KR20100011994A

KR20100011994A - 렌티바이러스 벡터-매개된 유전자 전달 및 이를 위한 조성물

Info

Publication number: KR20100011994A
Application number: KR1020097027248A
Authority: KR
Inventors: 제이 티모시 스토우트; 비노이 아푸쿠탄
Original assignee: 리서치 디벨럽먼트 파운데이션
Priority date: 2000-12-19
Filing date: 2001-12-18
Publication date: 2010-02-03
Also published as: ES2393717T3; EP1343532A1; CN1487841A; DK1343532T3; US20020114783A1; KR20080080684A; EP2301583A1; EP1343532A4; AU3405302A; AU2002234053B2; ZA200304664B; RU2288742C2; KR101026078B1; JP4280496B2; CA2432301C; CA2432301A1; CN100591359C; KR20030075152A; DK2301583T3; CN101732731B

Abstract

본 발명은 유전성 또는 후천성 증식성 안구 질환용 사람 유전자 치료요법의 수단을 제공한다. 본 발명은 유사분열적 활성 및 불활성 세포 둘다를 형질도입시키는 렌티바이러스 벡터의 능력을 이용하여 안구 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

렌티바이러스 벡터, 안내 세포 증식, 치료 유전자, 안구 질환, 신혈관형성, 아폽토시스

Description

렌티바이러스 벡터-매개된 유전자 전달 및 이를 위한 조성물{Lentiviral vector-mediated gene transfer and composition therefor}

본 발명은 일반적으로 벡터 및 유전자 치료요법의 분자생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전적 증식성 안구 질환용 사람 유전자 치료요법에서 렌티바이러스 벡터 (lentiviral vector)의 용도에 관한 것이다.

사람 실명의 가장 흔한 원인 중 하나는, 흔히 시축 (visual axis) 선명도의 상실 또는 망막 표면에 직접적으로 가해진 견인력으로 인한 망막 색소 상피 (PRE)로부터의 망막 분리를 야기하는 비정상적인 안내 세포 증식이다. 증식성 망막 탈리는 증식성 당뇨 질환 (PDR), 미숙아 망막병증 (ROP), 증식성 유리체 망막병증 (PVR) 또는 노인성 황반변성 (AMD)과 관련되든지 아니든지 간에, 치료되지 않는다면 결국에는 영구적 시각 손상을 유발한다.

안구내의 신생혈관의 비정상적 증식인 안구 혈관신생 (neovascularization)은 선진국에서 영구 실명의 가장 흔한 원인이다. 세가지 질병, 당뇨, 미숙아 망막병증 및 노인성 황반변성은 모든 안내 혈관신생 (intraocular neovascularization) 사례 중 대다수와 관련된다. 이러한 세가지 임상 질환은 성질이 다르며 상이한 그룹의 환자에게 영향을 미치는 반면, 결국에는 망막 기능을 손상시키는 신생 혈관의 형성을 유도하는, 내피 세포의 비조절된 분열과 관련되는 최종 공통 경로를 공유한다. 또한, 상기 질환들은 미국에서 약 60%의 치료불가능한 실명의 원인이다.

망막내의 혈관 내피 세포의 증식은 증식성 당뇨망막병증 (PDR)의 과정을 개시한다. 치료되지 않을 경우, 이들 내피 세포는 지속적으로 분열하여 결국에는 망막의 내표면을 따라 신장되거나 유리체강내로 신장되는 섬유혈관 막을 형성한다. 후유리체 표면의 수축은 유리체-섬유혈관 유착 부위에서 당김을 유발하여 최종적으로 망막을 탈리시킨다. 1형 당뇨병 환자의 약 50%가 당뇨병으로 진단된지 20년 이내에 증식성 당뇨망막병증이 발병할 수 있으며, 2형 당뇨병 환자의 10%에서 유사한 기간 내에 명백한 증식성 당뇨망막병증이 발병할 수 있다.

혈관은 일반적으로 두 과정, 혈관형성 (vasculogenesis) 또는 신혈관형성 (angiogenesis) 중 하나에 의해 발달한다. 혈관형성 동안, 모세혈관의 원시 네트워크는 다기능 간엽 전구세포의 성숙에 의한 배형성 동안 확립된다. 대조적으로, 신혈관형성은 기존의 혈관과 관련되는 재형성 과정을 의미한다. 신혈관형성시에는, 새로운 혈관 움 (bud)이 기존의 확립되어 있는 혈관으로부터 성장하여 주위 조직으로 침윤한다. 망막에서는, 일단 정상 혈관 네트워크가 확립되면 이러한 네트워크의 재형성은 주로 조직 산소 농도의 영향하에 있게 된다-저산소증 (산소 부족)은 신혈관형성을 자극한다. 상기 과정은 사회에서 수백만의 당뇨병 환자, 미숙아 또는 노인의 실명을 유발한다.

따라서, 노인성 황반변성, 증식성 당뇨망막병증, 미숙아 망막병증, 녹내장 및 증식성 유리체망막병증과 같은 안내 질환은 비정상적 증식 또는 유전자 치료요법이 유용할 수 있는 기타 상태를 특징으로 한다. 그러나, 포유동물 세포에서 상당한 정도의 효율성으로 유전자 형질도입이 수행되는 것은 어려웠다. 게다가, 이러한 아데노바이러스 벡터, 리포좀 및 덴드라이머계 시약과 같은 종래의 벡터를 사용하여 나타난 결과는 상당히 일시적이다. 또한, 이들 벡터를 강력한 염증 반응의 유도 없이 안내로 도입하는 것이 문제가 된다.

따라서, 선행 분야는 안구 내에 있거나 안구로부터 유래된, 완전히 분화되었거나 증식중인 사람 세포를 형질도입하는 수단이 부족하다는 결함이 있다. 본 발명은 당해 분야에서 이러한 다년간 지속된 필요성과 요구를 충족시킨다.

본 발명의 목적은 렌티바이러스 벡터의 개발 및 유전적 증식성 안구 질환용 사람 유전자 치료요법에서 상기 벡터를 사용하는 방법에 관한 것이다. 렌티바이러스 벡터의 유용성은 사람 망막, 각막, 혈관 내피, 증식성 수정체망막병증 및 망막 색소 상피 세포의 형질도입에 대해서 설명되어 있다.

본 발명의 하나의 양태에서, 렌티바이러스-전달되는 구성적 활성 (constitutively active) (돌연변이체 또는 변이체) 망막모세포종 (CA-rb) 유전자에 의해 안내 세포 분열을 억제할 수 있는 가능성이 입증되었다. 사람 안구 세포는 시험관내에서 시험하고 안내 증식성 질병의 두 모델 [증식성 유리체망막병증 및 수정체 적출후 후피막 (post-lens posterior capsular) 혼탁화]은 생체내에서 시험하였다. 시험관내 세포 분열의 현저하고 장기간 지속되는 억제가 다수의 상이한 세포 유형에서 관찰되었다. 증식성 유리체망막병증 및 수정체 적출후 후피막 혼탁화의 중증도 감소가 생체내에서 관찰되었다.

본 발명의 다른 양태에서, 신생 혈관 성장 (신혈관형성) 또는 미리 프로그램된 세포 사멸 (아폽토시스; apoptosis)의 발달 및 억제에 있어 중요한 것으로 공지된 유전자의 렌티바이러스-매개된 전달이 병리학적 안구 신혈관형성 (예: 당뇨병 망막병증 또는 습식 노인성 황반변성) 또는 병리학적 세포 사멸 (예: 건식 노인성 황반변성)의 치료시에 유용할 수 있다는 것이 입증되었다. 상기 유전자는 사람 망막, 각막 및 망막 색소 상피 세포 내에서 활성인 것으로 공지된 각각의 2종의 개별 적인 강력한 프로모터 중 하나의 조절하에 위치시키고, 각막 신혈관형성의 억제는 래빗 모델에서 입증되었다.

또한, 당해 벡터 시스템은 유전성 안구 질환을 앓는 사람 환자에는 결실되어 있는 것으로 공지된 유전자를 보유할 경우, 상기 유전자를 사람 안구 세포로 전달할 수 있다. 당해 시스템에 의한 상기 유전자의 전달은 안구 질환을 앓는 환자용으로 유용한 치료요법의 기본을 형성한다.

본 발명은 안구 질환을 앓는 환자와 같이 이러한 치료가 필요한 환자에서 안내 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은, 상기 환자에게 안내 세포 증식을 억제하는 치료 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 약리학적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 또한 안구 질환을 앓는 환자에게 안내 혈관신생을 억제하는 치료 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 약리학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 당해 환자에서 안내 신혈관형성을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 추가의 양상, 특징 및 잇점은 하기의 본 발명의 바람직한 양태의 설명으로부터 명백할 수 있다. 이들 양태는 본 발명의 목적을 위해 제공된다.

렌티바이러스는 천연 병원성이 수개월 내지 수년의 기간에 걸쳐서 발생하는 느린 바이러스이다. 상기 바이러스 속으로는 HIV와 같은 레트로바이러스가 포함된 다. 이들 바이러스는 완전히 분화된, 유사분열적으로 활성 또는 불활성인 여러 종류의 사람 세포 유형을 감염시키고 형질도입시키는 것으로 공지되어 있다. 이의 형질도입 효율은 매우 높으며, 심지어 사람 망막, 각막, 섬유주, 수정체, 망막 색소 상피, 증식성 유리체망막병증 및 혈관 내피 세포와 같이 통상적으로 유전자 전달에 매우 불응성인 세포주도 상기 벡터를 사용하여 형질도입시킬 수 있다.

일단 렌티바이러스로 감염되면, 바이러스의 유전자 물질은 스스로 숙주 게놈내로 통합된다. 따라서, 바이러스의 유전자는 숙주 세포의 유전자 물질의 영구적 부분이 되며, 유전자 발현은 상기 세포의 일생 동안 지속된다. 렌티바이러스로 형질도입된 각 세포는 유전자 정보를 이의 자손에게 전달할 수 있다. 안내 질환용 유전자 치료요법에서 벡터로서 렌티바이러스를 사용할 수 있는데, 이는 모 바이러스에 의한 천연 감염 조건하에 당해 바이러스가 염증 반응과 관련되지 않는 안내 병원체이기 때문이다. 상기 바이러스를 사용한 이전의 연구는 신경 및 망막 세포 둘다의 형질도입에서 이의 성공적 사용을 입증한 바 있다 [참조문헌: Naldini et al., 1996; Miyoshi et al., 1997].

