JP4971974B2 - Ｐｅｄｆおよびｆｇｆ２を含む眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療薬 - Google Patents
Ｐｅｄｆおよびｆｇｆ２を含む眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療薬 Download PDFInfo
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Description
本発明は、神経栄養因子を搭載したレンチウイルスベクターを用いた、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品に関する。
眼科領域の疾患には、適切な治療を施さないと失明に至る重篤なものがある。決定的な治療法がなく、対症的療法による治療に頼らざるを得ない疾患も少なくない。最近、眼科領域の重篤な疾患の一部の発生・進行に、アポトーシスが関与していることがわかってきた。
網膜色素変性は、網膜の視細胞層及び色素上皮層が広範におかされてアポトーシスに至る、難治性の遺伝性疾患である。視細胞には、大きく分けて杆体と錐体との２種類の細胞がある。杆体は、主に網膜の中心から少しずれた部分に多く分布し、暗いところでの物の見え方や視野の広さなどに関係している。錐体は網膜の中心部である黄斑に多くに分布し、主に中心の視力や色覚などに関係する。網膜色素変性では、視細胞が傷害されるために、夜盲、視野狭窄、視力低下の症状を呈し、進行にしたがい失明する例も多い。網膜色素変性の一部は、視細胞や網膜色素上皮細胞に特異的に働く遺伝子の異常によって起こるとされているが、大部分の網膜色素変性においては、いまだ原因不明である。現在までにわかっている原因遺伝子としては、常染色体劣性網膜色素変性では、杆体cGMP-フォスフォジエステラーゼ aおよびb サブユニット、杆体サイクリックヌクレオチド感受性陽イオンチャンネル、網膜グアニルシクラーゼ、RPE65、細胞性レチニルアルデヒド結合蛋白質、アレスチンの各遺伝子が知られている。また常染色体優性網膜色素変性では、ロドプシン、ペリフェリン・RDS (retinal degeneration slowの略) 、ロム-1、X連鎖性網膜色素変性では網膜色素変性GTPase調節因子(RPGR)の各遺伝子が知られている。診断は、眼底所見（定型例では網膜血管狭小、粗造な胡麻塩状網膜、骨小体様色素沈着。非定型例では無色素性、白点状、等）、視野（求心性、輪状、地図状、中心性など病変の部位に一致した狭窄）、暗順応（暗順応曲線の第２次曲線の閾値の上昇）、視力低下、)電気生理学的所見（網膜電図(ＥＲＧ)の振幅低下・消失）、蛍光眼底造影所見（網膜色素上皮萎縮および網脈絡膜萎縮による過蛍光）により判断される。
現在のところ、網膜色素変性の有効な治療法はなく、対症療法が行われているに過ぎないが、遺伝子治療、網膜移植、人工網膜などによる治療法が研究されている。神経栄養因子を用いた遺伝子治療もそのひとつである。神経栄養因子は、アポトーシス抑制に効果があるといわれている。神経栄養因子である線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）は、網膜光傷害モデル（非特許文献１）、網膜色素変性モデル（非特許文献２−６）、網膜神経節細胞障害（虚血再還流、視神経切断）モデル（非特許文献７）などを用いた動物実験によって、眼科領域における遺伝子治療への応用が検討されている。また本発明者らは、神経栄養因子の一つである色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）を網膜色素変性の治療に応用することを検討している（非特許文献８）。本発明者らは、レトロウイルスであるサル免疫不全ウイルス（SIV： simian immunodeficiency virus）をバックボーンにもつSIVベクターにPEDFを挿入したSIV-PEDFベクターを構築し、モデル動物において検討し、良好な結果を得ている（非特許文献８）。しかし、最終的に失明に至る重篤な疾患である網膜色素変性については、より高い効果を発揮する治療法の開発が求められる。
国際出願番号PCT/JP2002/005225 国際公開番号WO2002/101057
国際出願番号PCT/JP00/03955 国際公開番号WO00/078987
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本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、本発明が解決しようとする課題は、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の新たな治療方法を見出すことである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、２つの神経栄養因子：PEDFとFGF2の同時投与に思い至った。PEDFとFGF2は作用部位が異なると考えられている。PEDFの作用部位は網膜の視細胞および神経節細胞であるが、FGF2の作用部位については、FGF2受容体が網膜の内顆粒層にあることを示唆する報告（非特許文献９）と視細胞にあることを示唆する報告（非特許文献１０）がある。PEDFとFGF2を同時投与すれば、両者の相乗効果によって、従来よりも高い効果を得られる可能性がある。本発明者らは、SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターを構築した。SIVベクターはサル免疫不全ウイルスをバックボーンとするベクターであり、導入外来遺伝子を宿主内において継続的に発現させることが可能なため、慢性疾患の治療においては特に適したドラッグデリバリーを提供することができる。網膜色素変性疾患モデルであるRCSラットの網膜下腔に上記ベクターを投与し、その効果を検討した。ベクター投与4週間後において、ラット後眼部を採取し、PEDFおよびFGF2の発現量を測定したところ、SIV-hPEDF、SIV-hFGF2ベクター投与によるhPEDFおよびhFGF2遺伝子発現が確認された。また、視細胞の残存数をカウントしたところ、単独投与群においても視細胞保護効果が観察されたが、同時投与群は単独投与群よりも著しく高い視細胞保護効果が得られた。さらに、網膜電図により網膜の機能的評価を行ったところ、単独投与群、同時投与群の両方で機能維持が認められたが、同時投与群における効果は単独投与群よりも顕著に高い効果であった。さらに、ベクター投与8週間後および12週間後においても、SIV-hPEDFおよびSIV-hFGF2ベクターの同時投与による顕著な神経保護効果が認められた。本発明者らは上記結果から、PEDFおよびFGF2の同時投与は網膜色素変性の効果に高い効果があるということを、初めて見出した。PEDFおよびFGF2の同時投与は、網膜色素変性のみならず、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療に有効と考えられる。すなわち、本発明は、FGF2およびPEDFの同時投与による、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療に関し、より具体的には以下の発明を提供するものである。
（１）下記（a）から（d）のいずれかを薬学的に許容される媒体とともに含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品
（a）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）遺伝子
（b）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）タンパク質および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）タンパク質
（c）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）タンパク質
（d）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）タンパク質および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）遺伝子、
（２）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む医薬品であって、該PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が、別々の組換えサル免疫不全ウイルスベクターに保持されるか、または1つの組換えサル免疫不全ウイルスベクターに保持される、上記（１）に記載の医薬品、
（３）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターおよびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む、上記（２）に記載の医薬品、
（４）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む、上記（２）に記載の医薬品、
（５）サル免疫不全ウイルスベクターがcPPT配列および／またはWPRE配列を含む、上記（２）から（４）のいずれかに記載の医薬品、
（６）サル免疫不全ウイルスベクターがVSV-Gでシュードタイプ化されている、上記（２）から（５）のいずれかに記載の医薬品、
（７）サル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、上記（２）から（６）のいずれかに記載の医薬品、
（８）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物、およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用キット、
（９）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用キット、
（１０）眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患が、網膜色素変性、緑内障、網膜剥離、網膜虚血性疾患のいずれかである、上記（１）から（７）のいずれかに記載の医薬品または上記（８）もしくは（９）に記載のキット、
（１１）PEDFおよびFGF2あるいはそれらをコードする遺伝子を投与する、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療方法、
（１２）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターおよびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを投与する、上記（１１）に記載の治療方法、
（１３）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターおよびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを網膜下腔に投与する、上記（１２）に記載の治療方法、
