenttijulkaisussa WO 90/02798, edellä.

15 IV. Ilmentyminen ja puhdistaminen käyttäen kiinalaisen hamsterin munasarjasoluja (CHO-soluja)

Laajalti käyttökelpoista parentaalista vektoria pSVI6B5 (transformoitu E. coli -kanta ATCC no 68 151) käytettiin tämän keksinnön t-PA-muunnelmien transfektoimiseksi 20 ja ekspressoimiseksi kiinalaisen hamsterin munasarjasoluissa (CHO). pSVl6B5-vektorin muodostaminen on julkaistu US-paten- . tissa 5 087 572, myönnetty helmikuun 11. päivä, 1992.

• »· .1CHO-dhfr-solut (jollaiset on kuvattu edellä mainitus-• · · * ·* sa Urlaubin ja Chasinin julkaisussa), joita oli kasvatettu • · · *···' 25 ei-valikoivalla kasvualustalla, transfektoitiin yhdessä «· ♦ : .* pSVI6B5:teen perustuvalla ekspressiovektorilla, johon oli ..*·* insertoitu cDNA-sekvenssi, joka koodaa halutun t-PA-muunnel- ··♦ V : man, polylinkkeripaikalle, ja dhfr-valintavektorilla PFD11 [Simonsen ja Levinson, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 2495 ·*·,. 30 - 1499 (1983)] käyttäen Grahamin ja van der Ebin (edellä) .***. yleistä menetelmää. Transfektion jälkeen solut saatettiin • · · • · alttiiksi elatusaineelle; joko (a) elatusaineelle, josta | * puuttuivat glysiini, hypoksantiini ja tymidiini tai (b) ela- *...· tusaineelle, josta puuttuivat nämä aineosat ja joka oli täy- :***: 35 dennetty metotreksaatilla konsentraation ollessa 10 - 300 ♦ * · ί*.\ nM. Noin 50 koloniaa eristettiin kunkin transfektion osalta • · • · valikoivasti niiltä maljoilta, jotka osoittivat eniten väli- 117940 47 koivuutta (metotreksaatin kanssa). Kloonit laajennettiin 6-paikkaisille levyille rekombinantti-t-PA-muunnelman ekspres-soitumisanalyysiä varten. Konfluoituneet kuopat saatettiin alttiiksi seerumista vapaalle tuotantoelatusainelle (muun-5 nettu DMEM/F12-elatusaineista (1 : 1), sisältää insuliinia ja transferriiniä) 5-6 päivän ajaksi ja t-PA soluviljelmän nesteessä määritettiin kvantitatiivisesti käyttäen poly-klonaalisuuteen perustuvaa ELISA-määritystä. Tuottavin klooni kustakin transfektiosta laajennettiin lisäämistä ja tuo-10 tantoa varten. Solut sopeutettiin kasvamaan suspensiossa ja t-PA-muunnelmat tuotettiin spinner-viljelmissä käyttäen seerumista vapaata elatusainetta. Talteenotettu soluviljelmän neste diasuodatettiin ja t-PA-muunnelma puhdistettiin käyt- taen lysiiniaffiniteettikromatografiaa.

15 Esimerkki 2 t-PA-muunnelmien karakterisointi 1. t-PA:n kvantitatiivinen määritys

Proteiinikonsentraatiot määritettiin rutiininomaisesti ELISA:11a standardoituna alkuperäisen sekvenssin omaavaan 20 t-PA:iin (katso EPO-patenttijulkaisu 93 619). Proteiinin puhtaus ja homogeenisyys analysoitiin polyakryyliamidigee- .·. · lielektroforeesin avulla natriumdodekyylisulfaatin läsnäol- * * * · /. .* lessa (PAGE-SDS) käyttäen puskurijärjestelmää, joka on ku- : * vattu julkaisussa Laemmli, Nature, 227 : 680 (1970). Tyypil- ♦ · · *···* 25 lisesti käytettiin 10 - 20 %:n gradienttigeelejä ja prote- • · · '· ** iinit tehtiin näkyviksi joko Coomassie-sininen- tai ho- peavärjäystekniikan avulla, joka on kuvattu julkaisussa Mor-

Ml V · rissey, Anal. Biochem., 117 : 307 (1981). Havaittiin, että edellä kuvatulla tavalla valmistettu t-PA-muunnelma oli tä-30 män menetelmän mukaisesti puhdas ja homogeeninen.

2. t-PA-muunnelmien leimaaminen puhdistuma- ja sitou- ··· * t tumistutkimuksia varten