본 발명은 2개의 클로닝 부위 사이에 IRES (내부 리보솜 진입 부위) 요소가 삽입된 신규한 렌티바이러스 벡터를 제공한다. IRES 요소는 mRNA-리보솜 결합 및 단백질 합성을 가능케한다. 이러한 골격은 2종의 상이한 발현가능한 유전자를 수용할 수 있다. 형질도입된 세포에서는 단일 메시지가 생성되나, IRES 요소로 인하여 상기 메시지는 기능적으로 2-시스트론이며 2종의 상이한 단백질의 합성을 유도할 수 있다. 이들 2종의 유전자는 CMV 또는 HTLV 프로모터와 같은 강력한 프로모 터의 조절하에 있다. 대안으로, 당해 분야의 숙련가는 사람 망막, 각막 또는 망막 색소 상피 세포내에서 활성인 것으로 공지된 기타 프로모터를 용이하게 사용할 수 있을 것이다. 상기 방식으로, 하기에서 논의되는 각각의 잠재적 치료 유전자를 마커 유전자 (예: 증강된 녹색 형광 유전자-eGFP 유전자)에 연결시켜 형질도입된 세포가 동시에 표지되고 목적하는 치료 유전자가 발현되도록 할 수 있다. 표지된 세포는 시험관내에서 용이하게 분리할 수 있으며 생체내에서 관찰할 수 있다. 당해 분야의 숙련가에게 증강된 녹색 형광 단백질 유전자 이외의 다른 마커 유전자를 렌티바이러스 벡터내로 혼입시킬 수 있음은 명백하다. 유전공학 및 클로닝 분야의 평균적인 과학자들의 기술 수준이 최근들어 현저하게 증가했기 때문에, 당해 분야의 숙련가는 본원에서 기술하는 유전자 이외의 목적하는 기타 치료 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 용이하게 작제할 수 있다. 게다가, 본원에서 기술하는 렌티바이러스 벡터 시스템은 유전성 안구 질환이나 기타 질환을 앓는 사람 환자에는 결실된 유전자를 전달할 수 있다. 당해 시스템에 의한 상기 유전자의 사람 안구 세포 또는 기타 조직으로의 전달은 다양한 질환을 앓는 환자에게 유용한 요법의 기초를 형성한다.

본원에서 상술하는 기본 발견은 렌티바이러스 벡터로 각종 유전자를 전달시켜 비정상적 안내 증식을 변형시킴으로써 혈관신생 질환, 망막 탈리 또는 백내장 적출후 후피막 혼탁화의 발병율을 감소시킬 수 있다는 것을 입증한다. 수많은 치료 유전자가 임상 상황에서 안내 세포 분열의 생체내 억제용으로 유용할 수 있다. 이러한 유전자로는 신생 혈관 성장 (신혈관형성) 또는 아폽토시스의 과정에 대해 최근 동정된 각종 조절제가 포함된다. 렌티바이러스-매개된 유전자 전달을 통한 상기 조절제의 유전자 조절은 노인성 황반변성 (AMD), 미숙아 망막병증 (ROP) 및 증식성 당뇨망막병증 (PDR)과 같은 안내 혈관신생 질환의 치료에서 유용함을 입증할 수 있는 것으로 사료되고 있다.

본원에서 기술하는 렌티바이러스 벡터는 임상현장 (clinical settings)에서 용이하게 적용할 수 있다.

혈관 내피 세포는 혈관형성 및 신혈관형성 둘다에서 중요한 역활을 한다. 이들 세포는 각종 단백질 사이토킨에 유사분열적으로 반응한다 (세포 분열 또는 이동에 관해서 활성적이다). 예를 들어, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오제닌, 안지오포이에틴-1 (Ang1) 및 안지오트로핀은 내피 세포 분열, 이동 또는 세포-세포 부착을 자극하는 사이토킨으로서 신혈관형성 과정을 촉진한다. 엔도스타틴, 가용성 (미끼; decoy) VEGF 수용체 (sflt) 및 트롬보스폰딘은 신혈관형성을 억제하는 것으로 간주되는 내인성 단백질 사이토킨이다. 본 발명은 렌티바이러스에 의해 전달되는 다수의 이러한 억제 단백질이 안내 신생혈관증식의 치료에서 유용함을 입증한다. 본 발명의 렌티바이러스 벡터내로 혼입될 수 있는 유전자의 예로는 다음 유전자들이 포함되나 이에 제한되지 않는다:

메탈로프로테이나제의 조직 억제제

메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)의 천연 억제제인 편재하는 단백질의 계통을 대표한다. 매트릭스 메탈로프로테이나제는 종양 침입, 신혈관형성 및 전이에서 필수 단계인, 결합조직 매트릭스 재형성 및 세포외 메트릭스 (ECM)의 분해와 관련되는 아연-결합 엔도펩티다제의 그룹이다. MMP는 각각 ECM에 있어 상이한 기질 특이성을 지니며 ECM의 분해에서 중요하다. 사람 유방 병리학에서 MMP의 분석은 일부 MMP가 ECM의 분해과 관련됨을 제시한다: 콜라게나제 (MMP1)는 원섬유 간질 콜라겐을 분해한다; 젤라티나제 (MMP2)는 주로 IV형 콜라겐을 분해한다; 스트로멜리신 (MMP3)는 광범위한 작용을 한다 [참조문헌: Bramhall et al., 1996, 1997]. TIMP 계통에는 4종의 구성원이 있다. TIMP-1 및 TIMP-2는 MMP 억제 활성과 관련되는 종양 성장, 침입 및 전이를 억제할 수 있다. 또한, TMIP-1 및 TIMP-2는 둘다 신혈관형성의 억제에 관여한다. TIMP 계통의 다른 구성원과는 달리, TIMP-3은 ECM에서만 발견되며 완전한 분화에 대한 마커로서 작용할 수 있다. 마지막으로, TIMP-4는 세포외 매트릭스 지혈에서 조직-특이적 방식으로 작용하는 것으로 사료되고 있다 [참조문헌: Gomez et al., 1997].

TIMP -1

메탈로프로테이나제의 조직 억제제-1 (TIMP-1)은 메탈로프로테이나제 억제제 1, 섬유모세포 콜레게나제 억제제, 콜라게나제 억제제 및 적혈구 강화 활성 (erythroid potentiating acitivity; EPA)으로서 또한 공지된 23kD 단백질이다. TIMP-1을 암호화하는 유전자는 도케르티 등 (Docherty et al., 1985)에 의해 기술된 바 있다. TIMP-1는 메탈로프로테이나제 (예: 콜라게나제)와 복합체를 형성하여 비가역적 불활성화를 유발한다. TIMP-1의 효과는 형질전환 마우스 모델, 즉 간에서 TIMP-1을 과발현하는 마우스와 간세포 암종의 유전성 발달을 유도하는 바이러스 발암유전자 시미안 바이러스 40/T 항원 (TAg)를 발현하는 또 다른 마우스에서 조사된 바 있다. 이중 형질전환 실험 (TIMP-1 주를 TAg 형질전환주와 교배시킨다)에서, 간 TIMP-1의 과발현은 성장 및 신혈관형성을 억제시켜 TAg-유도된 간세포 암종의 발병을 차단하는 것으로 보고되어 있다 [참조문헌: Martin et al., 1996].

TIMP -2

메탈로프로테이나제의 조직 억제제-2 (TIMP-2)는 메탈로프로테이나제 억제제 2로 또한 공지된 24kD 단백질이다. TIMP-2를 암호화하는 유전자는 스테틀러-스티벤슨 (Stetler-Stevenson) 등 (1990)에 의해 기술된 바 있다. 종양 침입에서 중요한 역활을 하는 메탈로프로테이나제 (MMP2)는 TIMP-2와 복합체를 형성하여 억제된다. 이와 같이, TIMP-2는 암 전이를 억제하는데 유용할 수 있다 [참조문헌: Musso et al., 1997]. B16F10 쥐 흑색종 세포 (침입성 및 전이성이 높은 세포주)를 사람 TIMP-2를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고 마우스에 피하 주사할 경우, TIMP-2 과발현은 생체내 종양 성장 및 신혈관형성을 제한한다 [참조문헌: Valente et al., 1998].

TIMP -3

메탈로프로테이나제의 조직 억제제-3 (TIMP-3)는 메탈로프로테이나제 억제제 3으로서 또한 공지되어 있다. 유방 암종 및 악성 흑색종 세포주를 TIMP-3 플라스미드로 형질감염시키고 누드 마우스에 피하 주사할 경우, 종양 성장의 억제가 관찰된다 [참조문헌: Anand-Apte et al., 1996]. 그러나, TIMP-3 과발현은 시험관내에서 두 종양 세포주의 성장에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 종양 세포에 의해 인접한 ECM으로 방출된 TIMP-3이 ECM내에 격리된 성장 인자의 방출을 억제하거나 신혈관형성을 억제함으로써 종양 성장을 억제한다고 제시되었다 [참조문헌: Anand-Apte et al., 1996].

TIMP -4

메탈로프로테이나제-4의 억제제 (TIMP-4)는 메탈로프로테이나제 억제제 4로서 또한 공지되어 있다. TIMP-4 유전자 및 조직 국재화는 그린 (Greene) 등 (1996)에 의해 기술된 바 있다. 생화학적 연구는 TIMP-4가 TIMP-2의 것과 유사한 사람 젤라티나제 A에 결합한다는 것이 제시한 바 있다 [참조문헌: Bigg et al., 1997]. 생체내 사람 유방암의 성장에 있어 TIMP-4 조절의 효과는 왕 등 (Wang et al., 1997)에 의해 조사되었다. TIMP-4의 과발현은 시험관내에서 세포 침입성을 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 생체내에서 종양 성장은 누드 마우스에게 TIMP-4 종양 세포 형질감염체를 주사한 후 현저하게 감소되었다 [참조문헌: Wang et al., 1997].

엔도스타틴 , 안지오스타틴 , PEX , 크링글 -5 및 융합 유전자

포크맨 (J. Folkman)과 동료들 [참조문헌: Boehm et al., 1997]은 루이스 폐암종을 앓는 마우스를 엔도스타틴+안지오스타틴 단백질의 배합물로 치료하면 종양의 완전한 퇴화가 유도되며 상기 마우스는 남은 일생 동안 건강하게 유지된다는 것을 제시하였다. 이러한 효과는 단지 1주기 (25일)의 엔도스타틴+안지오스타틴 치료 후에 수득되는 반면에, 엔도스타틴만을 사용할 경우에는 종양 휴면을 유도하기 위해 6주기가 요구되었다.