（１４）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを投与する、上記（１１）に記載の治療方法、
（１５）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを網膜下腔に投与する、上記（１４）に記載の治療方法、
（１６）配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法、
（１７）配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、上記（１６）に記載の方法、
（１８）配列番号：１に記載の塩基配列にFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法、
（１９）配列番号：３に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、上記（１８）に記載の方法、
（２０）配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法、
（２１）配列番号：４に記載の塩基配列を含むパッケージングベクターが導入されたパッケージング細胞に、該ジーントランスファーベクターを導入する工程を含む、上記（１６）から（２０）のいずれかに記載の方法。
（１）下記（a）から（d）のいずれかを薬学的に許容される媒体とともに含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品
（a）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）遺伝子
（b）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）タンパク質および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）タンパク質
（c）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）タンパク質
（d）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）タンパク質および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）遺伝子、
（２）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む医薬品であって、該PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が、別々の組換えサル免疫不全ウイルスベクターに保持されるか、または1つの組換えサル免疫不全ウイルスベクターに保持される、上記（１）に記載の医薬品、
（３）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターおよびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む、上記（２）に記載の医薬品、
（４）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む、上記（２）に記載の医薬品、
（５）サル免疫不全ウイルスベクターがcPPT配列および／またはWPRE配列を含む、上記（２）から（４）のいずれかに記載の医薬品、
（６）サル免疫不全ウイルスベクターがVSV-Gでシュードタイプ化されている、上記（２）から（５）のいずれかに記載の医薬品、
（７）サル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、上記（２）から（６）のいずれかに記載の医薬品、
（８）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物、およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用キット、
（９）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用キット、
（１０）眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患が、網膜色素変性、緑内障、網膜剥離、網膜虚血性疾患のいずれかである、上記（１）から（７）のいずれかに記載の医薬品または上記（８）もしくは（９）に記載のキット、
（１１）PEDFおよびFGF2あるいはそれらをコードする遺伝子を投与する、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療方法、
（１２）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターおよびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを投与する、上記（１１）に記載の治療方法、
（１３）PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターおよびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを網膜下腔に投与する、上記（１２）に記載の治療方法、
（１４）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを投与する、上記（１１）に記載の治療方法、
（１５）PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを網膜下腔に投与する、上記（１４）に記載の治療方法、
（１６）配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法、
（１７）配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、上記（１６）に記載の方法、
（１８）配列番号：１に記載の塩基配列にFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法、
（１９）配列番号：３に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、上記（１８）に記載の方法、
（２０）配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法、
（２１）配列番号：４に記載の塩基配列を含むパッケージングベクターが導入されたパッケージング細胞に、該ジーントランスファーベクターを導入する工程を含む、上記（１６）から（２０）のいずれかに記載の方法。
本発明は、色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）による眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品に関する。本発明者らは、PEDFとFGF2のアポトーシス抑制作用の標的細胞が異なることに着目し、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患に対し、PEDFまたはFGF2の同時投与は、これらいずれかの単独投与よりも顕著に高い効果を得られることを示した。
本発明の医薬品に含まれるPEDFとFGF2は、タンパク質であってもよく、遺伝子であってもよい。ヒトPEDF（hPEDF）タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：５に、ヒトFGF2（hFGF2）タンパク質のアミノ酸配列を配列番号：６に示す。また、hPEDFのcDNA配列を配列番号：７に、hFGF2タンパク質のcDNA配列を配列番号：８に示す。
本発明の医薬品に含まれるPEDF遺伝子とFGF2遺伝子は、当業者に周知の方法で調製することができる。例えば、配列番号：７または配列番号：８に記載された塩基配列の一部または全部をプローブとしてヒト網膜色素上皮細胞のcDNAライブラリーから調製することができる。あるいは、配列番号：７または配列番号：８に記載された塩基配列の一部をプライマーとして、ヒト網膜色素上皮細胞のmRNAを鋳型として、公知の核酸増幅法を行って調製可能である。上記遺伝子から本発明の医薬品を調製する場合、DNAの状態でもよいが、好ましくはベクターに挿入した状態であることが望ましい。PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子は、別々のベクターに保持されてもよく、1つのベクターに同時に保持されていてもよい。ベクターの種類は、医薬品用途としてふさわしい安全なベクターである限り制限はないが、好ましくは、レンチウイルスベクター、最も好ましくは、サル免疫不全ウイルスベクターである。
ウイルスの生活環は大きく感染と増殖の段階に分けられる。一般にウイルスベクターは、ウイルスの感染システムを利用して、遺伝子を効率よく宿主の細胞内に導入出来ることが特徴である。多くのウイルスベクターは、安全性確保のため、増殖システムを排除して自己複製能を欠如させ、導入された細胞内での増殖を防止する措置がとられている。
ベクター粒子の構造を簡単に説明すると、ベクター粒子には、カプシドと呼ばれる蛋白質の外殻がある。カプシドはgag遺伝子産物の構造蛋白質から構成されている。そのカプシドの外側にエンペロープと呼ばれる膜構造がある。エンベロープは、感染する細胞の種類を決定する機能を有する。カプシドの中には、２コピーのベクターゲノムRNA、pol遺伝子産物である逆転写酵素が存在している。ウイルスベクターは宿主細胞に感染すると、ベクターゲノムRNAは自らの上記逆転写酵素により逆転写された後、宿主染色体に組み込まれてプロウイルスDNAとなり、感染を成立させる。
一般にウイルスベクターは、パッケージングベクターとジーントランスファーベクターによって調製することができる。パッケージングベクターは、パッケージングシグナルが除去されたウイルスDNAを搭載している。ウイルスDNAには、ウイルスタンパク質配列が含まれている。パッケージングベクターを宿主に導入すると、宿主細胞（パッケージング細胞）では、パッケージングシグナルがないために、空のウイルス粒子が作られる。一方のジーントランスファーベクターは、宿主染色体DNAに組み込まれるために必要なウイルス由来の遺伝子配列と、導入する外来遺伝子を搭載している。このジーントランスファーベクターをパッケージング細胞に導入すると、ジーントランスファーベクターから供給されるベクターゲノムDNAが宿主染色体に組み込まれた後、転写によってベクターゲノムRNAが作られる。このベクターゲノムRNAが、パッケージング細胞によって作られるウイルス粒子に取り込まれ、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子が生成される。
本発明において「ウイルスベクター」とは、自己複製能を欠如し、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子を指す。「組換え」ウイルスベクターとは、遺伝子組換え技術により構築されたウイルスベクターを言う。ウイルスゲノムをコードするDNAとパッケージング細胞を用いて構築したウイルスベクターは、組換えウイルスベクターに含まれる。