Aktiivisen paikan leimaava aine valmistettiin ra- * · *···* diojodaamalla Chloramine-T:n katalysoimana tyrosyyli-propyy- 35 li-arginyyli-kloorimetyyliketoni (YPRck) käyttäen erästä • » · ·*·*. muunnelmaa menetelmästä, joka on kuvattu julkaisussa Hunter ja Greenwood, Nature, 194, 495 - 496 (1962). Tyypillisessä 117940 reaktiossa 50 μΐ 1 M Tris-HCl-puskuria, pH-arvo 7,5, lisät-! tiin 40 pliaan Na125I:a (4 mCi; 1,8 nmol) tulpalla suljetussa astiassa. Tähän astiaan lisättiin 8,3 μΐ YPRckia (1,8 nmol 12 mM HCl:ssa). Jodaus aloitettiin lisäämällä Chloramine-T-5 katalyyttiä (1 mg/ml 0,1 M Nap1:ssa, pH-arvo 7,5). Jodaus pysäytettiin 60 sekunnin kuluttua 24 °C:n lämpötilassa 25 piillä natriummetabisulfiittia (mg/ml 0,1 M NaPiissa, pH-arvo 7,5). Sitten reaktioseos laimennettiin lisäämällä 2 ml PBS-liuosta ja 20 piin näytteet laimennetusta leimatusta 10 reagenssista lisättiin 1 ml:n näytteisiin, jotka oli otettu väliaikaisesti transfektoitujen 293-solujen viljelmän pääl-lysnesteista. Tätä seosta inkuboitiin yhden tunnin ajan ja vapaa I erotetun proteiiniin sitoutuneesta lista gee- lisuodatuksen avulla käyttäen PD-10-pylvästä (Oharmacia). 15 Proteiiniin sitoutunut 125I määritettiin saostamalla 10- %:isella trikloorietikkahapolla. Nämä leimausolosuhteet optimoitiin, jolloin moolisuhde jodi/YPRck/t-PA oli 1:1:1. 125I-leimattujen t-PA-muunnelmien spesifinen radioaktiivisuus oli noin 1 pCi 125I/pg t-PA:a.

20 3. Puhdistumanopeuden arvioiminen

Puhdistuminen hiiren plasmasta , « t-PA-muunnelmien puhdistumanopeus määritettiin ra- • · » / dioleimaamalla ihmisen sikiön munuaisen 293-solusta peräisin * * · • ** oleva proteiini, ruiskuttamalla se hiiriin ja mittaamalla • · f M.’ 25 radioaktiivisuus hiirten verestä ajan kuluessa. Jokainen koe • * · : *.* käsitti neljä hiirtä. Hiiret jaettiin kahteen ryhmään ja .,*·* kummaltakin hiireltä ryhmässä otettiin verta ennalta määrät- tyinä ajankohtina* Näistä kahdesta ryhmästä saadut tiedot yhdistettiin ja niiden avulla piirrettiin käyrä aika versus ί*. 30 cpm veressä. Plasman dispositiokäyrän alle jäävä alue (AUC) .···, kunkin hiiren tapauksessa laskettiin käyttäen peräkkäisiä • · *·* puolisuunnikkaita ajalta 1-40 minuuttia.

* * Seuraavassa taulukossa N osoittaa kokeiden lukumää- • · · rää, jota käytettiin puhdistumanopeuden määrittämiseksi.

.*·*. 35 Keskiarvo ± keskihajonta edustaa puhdistumanopeutta * · · ilmaistuna yksiköllä ml/min/kg (eläimen paino-kg) laskettuna • · edellä kuvatun plasman dispositiokäyrän alle jäävän alan 117940 49 avulla.

VK, % on vaihtelukertoimen arvo prosentteina.

Norm, on normalisoitu tekijä, joka edustaa t-PA-muun-nelman puhdistuman ja villin t-PA:n (peräisin 293-soluista) 5 puhdistuman välistä suhdetta.

Tähdet osoittavat muunnelmia, jotka kuvaavat tätä keksintöä.

• · • · · • · · * · • ♦ · • « • · · • · · ··· • 1 1 • ♦ · · · • · • · • t · · φ « « · · ··1 : • ♦ · • · · ♦ « · • ·· • · · • · • ♦ ··· φ···« • ··· • · * · • · · * · • · • · · • · 1 • · · « 117940 50

Taulukko 4. Puhdistuma plasmasta hiirillä. t-PA-muunnelmat N Keskiarvo+keskihajonta VK,% Norm.

Villin tyypin : , t-PA 12 34,3 +4,9 14,3 1,00 5 T103N 5 14,4 + 1,5 10,1 0,42 S105N,A107S 3 20,0 ± 2,6 12,9 0,58 N117Q 4 20,2 ± 3,7 18,6 0,59 KHRR 3 35,0 ± 5,2 15,1 1,02 T103N,N117Q* 3 10,5 ± 2,3 21,8 0,31 10 S105N,A107S, N117Q* 3 12,1 ± 2,2 . 18,3 0,35 T103N, KHRR 4 14,4 ± 1,6 10,8 0,42 S105N,A107S,KHRR 2 19,2 + 0,8 4,2 0,56 . N117Q,KHRR 5 20,3 ± 3,9 , 19,4 0,59 15 T103N,N117Q,KHRR* 2 9,7 ± 0,7 7,3 0,28 S105N,A107S, · N117Q,KHRR* 1 10,0 n.a. n.a. 0,30

KHRR - KHRR(296-299)AAAA-t-PA

n.a. = ei analysoitu 20 Puhdistuma plasmasta kaniineilla t-PA:n ja t-PA-muunnelmien farmakokineettinen analyy- • . si toteutettiin kaniineilla käyttäen jäljempänä osassa 5 ku- • · * .* .* vattua kokeellista trombolyysin valtimo-laskimo-oikovir- • · · • ·* tauskanavamallia (AVS-malli). Asetettiin 20G Teflon-katetri, • · a *·ί·* 25 jossa oli virtauskytkin (Viggo), nukutettujen urospuolisten • · · : Uuden Seelannin valkoisten kaniinien (paino 2,5 - 3,5 kg) keskikorvan valtimoon. 22G-katetri, joka oli varustettu in- : jektiotulpalla, asetettiin vastakkaisen korvan reunalaski- moon. Katetrit huuhdottiin ja lukittiin hepariinilla käsi- •*.>4 30 tellyllä suolaliuoksella.