하나한 (D. Hanahan)과 동료들 [참조문헌: Bergers et al., 1999]은 췌장 섬 암종에 대한 마우스 모델에서 엔도스타틴+안지오스타틴 단백질의 배합물의 보다 우수한 항암 효과를 입증하였다. 엔도스타틴+안지오스타틴 배합물은 종양의 현저한 퇴화를 유발한 반면에, 단독의 엔도스타틴 또는 안지오스타틴은 효과가 없었다.

엔도스타틴 XVIII

혈관내피종에 의해 생성되는 신혈관형성 억제제인 엔도스타틴은 오릴리 등 (O'Reilly et al., 1997)에 의해 최초로 동정되었다. 엔도스타틴은 내피 증식을 특이적으로 억제하는 콜라겐 XVIII의 20kD C-말단 단편으로서 신혈관형성 및 종양 성장을 강력하게 억제한다. 사실상, 원발성 종양은 재조합 엔도스타틴의 투여 후에 잠복상태의 극미한 병반을 퇴화시키는 것으로 나타났다 [참조문헌: O'Reilly et al., 1997]. 엔도스타틴은 성장 인자 신호전달과 관련되는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 결합함으로써 신혈관형성을 억제하는 것으로 보고되어 있다 [참조문헌: Zetter, 1998].

엔도스타틴 XV

최근에는, 콜라겐 XV의 C-말단 단편 (엔도스타틴 XV)가 엔도스타틴 XVIII과 마찬가지로 신혈관형성을 억제하나 일부 기능적 차이점을 갖는 것으로 제시되었다 [참조문헌: Sasaki et al., 2000].

안지오스타틴

처음 4개의 크링글 구조를 포함하는, 플라스미노겐의 내부 단편인 안지오스 타틴은 현재까지 기술된 가장 강력한 내인성 신혈관형성 억제제 중 하나이다. 안지오스타틴의 전신 투여는 생체내에서 악성 신경아교종을 효과적으로 억제하는 것으로 제시되었다 [참조문헌: Kirsch et al., 1998]. 또한, 안지오스타틴을 종래의 방사선요법과 병용하여, 생체내 독성 효과의 증가없이 종양 소거율을 증가시킨 바 있다 [참조문헌: Mauceri et al., 1998]. 다른 연구는 안지오스타틴 cDNA의 레트로바이러스 및 아데노바이러스 매개된 유전자 전달이 시험관내 내피 세포 성장 및 생체내 신혈관형성을 억제시킨다는 것을 입증하였다. 종양-유도된 신혈관형성의 억제는 종양 세포 사멸을 증가시킨다 [참조문헌: Tanaka et al., 1998]. 마우스 안지오스타틴을 암호화하는 cDNA를 쥐 T241 섬유육종 세포로 유전자 전달시키면 생체내에서 원발성 및 전이성 종양 성장을 억제하는 것으로 나타났다 [참조문헌: Cao et al., 1998].

PEX

PEX는 인테그린 알파-브이 베타3에 대한 MMP-2의 결합을 억제하는 MMP-2의 C-말단 헤모펙신 도메인으로서, 신혈관형성 및 종양 성장에 필수적인 세포 표면 콜라겐용해 활성을 차단하며 브룩스 등 (Brooks et al., 1998)에 의해 클로닝되고 기술되었다.

크링글 -5

안지오스타틴의 4개의 크링글과 고도의 서열 상동성을 공유하는, 사람 플라스미노겐의 크링글-5 도메인은 내피 세포 증식에 특이적인 억제제로서 제시되었다. 크링글-5는 염기성 섬유모세포종 성장 인자-자극된 모세관 내피 세포 증식의 억제 에 있어 안지오스타틴보다 강력한 것으로 간주되고 있다 [참조문헌: Cao et al., 1997]. 이의 항증식 특성 이외에도, 크링글-5는 안지오스타틴과 유사한 항이동 (antimigratory) 활성을 또한 나타내며, 내피 세포에 선택적으로 영향을 미친다 [참조문헌: Ji et al., 1998].

신혈관형성억제 ( angiostatic ) 융합 유전자

신규한 신혈관형성억제 융합 유전자는 엘라스틴 펩타이드 모티프 (Val-Pro-Gly-Val-Gly)를 링커로서 사용하여 클로닝할 수 있다. 이들 융합체는 2종의 강력한 신혈관형성 유전자를 결합시킨 것으로 종양 신혈관형성의 억제를 증가시킨다. 상기 분자들은 상이한 기작을 통해 작동하기 때문에, 이들의 배합물은 상승효과를 유발할 수 있다. 신혈관형성억제 융합 단백질의 예로는 엔도스타틴 18과 안지오스타틴의 융합체 (endo/ang), 엔도스타틴 18과 플라스미노겐의 크링글 5 모티프의 융합체 (endo/k5) 뿐만 아니라 인터페론-감마에 의해 유도된 모노킨과 인터페론-알파 유도성 단백질 10의 융합체 (MIG/IP10)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

케모킨

케모킨은 백혈구 화학주성을 유도할 수 있는 저분자량 염증 촉진성 사이토킨이다. 고려되는 케모킨에 따라서, 화학유인 (chemoattraction)은 특정 백혈구 세포 종류에 특이적이다. 케모킨 유전자를 종양내로 발현시켜 항암 활성이 가능한 백혈구의 보다 효율적 보충을 유도할 수 있다. 게다가, 이의 화학주성 활성 이외에, 일부 케모킨은 항신혈관형성 활성을 지닌다: 이들 케모킨은 종양에 영양을 공급하는 혈관의 형성을 억제한다. 이러한 이유로, 이들 케모킨은 암 치료에서 유용 하다.

MIG

인터페론-감마에 의해 유도되는 모노킨 (mokine-induced by interferon-gamma)인 Mig는 IP-10과 관련된 CXC 케모킨이며 단핵구에 의해 생성된다. Mig는 활성화 T 세포에 대해 화학유인성이며 또한 강력한 신혈관형성억제 특성을 지닌다. Mig의 종양내 주사는 종양 괴사를 유도한다 [참조문헌: Sgadari et al., 1997].

IP -10

인터페론-알파 유도성 단백질 10인 IP-10은 CXC 케모킨 계통의 구성원이다. IP-10은 주로 단핵구에 의해 생성되나, T 세포, 섬유모세포 및 내피 세포에 의해서도 생성된다. IP-10은 T 세포, 단핵구 및 NK 세포와 같은 림프구 세포에서 화학주성 활성을 발휘한다. 또한, IP-10은 신혈관형성의 강력한 억제제이다: IP-10은 내피 세포 분화를 억제함으로써 신생혈관증식을 억제한다. 면역 세포에 대한 이의 화학주성 활성으로 인하여, IP-10은 항암 면역 반응을 증진시키는 우수한 후보로서 고려되고 있다. 종양 세포내로의 IP-10의 유전자 전달은 종양 세포의 종양유발성 (tumorigenicity)을 감소시켜 장기간의 보호 면역 반응을 유도한다 [참조문헌: Luster and Leder, 1993]. IP-10의 신혈관형성억제 활성은 종양 퇴화를 매개하는 것으로도 나타났다: IP-10을 발현하는 종양 세포는 생체내에서 괴사성이다 [참조문헌:Sgadari et al., 1996]. 또한, IP-10은 종양 퇴화를 유도하는 IL-12의 신혈관형성억제 효가를 매개하는 것으로 나타났다 [참조문헌: Tannenbaum et al., 1998].

가용성 VEGF 수용체

FLT-1 (fms형 티로신 키나제 1 수용체)는 VEGF의 막-결합된 수용체 (VEGF 수용체 1)이다. FLT-1의 가용성 단편 (sFLT-1)은 VEGF에 대한 길항제 활성으로 인해 신혈관형성억제 특성을 나타낸다는 것이 제시된 바 있다. 가용성 FLT-1은 VEGF에 결합함으로써 작용할 뿐만 아니라, 막-결합된 FLT-1의 외부 도메인에 결합하여 이를 차단한다 [참조문헌: Kendall & Thomas 1993, Goldman et al., 1998]. sFLT-1의 한 예로는 FLT-1의 외부의 7종의 면역글로불린형 도메인에 이르는 사람 sFLT-1이 있다.

sFLK -1/ KDR

FLK-1 또는 KDR (키나제 삽입 도메인 수용체)는 VEGF의 막-결합된 수용체 (VEGF 수용체 2)이다. KDR의 가용성 단편 (sKDR)은 VEGF에 결합할 뿐만 아니라 막-결합된 KDR의 외부 도메인에 결합하여 이를 차단하기 때문에, VEGF에 대한 길항제 활성으로 인한 신혈관형성억제 활성을 나타내는 것으로 제시되었다 [참조문헌: Kendall & Thomas, 1996, Millauer et al., 1994]. sKDR의 한 예로는 KDR의 외부의 7종의 면역글로불린형 도메인에 이르는 사람 sKDR이 있다.

아폽토시스

아폽토시스는 프로그램된 세포 사멸 또는 세포 자살의 과정을 설명하는데 사용되는 용어이다. 상기 과정은 다세포 유기체의 발육 및 건강의 정상적 성분이다. 아폽토시스의 비정상적 조절은 암 내지 자가면역 질환에 이르는 각종 병리학적 장애와 연루되어 왔다.

BIK

Bik는 18kD (160개의 아미노산) 잠재적 아폽토시스촉진 (pro-apoptotic) 단백질이며, Bcl-2 상호작용 킬러, 아폽토시스 유도인자 NBK, BP4 및 BIP1로서 또한 공지되어 있다. Bik는 유전자 bik (또는 nbk)에 의해 암호화된다. Bik의 기능은 Bcl-XL, BHRF1, Bcl-2 또는 이의 아데노바이러스 상동체 E1B 단백질과 같은 각종 아폽토시스 억제인자와 복합체를 형성함으로써 프로그램된 세포 사멸을 가속화시키는 것이다. 일시적 형질감염 연구에서, Bik는 Bcl-2 계통의 아폽토시스촉진 구성원인 Bax 및 Bak와 유사한 방식으로 세포 사멸을 촉진하였다 [참조문헌: Boyd et al., 1995].

BAK

Bcl-2 상동체인 Bak는 Bcl-2 및 Bcl-XL을 포함하는 항-아폽토시스 계통 구성원에 결합하여 아폽토시스를 촉진하는 아폽토시스 촉진 단백질이며 Bik에 대해 앞서 기술한 바와 같이 상기 항-아폽토시스 계통 구성원의 활성을 억제한다 [참조문헌: Chittenden et al., 1995].