本発明において「サル免疫不全ウイルス（SIV）ベクター」とは、ウイルス粒子中の核酸分子のうち、ウイルスベクターとしての機能に必須な配列がSIVゲノムに基づく配列であるベクターを指す。本発明において「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」とは、5’側から順に、5’LTRのR領域、U5領域、パッケージングシグナル（φ）、RRE、3’LTRのプロモーター領域以外のU3領域、R領域の配列である。5’LTR領域からパッケージングシグナルまでの塩基配列を配列番号：９に、RRE配列を配列番号：１０に、3’LTRのプロモーター領域を欠如したU3領域からR領域までの塩基配列を配列番号：１１に示す。本発明のSIVベクターは、上述の定義に当てはまる限り、改変が施されていてもよく、例えば、「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」がSIV由来である限り、他にSIV由来の配列またはSIV以外の由来の配列を含んでいてもよい。好適に含まれ得る配列として、例えば、後述するcPPT （central polypurine tract)、内部プロモーター（CMV）、WPRE （woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)を挙げることができる。
本発明においてサル免疫不全ウイルス（simian immunodeficiency virus; SIV）には、SIVの全ての株およびサブタイプが含まれる。SIV単離株としては、SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm、SIVsyk等が例示できるがこれらに制限されない。
サル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus, SIV）はサルにおけるHIV類似ウイルスとして発見され、HIVとともにPrimates Lentivirusグループを形成している（井戸栄治, 速水正憲, サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染・病原性. 蛋白質 核酸 酵素: Vol..39, No.8. 1994）。このグループはさらに大きく４つのグループに分類され、1)ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（acquired immune deficiency syndrome, AIDS）の原因となるHIV-1とチンパンジーより分離されたSIVcpzを含むHIV-1グループ、2)スーティーマンガベイ Cercocebus atys より分離されたSIVsmmとアカゲザル Macaca mulatta より分離されたSIVmac、およびヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示すHIV-2（Jaffar, S. et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol., 16(5), 327-32, 1997）よりなるHIV-2グループ、3)アフリカミドリザル Cercopithecus aethiops から分離されたSIVagmに代表されるSIVagmグループ、4)マンドリル Papio sphinx から分離されたSIVmndに代表されるSIVmndグループからなっている。
このうち、SIVagmおよびSIVmndでは自然宿主における病原性の報告はなく（Ohta, Y. et al., Int. J. Cancer, 15, 41(1), 115-22, 1988; Miura, T. et al., J. Med. Primatol., 18(3-4), 255-9, 1989; 速水正憲, 日本臨床, 47, 1, 1989）、特に本実施例で用いたSIVagmの一種であるTYO-1株は自然宿主でも、カニクイザル Macaca facicularis 、アカゲザル Macaca mulatta に対する実験感染でも病原性を示さないことが報告されている（Ali, M. et al, Gene Therapy, 1(6), :367-84, 1994; Honjo, S. et al., J. Med. Primatol., 19(1), 9-20, 1990）。SIVagmのヒトに対する感染、発症については報告がなく、ヒトに対する病原性は知られていないが、一般に霊長類におけるレンチウイルスは種特異性が高く、自然宿主から他種に感染、発症した例は少なく、その発症も低頻度あるいは進行が遅いという傾向がある（Novembre, F. J. et al., J. Virol., 71(5), 4086-91, 1997）。従って、SIVagm、特にSIVagm TYO-1株をベースとして作製したウイルスベクターは、HIV-1や他のレンチウイルスをベースとしたベクターと比べて安全性が高いと考えられ、本発明において好適に用いられ得る。SIVagm TYO-1株のゲノム塩基配列を配列番号：１２に示す。
本発明のサル免疫不全ウイルスベクターは、他のレトロウイルスのゲノムRNA配列の一部を有していてもよい。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus；HIV）、ネコ免疫不全ウイルス（Feline Immunodeficiency Virus：FIV）（Poeschla, E. M. et al., Nature Medicine, 4(3), 354-7, 1998）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（Caprine Arthritis Encephalitis Virus：CAEV）（Mselli-Lakhal, L. et al., Arch. Virol., 143(4), 681-95, 1998）などの他のレンチウイルスのゲノム配列の一部をサル免疫不全ウイルスのゲノムの一部と置換したキメラ配列を有するベクターも、本発明のサル免疫不全ウイルスベクターに含まれる。
本発明の色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクター（SIV-PEDFベクター）とは、PEDF遺伝子を搭載している組換えSIVベクターを指す。また本発明のFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクター(SIV-FGF2ベクター)とは、FGF2遺伝子を搭載している組換えSIVベクターを指す。また本発明のPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターとは、PEDF遺伝子とFGF2遺伝子の両方を搭載している組換えSIVベクターを指す。本発明のSIV-PEDFベクターは、上述の定義に該当する限り、種類・構造を問わないが、好ましい例としては、配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができ、より好ましい例としては、配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができる。同様に、本発明のSIV−FGF2ベクターは、上述の定義に該当する限り、種類・構造を問わないが、好ましい例としては、配列番号：１に記載の塩基配列にFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができ、より好ましい例としては、配列番号：３に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができる。また同様に、本発明のPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターは、上述の定義に該当する限り、種類・構造を問わないが、好ましい例としては、配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができる。
SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターなどの本発明のPEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子を保持するSIVベクターは、VSV-Gシュードタイプ化されていてもよい。VSV-Gシュードタイプ化とは、ベクターのエンベロープに水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus; VSV）の表面糖蛋白質であるVSV-G蛋白質を含ませることを言う。VSV-G蛋白質は、任意のVSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981)）由来のVSV-G蛋白を用いることができるが、これに限定されない。また、VSV-G蛋白質は、天然由来の蛋白質から１または複数のアミノ酸の置換、欠失、および/または付加などにより改変されていてもよい。VSV-Gシュードタイプ化ベクターは、ウイルスの産生時にVSV-G蛋白質を共存させることにより製造することができる。例えば、VSV-G発現ベクターのトランスフェクションや、宿主染色体DNAに組み込んだVSV-G遺伝子からの発現誘導により、パッケージング細胞内でVSV-Gを発現させることにより、この細胞から産生されるウイルス粒子がVSV-Gでシュードタイプ化される。VSV-G蛋白質は１種類の糖蛋白が安定な３量体を形成して膜上に存在するため、精製過程でのベクター粒子の破壊が起こりにくく、遠心による高濃度の濃縮が可能となる（Yang, Y. et al., Hum Gene Ther: Sep, 6(9), 1203-13. 1995）。
SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターなどの本発明のPEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子を保持するSIVベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（MuLV）4070A株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばpCL-10A1(Imgenex)（Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701-5705 (1996)）。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのgB、gD、gH、gp85蛋白質、EBウイルスのgp350、gp220蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、B型肝炎ウイルスのS蛋白質などが挙げられる。