*

Activase® t-PA tai t-PA-muunnelmat annettiin bolukse- • · • na tai infuusiona laskimokatetrin kautta. Laskimonsisäinen infuusio aloitettiin 15 %:n boluksella ja sen jälkeen jäi- * * * ·...· jelle jäänyt 85 % annoksesta annettiin infuusiona 120 minuu- • 35 tin kuluessa. Activase® t-PA:n tai t-PA-muunnelmien eri an- * · · noksia tutkittiin AVS-mallissa: 60 pg/kg, 180 ug/kg ja 540 pg/kg. Muunnelma T103N,KHRR(296-299)AAAA tutkittiin käyttäen 117940 51 neljää annosta: 20 pg/kg, 60 pg/kg, 180 pg/kg ja 540 pg/kg. Verinäytteet otettiin infuusion aikana 30 minuutin, 60 minuutin ja 90 minuutin kuluttua. Näytteet otettiin 2, 10, 20, 30, 45, 60, 90 ja 120 minuutin kuluttua bolus-ruiskeen anta-5 misen jälkeen. Verinäytteistä valmistettiin anti-koaguloitu plasma ja t-PA:n tai t-PA-muunnelman konsentraatio plasmassa määritettiin polyklonaalisen ELlSA-menetelmän avulla. Viiden eläimen puhdistumanopeuden arvot arvioitiin kunkin annoksen osalta.

10 Tämän keksinnön t-PA-muunnelmien puhdistuma plasmasta verrattuna Activase® t-PA:iin ja tunnettuihin t-PA-muunnel-miin esitetään seuraavassa taulukossa 5. Tähti osoittaa muunnelmaa, joka on tätä keksintöä kuvaava.

Taulukko 5. Puhdistuma plasmasta kaniineilla 15 (ml/min/kg).

t-PA-näyte Infuusioa Bolusb

Activase® t-PA 20,7 ±3,9 23,9 ±6,4 KHRR(296-299)AAAA 20,0 ±3,0 n.d.

T103N n.d. 2,7 ± 0,4 20 T103N,KHRR(296-299)AAAA n.d. 3,3 ± 0,2 N117Q,KHRR(296-299)AAAA n.d. 22,7 ± 1,2 .... T103N,N117Q, KHRR (296-299) AAAA* n.d. 2,1 ± 0,4 • Il .1 a Niiden t-PA-muunnelmien tapauksessa, joilta puut- • tuivat hidastuneeseen puhdistumaan liittyvät mutaatiot [so.

*;*·' 25 villin tyypin t-PA ja KHRR(296-299) AAAA] , puhdistuma plas- i * t : masta arvioitiin proteiinin laskimonsisäisen vakioinfuusion jälkeen. t-PA-muunnelman vakiotilakonsentraatio plasmassa • · · ! määritettiin infuusion lopussa polyklonaalisen ELISA-mene- telmän avulla. Puhdistuma laskettiin seuraavan suhteen avul- ·*·,. 30 la: Puhdistuma = infuusionopeus/vakiotilakonsentraatio plas- ·***· massa. Keskimääräiset puhdistumanopeudet (± keskihajonta) ·*· * . määritettiin Activase® t-PA:n ja KHRR(296-299)AAAA:n tapaukin* sessa käyttäen kerranneanalyysejä (vastaavassa järjestykses- *···* sä n = 33 ja n = 19) .

:*": 35 b t-PA-muunnelmat, joilla oli hidas puhdistu- * * * ·*·*. manopeusominaisuus, (ja Activase® t-PA) arvioitiin kanii- • « neilla proteiinin bolus-annoksen jälkeen, . joka annettiin 117940 52 laskimonsisäisenä ruiskeena. t-PA:n konsentraatio plasmassa eri aikoina ruiskeen jälkeen määritettiin käyttäen poly-klonaalista ELISA-menetelmää. Puhdistumanopeus laskettiin käyttäen suhdetta: Puhdistumanopeus = annos/alue plasman 5 dispositiokäyrän alla. Keskimääräiset puhdistumanopeudet (± keskihajonta) määritettiin kerranneanalyysien avulla (n = 5, 15, 16, 15 ja n = 10) Activase® t-PA:n; T103N:n; T103N, KHRR(296-2 99)AAAA:n; N117Q, KHRR(296-299)AAAA:n ja T103N,N117Q,KHRR(2 96-299) AAAA:n osalta vastaavassa järjes-10 tyksessä.

4. Sitoutuminen fibriiniin CHO-soluista peräisin olevat puhdistetut t-PA-mutan-tit radioleimattiin I125-YPRck: 11a ja muutettiin kaksiketjui-seksi muodoksi liukoisen plasmiinin avulla käyttäen seuraa-15 vaa menetelmää. Näytteitä (1,5 ml), jotka sisälsivät 0,15 pCi i125-YPRck:11a leimattua t-PA:a (tai muunnelmia) fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa oli 0,5 % naudan seerumin albumiinia ja 0,01 % Tween 80:ntä, inkuboitiin ihmisen plasmiinin (0,09 kaseiiniyksikköä 15 piissä fosfaatil-20 la puskuroitua suolaliuosta) kanssa kahden tunnin ajan 25 °C:n lämpötilassa ravistellen varovaisesti. Jäljelle jää- .·. j nyt plasmiini inhiboitiin aprotiniinilla lisäämällä 0,9 TI- • · · .1^.’ yksikköä 15 piissä fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta.