BAX

Bax는 아폽토시스 조절제로서 기능하는 21kD 단백질이다. Bax는 아폽토시스 억제인자 Bcl-2와 이량체화되어 이를 길항시킴으로써 프로그램된 세포 사멸을 가속화시킨다. 이들 단백질 이량체의 비는 아폽토시스의 개시와 관련되는 것으로 사료되고 있다. K562 적백혈구 세포 내에서 재조합 Bax 발현의 효과는 고바야시 등 (Kobayashi et al., 1998)에 의해 조사되었다. Bax 벡터를 K562 세포내로 형질감염시키면 아폽토시스가 유도된다. 게다가, Bax로 안정하게 형질감염된 세포는 화 학요법제 ara-X, 독소루비신 및 SN-38에 보다 민감한 것으로 밝혀졌다 [참조문헌; Kobayashi et al., 1998].

BAD

Bad 단백질 (Bcl-2 결합 성분 6, bad 유전자 또는 bbc6 또는 bcl218)은 세포 사멸을 촉진하는 소형 단백질 (168개의 아미노산, 18kD)이다. Bad 단백질은 Bcl-XL 및 Bcl-2에 결합하기 위해 성공적으로 경쟁함으로써, 상기 두 단백질과 Bax의 이종이량체화의 수준에 영향을 준다. Bad 단백질은 Bcl-XL의 사멸 억제 활성을 역전환시킬 수 있으나, Bcl-2의 사멸 억제 활성은 역전환시키지 못한다.

BCL -2

B 세포 백혈병/림프종-2 (Bcl-2)는 세포 사멸 조절 단백질 계통의 원형 (prototype) 구성원이다. Bcl-2는 미토콘드리아에서 주로 발견되며 카스파제의 활성화를 방해함으로써 아폽토시스를 차단한다. 종양 세포내로 Bcl-2를 유전자 전달시키면 상기 종양 세포의 전이 잠재성이 증가되는 것으로 나타났다 [참조문헌: Miyake et al., 1999]. Bcl-2가 방사선 조사된 수용자의 재구성 후에 조혈 줄기세포의 생존성을 증가시키기 때문에 Bcl-2 유전자 전달은 골수 이식에 적용할 수 있다 [참조문헌: Innes et al, 1999]. 또한, 뉴론내 Bcl-2의 발현이 뉴론을 아폽토시스로부터 보호하기 때문에 Bcl-2 유전자 전달은 신경퇴행성 질환에 유용할 수 있다 [참조문헌: Saille et al., 1999].

BCL - XS

Bcl-XS (짧은 이소형)은 Bcl-2 및 Bcl-XL의 우세한 음성 억제인자이다. 이 것을 유전자 치료요법 실험에서 사용하여, Bcl-2 및 Bcl-XL을 발현하는 종양에서 아폽토시스를 개시하였다. Bcl-XS의 발현은 종양 크기를 감소시키며 [참조문헌: Ealovega et al., 1996], 종양 세포를 화학요법제에 감응성이 되도록 하는데 [참조문헌: Sumatran et al., 1995], 이는 Bcl-2 및 Bcl-XL을 발현하는 종양에서 세포 사멸을 개시하는데 있어 Bcl-XS의 역활을 제시한다 [참조문헌: Dole et al., 1996].

GAX

Gax는 p21-의존적 방식으로 세포 증식을 억제하는 전사 인자를 암호화하는 호메오박스 유전자이다. Gax는 세포가 자극되어 증식할 경우 하향-조절된다. Gax 과별현은 미토겐-활성화된 세포에서 Bcl-2 하향-조절 및 Bax 상향 조절을 유도한다 [참조문헌: Perlman et al., 1998]. 따라서, Gax는 특정 종양 세포의 성장을 억제하는데 유용할 수 있다. 게다가, 혈관 평활근 세포에서 Gax 과발현은 혈관 평활근 세포의 증식을 억제한다 [참조문헌: Perlman et al., 1999]. 따라서, Gax 유전자 전달은 혈관 손상에 이은 혈관 협착을 제한할 수 있다.

종양 서프레서 유전자

종양 서프레서 유전자의 다양한 돌연변이는 상이한 종류의 암과 관련되어 왔다. 상기 경우에, 종양 억제 유전자의 야생형 형태를 사용한 체세포 유전자 치료요법이 항암 치료 접근법으로서 고려되어 왔다. p16, p21, p27 및 p53은 사이클린-의존성 키나제에 작용함으로써 세포 주기를 억제한다.

P16

15kD 단백질 (148개의 아미노산)인 P16은 CDK4I, P16-INK4, P16-INK4A 또는 다중 종양 서프레서 1 (MTS1)로서 또한 공지되어 있다. P16은 유전자 cdkn2a 또는 cdkn2에 의해 암호화된다. P16은 사이클린-의존성 키나제 4 및 6과 이종이량체를 형성함으로써, 시험관내 및 생체내 둘다에서 사이클린 D와의 상호작용을 방해한다. 따라서, P16은 정상 세포의 음성 증식 조절제로서 작용한다. P16 (cdkn2) 돌연변이는 광범위한 조직에서 종양 형성과 관련된다. cdkn2a는 대부분의 종양 세포주 및 흑색종 및 담관, 췌장 및 위의 종양을 포함하는 일부 원발성 종양에서 동종접합적으로 결실 또는 돌연변이되어 있거나 불활성화되어 있다 [참조문헌; Biden et al., 1997; Castellano et al., 1997]. p16IKN4A 유전자 발현의 상실은 중피종 종양 및 기타 세포주에서는 통상적으로 관찰된다. 중피종 세포내에서 발현 아데노바이러스로 p16INK4A를 형질도입시키면 세포 성장이 감소되고 형질도입된 세포가 사멸된다 [참조문헌: Frizelle et al., 1998]. 게다가, 내인성 p16/CDKN2 유전자를 발현하지 않는 3종의 사람 신경아교종 세포주 (U251 MG, U-87 MG 및 D54 MG)로의 야생형 p16INK4A의 아데노바이러스 매개된 유전자 전달은 G0기 및 G1기에서 세포 성장을 정지시킨다 [참조문헌: Fueyo et al., 1996]. 또한, p16-INK4A를 발현하지 않는 페암 세포주내로의 야생형 p16의 아데노바이러스 매개된 유전자 전달은 시험관내 및 생체내 둘다에서 종양 증식을 억제한다 [참조문헌: Jin et al., 1995]. 따라서, 종양 세포내 야생형 P16 단백질의 복구는 암 치료학적 용도를 가질 수 있다.

P21

p21은 사이클린-의존적 키나제 억제제 1 (CDKN1), 흑색종 분화 관련 단백질 6 (MDA-6) 및 CDK-상호작용 단백질 1로서 또한 공지된 18kD 단백질 (164개 아미노산)이다. p21은 CIP1 및 WAF1로서도 공지된 유전자 CDKN1 [참조문헌: Harper et al., 1993]에 의해 암호화된다. p21은 p53이 DNA 손상에 반응하여 세포 증식의 억제제로서의 이의 작용을 매개하도록 하는 중요한 중간체일 수 있다. p21은 사이클린-의존적 키나제에 결합하여 사이클린-의존적 키나제 활성을 억제함으로써, 중요한 사이클린-의존적 키나제 기질의 인산화를 방지하고 세포 주기 진행 및 증식을 차단켐한다. p21은 모든 성인 조직에서 발현된다. 종양 세포내로의 p21 유전자 전달은 종양 성장을 억제하는데 유용할 수 있다. 사람 비-소세포폐암 (NSCLC) 세포주에서 재조합 아데노바이러스 매개된 p21 유전자 전달은 투여량-의존적 p21 유도 및 G0/G1 세포 주기 정지로 인한 동시적 세포 성장 억제를 유발한다. 또한, p21을 보유하는 아데노바이러스를 마우스내의 NSCLC 미리 확립된 종양에 주사하면 종양 성장이 감소되고 동물의 생존율이 증가된다 [참조문헌; Joshi et al., 1998]. 이러한 결과들은 암 유전자 치료요법을 위한 p21의 용도를 지지한다.

본 발명에 따라서, 당해 기술 분야내의 통상적인 분자생물학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다 [참조문헌: Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); "DNA Cloning: A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985]; "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985); "Transcription and Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1984)); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed. (1986)); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, (1986)); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984)].

"벡터"는 다른 DNA 분절이 부착되어 부착된 분절의 복제를 유발할 수 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 레플리콘이다.

"프로모터 서열"은 세포내에서 RNA 폴리머라제가 결합하고 하부 (3' 방향) 암호 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 본 발명을 정의하기 위한 목적으로, 프로모터 서열을 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에 결합시키고 상부 (5' 방향)로 신장시켜, 배경값 이상의 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필수적인 최소수의 염기 또는 요소를 포함하도록 한다. 프로모터 서열 내에서는 전사 개시 부위 (통상적으로 뉴클레아제 S1을 사용한 지도화에 의해 정의됨) 뿐만 아니라, RNA 폴리머라제의 결합에 관여하는 단백질 결합 도메인 (보존성 서열)이 발견될 수 있다. 진핵 프로모터는 흔히 "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유할 수 있으나 항상 함유하는 것은 아니다. 벡터를 유도하는데 다양한 프로모터를 사용할 수 있다.

세포는 외인성 또는 이종 DNA를 일반적으로 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내부로 도입시킨 경우 이러한 DNA를 사용하여 "형질도입"되었다. 형질도입 DNA는 (렌티바이러스 벡터의 경우) 세포의 게놈내로 통합될 수 있거나 (공유적으로 연결될 수 있거나) 통합될 수 없다. 예를 들어, 원핵생물, 효모 및 포유동물 세포에서 DNA는 플라스미드와 같은 에피좀 요소 상에서 유지시킬 수 있다. 진핵 세포의 경 우에, 안정하게 형질전환된 세포는 형질전환 DNA가 염색체 복제를 통해 딸 세포로 유전되도록 염색체내로 통합된 세포이다. 이러한 안정성은 세포주 또는 형질전환 DNA를 함유하는 딸 세포군으로 이루어진 클론의 능력에 의해 입증된다. "클론"은 유사분열에 의해 단일 세포 또는 공통의 조상으로부터 유래된 세포 집단이다. "세포주"는 여러 세대 동안 시험관내에서 안정하게 성장할 수 있는 1차 세포의 클론이다.