本発明の組換えサル免疫不全ウイルスベクターとしては、LTR（long terminal repeat）に改変を加えることもできる。LTRはレトロウイルスに特徴的な配列であり、ウイルスゲノムの両端に存在している。5' LTRはプロモーターとして働き、プロウイルスからのmRNAの転写を促す。したがって、ウイルス粒子内にパッケージングされるウイルスRNAゲノムをコードするジーントランスファーベクターの5' LTRのプロモーター活性をもつ部分を別の強力なプロモーターと置換すれば、ジーントランスファーベクターのmRNA転写量が増大し、パッケージング効率が上昇、ベクター力価を上昇させる可能性がある。さらに、例えばレンチウイルスの場合、5' LTRはウイルス蛋白質tatによる転写活性の増強を受けることが知られており、5' LTRをtat蛋白質に依存しないプロモーターに置換することで、パッケージングベクターからtatを削除することが可能となる。また、細胞に感染し細胞内に侵入したウイルスRNAは逆転写された後、両端のLTRを結合させた環状構造となり、結合部位とウイルスのインテグラーゼが共役して細胞の染色体内にインテグレートされる。プロウイルスから転写されるmRNAは5' LTR内の転写開始点より下流、3' LTRのpolyA配列までであり、5' LTRのプロモーター部分はウイルス内にパッケージングされない。したがって、プロモーターを置換したとしても標的細胞の染色体に挿入される部分には変化が無い。以上のことから、5' LTRのプロモーターの置換は、より高力価で安全性の高いベクターを作製することにつながると考えられる。従って、ジーントランスファーベクターの5' 側プロモーターの置換を行い、パッケージングされるベクターの力価を上昇させることができる。
また、3' LTRの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターmRNAが転写されることを防止する自己不活性化型ベクター（Self Inactivating Vector：SINベクター）の作製により、安全性を上昇させることも可能である。標的細胞の染色体に侵入したレンチウイルスのプロウイルスは、3' LTRのU3部分を5' 端に結合した形となる。したがってジーントランスファーベクターの転写産物は、逆転写後、標的細胞の染色体に組み込まれた状態では 5' 端にU3が配置され、そこからジーントランスファーベクターからの転写産物と同様の構造を持つRNAが転写されることになる。仮に、標的細胞内にレンチウイルスあるいはその類似の蛋白質が存在した場合、転写されたRNAが再びパッケージングされ、他の細胞に再感染する可能性がある。また3' LTRのプロモーターにより、ウイルスゲノムの3' 側に位置する宿主由来の遺伝子が発現されてしまう可能性がある（Rosenberg, N., Jolicoeur, P., Retoroviral Pathogenesis. Retroviruses. Cold Spling Harbor Laboratory Press, 475-585, 1997）。この現象はレトロウイルスベクターにおいてすでに問題とされ、回避の方法としてSINベクターが開発された(Yu, S. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 83(10), 3194-8, 1986)。ジーントランスファーベクター上の3' LTRのU3部分を欠失させることにより、標的細胞内では5' LTRや3' LTRのプロモーターが無くなるため、全長のRNAや宿主遺伝子の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行われることになり、安全性が高く、高発現のベクターとなることが期待される。このようなベクターは、本発明において好適である。SINベクターの構築は、公知の方法または本発明者らによる特許出願：国際公開番号WO2002/101057（特許文献1）の実施例１-４に記載の方法などに従えばよい。
レトロウイルスベクターなどそのゲノムにLTR配列を含むウイルスベクターを用いた遺伝子治療の問題点の一つに導入遺伝子の発現が次第に低下することがある。これらのベクターは宿主ゲノムに組み込まれると、宿主側の機序によりそのLTRがメチル化され、導入遺伝子の発現が抑制されてしまうことが原因の一つと考えられている（Challita, P. M. and Kohn, D. B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2567, 1994）。自己不活性化（SIN）型ベクターでは、宿主ゲノムに組み込まれるとLTR配列の大部分を失うため、LTRのメチル化による遺伝子発現の減弱を受けにくい利点がある。本発明者らによって、ジーントランスファーベクターの3'LTRのU3領域を他のプロモーター配列に置換して製造した自己不活性化型ベクターは、霊長類ES細胞に導入後、２ヵ月以上にわたって安定した発現を維持することが判明している（特許文献１）。このように、LTR U3領域の改変により自己不活性化するように設計されたSINベクターは、本発明において特に好適である。具体的には、3'LTRのU3領域の1または複数の塩基が置換、欠失、および/または付加により改変されたベクターは、本発明に含まれる。このU3領域は、単に欠失させてもよいし、あるいはこの領域に他のプロモーターを挿入してもよい。このようなプロモーターとしては、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、またはCAGプロモーターなどを挙げることができる。
また、本発明のベクターにコードされるPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子は、LTR以外のプロモーターにより転写されるように設計することが好ましい。例えば、上記のようにLTR U3領域を非LTRプロモーターと置換した場合には、この改変LTRによりPEDF遺伝子またはFGF2遺伝子の発現を駆動することが好ましい。あるいは、実施例において示されるように、LTR領域とは別の位置に非LTRプロモーターを配置し、その下流にPEDF遺伝子またはFGF2遺伝子を連結することにより、LTRに依存せずにPEDF遺伝子またはFGF2遺伝子の発現を誘導することができる。本発明者らによって、外来遺伝子の発現を非LTRプロモーターにより駆動するように構築されたSIVベクターは、ES細胞においてこの外来遺伝子を長期間安定に発現することが示された（特許文献１）。同様に、PEDF遺伝子またはFGF2遺伝子の上流に非LTRプロモーターが連結されており、このプロモーターからPEDF遺伝子またはFGF2遺伝子が転写されるようなベクターは本発明において特に適しているということができる。非LTRプロモーターとしては、例えばCMVプロモーター、EF1プロモーター、またはCAGプロモーターが挙げられ、特にCMVプロモーターが好適である。本実施例で使用したCMVプロモーターの塩基配列を配列番号：１３に示す。このようなベクターは、特に上記の自己不活性化（SIN）型ベクターにおいて構築することで高い効果を発揮する。
HIVベクターをはじめとするレンチウイルスベクターは、宿主ゲノムがHIVプロウイルスをすでに保持している場合、外来ベクターと内因性プロウイルスの間で組換えが生じ、複製可能ウイルスが発生しないかという危惧が指摘されている。これは、将来実際にHIV感染患者にHIVベクターを用いる時には確かに大きな問題になろう。今回使用したSIVベクターは、HIVとの相同配列はほとんどない上、ウイルス由来の配列を80％以上取り除いた複製不能ウイルスであり、この危険性は極めて小さく、他のレンチウイルスベクターに比べて安全性が高い。本発明のSIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターは、上述の「ウイルスベクターとしての機能に必須な配列」以外のSIVゲノム配列が一定以上除去されたベクターであり、好ましくは、このベクターが由来するSIVのゲノム配列の40％以上、より好ましくは50％以上、さらに好ましくは60％以上、さらに好ましくは70％以上、最も好ましくは80％以上が取り除かれた複製不能ウイルスである。
レトロウイルスの産生には、宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターDNAを転写させ、gag, pol蛋白質およびエンベロープ蛋白質の存在下でウイルス粒子を形成させる。パッケージング細胞内のgag, pol蛋白質はパッケージングベクターを用いて供給することができる。エンベロープ蛋白質は、パッケージングベクターによって供給されてもよいが、別のベクターによって供給されてもよい。例えば実施例のように、VSV-G発現ベクターによって供給されてもよい。
本発明のジーントランスファーベクターは、最も基本的には、5’LTR、パッケージングシグナル配列、PEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子、ならびに3’LTR配列を有する。LTR配列は、SIVベクターの改変として上述したLTRの改変が施されていてもよい。また、上述のcPPT配列、CMV配列、RRE配列等が組み込まれていてもよい。ジーントランスファーベクターDNAにコードされるパッケージングシグナル配列は、この配列により形成される構造を保持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい一方で、該ベクターDNA上のパッケージングシグナルと、gag,pol蛋白質を供給するパッケージングベクターとの間で起こる組換えによる野生型ウイルスの出現頻度を抑制するためにはこれらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。従って、ジーントランスファーベクターDNAの構築においては、パッケージング効率および安全性の両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。
例えば、パッケージングベクターをSIVagm由来のものにした場合は、HIV由来のジーントランスファーベクターはパッケージングされないため、ジーントランスファーベクターDNAに用いられるパッケージングシグナルの由来としてはSIVのみに制限されると考えられる。但し、HIV由来のパッケージングベクターを用いた場合、SIV由来のジーントランスファーベクターもパッケージングされるので、組換えウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成させることが可能であると考えられる。このようにして製造されたSIVベクターも、本発明のベクターに含まれる。この場合、霊長類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、HIVとSIV）であることが好ましい。