• · * Sitoutuminen fibriiniin arvioitiin käyttäen erästä • « · • · * 25 muunnelmaa menetelmästä, joka on kuvattu julkaisussa Rijken * ·* _ et ai., J. Biol. Chem., 257 : 2920 - 2925 (1982). Lysiini- ...Γ Sepharosella käsitellyn humaanisen fibrinogeenin laimennuk- ··· 1 set, jotka olivat vaihtelualueelta 0,12 pg/ml - 8 mg/ml, valmistettiin fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen. Fib-

:*„ 30 rinogeenin näytteet (50 pl) ja I125-YPRck: 11a leimattu t-PA

•***j tai muunnelmat (100 pl) yhdistettiin 1,2 ml:n polypropy- ··· * . leeniputkiin ja niitä sekoitettiin vähän aikaa. Fibriinihyy- tymät muodostettiin lisäämällä ihmisen trombiinia (50 pl * · '*··* liuoksesta, jossa oli 1 yksikkö/ml) ja olivat nähtävissä 60 :^*i 35 sekunnissa. Sitten 60 minuutin kuluttua huoneenlämpötilassa ·*·*· hyytymiä sentrifugoitiin kierrosnopeudella 13 000 rpm 5 mi- • » nuutin ajan 4 °C:n lämpötilassa. Päällysnesteiden (50 pl) 117940 53 näytteet siirrettiin yksittäisiin putkiin laskentaa varten. Kokonaisradioaktiivisuuden laskemiseksi myös alkuperäiset polypropyleeniputket (jotka sisälsivät hyytymiä ja jäljellä olevaa nestettä) laskettiin. Sitoutuneen t~PA:n määrä oli 5 kokonaisradioaktiivisuuden (50 μ1:η näytteen ja hyytymän sisältävien putkien arvojen summa) ja sitoutumattoman radioaktiivisuuden välinen ero, joka laskettiin 4-kertaiseksi määrästä, joka oli 50 pl:ssa päällysnestettä.

Kuvissa 1 ja 2 esitetään fibriinisitoutumiskokeiden 10 tulokset, jolloin kokeissa käytettiin CHO:sta peräisin olevaa puhdistettua, plasmiinilla käsiteltyä ainetta. Seuraa-vassa taulukossa 6 esitetään kaksiketjuisen t-PA:n (ja t-PA-muunnelmien) fibriinisitoumista koskevat numeeriset tiedot. Tähdet osoittavat muunnelmia, jotka ovat tätä keksintöä ku-15 vaavia.

Taulukko 6. Fibriinisitoutumiskoe3 [Fibriini]50 Todellinen Kd t-PA-näytea (pg/ml)b (pM)c

Activase® t-PA 72 0,21 20 KHRR(296-299)AAAA 87 ' 0,26 T103N 830 2,5 .... T103N, N117Q* 63 0,19 .*.* .'** T103N, KHRR (296-299) AAAA 620 1,8 • « « : T103N,N117Q,KHRR(296-299)AAAA* 120 0,35 :·ί·: 25 S105N, A107S . 210 0,63 : V S105N,A107S,N117Q* 97 0,29 ..'S S105N,A107S,N117 Q,- 0*: KHRR (296-299) AAAA* 85 0,25 a t-PA:n YPRck-leimatut näytteet oli käsitelty plas-30 raiinilla. Tämä sitoutumiskoe mittaa kaksiketjuisessa muodos-.***. sa olevan t-PA:n fibriiniaffiniteettia.

*. (Fibriini]50 edustaa fibriinin konsentraatiota, jo- ka tarvittiin, että 50 % näytteen proteiinista sitoutui fib- • · *···* riiniin.

:***: 35 c Todellinen Kd edustaa fibriinihyytymään sitoutuvan • · · ·*·'. t-PA: n todellista af f initeettivakiota määritettynä fibriinin * · mikromolaarisena konsentraationa, joka tarvittiin, jotta 50 ..

117940 54 % t-PA:sta sitoutui. Tässä laskelmassa käytetty fib-riinimonomeerin molekyylipaino oli 340 kilodaltonia.

Kuten edellä esitetyistä tiedoista ja kuvasta 1 on ilmeistä, T103N-mutaatio, joka lisää (ylimääräisen) gly-5 kosylaatiopaikan villin tyypin humaanisen t-PA-molekyylin asemaan 103, tuottaa tulokseksi merkitsevän fibriinisitoutu-misen häviön.

Vaikka T103N-t-PA on osoittanut noin 3-5 -kertaisesti hidastunutta puhdistumaa plasmasta verrattuna villin 10 tyypin humaaniseen t-PA:iin, sen hoidollinen arvo ei ole lisääntynyt merkitsevästi johtuen fibriinisitoutumisen häviöstä.

Kuten edellä esitetyt tiedot osoittavat ja kuvassa 2 on esitty, T103N-t-PA:n sitoutumista fibriiniin parannetaan 15 oleellisesti lisäämällä toinen mutaatio, josta on tuloksena glykosylaation poistuminen villin tyypin humaanisen t-PA- molekyylin asemasta 117. Lisäksi T103N,N117Q-t-PA-muunnelma säilyttää hidastuneen puhdistumansa verrattuna villin tyypin humaaniseen t-PA:iin (tai Activase® t-PA:iin).

20 Kun villin tyypin humaanisen t-PA-molekyylin asemiin 296 - 299 lisätään vielä mutaatio, jonka tiedetään tuottavan : merkittävän fibriinispesifisyyden parannuksen [KHRR(296- • * *V. 299)AAAA], saadaan kolminkertainen mutantti, joka on parempi • · [ ml verrattuna villin tyypin humaaniseen t-PA:iin johtuen sen • · · ."* 25 merkitsevästi hidastuneesta puhdistumanopeudesta ja lisään- • · ♦ * ·* tyneestä fibriinispesifisyydestä ilman merkitsevää fib- «·· *··ί riinisitoutumisen häviötä.