"치료 유전자"는 목적하는 표현형을 부여하는 유전자를 의미한다. 예를 들어, 항상성 활성 망막모세포종 (CA-rb) 유전자를 사용하여 안내 증식을 예방하거나 유전자 결함을 페리페린 유전자의 전달에 의해 복구시킨다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "마커 유전자"란 용어는 이종 프로모터 또는 인핸서 요소에 결합된 암호 서열로서, 작제물을 조직 또는 세포내로 도입할 경우 이의 생성물이 용이하게 정량적으로 검정되는 서열을 의미한다. 통상적으로 사용되는 마커로는 방사성 원소, 효소, 단백질 (예: 증강된 녹색 형광 단백질) 또는 자외선 등에 노출될 경우 형광을 내는 화학물질이 포함된다.

본 발명은 렌티바이러스 유전자 전달에 의해 유전적 증식성 실명 질환을 치료하는 신규한 수단에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 이러한 질병의 치료에 도움이되는 유전자를 암호화하는 DNA 서열을 보유하는 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 상기 유전자의 예로는 페리페린 유전자, 항상성 활성 형태의 rb 유전자 및 상기 논의한 각종 치료 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 안구 질환을 앓는 환자에게 안내 세포 증식을 억제하는 치료 유전 자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 약리학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 당해 환자에서 안내 세포 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 안구 질환의 대표적 예로는 노인성 황반변성, 증식성 당뇨망막병증, 미성숙 망막병증, 녹내장 및 증식성 유리체망막병증이 포함된다. 치료 유전자는 망막모세포종 유전자, p16 유전자 또는 p21 유전자의 항상성 활성 형태일 수 있다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터는 약 10⁶ 내지 10⁹ 형질도입 단위의 투여량으로 피막 (capsular), 유리체 또는 망막하 공간 (Subretinal space) 내로 투여한다.

또한, 본 발명은 안구 질환을 앓는 환자에게 안내 혈관신생을 억제하는 치료학적 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 약리학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하여, 당해 환자에서 안내 혈관신생을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기한 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 안구 질환의 대표적 예로는 노인성 황반변성, 증식성 당뇨망막병증, 미숙아 망막병증, 녹내장 및 증식성 유리체망막병증이 포함된다. 치료 유전자는 신혈관형성 또는 아폽토시스를 조절하는 유전자일 수 있다. 일반적으로, 신혈관형성을 조절하는 유전자로는 메탈로프로이나제의 조직 억제제 (TIMP)-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-3 엔도스타틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴 XVIII, 엔도스타틴 XV, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2의 C-말단 헤모펙신 도메인, 사람 플라스미노겐의 크링글 5 도메인, 엔도스타틴과 안지오스타틴의 융합 단백질, 엔도스타틴과 사람 플라스미노겐의 크링글 5 도메인의 융합 단백질, 인터페론-감마에 의해 유도되는 모노킨 (Mig), 인터페론-알파 유도성 단백질 10 (IP10), Mig와 IP10의 융합 단백질, 가용성 FLT-1 (fms형 티로신 키나제 1 수용체) 및 키나제 삽입 도메인 수용체 (KDR)를 암호화하는 유전자가 포함되며, 아폽토시스를 조절하는 유전자로는 Bcl-2, Bad, Bak, Bax, Bik, Bcl-X 짧은 이소형 및 Gax가 포함된다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터는 약 10⁶ 내지 10⁹ 형질도입 단위의 투여량으로 피막, 수정체 또는 망막하 공간 내로 투여한다.

하기 실시예는 본 발명의 다양한 양태를 설명하기 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하고자하는 것은 아니다.

실시예 1

세포 및 조직

사람 맥락막 섬유모세포 (HCF), 사람 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC) 및 사람 태아 망막 색소 상피 세포 (HRPE)의 1차 추출물을 확립시키고 유사분열 활성을 촉진시키거나 촉진시키지 않는 조건하에 놓는다. 또한 안정한 광수용체-유래된 세포 (Y-27 및 Weri-Rb-1)를 배양한다.

망막모세포종 적출시에 수득한 사람 망막 및 RPE를, 이들 유사분열적 불활성 세포를 형질도입시키고 외인성 사람 페리페린 형질전환 유전자의 발현을 유도하는 렌티바이러스 벡터의 능력을 입증하는데 사용한다. 각막 이식 수술시에 수득한 사람 각막을, 이들 유사분열적 불활성 세포를 마커 유전자 증강된 녹색 형광 단백질 유전자로 형질도입시키는 렌티바이러스 벡터의 능력을 입증하는데 사용한다.

실시예 2

렌티바이러스 벡터

수포성구내염 바이러스 (VSV) 외피로 가형 (pseudotype)화되고 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 마커로서 함유하는 3종의 플라스미드계 렌티바이러스 벡터 시스템을 사용한다 (도 1). 재조합 렌티바이러스를 문헌 [참조: Naldini et al]에 기술된 바와 같이 제조한다. 사이토메갈로바이러스 (CMV) 즉시적인 초기 발현 유전자 (immediate-early gene) 프로모터를 플라스미드 pHR'-CMV-eGFP 내의 eGFP의 발현으로 지시되도록 한다. 바이러스의 스톡을 다음과 같이 제조한다. 사람 신장 293 T 세포 (5x10⁶)를 10cm 플레이트에 분주하고, 다음날 D10 성장 배지 (10% 태아 소 혈청을 함유하는 고 글루코스 DMEM)에서 인산칼슘 침전법을 사용하여 pCMVΔR8.91 (팩키징 작용 플라스미드) 10㎍, pHR'-CMV-eGFP (마커 유전자 플라스미드) 10㎍ 및 pMD.G (VSV-G 외피 함유 플라스미드) 2㎍으로 동시형질감염시킨다. 37℃에서 12시간 내지 16시간 후, 배지를 제거하고 신선한 D10 성장 배지를 첨가한다. 세포를 추가로 10시간 동안 배양한다. 10mM 나트륨 부티레이트 및 20mM Hepes 완충액을 함유하는 신선한 D10 배지를 상기 세포에 첨가하고 세포를 다시 12시간 동안 배양한다. 상기 배지를 20mM Hepes 완충액을 함유하는 새로운 D10 배지로 교체하고, 12시간 후 바이러스 함유 배지를 수집한다. 신선한 배지를 첨가하고, 상청액을 4일 후에 매 24시간마다 수집한다. 바이러스 상청액을 수집 직후에 -80℃에서 저장한다.

바이러스 스톡을 상청액을 140분 동안 실온에서 초원심분리 (19,000rpm, Beckman SW28 로터)하여 농축시키고 수득되는 바이러스 펠릿을 포스페이트 완충 식염수 1 내지 3㎖ 속에 재현탁시킨다. 분취한 바이러스 스톡을 293개 세포를 사용하여 역가측정하고, 남은 샘플을 -80℃에서 보관한다.

모든 렌티바이러스 벡터 상청액을, 식물성 혈구응집소 (phytohemagglutinic)-자극된 사람 말초혈 단핵 세포를 감염시킨 다음, 배양 배지를 ELISA에 의해 p24 gag에 대해 분석함으로써 복제 수용능 (competent) 레트로바이러스 (RCR)의 존재에 대해 검정한다. RCR은 제조된 어떠한 바이러스 상청액에서도 검출되지 않는다.

실시예 3

렌티바이러스 벡터 형질도입

293T 세포를 상기한 렌티바이러스 벡터로 형질감염시켜 2x10⁶ 복제-결핍 렌티바이러스 입자/㎖를 함유하는 상청액을 제조한다. 세포를 바이러스 입자와 함께 24시간 동안 배양한 다음, 형광-활성화 세포 선별에 의한 GFP 발현의 측정에 앞서 4일 동안 표준 배지에서 회수한다 (도 2 및 3).

형질도입 효율을 MOI 범위가 1 내지 1000인 다중감염도의 함수로서 측정한다. 다수의 사람 세포주의 시험관내 형질도입의 결과는 렌티바이러스 입자의 수를 증가시킬 수록 보다 많은 세포가 형질도입되기 때문에 MOI 및 형질도입 효율 간의 양성 상관성을 입증한다 (도 2).

비분열 세포를 형질도입시키는 렌티바이러스 벡터의 능력을 검사한다. 사람 망막 색소 상피 세포를 렌티바이러스 벡터 또는 쥐 백혈병 바이러스 벡터를 사용하여 형질도입시킨다. 당해 세포는 벡터에 노출시에 유사분열적으로 불활성 (융합성) 또는 유사분열적으로 활성 (성장)이다. 도 4에 제시한 결과는 다른 레트로바이러스 벡터에 비해 보다 우수한, 비분열 세포를 형질도입시키는 렌티바이러스 벡터의 능력을 입증한다. 또한, 렌티바이러스 벡터는 비-렌티바이러스 레트로바이러스 벡터와 비교하여 사람 태아 세포를 형질도입시키는데 있어 매우 효율적이다 (도 6)

eGFP 형질전환 유전자 발현 기간을 측정하기 위해, 렌티바이러스 벡터로 형질도입시킨 세포를 120일의 기간에 걸쳐서 시험한다. 형질도입된 세포의 클론 집단에 대한 서던 블롯 분석의 결과는, 렌티바이러스-eGFP 벡터가 숙주 게놈내로 삽입되었음을 나타낸다 (도 5b). 삽입된 eGFP 형질전환 유전자의 발현은 120일에 걸쳐 안정하며, 형질도입된 세포에 대한 또는 이와 상반되는 선택적 잇점을 부여하지 않는다 (도 5a).

실시예 4

각막의 원-위치 형질도입

각막 이식 수술시에 수득한 사람 각막 이식편을, 이들 유사분열적 불활성 세포를 마커 유전자 증강된 녹색 형광 단백질 유전자로 형질도입시키는 렌티바이러스 벡터의 능력을 입증하는데 사용한다 (도 7). 데스메막에 부착된 내피 세포를 형질 도입된 각막 조직으로부터 벗겨내고, 광학 현미경 및 형광 현미경으로 검사한다. 각막 내피는 eGFP에 대해 양성이며, 이는 효과적 유전자 전달 및 발현이 달성되었음을 의미한다 (도 7b). 상피층내의 효율적인 원-위치 형질도입 및 eGFP 발현이 또한 관찰된다 (도 7c).

결론으로서, 이러한 결과들은 복제-결핍 렌티바이러스 벡터가 형질전환유전자를 사람 각막 내피 및 상피 세포로 효과적으로 원-위치 전달시키며 장기간의 형질전환 유전자 발현을 달성할 수 있음을 나타낸다. 당해 벡터는 각막 내피 또는 상피 질환을 치료하는데 유용할 수 있으며, 이를 적용하여 동종이식 거부 과정을 조기에 조절함으로써 이식하기 전에 공여자 각막 조직의 유전자 구성을 생체외에서 개질시킬 수 있다.