ジーントランスファーベクターDNAでは、gag蛋白質が発現しないように改変されていることが好ましい。ウイルスgag蛋白質は、生体にとって異物として認識され、抗原性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。gag蛋白質を発現しないようにするためには、gagの開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレームシフトするように改変することができる。また、gag蛋白質のコード領域の一部を欠失させることが好ましい。一般にウイルスのパッケージングには、gag蛋白質のコード領域の5'側が必要であるとされている。従って、ジーントランスファーベクターにおいては、gag蛋白質のC末側のコード領域を欠失していることが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与えない範囲でできるだけ広いgagコード領域を欠失させることが好ましい。また、gag蛋白質の開始コドン（ATG）をATG以外のコドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パッケージング効率に対する影響が少ないものを適宜選択する。これにより構築されたパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターDNAを、適当なパッケージング細胞に導入することにより、ウイルスベクターを生産させることができる。生産させたウイルスベクターは、例えばパッケージング細胞の培養上清から回収することができる。
さらにジーントランスファーベクターDNAでは、PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子の導入効率および発現効率を高める改変がなされていることが好ましい。導入効率を上昇させる改変の例として、cPPT配列の導入を挙げることができる。cPPTは、もともとSIVゲノムに存在する配列である。HIVウイルスにおいてはかなり以前から報告があり（P.Charneau et al. : J.Virol 65: 2415-2431, 1991）、HIVベクターにおいてはcPPTを導入するとベクターゲノムの核への移行が良くなり、遺伝子導入効率が上昇することが報告されている(A.Sirven et al. : Blood 96:4103-4110, 2000)。本実施例で使用したcPPTの塩基配列を配列番号：１４に示す。また発現効率を高める改変の例としては、WPRE配列の導入を挙げることができる。WPREは遺伝子発現効率を高める機能を有する因子である（US Patent 6284469 : RNA export element and methods of use）。他のレンチウイルスベクターではcPPTとWPREの２つの因子の同時導入は個々の効果を更に高める結果が報告されている(SC.Barry et al. : Hum. Gene Ther. 12: 1103-1108, 2001)。本実施例で使用したWPREの塩基配列を配列番号：１５に示す。SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターなどの本発明のPEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子を保持するSIVベクターにおいて、cPPTは、一般的なレンチウイルスベクターにおける配置と同様の配置をとることができる。例えば、cPPTをプロモーターと外部遺伝子との間に配置してもよく、またはRRE配列の上流に配置することもできるが、好ましくは、PEDFまたはFGF2の転写を駆動する上述の非LTRプロモーターの上流に配置する。WPREは、PEDFまたはFGF2遺伝子の下流に配置することができる。このようなジーントランスファーベクターの好ましい具体例として、配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクター、配列番号：１に記載の塩基配列にFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクター、ならびに配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができ、より好ましい例としては、配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクター、配列番号：３に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いて製造されるSIVベクターを挙げることができる。
本発明において、パッケージングベクターは、PEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子の導入に必要でない配列を取り除いたものを用いることができる。必要でない配列として、修飾遺伝子と呼ばれるvif,vprと制御遺伝子のtat,revを例示することができる。修飾遺伝子産物はベクターにおいて必要でないことが報告されており(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが使用されている。また、tatも削除され、revは別のプラスミドに移すことにより更に安全性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されている。パッケージングベクターからrevを除いた場合は、別に、rev発現ベクターを構築し、該rev発現ベクターをSIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターなどの本発明のPEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子を保持するSIVベクターの製造において使用することができる。SIVagm TYO-1株のrevの塩基配列を配列番号：１６に示す。上記のようにして構築されたパッケージングベクターは、例えば、プロモーター配列、ウイルスコアタンパク質配列（gag）、逆転写酵素配列（pol）、polyA配列を含む構成とすることができ、実施例に示すように上記構成にさらにRRE配列が含まれていてもよい。またrev発現ベクターは、rev配列の上流に該配列を制御するためのプロモーター、rev配列の下流にpolyA配列を配置した構成とすることができる。
パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的にウイルスの産生に使用される細胞株であれば制限はない。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株としては、例えば293細胞、293T細胞、293EBNA細胞、SW480細胞、u87MG細胞、HOS細胞、C8166細胞、MT-4細胞、Molt-4細胞、HeLa細胞、HT1080細胞、TE671細胞などが挙げられる。サル由来細胞株としては、例えば、COS1細胞、COS7細胞、CV-1細胞、BMT10細胞などが挙げられる。
SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターなどの本発明のPEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子を保持するSIVベクターは、実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方法はフィルター濾過、遠心分離、およびカラム精製等を含む公知の精製・分離方法により行うことができる。例えば、ベクター溶液を0.45μmのフィルターにて濾過後、42500×g、90分、４℃で遠心を行うことで、ベクターを沈殿・濃縮することができる。
また上述のとおり本発明の医薬品はPEDFタンパク質とFGF2タンパク質を用いて調製してもよく、PEDFタンパク質とFGF2タンパク質は、これらのcDNAを当業者に周知の方法で調製し、該cDNAを適当な発現ベクターに挿入して宿主細胞に導入して発現させることができる。これらのcDNAは、別々の発現ベクターに保持されてもよく、1つの発現ベクターに同時に保持されていてもよい。cDNAの調製は、上述したとおりである。発現ベクターは、宿主細胞に合わせて適宜選択することができる。
本発明の医薬品は、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療および予防へ使用することができる。例えば、網膜色素変性、緑内障、網膜剥離、網膜虚血性疾患の治療および予防に用いることができ、特に、網膜色素変性の治療および予防には好適に用いることができる。上述したSIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターなどのPEDF遺伝子および／またはFGF2遺伝子を保持するSIVベクターは、必要に応じて薬学的に許容される所望の担体または媒体と適宜組み合わせて上記疾患用の医薬品とすることができる。「薬学的に許容される担体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺伝子導入を有意に阻害しない材料である。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）などと適宜組み合わせることが考えられる。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明の医薬品の形態は、PEDFタンパク質およびFGF2タンパク質または、SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターを同一の媒体に存在させて組成物とし、一つの医薬品とすることができる。SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターを一つの組成物とする場合は、それぞれのベクターについて下記に示す投与量を確保できる範囲で配合することができる。または、SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターを別々の組成物として調製し、両組成物を含む治療用キットとしてもよい。PEDFおよびFGF2の遺伝子、タンパク質も同様のキットとすることができる。PEDFタンパク質およびFGF2タンパク質を本発明の医薬品とする場合における、担体および形態は、ベクターの場合と同様である。
本発明のSIV-PEDFおよびSIV-FGF2を含む医薬品を投与する場合は、網膜アポトーシス変性抑制効果を得られる限り、特に投与経路を問わないが、好ましくは、網膜下腔投与、硝子体内投与、前房内投与であり、より好ましくは網膜下腔投与である。本発明のSIV-PEDFおよびSIV-FGF2を含む医薬品の投与量（ヒト１眼球あたり）は、例えば、2.5×105TU-2.5×108TU、好ましくは、5.0×105TU-5.0×107 TUを目安とすることができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］VSV-GシュードタイプSIVベクターの構築
ベクターの構築には図１に示す４種のプラスミド（ジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、VSV-G発現ベクター）を用いた。３種のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクターについては、従来型のベクタープラスミド（PCT/JP00/03955）を改良して作製した。VSV-G発現ベクターについては従来のものをそのまま用いた。