· · * 5. Hyytymän hajotusmääritys in vivo (valtimon ja laskimon oikovirtauskanavan käsittävä trombolyysimalli kanii-Γ·.. 30 nilla)

Hyytymät muodostettiin ex vivo lisäämällä 0,2 ml joko ···

tuoretta 70-%:ista kaniinin kokoverta (laimennettu 0,15 M

• · ... NaCl:lla) tai EDTA:lla kerättyä kaniinin runsaasti veri- • · hiutaleita sisältävää plasmaa (0,8 x 106 verihiutaletta/μΐ) ·»· ! ϊ 35 0,5 ml:n ruiskun säiliöön. Verihiutaleita runsaasti sisältä- • · · vään plasmaan lisättiin ihmisen trombiinia (loppukonsentraa-tio 0,2 pg/ml) ja CaCl2:a (loppukonsentraatio 15 mM) . Koko- 117940 ss veren ja verihiutaleita runsaasti sisältävän plasman näytteisiin lisättiin I125:lla leimattua ihmisen fibrinogeeniä ennen siirtoa ruiskuihin. Ruiskun säiliössä oli pituussuuntaan asetettuna puuvillalanka, joka ankkuroi muodostuvat 5 hyytymät. Kun hyytymiä oli inkuboitu 37 °C:n lämpötilassa yhden tunnin ajan, mäntä poistettiin ja ruiskut (1 kokoverta ja 1 verihiutaleita runsaasti sisältävää plasmaa) sovitettiin silastiseen putkeen. Tämä putki oli kiinnitetty katet-reihin, jotka oli aikaisemmin implantoitu Uuden Seelannin 10 valkoisen kaniinin (paino 2,5 - 3,0 kg) päävaltimoon ja kau-lalaskimoon. Veri kulki valtimoverenkierrosta hyytymän ohi ja palasi laskimon kautta. Verivirta oikovirtauskanavan läpi oli noin 20 ml/min. Activase® t-PA:a annettiin laskimokatetrin kautta infuusiona 90 minuutin ajan (15 % annoksesta). 15 T103N,N117Q,KHRR(296-299)AAAA annettiin laskimonsisäisenä boluksena. Hepariini (300 U/kg) annettiin myös boluksena tätä kautta hetkellä -10 min ja 45 min. Trombolyysiä seurattiin ulkoisen gammadetektorin avulla 120 minuutin koeajan. Mutanttien suhteellinen tehokkuus määritettiin annos-vaste-20 käyrien puolilogaritmisesta käyrästä verrattuna Activase® t-PA:n standardikäyrään. Kun yhden päivän koe oli saatu pää- . . tökseen, hyytymäpiiri poistettiin ja katetrit huuhdottiin • · · I* / suolaliuoksella ja lukittiin hepariinilla (500 yksikköä/ka- « · * : ·* tetri). Sitten 10 eläintä tutkittiin kerran päivässä viiden *·ί·* 25 peräkkäisen päivän ajan. Tulokset esitetään kuvissa 3-6.

·* · • *.· In vivo -tiedot osoittavat, että hyytymän hajotus » saavutettiin käytettäessä kolminkertaista mutanttia T103N, N117Q, KHRR (296-299) AAAA-t-PA, merkitsevästi nopeammin kuin käytettäessä Activase®-t-PA:a, kun kysymyksessä olivat :*.ti 30 kokoveren hyytymät ja runsaasti verihiutaleita sisältävän .···. plasman hyytymät (kuvat 3 ja 4). Tiedot osoittavat lisäksi, • m *·’ että T103N,N117Q,KHRR(296-299)AAAA-t-PA:n tehokkuus in vivo »··**- * * on 6,0-kertaa suurempi kokoveren hyytymien tapauksessa ja • · · ·...♦ 9,5-kertaa suurempi runsaasti verihiutaleita sisältävän .***. 35 plasman hyytymien tapauksessa kuin Activase® t-PA (kuvat 5 ja 6) . Numeeriset tiedot määritettiin perustuen rinnakkai- • · siin lineaarisiin käyriin, joihin oli sovitettu kokeen pis- ' 117940 56 teet, kuten kuvissa 5 ja 6 on esitetty.

Aineiden talletus E. coli 294-solut, jotka oli transformoitu vektorilla pSVIB5, talletettiin kokoelmaan American Type Culture Col-5 lection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC) lokakuun 25 päivä, 1989, ja niille annettiin numero ATCC Accession No. 68 151. Talletus tehtiin Budapestin sopimuksen määräysten mukaisesti, jotka koskevat mikro-organismien talletuksen kansainvälistä tunnustamista patenttia ja sitä kos-10 kevia säännöksiä varten (Budapest Treaty) (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder). Tämä varmistaa elävän viljelmän ylläpi-. tämisen 30 vuoden ajan talletuspäivämäärästä lähtien. ATCC 15 saattaa organismin saataville Budapestin sopimuksen ehtojen alaisena ja Genentech Inc:in ja ATCC:n välisen sopimuksen mukaisesti, mikä varmistaa sen, että viljelmän jälkeläiset ovat pysyvästi ja rajoittamattomasti yleisön saatavissa asiaankuuluvan US-patentin myöntämisen jälkeen tai sen jälkeen, 20 kun yleisölle on saatettu julkiseksi mikä tahansa US-patent-tihakemus tai ulkolainen patenttihakemus, mikä tahansa niis- .·, : tä tuleekin ensimmäisenä, varmistaen jälkeläisten saatavuu- *· ** ·..* den sille, jonka U.S. Commissioner of Patents and Trademarks \ määrittää oikeutetuksi siihen 35 USC #122:n ja siihen liit- • * · 25 tyvien Commissioner1 in sääntöjen mukaisesti (mukaan luettuna : ·* 37 CFR #1,14 viitaten erityisesti kohtaan 886 OG 638). Kaik- • · · ki ATCC 68 151 :n jakamista koskevat rajoitukset on poistettu • ♦ ♦ *.· · 11. helmikuuta 1992 lähtien.