실시예 5

안구 증식성 질환용 성장 서프레서 요법

사람 페리페린 유전자를 치료 유전자의 한 예로서 사용한다. 사람의 페리페린 유전자의 유전자 결손은 광범위한 불능성 표현형을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 망막모세포종에 대한 적출시에 외과술에 의해 절개한 정상 사람 망막 또는 망막 색소 상피 (RPE) 조직을 치료 유전자가 결여되어 있거나 사람 페리페린 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 노출시킨다. 도 8의 결과는 페리페린 유전자가 렌티바이러스 벡터에 의해 사람 망막 조직으로 효율적으로 전달됨을 입증한다.

치료 유전자 전달의 다른 예로서, 항상성 활성 형태의 망막모세포종 유전자 (CA-rb)를 사용한다. 본원에서 기술하는 렌티바이러스 벡터는 항상성 활성 형태의 망막모세포종 유전자의 효율적 전달을 매개한다 (도 9). 전달된 CA-rB 유전자는 사람 망막과 맥락막 세포의 증식 (도 10) 및 사람 수정체 상피 세포의 증식 (도 11)에 있어 투여량-의존적 억제 효과를 나타낸다.

당해 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 항상성 활성 형태의 망막모세포종 유전자는 생체내 안내 세포 질환을 또한 억제한다. 안내 증식 질환의 두 모델 (증식성 유리체망막병증 및 수정체 적출후 후피막 혼탁화)을 생체내에서 시험한다. 증식성 유리체망막병증을 3종의 래빗 세트에서 유도한다 (도 12). 한 세트는 처리하지 않고, 또 한 세트는 CA-rb 유전자가 결여된 렌티바이러스 벡터로 처리하고 마지막 세트는 수정체내로-전달된 렌티바이러스 CA-rb로 처리한다. 증식성 수정체망막병증 및 망막 탈리는 처음 두 세트에서 고빈도 (>90%)로 주지된 반면, 망막 탈리가 진행되는 동물의 비율은 CA-rb 처리한 세트에서 현저하게 낮다 (26%).

도 13의 결과는 수정체 적출후 후막 혼탁화 과정에 있어 렌티바이러스 CA-rb의 생체내 억제 효과를 입증한다. 3종의 래빗 세트는 표준 수정체유화에 적용시켜 본래의 수정체를 제거한다. 이어서 처음 세트 (그룹 1)는 처리하지 않고, 두번째 두 세트는 백내장 상처의 봉합시에 무손상 수정체 피막낭으로 전달되는 공 렌티바이러스 작제물 (치료 유전자를 함유하지 않음, 그룹 2) 또는 렌티바이러스 CA-rb (그룹 3)으로 처리한다. 동물을 후피막 혼탁화의 존재에 대해 연속적으로 검사한다. 혼탁화의 존재를 1 내지 5 단위로 등급화하는데, 이때 1은 혼탁화가 없음을 의미하고 5는 간접 쌍안 검안경검사를 사용할 경우 망막의 가시화를 방해하기에 충분히 중증인 혼탁화를 의미한다. 그룹 1 및 2 (처리하지 않은 그룹 및 공 벡터로 처리한 그룹) 사이에 통계학적으로 상이한 결과는 수득되지 않은 반면에, 후피막 혼탁화의 발달에 있어 렌티바이러스 CA-rb의 현저한 억제 효과가 수득된다. 28일째까지, 대조군 동물은 4.4의 유리한 혼탁화 스코어를 나타내는 한편, 렌티바이러스 CA-rb로 처리한 동물은 2.1의 평균 혼탁화 스코어를 나타낸다.

실시예 6

"2종 유전자" 렌티바이러스 벡터

2개의 클로닝 부위 사이에 IRES (내부 리보솜 진입 부위) 요소를 포함하는 신규한 렌티바이러스 벡터를 작제한다. IRES 요소는 mRNA-리보솜 결합 및 단백질 합성을 가능케 한다. 이러한 골격은 2종의 상이한 발현가능한 유전자를 수용할 수 있다. 형질도입된 세포에서는 단일 메시지가 생성되나, IRES 요소로 인하여 상기 메시지는 기능적으로 2-시스트론이며 2종의 상이한 단백질의 합성을 유도할 수 있다. 상기 방식으로, 하기에서 논의되는 각각의 잠재적 치료 유전자를 마커 유전자 (예: 증강된 녹색 형광 유전자-eGFP 유전자)에 연결시켜 형질도입된 세포가 동시에 표지되고 목적하는 치료 유전자를 발현하게 할 수 있다. 표지된 세포는 시험관내에서 용이하게 분리할 수 있으며 생체내에서 관찰 수 있다. 다양한 치료 유전자를 보유하는 다수의 렌티바이러스 벡터의 유전자 지도는 도 15 내지 31에 제시한다. 유전공학 및 클로닝 분야의 평균적인 과학자들의 기술 수준이 최근들어 현저하게 증가했기 때문에, 당해 분야의 숙련가는 관심있는 다른 치료 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터를 용이하게 작제할 수 있다.

실시예 7

항-혈관신생 유전자 치료요법

원시 세포 (치료 유전자를 발현하지 않는 것으로 공지된 세포)를 24시간 동안 상기한 렌티바이러스 벡터에 노출시킨다. 이렇게 노출시킨지 2일 후에, RNA를 상기 세포로부터 분리시키고 역전사 효소 보조된 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용하여 형질전환 유전자 발현에 대해 시험한다. 도 32는 사람 피부 미세혈관 내피 세포로부터 분리된 mRNA로부터의 엔도스타틴-18/안지오스타틴 융합 유전자에 대해 양성인 RT-PCR 생성물을 제시한다.

상기 제시한 바와 같이, 시험관내 렌티바이러스-매개된 유전자 전달을 입증한 후, 이어서 생체내 혈관신생을 억제하는 능력을 검사한다. 혈관신생은 다음 방식으로 래빗 각막 조직에서 유도한다:

각막 간질내 미세포켓의 생성 및 렌티바이러스가 주입된 나일론 망의 삽입

래빗을 마스크를 사용하여 이소플루란 (4ℓ/분) 및 산소 (2ℓ/분)로 전신 마취시킨다. 프로파라카인 한 방울을 국소 마취제용 원개 (fornix)내에 놓는다. 이소플루란을 2.5ℓ/분으로 감소시킨다. 베타딘을 30초 동안 원개 내에 놓고 BSS (균형 식염 용액, 제조원: Alcon Inc)로 헹군다. 납 검경을 안구에 위치시킨다. 2.8mm 미세각막절개도 (microkeratome)를 사용하여 12시 정각에 각막 간질에 끼워 넣는다. 이러한 간질내 절개는 McPherson 겸자 및 Irs Sweep 장비를 사용하여 앞뒤로 쓸어줌으로써 5x5 간질내 포켓으로 전개시킨다. 12시 정각의 절개부를 Vannas 가위를 사용하여 개구부가 4.5mm가 되도록 어느 한쪽을 개방시킨다. 렌티바이러스 10㎕가 주입된 4 x 4mm Amersham 하이브리드화 나일론 망 (제조원: Amersham Bioscientist RPN 2519)을 예비-형성된 포켓내로 삽입한다. 토브라마이신 한 방울을 각막 위에 놓는다. 이소플루란을 중지하고 비강 산소를 4ℓ/분으로 증가시킨다. 이러한 방식으로, 래빗을 20분 후에 연속적으로 전신 마취시키고, 케이지로 다시 넣어서 정상 생체 기능으로 회복시킨다. 진통을 위해 래빗에게 부프레넥스 (.3mg/cc) SQ bid를 2일 동안 투여한다. 또한 수술후 조절마비 (cycloplegia) 및 항생제 관리를 위해 래빗에게 한 방울의 아트로핀 및 한 방울의 토브라마이신을 2일 동안 투여한다. 수술후 첫날에 각각의 래빗에게 마취용 국소 프로파라카인을 투여하고, .12 겸자를 사용하여 각막 간질내 포켓으로부터 나일론 망을 제거한다. 수술후 통증 조절 및 관리를 2주 동안 매일 모니터링한다.

알칼리 유도된 혈관신생

최초의 수술 2주 후에, 각막을 1.0M의 NaOH 20㎕로 포화된 6mm 와트만 #3 필터 디스크에 1분 동안 노출시킨다. 이어서 모든 각막을 BSS로 충분히 세척한다. 수술후 조절마비 및 항생체 관리를 위해 래빗에게 한 방울의 아트로핀 및 한 방울의 토브라마이신을 2일 동안 투여한다. 디지탈 광문서화를 수행하여 신생혈관 반응을 기록한다. 신생혈관 반응을 외상후 1일째, 3일째, 5일째, 7일째 및 10일째에 시계 시간 및 혈관의 길이를 주목하면서 세극등 현미경 검사에 의해 측정한다. 혈 관신생을 하기 기술하는 바와 같이 혈관 성장 면적을 계산하여 정량화한다.

각막 혈관신생용으로 표준화된 평가 방법의 경우, 하기 프로토콜 및 수학식을 고안하여 알칼리 화상 후에 혈관신생을 기록하고 비교한다. 혈관신생 면적에 대한 수학식은 반경 RT에 의해 결합된 보다 큰 부채꼴의 면적을 계산하고 반경 R2에 의해 결합된 보다 작은 부채꼴을 빼서 유도한다. 반경 RT에 의해 결합된 보다 큰 부채꼴의 면적은 시계 시간을 12로 나누고 πRT²를 곱한 수이다. 반경 R2에 의해 결합된 보다 작은 부채꼴의 면적은 시계 시간을 12로 나누고 π (R2)²를 곱한 수이다.

2개의 부채꼴의 공제로부터 유도되는, 수득된 면적이 혈관신생의 면적이다.

공초점 현미경 검사를 수행하여 증가된 녹색 형광 단백질, 즉 렌티바이러스 2시스트론 메세지내에 포함된 마커 유전자의 발현을 기록한다. 도 33은 렌티바이러스 벡터로 처리된 동물에서 각막 미세포켓 내에 eGFP의 존재를 입증하는 현미경 사진을 제시한다.

혈관신생에 있어 억제 효과를 입증하기 위해, 상기 기술한 바와 같이 동물에서 혈관신생을 유도한다. Mig/IP10 융합 단백질을 함유하는 렌티바이러스 벡터로 처리한 후, 억제 효과를 관찰한다 (도 34). 표 1에 제시한 바와 같이, 혈관신생의 현저한 감소는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달된 Mig/IP10 융합 유전자 또는 크링글 1-5 유전자로 처리된 동물에서 관찰된다.