ベクターの構築には図１に示す４種のプラスミド（ジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、VSV-G発現ベクター）を用いた。３種のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクターについては、従来型のベクタープラスミド（PCT/JP00/03955）を改良して作製した。VSV-G発現ベクターについては従来のものをそのまま用いた。
プラスミド作製にあたっては、市販の各種キットを使用した。制限酵素はNew England Biolabs社製品を使用し、プラスミドDNAの抽出,精製,回収にはキアゲンのキット（QIAquick PCR purification kit, QIAquick Nucleotide Removal kit, QIAquick Gel extraction kit, Plasmid Maxi kit）を使用した。PCRにはTaKaRaのEX Taq酵素を用い、使用するプライマーは外部のメーカー（シグマジェノシス・ジャパン）に合成を依頼した。DNA末端の脱リン酸化はTaKaRaのAlkalline Phosphatase (E.coli C75)を使用した。ライゲーションにはTaKaRaのDNA Ligation kit ver.2を用い、トランスフォーメーションにはTOYOBOのDH5α COMPETENT highを利用した。
１−１．ジーントランスファーベクターの改良
従来型ジーントランスファーベクターに、cPTT(central polypurine tract)およびWPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)の導入を行い、ジーントランスファーベクターの性能改良を図った（図２Ａ、Ｂ）。使用した従来型のジーントランスファーベクターは、非病原性のアフリカミドリザル免疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmを基本とし、5’LTR領域、RRE、CMV（cytomegalovirus）プロモーター、EGFP（enhanced green fluorescent protein）遺伝子、3’LTRを順に有するベクターである。該従来型ジーントランスファーベクターは、本発明者らによって構築されたものであり、構築方法等については、既に報告済みである（特許文献２）。該従来型ジーントランスファーベクターの塩基配列を、配列番号：１７に示す。
従来型ジーントランスファーベクターに、cPTT(central polypurine tract)およびWPRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)の導入を行い、ジーントランスファーベクターの性能改良を図った（図２Ａ、Ｂ）。使用した従来型のジーントランスファーベクターは、非病原性のアフリカミドリザル免疫不全ウイルスのクローンであるSIVagmを基本とし、5’LTR領域、RRE、CMV（cytomegalovirus）プロモーター、EGFP（enhanced green fluorescent protein）遺伝子、3’LTRを順に有するベクターである。該従来型ジーントランスファーベクターは、本発明者らによって構築されたものであり、構築方法等については、既に報告済みである（特許文献２）。該従来型ジーントランスファーベクターの塩基配列を、配列番号：１７に示す。
具体的なベクターの改良方法は以下のとおりである。まず、従来型のジーントランスファーベクターを制限酵素Sac IIで切断し、サンプルを泳動してCMVプロモーターとEGFP遺伝子を取り除き、セルフライゲーションを行った。次に、プラスミドのNot I部位をなくすために、上記ベクターをNot Iで切断し、切断末端をT4 DNAポリメラーゼで平滑化し、セルフライゲーションを行った。
続いて、上記ベクターを制限酵素Sac IIで切断し、BAP処理を用い、切断末端を脱リン酸化した。従来型のジーントランスファーベクターをテンプレートにし、プライマー１F（配列番号：１８）と１R（配列番号：１９）でPCRを行い、PCR産物をSac IIで切断し、CMVプロモーター（配列番号：１３）の末端にSac II部位を付加した断片を作成した。該CMVプロモーター断片を、BAP処理した上記ベクターのSac II部位に組み込んだ。
ベクターをNot I、BamH Iで順番に切断し、その切断部位に2種の合成オリゴDNA２F（配列番号：２０）と２R（配列番号：２１）をアニールして作成したアダプターをライゲーションし、制限酵素部位を改変した。ベクターを制限酵素Sac IIで切断し、BAP処理を用い、切断末端を脱リン酸化した。
導入用のcPTT断片（配列番号：１４）を得るために、SIVagmTYO1ゲノム（配列番号：１２）を組み込んだプラスミドｐSA212をテンプレートとし、プライマー３F（配列番号：２２）と３R（配列番号：２３）でPCRを行った。該PCR増幅断片の末端をSAC IIで切断し、cPPTの両端にSAC II部位を付加した断片を作成した。cPPT断片を、BAP処理した上記ベクターのSac II部位にライゲーションした。
ベクターをBamH Iで切断し、BAP処理を用い、切断末端を脱リン酸化した。導入するWPRE断片を得るために、WPRE cDNA（配列番号：１５）の入ったプラスミドをテンプレートとし、プライマー４F（配列番号：２４）と４R（配列番号：２５）でPCRを行った。得られたPCR増幅産物の末端をBamH IとBgl IIで切断し、WPREの末端に制限酵素部位を付加した断片を作成した。ベクターのBamH I部位に上記WPRE断片をライゲーションし、搭載遺伝子のない改良型ジーントランスファーベクター（配列番号：１）を完成させた。
搭載遺伝子断片を作成し、上記の改良型ジーントランスファーベクターNot I部位に組み込んだ。EGFP断片は、EGFP cDNA（配列番号：２６）の入ったプラスミドをテンプレートとし、プライマー５F（配列番号：２７）と５R（配列番号：２８）でPCRを行い、Not Iで切断し作成した。FGF2断片は、hFGF2 cDNA（配列番号：８）の入ったプラスミドをテンプレートとし、プライマー６F（配列番号：２９）と６R（配列番号：３０）でPCRを行い、Not Iで切断し作成した。PEDF断片はhPEDF cDNA （配列番号：７）の入ったプラスミドをテンプレートとし、プライマー７F（配列番号：３１）と７R（配列番号：３２）でPCRを行い、pGEM-T Easy vector（プロメガ社）へTAクローニングし、Not Iで切り出し作成した。
また、cPPT,WPREを組み込んだプラスミドの構築と同時に、cPPT,WPREの効果を確認するために、cPPTのみ、またはWPREのみを組み込んだジーントランスファーベクターもそれぞれ作成した。
１−２．パッケージングベクターの改良
従来型パッケージングベクターにはgag,polの他に、修飾遺伝子と呼ばれるvif,vprと制御遺伝子のtat,revが含まれている。しかし、修飾遺伝子産物はベクターにおいて必要でないことが分かり(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが使用されている。また、tatも削除され、revは別のプラスミドに移すことにより更に安全性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されており、現在ではベクターの第三世代化は必須となっている。そこで本発明においても、従来型パッケージングベクター（配列番号：３３）から補助遺伝子（vif,vpr,tat）を取り除き、revを別のプラスミドに移し、安全性を高めることとした（図３）。方法は、基本的には、HIVベクターで以前に報告されている(T.Dull.et al.: J.Virol 72:8463-8471, 1998)。
従来型パッケージングベクターにはgag,polの他に、修飾遺伝子と呼ばれるvif,vprと制御遺伝子のtat,revが含まれている。しかし、修飾遺伝子産物はベクターにおいて必要でないことが分かり(V.Kim et al.: J.Virol 72:811-816, 1998)、近年は、安全性を高めるため、修飾遺伝子が削除されたベクターが使用されている。また、tatも削除され、revは別のプラスミドに移すことにより更に安全性が高められた、第三世代と呼ばれるベクターが開発されており、現在ではベクターの第三世代化は必須となっている。そこで本発明においても、従来型パッケージングベクター（配列番号：３３）から補助遺伝子（vif,vpr,tat）を取り除き、revを別のプラスミドに移し、安全性を高めることとした（図３）。方法は、基本的には、HIVベクターで以前に報告されている(T.Dull.et al.: J.Virol 72:8463-8471, 1998)。
具体的には、まず、パッケージングベクターのプラスミドを制限酵素Not Iで切断し、続いてEcot22Iで切断した。サンプルを泳動し、EcoT22I-Not I断片を除去し、サイズの大きいベクター断片とpol遺伝子の一部のEcoT22I-EcoT22I断片を回収した。
２種類の合成オリゴDNA1F（配列番号：３４）と1R（配列番号：３５）をアニールさせて作製したアダプターを、上記ベクターのEcoT22I-Not I部位にライゲーションした。続いて、ベクターをEcoT22Iで切断し、BAP処理を行い、切断末端を脱リン酸化し、BAP処理したEcoT22I部位に、回収して置いたpol遺伝子のEcoT22I断片を組み込んだ。
上記ベクターをNot Iで切断し、BAP処理を行い、切断末端を脱リン酸化した。RRE断片を得るために、従来型のパッケージングベクター（配列番号：３３）をテンプレートにし、プライマー８F（配列番号：３６）と８R（配列番号：３７）でPCRを行い、pGEM-T Easy vector（プロメガ社）へTAクローニングした。Not IでRRE断片を切り出した。脱リン酸化したベクターのNot I部位へRRE断片をライゲーションし、改良型パッケージングベクター（配列番号：４）を完成させた。
１−３．rev発現ベクターの構築
rev蛋白はこれまで従来型のパッケージングベクターより供給されていたが、パッケージングベクターの上記改良に伴い、rev蛋白を別の発現プラスミドの形で供給することとし、新たに発現ベクターを構築した。revはゲノム上ではイントロンで２つに分かれているが、一つに結合して発現プラスミドに組み込むこととした（図４Ａ、Ｂ）。
rev蛋白はこれまで従来型のパッケージングベクターより供給されていたが、パッケージングベクターの上記改良に伴い、rev蛋白を別の発現プラスミドの形で供給することとし、新たに発現ベクターを構築した。revはゲノム上ではイントロンで２つに分かれているが、一つに結合して発現プラスミドに組み込むこととした（図４Ａ、Ｂ）。