Tämän patenttihakemuksen siirronsaaja on sopinut, et-30 tä jos talletetti viljelmä kuolisi tai katoasi tai tuhou-tuisi, kun sitä viljellään sopivissa olosuhteissa, se korva- ««« *. taan välittömästi ilmoituksen jälkeen saman viljelmän elä- • * ... väliä näytteellä. Talletetun kannan saatavuus ei ole tarkoi- * * tettu lupana keksinnön harjoittamiseksi vastoin minkä tähän- ί#>>: 35 sa hallituksen viranomaisten myöntämiä oikeuksia maan pa- :*·*; tenttilakien mukaisesti.

* ·

Edellä kuvattua kirjallista patenttimäärittelyä pide- 117940 57 tään riittävänä, jotta alan ammattilainen kykenee harjoittamaan keksintöä käytännössä. Talletetun rakennelman ei ole tarkoitus rajoittaa tämän keksinnön piiriä. Tämän aineen talletus ei tuota myönnytystä, että tämä kirjoitettu kuvaus 5 on riittämätön tekemään mahdolliseksi keksinnön minkä tahansa näkökohdan harjoittamisen, mukaan luettuna sen parhaan mallin, eikä sitä ole tarkoitettu patenttivaatimusten piirin rajoittamiseksi spesifiseen kuvaukseen, jota se edustaa.

Vaikka edellä esitetty viittaa erityisiin edullisiin 10 suoritusmuotoihin, on ymmärrettävä, että tämä keksintö ei ole siten rajoitettu. Alan ammattilaisille tulee mieleen, että erilaisia muunnelmia voidaan tehdä julkaistuihin suoritusmuotoihin poikkeamatta keksinnön yleiskäsitteestä. Kaikki tällaiset muunnelmat on tarkoitettu tämän keksinnön piiriin 15 kuuluviksi.

Sekvenssiluettelo (1) Yleinen informaatio (i) Hakija: Genentech, Inc.

(ii) Keksinnön otsikko: Kudosplasminogeeniaktivaatto-20 rin glykosylaatiomuunnelmat, joilla on parannetut hoidolliset ominaisuudet.

• · (iii) Sekvenssien lukumäärä: 4.

«mm ' ' • · · .* (iv) Kirjeenvaihto-osoite: • * * * (A) Vastaanottaja: Genentech, Inc.

• · · *·:·* 25 (B) Katu: 460 Point San Bruno Blvd.

·· · . ' • · * : ·* (C) Kaupunki: South San Francisco » ..ΙΓ (D) Valtio: Kalifornia

(E) Maa: USA

(F) Postinumero: 94080 ·*·., 30 (v) Tietokoneen luettava muoto: ·***· (A) Medium-tyyppi: 5,25 tuumaa, 360 Kb:n levyke ··· * . (B) Tietokone: IBM PC -yhteensopiva

(C) Käyttöjärjestelmä: PC-DOS/MS-DOS

• · *·;·’ (D) Ohjelmisto: patin (Genentech) :***; 35 (vi) Patenttihakemusta koskevat tiedot tällä hetkel- ··· • · · η ..

: · : la: • · (A) Patenttihakemuksen numero: ; 58 117940 (B) Jättöpäivä: (C) Luokittelu: (vii) Aikaisempaa patenttihakemusta koskevat tiedot: (A) Patenttihakemuksen numero: 5 (B) Jättöpäivä: (viii) Valtuutettu asiamies/edustaja: (A) Nimi: Dreger, Ginger R.

(B) Rekisterinumero: 33 055 (C) Viite/tiivistelmänumero: 757 10 (ix) Teleyhteydet: (A) Puhelin: 415/266-3216 (B) Telefax: 415/952-9881 (C) Telex: 910/371-7168 (2) Sekvenssiä ID no 1 koskevat tiedot: 15 (i) Sekvenssin tunnuspiirteet: (A) Pituus: 24 emästä (B) Tyyppi: nukleiinihappo (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen 20 (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ ID NO:l: TGTGCTCCAA TTGCCCCTGT AGCT 24 • · (2) Sekvenssiä ID no 2 koskevat tiedot: • · · ' ' * * * .1.* (i) Sekvenssin tunnuspiirteet: * I (A) Pituus: 30 emästä • · · ]*·;* 25 (B) Tyyppi: nukleiinihappo • · · ’ ·* (C) Juosteisuus: yksinkertainen ...Γ (D) Topologia: lineaarinen • · · ·.· · (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ IN NO: 2: GCCACTCTCG GATGTATTCC ACGTGCCCCT 30 30 (2) Sekvenssiä ID no 3 koskevat tiedot: * :'**· (i) Sekvenssin tunnuspiirteet: • · * * , (A) Pituus: 24 emästä (B) Tyyppi: nukleiinihappo • · **··* (C) Juosteisuus: yksinkertainen :***; 35 (D) Topologia: lineaarinen • * * ·*·*; (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ IN NO:3: ♦ · CGCGCTGCTT TGCCAGTTGG TGCA 24 117940 59 (2) Sekvenssiä ID no 4 koskevat tiedot: (i) Sekvenssin tunnuspiirteet: (A) Pituus: 36 emästä (B) Tyyppi: nukleiinihappo 5 (C) Juosteisuus: yksinkertainen (D) Topologia: lineaarinen (xi) Sekvenssin kuvaus: SEQ IN NO:4: CCGCTCTCCG GGCGACGCCG CGGCCGCGGC AAAGAT 36 • · * · · • · · • 1 2 3 * · 1 • · ® • · « « * · · ♦ 1 1 • · · ·· 1 • · • · • 1 1 «·»1 t · · • · · # · « • · • 1 • m · • · *·· • · • ♦ · • · · 1 » • · · • · • · • · ♦ • 1 * 1 1 2 *♦· 3 * · • ·