렌티바이러스에 의한 유전자 전달 후 혈관신생의 억제

유전자	혈관신생의 mm² 처리된 동물	혈관신생의 mm² 미처리된 동물
Mig/IP10 융합 유전자	57.0mm²	132.2mm²
크링글 1-5	0.9mm²	17.0mm²

다음 참조문헌이 본원에서 인용된다 [참조문헌: Naldini et al., (1996) Science 272:263-267, Miyoshi et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 10319-10323].

본 명세서에서 언급되는 모든 특허 또는 문헌은 본 발명과 관련되는 분야의 숙련가의 수준의 지표이다. 또한, 상기 특허 및 문헌은 개개의 문헌이 참조문헌으로 인용되도록 구체적이며 개별적으로 명시되는 바와 동일한 범위로 본원에서 참조로 인용된다.

당해 분야의 숙련가는 본 발명을 적용하여 본 목적을 실행하고 언급한 결론 및 잇점 뿐만 아니라 본원에서 고유한 목적, 결론 및 잇점이 수득됨을 쉽게 이해할 것이다. 본 실시예와 함께, 본원에서 기술하는 방법, 과정, 처리, 분자 및 특정 화합물은 바람직한 양태를 대표하며, 예시적이며 본 발명의 범주로 제한하고자 하는 것은 아니다. 이때의 변화 및 다른 용도는 하기 청구의 범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 취지내에 포함되는 당해 기술에 발생할 수 있다.

상기한 본 발명의 특징, 잇점 및 목적에서의 문제 뿐만 아니라 명백해 질 수 있는 다른 것들을 달성하고 상세히 이해할 수 있도록, 상기에서 간략히 요약한 본 발명의 보다 특정한 설명은 첨부된 도면에서 설명되는 이의 특정 양태를 참조로 할 수 있다. 본 도면들은 본 명세서의 일부를 구성한다. 그러나, 첨부된 도면이 본 발명의 바람직한 양태를 설명하므로 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 고려되서는 안된다는 것이 주지될 것이다.

도 1은 벡터 (공급원: Dr. Inder Verma, Salk Institute, San Diego, CA)를 도시한 것이다. HIV: 사람 면역결핍 바이러스, LTR: 긴 말단 반복부, GAG: HIV GAG 유전자, POL: HIV 역전사효소, ENV: HIV 외피 유전자, rre: rev-반응 요소, CMV: 사이토메갈로스바이러스, VSV: 수포성구내염 바이러스, 폴리 A: 폴리아데닐화 시그날, 특이적 프로모터: 치료 유전자 발현의 시공간적 또는 정량적 측면을 조절하도록 모든 전사-증진 프로모터가 이 부위에 위치할 수 있다, 치료 유전자: 치료 가능성을 갖는 모든 유전자가 이 부위에 위치할 수 있으며, 예로는 항상성 활성 망막모세포종 유전자 또는 결손되면 질병을 유발하는 유전자가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

도 2는 다음 사람 세포주의 시험관내 형질도입을 제시한 것이다: 사람 망막 색소 상피 세포 (RPE), 사람 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC), 맥락막 섬유모세포 (CF), 사람 망막모세포종 (망막-유래된) 세포 (Weri-RB-1 및 Y79). 상기 세포주들은 마커 유전자 (증강된 녹색 형광 단백질 유전자)를 함유하는 렌티바이러스 입자 로 형질도입시키고 상기 마커 유전자를 발현하는 세포의 분획을 형광-활성화 세포 선별 (cell sorting)에 의해 측정한다. 렌티바이러스 입자의 수가 보다 많을수록 보다 많은 세포가 형질도입되기 때문에 투여량-반응이 주지된다 (감염 다중도-MOI).

도 3a는 배양한 망막 색소 상피 세포의 렌티바이러스 형질도입을 입증한다. 마커 유전자 (eGFP) 발현은 녹색 형광 세포를 유발한다. 도 3b는 형질도입 효율의 형광-활성화 세포 선별 분석을 제시한 것이다. 제1 패널내의 R2 게이트 외부의 데이터는 형광의 예비형질도입 결여를 반영한다. 제2 패널은 95%를 초과하는 형광으로의 형질도입후 이동을 입증한다.

도 4는 사람 망막 색소 상피 세포에서 유사분열 활성 및 형질도입 효율을 설명한 것이다. 사람 망막 색소 상피 세포를 렌티바이러스 또는 쥐 백혈병 바이러스 (MLV) 벡터를 사용하여 형질도입시킨다. 당해 세포는 벡터에 노출시에 유사분열적으로 불활성 (융합성) 또는 유사분열적으로 활성 (성장)이다. 도 4에 제시된 이러한 결과는 다른 레트로바이러스 벡터에 비해 보다 우수한, 비분열 세포를 형질도입시키는 렌티바이러스 벡터의 능력을 입증한다.

도 5는 사람 망막 색소 상피 세포에서의 발현 안정성을 도시한 것이다. 세포를 eGFP 함유 렌티바이러스 벡터에 노출시킨 다음, 연속적 배양물내에서 120일 이상 유지시킨다. 도 5a는 상기 세포내에서의 eGFP 발현의 안정성 뿐만 아니라, 렌티바이러스에 의해 형질도입된 세포에 대한 또는 이와 상반된 선택의 결여 (형질도입된 세포의 비율은 시간에 따라서 일정하게 유지된다)를 도시한 것이다. 도 5b 는 5개의 클론 세포 집단에 대한 서던 분석의 결과이다. 레인 1은 비형질도입 모주로부터의 게놈 DNA를 함유한다. 레인 2 및 3은 벡터에 노출시켰으나 녹색을 띄지 않는 (비형질도입된) 세포로부터의 DNA를 함유한다. 레인 4 및 5는 형질도입된 녹색 세포로부터의 DNA를 함유한다. 세포는 게놈 통합의 결과로서 e-GFP 양성이다.

도 6은 사람 태아 세포 형질전환유전자 발현을 설명한 것이다. 당해 그래프는 사람 태아 세포에서 비-렌티바이러스 레트로바이러스 벡터 (MND-eGFP) 또는 비바이러스 벡터 (대조군)와 비교하여 고효율적인, 렌티바이러스 벡터에 의해 달성된 형질도입 방식을 도시한 것이다.

도 7은 각막 형질도입을 입증한다. 도 7a는 사람 각막의 도식적 설명이다. 도 7b는 e-GFP 함유 렌티바이러스 벡터에 의한 사람 각막 내피 형질도입을 입증한다. 각막 이식시 제거한 사람 각막 이식편을 렌티바이러스 입자에 노출시킨다. 이어서 데스메막 (Descemet's membrane)을 제거하고 실내등 (좌측)하에서 및 형광 검출에 적절한 조건 (우측)하에서 촬영한다. 도 7c는 사람 각막 상피 세포로의 렌티바이러스-매개된 eGFP 유전자 전달을 입증한다. 서브패널 A는 상피층을 인공적으로 탈리시킨 사람 각막의 광학 현미경 사진이다. 형광 형미경 사진 (서브패널 B)은 상피 형광을 나타낸다.

도 8은 결여되면 사람 질병을 유발하는 유전자의 렌티바이러스 유전자 전달의 한 예를 제공한다. 망막모세포종에 대한 안구적출시에 외과술에 의해 절개한 정상 사람 망막 또는 망막 색소 상피 (RPE) 조직을 치료 유전자가 결여된 렌티바이 러스 벡터 (Mock) 또는 사람 페리페린 (peripherin) 유전자를 함유하는 렌티바이러스 벡터에 노출시킨다. 상기 유전자는 사람에서 유전자적으로 결여될 경우 광범위한 불능성 표현형을 유발하는 것으로 공지되어 있다. 전달된 페리페린 유전자만을 인식하도록 디자인된 프라이머를 사용하는 역전사효소-보조된 폴리머라제 연쇄 반응 (rt-PCR)의 결과를 제시한다. 사람 망막 및 망막 색소 상피 내의 사람 페리페린의 발현은 명백하게 입증된다.

도 9는 CA-rb mRNA의 렌티바이러스-매개된 발현을 입증한다. 이는 망막모세포종 유전자의 항상성 활성 형태만을 인식하도록 디자인된 프라이머를 사용하는 역전사효소-보조된 폴리머라제 연쇄 반응 (rt-PCR)의 결과를 제시한다. 레인 1: 마커, 레인 2: 렌티바이러스-eGFP 형질도입된 세포로부터 분리된 RNA를 사용한 경우의 반응 결과, 레인 3: 렌티바이러스-CA-rb 형질도입된 세포로부터 분리된 RNA를 사용한 경우의 반응 결과. 반응 생성물의 크기는 예상한 바와 같다.

도 10은 사람 망막 및 맥락막 세포 분열에 있어 렌티바이러스 항상성 활성 망막모세포종 유전자 벡터의 억제 효과를 제시한 것이다. 세포를 희석비를 감소시키면서 단일 렌티바이러스 스톡 (1:400 희석비 내지 1:50 희석비)에 노출시키고 성장율을 항상성 활성 망막모세포종 유전자를 함유하지 않는 렌티바이러스 벡터에 노출시킨 세포와 비교한다. 세포 분열에 있어 억제 효과는 시간에 따라 명백하게 보이며 이러한 효과는 투여량-의존적이다.

도 11은 사람 수정체 상피 세포 분열에 있어 렌티바이러스 CA-rb의 억제 효과를 제시한 것이다. 백내장 적출시에 사람 안구로부터 제거한 세포를 희석비를 감소시키면서 단일 렌티바이러스 스톡 (1:400 희석비 내지 1:50 희석비)에 노출시키고 성장율을 항상성 활성 망막모세포종 유전자를 함유하지 않는 렌티바이러스 벡터에 노출시킨 세포와 비교한다. 세포 분열에 있어 억제 효과는 시건에 걸쳐 명백하게 보이며 이러한 효과는 투여량-의존적이다.

도 12는 실명 안내 세포 증식에 대한 렌티바이러스 CA-rb의 생체내 억제 효과를 제시한 것이다. 증식성 유리체망막병증을 3종의 래빗 세트에서 유도한다. 한 세트는 처리하지 않고, 한 세트는 항상성 활성 망막모세포종 유전자가 결여된 렌티바이러스 벡터로 처리하고, 마지막 세트는 유리체내로-전달되는 렌티바이러스 CA-rb로 처리한다. 증식성 유리체망막병증 및 망막 탈리는 처음 두 세트에서 고빈도 (>90%)로 주지된다. 망막 탈리가 진행되는 동물의 비율은 항상성 활성 망막모세포종 유전자로 처리한 세트에서 현저하게 낮다 (26%). 본 도면에서는 2개의 망막 사진을 제시한다. 좌측 안구는 망막이 완전히 부착되어 있으며 항상성 활성 망막모세포종 유전자로 처리한 것이다. 우측 안구는 안내 유리체망막병증 세포 증식의 결과로서 망막이 완전히 탈리되어 있으며 CA-rb 유전자가 결여된 렌티바이러스 벡터로 처리한 것이다.