まず、従来のパッケージングベクターをテンプレートとし、２つの断片をPCRにより作製した。5’側の断片はプライマー１F（配列番号：３８）と１R（配列番号：３９）を使い、3’側の断片はプライマー２F（配列番号：４０）と２R（配列番号：４１）を使用して増幅した。２種のPCR断片を回収し、混合してPCRのテンプレートとし、プライマー１Fと２Rを用いて増幅し、２つの断片をつなげた目的のrev遺伝子断片（配列番号：１６）を得た。PCRで増幅したrev断片を、pGEM-T Easy vectorへTAクローニングした。続いて、該ベクターをEcoR Iで切断し、EcoR I部位が付加されたrev断片を回収した。一方、蛋白発現用のpCIベクター（プロメガ社）をEcoR Iで切断し、切断部位をBAP処理した。回収したrev断片とpCI発現ベクターをライゲーションし、rev発現ベクターとした。
［実施例２］cPPT,WPREを搭載したSIVベクターの機能評価
cPPT,WPREの導入の効果を調べるために、cPPT,WPRE同時搭載の他に、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載のベクターを生産し、従来型のコントロールと比較した。全てのジーントランスファーベクターはEGFPを搭載しているものを用いた。パッケージングベクターは従来型（配列番号：３３）を使用した。
cPPT,WPREの導入の効果を調べるために、cPPT,WPRE同時搭載の他に、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載のベクターを生産し、従来型のコントロールと比較した。全てのジーントランスファーベクターはEGFPを搭載しているものを用いた。パッケージングベクターは従来型（配列番号：３３）を使用した。
２−１．SIVベクターの調製
ヒト胎児腎細胞由来細胞株293T細胞を15cmプラスチックシャーレ１枚あたり約1×107（翌日70-80％密度）になるように播種し、10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地（Gibco BRL）20mlで24時間培養した。24時間培養後、培地を10mlのOPTI-MEM培地（Gibco BRL）に置換して、細胞をトランスフェクトに用いた。
ヒト胎児腎細胞由来細胞株293T細胞を15cmプラスチックシャーレ１枚あたり約1×107（翌日70-80％密度）になるように播種し、10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地（Gibco BRL）20mlで24時間培養した。24時間培養後、培地を10mlのOPTI-MEM培地（Gibco BRL）に置換して、細胞をトランスフェクトに用いた。
シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター６μg、パッケージングベクター３μg、VSV-G発現ベクター１μgを1.5mlのOPTI-MEM培地に溶解後、40μlのPLUS Reagent（インビトロジェン社）を加えて撹拌し、15分間室温で静置した。ジーントランスファーベクターは、cPPT,WPRE同時搭載、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載、または従来型（cPPT,WPREいずれも搭載していない）のものを使用した。これに1.5mlのOPTI-MEM培地で希釈した60μlのLIPOFECTAMINE Reagent（インビトロジェン社）を加え撹拌し、15分間室温で静置した。
上記DNA複合体を15cmシャーレの細胞に滴下し、穏やかに振とうさせて混ぜ、37℃,５%CO2インキュベーターで３時間インキュベートした。インキュベート後、シャーレに13mlの20％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地を加えて培養した。トランスフェクトの翌日に、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地30ｍｌと交換し培養した。トランスフェクトの２日後に、上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過し、ベクター液とした。
２−２．SIVベクターの力価測定
SIVベクターの力価には、搭載遺伝子蛋白の発現細胞数から算出する機能力価（Functional titer : TU/ml）とベクター粒子数から算出する値（Particle titer : particles/ml）がある。cPPT,WPREの性能評価はPartilce titerをそろえて細胞に感染させて評価するため、以下のようにドットブロッティングによる方法でParticle titerを測定した。
SIVベクターの力価には、搭載遺伝子蛋白の発現細胞数から算出する機能力価（Functional titer : TU/ml）とベクター粒子数から算出する値（Particle titer : particles/ml）がある。cPPT,WPREの性能評価はPartilce titerをそろえて細胞に感染させて評価するため、以下のようにドットブロッティングによる方法でParticle titerを測定した。
まず、上記のとおり生産したベクター液から、市販のキット（キアゲン社のQIAamp Viral RNA mini kit）を用いてRNA抽出を行った。次に、スロットブロッターを用いてHybondN+メンブレン（アマシャム社）にRNAをブロッティングした。同時に検量線用のモル数を計算したプラスミドDNAもブロッティングした。なお、RNAの処理方法はメンブレン付属のプロトコールに従った。DNAは加熱急冷した。メンブレンをアルカリ固定した後、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズに関してはロシュのDIGラベルでの検出システムを使用した。プローブはDIGラベルNTPを用いて作製し、ハイブリダイゼーション以降の操作はDIG Easy Hyb, DIG Wash and Block Buffer Set（ロシュ）を使用した。anti-DIG AP conjugate antibody（ロシュ）およびCSPD（ロシュ）を用い、化学発光させ、ルミノイメージアナライザー(富士写真フイルム：LAS-1000)を用いて、シグナルを検出・定量した。
２−３．SIVベクターの細胞への遺伝子導入、評価
Particle titerを測定した４種類のベクターは、以下のようにMOI(multiplicity of infection)を変えて細胞に感染させ、FACS解析を行った。293T細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートに１ウェルあたり1×106個で播き、37℃、５％CO2で一晩培養した。翌日、プレート１ウェルの細胞数を血球計数板で計算し、プレートの培地を除き、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地２mlで希釈したベクターをMOI(Particles/cell)が0.3、1.5、7.5、15になるように加えた。感染１日後、細胞の培地を２ｍｌの新しいものと交換した。感染２日後、ベクターにより遺伝子導入されたEGFPを蛍光顕微鏡で観察し、EGFP陽性細胞の割合を測定し、更に蛍光強度（EGFP蛋白量の目安となる値）も測定した。
Particle titerを測定した４種類のベクターは、以下のようにMOI(multiplicity of infection)を変えて細胞に感染させ、FACS解析を行った。293T細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートに１ウェルあたり1×106個で播き、37℃、５％CO2で一晩培養した。翌日、プレート１ウェルの細胞数を血球計数板で計算し、プレートの培地を除き、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地２mlで希釈したベクターをMOI(Particles/cell)が0.3、1.5、7.5、15になるように加えた。感染１日後、細胞の培地を２ｍｌの新しいものと交換した。感染２日後、ベクターにより遺伝子導入されたEGFPを蛍光顕微鏡で観察し、EGFP陽性細胞の割合を測定し、更に蛍光強度（EGFP蛋白量の目安となる値）も測定した。
２−４．ベクター機能評価の結果
従来型のジーントランスファーベクターをコントロールとして、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載、cPPT, WPRE同時搭載の４種類のベクターを生産した。ベクターデザインの模式図を図５-(a)に示す。
従来型のジーントランスファーベクターをコントロールとして、cPPT単独搭載、WPRE単独搭載、cPPT, WPRE同時搭載の４種類のベクターを生産した。ベクターデザインの模式図を図５-(a)に示す。
生産したベクターのParticle titerを測定したところ、４種ともベクター粒子の生産性には違いが見られなかった。ベクター粒子数でMOI（1個の細胞に感染させたベクター粒子数）を統一して293T細胞に遺伝子導入し、蛍光顕微鏡で観察したところ、MOI:15では図５-(b)に示すように、cPPTとWPREのない従来型のコントロール（-cPPT,-WPRE)ではEGFP陽性細胞の数が少なく蛍光も弱かった。cPPT単独搭載（+cPPT,-WPRE)ではEGFP陽性細胞の数が増加した。WPRE単独搭載（-cPPT,+WPRE)ではEGFP陽性細胞の数はコントロールに比べわずかな増加しか認められなかったものの、EGFP蛋白の蛍光は増強された。cPPT,WPRE同時搭載（+cPPT,+WPRE)では２つの因子が相乗的に効果を発揮し、細胞数，蛍光強度の両方ともcPPT,WPRE単独搭載のものより大幅に増加し、期待以上の結果となった。
EGFP陽性細胞の割合をFACSで調べたところ（図６）、いずれもMOI依存的に遺伝子挿入割合が増加したが、cPPT, WPRE同時搭載のものはコントロールに比べて約10倍も導入効率が上昇した。つまり実質的な機能力価（生産性）が10倍上昇した。
また、EGFP陽性細胞の平均蛍光強度を調べたところ（図７）、cPPT,WPRE同時搭載のものはWPRE単独搭載のものよりかなり高くなっており、細胞当たりの蛋白発現量も大幅に増大している事が明らかとなった。
[実施例３]治療用遺伝子搭載SIVベクターの大量調製および濃縮
図１に示す改良型のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、およびVSV-G発現ベクターの４種類のプラスミドをもとに以下のようにSIVベクターを調製した。PEDFおよびFGF2の治療遺伝子を搭載したベクターは、それぞれ15cmシャーレ20枚単位で生産を行った。
図１に示す改良型のジーントランスファーベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクター、およびVSV-G発現ベクターの４種類のプラスミドをもとに以下のようにSIVベクターを調製した。PEDFおよびFGF2の治療遺伝子を搭載したベクターは、それぞれ15cmシャーレ20枚単位で生産を行った。