Claims (29)

117940

1. Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattori-5 muunnelman (t-PA-muunnelman) valmistamiseksi, joka on gly-kosyloitunut villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin mihin tahansa asemiin 103 - 105 liittyen ja jolta puuttuu toiminnallinen hiilihydraattirakenne villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemasta 117 ja jolla on a) 10 pitempi puoliintumisaika verenkierrossa ja oleellisesti säilynyt sitoutuminen fibriiniin tai b) parempi fib-rinolyyttinen tehokkuus in vivo verrattuna villin tyypin ihmisen t-PA:iin tunnettu siitä, että viljellään t-PA muunnelmaa tuottavia isäntäsoluja.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että t-PA-muunnelmalla on pitempi puoliintumisaika verenkierrossa ja sen sitoutuminen fibriiniin on olennaisesti säilynyt verrattuna villin tyypin ihmisen t-PA:iin.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että t-PA-muunnelmalla on parempi sitoutuminen fibriiniin kuin verrattuna siihen ihmisen t-PA- • · *.**: muunnelmaan, joka glykosyloituu villin tyypin ihmisen t-PA:n ·· · • V mihin tahansa asemiin 103 - 105 liittyen ja jolla on funk- IJ ϊ 25 tionaalinen hiilihydraattirakenne villin tyypin ihmisen t- ·***: PA: n asemassa 117. « · .:· 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • r .1:1, n e t t u siitä, että t-PA-muunnelmalla on parempi fib- rinolyyttinen tehokkuus in vivo verrattuna villin tyypin ih- ·· 30 misen t-PA: iin. # • af

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- • 1 ***** n e t t u siitä, että t-PA-muunnelma glykosyloituu villin *:**: tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemaan 103 liit- :***: tyen. ···

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- m · • · n e t t u siitä, että t-PA-muunnelma glykosyloituu villin • · · : ** tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemaan 105 liit- 117940 tyen .

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelman glykosylaatio asemissa 103 - 105 on N-sitoutunutta.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että t-PA-muunnelman glykosylaatio asemissa 103 - 105 on O-sitoutunutta.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa on asparagiini 10 osana Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-tripeptidyylisekvenssissä, jolloin X on mikä tahansa aminohappo paitsi proliini, villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemassa 103.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa asparagiini on 15 villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemassa 103, tryptofaani asemassa 104 ja seriini asemassa 105.

11. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelman asparagiini on osana Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-tripeptidyylisekvenssiä, jolloin X 20 on mikä tahansa aminohappo paitsi proliini, villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemassa 105.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, • ·· .* tunnettu siitä, että t-PA-muunnelman asparagiini on • · · • · * * villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemassa • % » *·:·* 25 105, treoniini asemassa 106 ja seriini asemassa 107. ♦ · · ^ • « » ί .* 13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- n e t t u siitä, että t-PA-muunnelman aminohappo, on muu • « · ·/· i kuin asparagiini, villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohap posekvenssin asemassa 117. •\# 30 14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa on substitu-·. oitu glutamiini villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohappose- kvensin asemaan 117 liittyen. • · *

15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, ♦ ;’**· 35 tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa asparagiini »·· on osana Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-tripeptidyylisekvenssiä, f · jolloin X on mikä tahansa aminohappo paitsi proliini, sub- : 117940 stituoitu villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin . asemaan 103 liittyen.

16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa asparagiini 5 on osana Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-tripeptidyylisekvenssiä, jolloin X on mikä tahansa aminohappo paitsi proliini, sub-. stituoitu villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemaan 105 liittyen.

17. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-10 n e t t u siitä, että t-PA-muunnelmalla on parempi fib- riinispesifisyys verrattuna villin tyypin ihmisen t~PA:iin.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu parannettu fibriinis-pesifisyys saavutetaan t-PA-muunnelmassa muutoksen avulla, 15 joka on saadaan aikaan muutoin kuin arginiinin korvaamisella asparagiinihapolla asemassa 299, villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin aminohappoalueella 296 - 302 tai 274-277.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa muutos ai kaansaadaan villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvens- . . sin alueella 296 - 300. « i « • · · .* .* 20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, • · · ··’ tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa muutos ai- • r • · · *·:·* 25 kaansaadaan villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvens- ·♦ * • · · : .* sin yhdessä tai useammassa asemassa asemista 296, 297, 298 ja 299. • · * ·/· ϊ 21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa muutos ai- •\# 30 kaansaadaan siten, että kukin aminohapoista lysiini, histi- .·**. . diini, arginiini, arginiini villin tyypin ihmisen t-PA:n ·«· • 4 aminohapposekvenssin asemissa 296, 297, 298 ja 299 on sub- • · · « · : stituoitu alaniinilla. · · · *...* 22. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, ·***; 35 tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa asparagiini ·*· on osana Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-tripeptidyylisekvenssiä • · villin tyypin ihmisen t~PA:n aminohapposekvenssin asemassa 117940 103 ja aminohappo, joka on muu kuin asparagiini, asemasssa 117.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, ' tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa asparagiini 5 on villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemassa 103, tryptofaani asemassa 104, seriini asemassa 105 ja glutamiini asemassa 117.

24. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa asparagiini 10 on osana Asn-X-Ser- tai Asn-X-Thr-tripeptidyylisekvenssiä villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemassa 105 ja aminohappo, joka on muu kuin asparagiini, asemssa 117.

25. Patenttivaatimuksen 24 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että t-PA-muunnelmassa asparagiini on villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemassa 105, treeniini asemassa 106, seriini asemassa 107 ja glutamiini asemassa 117.

26. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että t-PA-muunnelma valitaan ryhmästä, joka koostuu ihmisen t-PA-muunnelmista, jotka käsittävät • . seuraavat mutaatiot: * · · il " T103N, N117Z; • · *

1. S105N, A107S, N117Z; :···** 25 T103N, N117Z, K296A, H297A, R298A, R299A; • · · : V S105N, A107S, N117Z, K296A, H297A, R298A, R299A; T103N, N117Z, R298E, R299E; Ξ105Ν, A107S, N117Z, R298E, R299E; T103N, N117Z, K296Q, H297N, P301S; ”·„ 30 S105N, A107S, N117Z, K296Q, H297N, P301S; T103N, N117Z, F274L, R275H, I276S, K277T; ’·*. S105, A107S, N117Z, F274L, R275H, 276S, K277T, joissa Z tarkoittaa mitä tahansa aminohappoa paitsi aspara-*..»* giinia (N) . ·***· 35 27. DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se ··· koodaa patenttivaatimuksen 1 mukaisella menetelmällä valmis- • · tettavaa ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorimuunnelmaa. .; 117940

28. Replikoituva ekspressiovehikkeli, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 27 mukaisen DNA-sekvenssin ja kykenee ilmentämään sen sopivassa isäntäsolussa.

29. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 28 mukaisella vektorilla.

30. Menetelmä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattori-muunnelman valmistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 29 mukaisten isäntäsolujen vil- 10 jelemisen siten, että t-PA-muunnelman koodaava DNA ilmentyy.

31. Patenttivaatimuksen 30 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että se käsittää muunnelman ottamisen talteen isäntäsoluviljelmästä.

32. Menetelmä farmaseuttisesti hyväksyttävän lääkkeen 15 valmistamiseksi vaskulaarisen tilan tai taudin hoitamista , varten, tunnettu siitä, että menetelmässä lisätään hoidollisesti tehokas määrä ihmisen kudosplasminogeeniakti-vaattorimuunnelmaa (t-PA-muunnelmaa) seoksena farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan kanssa, joka t-PA-muunnelma on 20 glykosyloitunut villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin mihin tahansa asemiin 103 - 105 liittyen ja josta . # puuttuu toiminnallinen hiilihydraattirakenne villin tyypin * · · / ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin asemasta 117, siten, • ♦ · • ·’ että t-PA-muunnelmalla a) puoliintumisaika verenkierrossa on • « · : 25 pidempi ja oleellisesti säilynyt sitoutuminen fibriiniin tai ·· i : V b) parempi fibrinolyyttinen tehokkuus in vivo verrattuna ,.*·* villin tyypin ihmisen t-PA:iin,

33. Menetelmä farmaseuttisesti hyväksyttävän lääkkeen valmistamiseksi fibriinin saostumisen tai kiinnikkeen muo- 30 dostumisen tai uudelleen muodostumisen estämistä varten, ,··*, tunnettu siitä, että menetelmässä lisätään tehokas • · ·* määrä ihmisen kudosplasminogeeniaktivaattorimuunnelmaa (t- * * PA-muunnelmaa) seoksena farmaseuttisesti hyväksyttävän kan- *♦· ta jän kanssa, joka t-PA-muunnelma on glykosyloitunut villin • : .*·*. . 35 tyypin ihmisen t-PA:n aminohapposekvenssin mihin tahansa • · · asemiin 103 - 105 liittyen ja josta puuttuu toiminnallinen • » hiilihydraattirakenne villin tyypin ihmisen t-PA:n aminohap- 117940 posekvenssin asemasta 117, siten, että t-PA-muunnelmalla a) puoliintumisaika verenkierrossa on pidempi ja oleellisesti säilynyt sitoutuminen fibriiniin tai b) parempi fib-rinolyyttinen tehokkuus in vivo verrattuna villin tyypin ih-5 inisen t-PA:iin.

34. Menetelmä villin tyypin ihmisen t-PA:n fib-riinisitoutumisaffiniteetin palauttamiseksi sen ollessa vähentynyt glykosylaation seurauksena mihin tahansa aminohap-’ poasemiin 103 - 105 liittyen, tunnettu siitä, että 10 poistetaan toiminnallinen hiilihydraattirakenne aminohappo-asemasta 117. • » • · · • · · • » • · m • · · i « • · • · 1 * · · • · · ·· 1 • · · * · • t • · · t • ••f.· ·· • · · ···. ·· • ♦ • · · « • · t * · I · ··· ····1 • · • · · • · • · ··» 9 * · • · « • « · » « t * · • · 1 1 7940 : 66 Patentkrav .