도 13은 수정체 적출후 후피막 혼탁화의 과정에 있어 렌티바이러스 CA-rb의 생체내 억제 효과를 제시한 것이다. 3종의 래빗 세트를 표준 수정체유화에 적용시켜 본래의 수정체를 제거한다. 이어서 첫번째 세트 (그룹 1)는 처리하지 않고 두번째 두 세트는 백내장 상처의 봉합시에 무손상 수정체 피막낭으로 전달되는 렌티바이러스 공 렌티바이러스 작제물 (치료 유전자를 함유하지 않음, 그룹 2) 또는 CA-rb (그룹 3)으로 처리한다. 동물은 후피막 혼탁화의 존재에 대해 연속적으로 검사한다. 혼탁화의 존재는 1 내지 5 단위로 등급화하고, 이때 1은 혼탁화가 없음을 의미하고 5는 간접 쌍안 검안경검사를 사용할 경우 망막의 가시화를 방해하기에 충분히 중증인 혼탁화를 의미한다. 그룹 1 및 2 (처리하지 않은 그룹 및 공 벡터로 처리한 그룹) 사이에 통계학적으로 상이한 결과는 수득되지 않는다. 본 도면의 그래프는 후피막 혼탁화의 발달에 있어 렌티바이러스 CA-rb의 현저한 억제 효과를 제시한다. 28일째까지, 대조 동물은 4.4의 평균 혼탁화 스코어를 나타내며, 렌티바이러스 CA-rb로 처리한 동물은 2.1의 평균 혼탁화 스코어를 나타낸다.

도 14는 렌티바이러스 벡터에 의해 전달되는 엔도스타틴-18/안지오스타틴 융합 유전자의 지도를 제시한 것이다.

도 15는 엔도스타틴/안지오스타틴 융합 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-CMV-Endo/Ang-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 16은 BIK 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-CMV-BIK-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 17은 엔도스타틴/크링글 융합 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-CMV-Endo/크링글-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 18은 KDR 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-CMV-KDR-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 19는 p16 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-CMV-P16-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 20은 p21 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-CMV-P21-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 21은 Timp1 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-CMV-Timp1-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 22는 안지오스타틴 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-Ang-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 23은 엔도스타틴 XV 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-EndoXV-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 24는 엔도스타틴/안지오스스타틴 융합 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-EndoAng-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 25는 엔도스타틴/크링글 융합 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-Endo크링글-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 26은 크링글 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-크링글 1-5-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 27은 Mig/IP10 융합 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-MigIP10-ires-eGFP의 지도를 제시한 것이다.

도 28은 Timp1 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-Timp1-ires-eGFP의 지도를 도시한 것이다.

도 29는 Timp4 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-Timp4-ires-eGFP의 지도를 도시한 것이다.

도 30은 p21 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-P21-ires-eGFP의 지도를 도시한 것이다.

도 31은 엔도스타틴 XVIII 유전자를 보유하는 렌티바이러스 벡터 pHR-EF1/HTLV-Endo XVIII-ires-eGFP의 지도를 도시한 것이다.

도 32은 엔도스타틴-18/안지오스타틴 융합 유전자로 형질도입된 사람 미세소포 내피 (hDMVE) 세포부터 분리한 mRNA의 RT-PCR을 제시한 것이다. 레인 1: 1000/00bp 래더 혼합물; 레인 2 내지 5: 12웰 플레이트의 단일 웰로부터의 pHR'-eF1α/HTLV-Endo::Ang-IRES-eGFP 바이러스 상청액 1㎕, 5㎕, 10㎕ 및 20㎕로 형질도입된 hDMVE 세포로부터 분리된 mRNA로부터의 RT-PCR; 레인 6: PBS 20㎕와 함께 배양한 hDMVE 세포로부터 분리한 mRNA로부터의 RT-PCR; 레인 7: 음성 대조군 (RT-PCR용 주형으로서 H₂O); 레인 8: 100bp 래더.

도 33은 처리된 동물에서 각막 미세포켓 (micropocket)내의 eGFP의 존재를 도시한 것이다. 도 33a는 미세포켓내의 eGFP 발현의 존재를 입증하는 형광 현미경 사진을 제시한 것이다. 도 33b는 도 33a에서 제시한 바와 같은 동일한 조직의 비형광 현미경 사진을 제시한 것이다. 도 33c는 미처리된 동물로부터의 유사하게 처리된 조직의 형광 현미경 사진을 제시한 것이다.

도 34는 Mig/IP10 렌티바이러스 벡터로 처리한 동물의 혈관신생에 있어 억제 효과를 제시한 것이다. 도 34a는 정상 (미처리되고 비자극된) 각막의 사진을 제시한 것이다. 도 34b는 Mig/IP10 렌티바이러스 벡터로 처리된 동물의 알칼리 투여된 각막의 사진을 제시한 것이다. 각막내로 향하는 혈관의 결여를 주목한다. 도 34c 는 치료학적 항-신혈관형성 유전자를 함유하지 않는 대조군 렌티바이러스 벡터로 처리된 동물의 알칼리 투여된 각막의 사진이다. 각막내로 향하는 혈관의 침입을 주목한다. 도 34d는 미처리된 동물의 알칼리 투여된 각막의 사진이다. 각막내로 향하는 혈관의 침입을 주목한다.

Claims

제1 치료 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터의 약리학적 유효량을 포함하는, 피험자에서 각막 질환을 치료하기 위한 조성물.
제1항에 있어서, 각막 질환이 각막의 혈관신생 (neovascularization)과 연관된 질환인 조성물.
제2항에 있어서, 각막의 혈관신생이 안내의 각막 혈관신생인 조성물.
제2항에 있어서, 각막 질환이 알칼리 화상인 조성물.
제1항에 있어서, 각막 질환이 각막 세포의 아폽토시스와 연관된 질환인 조성물.
제1항에 있어서, 피험자가 사람인 조성물.
제6항에 있어서, 치료 유전자가 사람 각막 세포에서 활성인 것으로 알려진 프로모터에 작동적으로 연결되는 조성물.
제1항에 있어서, 제1 치료 유전자가 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, 안지오스타틴, 엔도스타틴 XVIII, 엔도스타틴 XV, 크링글 1-5, PEX, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2의 C-말단 헤모펙신 도메인, 사람 플라스미노겐의 크링글 5 도메인, 인터페론-감마에 의해 유도되는 모노킨 (Mig), 인터페론-알파 유도성 단백질 10 (IP10), 가용성 FLT-1 (fms형 티로신 키나제 1 수용체) 및 키나제 삽입 도메인 수용체 (KDR)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 조성물.
제1항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 신혈관형성을 억제하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 치료 유전자를 추가로 포함하고, 제1 치료 유전자가 제2 치료 유전자와 상이한 조성물.
제9항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 각각 TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, 안지오스타틴, 엔도스타틴 XVIII, 엔도스타틴 XV, 크링글 1-5, PEX, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2의 C-말단 헤모펙신 도메인, 사람 플라스미노겐의 크링글 5 도메인, Mig, IP10, 가용성 FLT-1 및 KDR로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
제10항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 Mig이고, 제2 폴리펩타이드가 IP10인 조성물.
제10항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 엔도스타틴 XVIII이고, 제2 폴리펩타이드가 안지오스타틴인 조성물.
제10항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 엔도스타틴 XVIII이고, 제2 폴리펩타이드가 사람 플라스미노겐의 크링글 5인 조성물.
제10항에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 단일 전사물에 의해 암호화되도록 제1 치료 유전자와 제2 치료 유전자 사이에 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 포함하는 조성물.
제9항에 있어서, 렌티바이러스 벡터가 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 조성물.
제9항에 있어서, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드 사이에 링커를 추가로 포함하는 조성물.
제16항에 있어서, 링커가 엘라스틴 펩타이드 링커인 조성물.
제5항에 있어서, 제1 치료 유전자가 Bcl-2, Bad, Bak, Bax, Bik, Bcl-X 짧은 이소형 및 Gax로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 조성물.
제9항에 있어서, 제1 치료 유전자 및 제2 치료 유전자가 사람 각막 상피 세포에서 활성인 것으로 알려진 2개의 분리된 프로모터의 조절하에 있는 조성물.
각막 세포에서 활성인 것으로 알려진 프로모터에 작동적으로 연결되는 제1 치료 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스 벡터로 형질도입되는 세포를 포함하는 각막 이식편.
제20항에 있어서, 각막 이식편이 사람 각막 이식편인 각막 이식편.
제18항에 있어서, 제1 치료 유전자가 TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, 안지오스타틴, 엔도스타틴 XVIII, 엔도스타틴 XV, 크링글 1-5, PEX, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2의 C-말단 헤모펙신 도메인, 사람 플라스미노겐의 크링글 5 도메인, Mig, IP10, 가용성 FLT-1 및 KDR로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 조성물.
제20항에 있어서, 재조합 렌티바이러스 벡터가 신혈관형성을 억제하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 치료 유전자를 추가로 포함하고, 제1 치료 유전자 가 제2 치료 유전자와 상이한 각막 이식편.
제23항에 있어서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드가 각각 TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3, TIMP-4, 안지오스타틴, 엔도스타틴 XVIII, 엔도스타틴 XV, 크링글 1-5, PEX, 매트릭스 메탈로프로테이나제-2의 C-말단 헤모펙신 도메인, 사람 플라스미노겐의 크링글 5 도메인, Mig, IP10, 가용성 FLT-1 및 KDR로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 각막 이식편.
제24항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 Mig이고, 제2 폴리펩타이드가 IP10인 각막 이식편.
제24항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 엔도스타틴 XVIII이고, 제2 폴리펩타이드가 안지오스타틴인 각막 이식편.
제24항에 있어서, 제1 폴리펩타이드가 엔도스타틴 XVIII이고, 제2 폴리펩타이드가 사람 플라스미노겐의 크링글 5 도메인인 각막 이식편.
제20항에 있어서, 형질도입된 각막 상피 세포를 포함하는 각막 이식편.
제20항에 있어서, 형질도입된 각막 내피 세포를 포함하는 각막 이식편.