293T細胞を15cmプラスチックシャーレ１枚あたり約1×107（翌日70-80％密度）になるように播き、10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地20mlで24時間培養した。24時間培養後、培地を10mlのOPTI-MEM培地に置換してトランスフェクトに用いた。シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター１０μg、パッケージングベクター５μg、rev発現ベクター２μg、VSV-G発現ベクター２μgを1.5mlのOPTI-MEM培地に溶解後、40μlのPLUS Reagent（インビトロジェン社）を加えて撹拌し、15分間室温で静置した。これに1.5mlのOPTI-MEM培地で希釈した60μlのLIPOFECTAMINE Reagentを加え撹拌し、15分間室温で静置した。このDNA複合体を、上記の15cmシャーレの細胞に滴下し、穏やかに振とうさせて混ぜ、37℃,５%CO2インキュベーターで３時間インキュベートした。上記シャーレに13mlの20％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地を加えて培養した。
トランスフェクトの翌日に、新しい10％ウシ胎児血清を含むD-MEM培地30ｍｌと交換し培養した。トランスフェクトの２日後に、上清を回収し、新しい培地を20ml加えた。回収した上清は0.45μmのフィルターで濾過し、４℃で保存した。トランスフェクトの３日後に上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過し、前日の回収ベクターと合わせ、高速遠心機を利用して濃縮操作を行った。回収したベクター液を滅菌処理したチューブに分注し、42500G,4℃,1時間遠心した。この遠心操作を2回繰り返し、ベクター液を500倍−1000倍に濃縮した。ベクターはペレットとして沈殿するが、ペレットは5％ウシ胎児血清を含むPBSに溶解した。濃縮したベクターは少量ずつ分注したのち-80℃で保存し、一部を用いてParticle titerを測定した。Particle titerの測定は前述の方法と同様に行った。
［実施例４］SIV-hPEDF, SIV-hFGF2同時投与における視細胞変性抑制効果の検討
網膜色素変性は難治性遺伝性疾患で、現在有効な治療法が存在しない。本発明者らはSIVベクターの小動物における網膜への導入特性・長期安全性試験、さらに疾患モデル動物（RCSラット）を対象としたSIV-PEDF投与による効果判定試験（Gene therapy 10, 1503-1511, 2003）を行い良好な結果を得ている。神経栄養因子PEDF, FGF2は、標的細胞が異なると考えられている。これら２種類の神経栄養因子の同時投与の神経保護効果について、検討した。
網膜色素変性は難治性遺伝性疾患で、現在有効な治療法が存在しない。本発明者らはSIVベクターの小動物における網膜への導入特性・長期安全性試験、さらに疾患モデル動物（RCSラット）を対象としたSIV-PEDF投与による効果判定試験（Gene therapy 10, 1503-1511, 2003）を行い良好な結果を得ている。神経栄養因子PEDF, FGF2は、標的細胞が異なると考えられている。これら２種類の神経栄養因子の同時投与の神経保護効果について、検討した。
SIV-hFGF2およびSIV-hPEDFは、上述のとおり構築したものを用いた。
SIV-hPEDF、SIV-hFGF2、SIV-EGFP（コントロール）の各ベクター溶液を、ベクター濃度：total 2.5×107TU/mlとして作製した。RCS ラット 3週齢を、SIV-hPEDF単独投与群、SIV-hFGF2単独投与群、SIV-hPEDFおよびSIV-hFGF2同時投与群、SIV-EGFP投与群の４群に分け、網膜下腔に投与した。上記ベクターの網膜下投与により、PEDFおよびFGF2遺伝子は網膜色素上皮細胞に導入され、そこから神経保護因子が分泌されて神経細胞に作用する。
SIV-hPEDF、SIV-hFGF2、SIV-EGFP（コントロール）の各ベクター溶液を、ベクター濃度：total 2.5×107TU/mlとして作製した。RCS ラット 3週齢を、SIV-hPEDF単独投与群、SIV-hFGF2単独投与群、SIV-hPEDFおよびSIV-hFGF2同時投与群、SIV-EGFP投与群の４群に分け、網膜下腔に投与した。上記ベクターの網膜下投与により、PEDFおよびFGF2遺伝子は網膜色素上皮細胞に導入され、そこから神経保護因子が分泌されて神経細胞に作用する。
ベクター導入4週間後、各動物群を観察し、ベクター投与の影響を検討した。PEDFおよびFGF2が作用する視細胞、内顆粒層等の神経細胞の層および網膜色素上皮細胞は網膜内に存在する。しかし、網膜のみを採取するのは困難である。そこで、ラット後眼部を採取した。後眼部には、網膜・脈絡膜・強膜の３つの層が含まれる。採取した後眼部のhPEDF, hFGF2蛋白量を、各々ELISA法により測定した。ベクター導入4週間後の眼球後眼部において、hPEDFの発現はSIV-hPEDF投与群で高い傾向となることが示された。また、hFGF2の発現はSIV-hFGF2単独投与群および同時投与群で高い傾向を示し、SIV-hPEDF、SIV-hFGF2ベクター投与によるhPEDFおよびhFGF2遺伝子発現が確認された（図８）。
次に、ベクター導入4週間後、8週間後および12週間後において、最大割面標本を作製し、網膜10ヶ所（A1-A10）における100μm当りの視細胞核数を計測した。SIV-hPEDF、SIV-hFGF2各単独群、及び同時投与群では、ベクター注入部位に近い3箇所（A1-A3）の網膜組織において、有意に視細胞が残存しており、同時投与群では、単独群より高い神経保護効果が認められた（図９）。また、ベクター導入8週間後および12週間後においても、SIV-hPEDFおよびSIV-hFGF2の同時投与による顕著な神経保護効果が認められた（図１０および図１１）。
さらに、機能的評価として電気生理学的検討（網膜電図：ERG）を行った。網膜電図は光刺激に対する網膜電位の変化を記録する検査法であり、網膜が機能している場合には高い振幅が得られる。a波は視細胞に由来し、b波は主としてミュラー細胞と双極細胞に由来する。SIV-hPEDF、SIV-hFGF2の両単独投与群において、SIV-EGFP群に比較して、a, b波ともに有意に高い振幅結果が得られた。さらに同時投与群では、a,b波共により高い振幅が得られ、同時投与群でより高い神経保護効果が得られていることが確認できた（図１２および図１３）。
なお、追加実験群において組織学的検討を行ったところ、SIV-hPEDF、SIV-hFGF2の同時投与による明らかな炎症、増殖、及び血管新生所見は認められなかった（データ示さず）。
本発明によって、網膜色素変性の新規治療方法が提供された。本発明のPEDFおよびFGF2の同時投与は従来の網膜色素変性治療方法よりも顕著に高い効果を期待することができる。特に、SIV-PEDFベクターおよびSIV-FGF2ベクターを用いた投与方法は、患者の細胞内におけるPEDFおよびFGF2持続的提供を可能とし、患者に対する侵襲頻度、経済的コストの点においても極めて優れた治療法であるということが証明された。
Claims (17)
- 下記（a）を薬学的に許容される媒体とともに含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品。
（a）色素上皮由来因子（Pigment epithelium derived factor：PEDF）遺伝子および線維芽細胞成長因子2（fibroblast growth factor 2：FGF2）遺伝子 - PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む医薬品であって、該PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が、別々の組換えサル免疫不全ウイルスベクターに保持されるか、または1つの組換えサル免疫不全ウイルスベクターに保持される、請求項１に記載の医薬品。
- PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターおよびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む、請求項２に記載の医薬品。
- PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む、請求項２に記載の医薬品。
- サル免疫不全ウイルスベクターがcPPT配列および／またはWPRE配列を含む、請求項２から４のいずれかに記載の医薬品。
- サル免疫不全ウイルスベクターがVSV-Gでシュードタイプ化されている、請求項２から５のいずれかに記載の医薬品。
- サル免疫不全ウイルスベクターがagm株由来である、請求項２から６のいずれかに記載の医薬品。
- PEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物、およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用キット。
- PEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを含む組成物を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用キット。
- 眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患が、網膜色素変性、緑内障、網膜剥離、網膜虚血性疾患のいずれかである、請求項１から７のいずれかに記載の医薬品または請求項８もしくは９に記載のキット。
- 網膜下腔に投与するための、請求項1から７のいずれかに記載の医薬品。
- 網膜下腔に投与するための、請求項８もしくは９に記載のキット。
- 配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程、及び、
配列番号：１に記載の塩基配列にFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程、
を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法。 - 配列番号：２に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
- 配列番号：３に記載の塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、請求項１３に記載の方法。
- 配列番号：１に記載の塩基配列にPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子が挿入された塩基配列を含むジーントランスファーベクターを用いてPEDF遺伝子およびFGF2遺伝子を保持する組換えサル免疫不全ウイルスベクターを調製する工程を含む、眼組織細胞におけるアポトーシス変性を伴う疾患の治療用医薬品の製造方法。
- 配列番号：４に記載の塩基配列を含むパッケージングベクターが導入されたパッケージング細胞に、該ジーントランスファーベクターを導入する工程を含む、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
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