技术背景
对眼科领域的疾患而言,不适当的治疗会导致致盲性的重症发生。由于没有根本性的治疗方法,不得不依赖对症疗法治疗的疾病不在少数。最近,发现眼科领域中一部分重症疾病的发生和恶化是与凋亡相关的。
视网膜色素变性是一种多发性视网膜的视细胞层以及色素上皮层病变,可导致凋亡发生的治愈困难的遗传性疾患。视细胞大致分为杆体和椎体两种细胞。杆体主要分布在稍微偏离视网膜中心的部位,与暗视条件下的物体辨别以及视野的宽狭等有关。椎体大多分布在视网膜中心的黄斑部位,主要与中心视力以及色觉等有关。视网膜色素变性,由于视细胞受到伤害,表现出夜盲,视野狭窄,视力下降的症状,随着病情发展致盲的病例很多。视网膜色素变性中的一部分疾病是由于视细胞和视网膜色素上皮细胞特异性功能基因异常而引起的,大部分的视网膜色素变性至今仍然原因不明。作为目前为止已搞清的致病基因,在常染色体隐性遗传性视网膜色素变性中已知有杆体的cGMP-磷酸二酯酶a以及b亚单位,杆体的环核苷酸门控阳离子通道,视网膜的鸟氨酸环化酶,RPE65,细胞视黄醛结合蛋白,停滞因子等基因。另外常染色体显性遗传性视网膜色素变性中已知有视紫红质,盘膜边缘蛋白/视网膜缓慢变性(RDS,retinal degeneration slow的缩略语),杆体外节盘膜蛋白(ROM1),X-连锁视网膜色素变性中视网膜色素变性GTP酶调节因子(RPGR)等基因。诊断是通过眼底观察(陈旧性病例为视网膜血管狭小,粗糙的芝麻盐状视网膜,骨小体样色素沉着。非陈旧性病例为无色素,白斑等),视野(与向心性,环状,地图状,中心性等病变部位对应的狭窄),暗适应(暗适应曲线的第2次曲线阈值上升),视力下降,电生理学观察(视网膜电图(ERG)的振幅下降甚至消失),荧光眼底造影观察(视网膜色素上皮萎缩以及视网膜脉络膜萎缩引起的高荧光)进行判断的。
目前,尚无视网膜色素变性的有效治疗方法,仅仅是采用对症疗法,但是基因治疗,视网膜移植,人工视网膜等的治疗方法的研究正在开展之中。使用神经营养因子的基因治疗就是其中之一。据报道神经营养因子对抑制凋亡有效。神经营养因子的成纤维细胞生长因子2(fibroblast growthfactor 2:FGF2)通过使用视网膜光损伤模型(非专利文献1),视网膜色素变性模型(非专利文献2-6),视网膜神经节细胞损伤(缺血再灌流,视神经切断)模型(非专利文献7)等的动物实验,探讨了其对眼科领域中的基因治疗的应用。另外,本发明人还探讨了神经营养因子之一的色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor:PEDF)在视网膜色素变性的治疗上的应用(非专利文献8)。本发明人们还通过向具有逆转录病毒的猴免疫缺陷病毒(SIV:simian immunode ficiency virus)骨架的SIV载体中插入PEDF,构建了SIV-PEDF载体,并进行了模型动物的探讨,得到了良好的结果(非专利文献8)。但是,对于最终致盲的重症疾患的视网膜色素变性,仍需要开发能发挥更高疗效的治疗方法。
专利文献1:国际申请号PCT/JP2002/005225 国际公开号WO2002/101057
专利文献2:国际申请号PCT/JP00/03955 国际公开号WO00/078987
非专利文献1:Lau D,Flannery J.Viral-mediated FGF-2 treatment of theconstant light damage model of photoreceptor degeneration.Doc Ophthalmol.2003 Jan;106(1):89-98.
非专利文献2:Akimoto M,Miyatake S,KogishiJ,Hangai M,Okazaki K,Takahashi JC,Saiki M,Iwaki M,Honda Y.Adenovirally expressed basicfibroblast growth factor rescues photoreceptor cells in RCS rats. InvestOphthalmol Vis Sci.1999 Feb;40(2):273-9.
非专利文献3:Uteza Y,Rouillot JS,Kobetz A,Marchant D,Pecqueur S,Arnaud E,Prats H,Honiger J,Dufier JL,Abitbol M,Neuner-Jehle M. Intravitreous transplantation of encapsulated fibroblasts secreting the humanfibroblast growth fa
非专利文献4:Neuner-Jehle M,Berghe LV,Bonnel S,Uteza Y,Benmeziane F,Rouillot JS,Marchant D,Kobetz A,Dufier JL,Menasche M,Abitbol M.Ocular cell transfection with the human basic fibroblast growthfactor gene delays photoreceptor cell degeneration in RCS rats.Hum GeneTher.2000 Sep 1;11(13):1875-90.
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非专利文献8:Miyazaki M,Ikeda Y,Yonemitsu Y,Goto Y,Sakamoto T,Tabata T,Ueda Y,Hasegawa M,Tobimatsu S,Ishibashi T,Sueishi K.Simianlentiviral vector-mediated retinal gene transfer of pigment epithelium-derivedfactor protects retinal degeneration and electrical defect in Royal College ofSurgeons rats.Gene Ther.2003 Aug;10(17):1503-11.
非专利文献9:Wahlin KJ,Campochiaro PA,Zack DJ,Adler R.Neurotrophic factors cause activation of intracellular signaling pathways inMuller cells and other cells of the inner retina,but not photoreceptors.InvestOphthalmol Vis Sci.2000;41(3):927-36.
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发明内容
本发明为鉴于这种状况的发明,本发明要解决的问题是发现一种新的伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗方法。
本发明人为彻底解决上述问题,进行了锐意研究,想到了用两种神经营养因子:PEDF和FGF2进行同时给药的方法。通常认为PEDF和FGF2的作用部位相异。PEDF的作用部位为视网膜的视细胞以及神经节细胞,而FGF2的作用部位则有FGF2受体位于视网膜的内颗粒层的报道(非专利文献9)和位于视细胞的报道(非专利文献10)。如果进行PEDF和FGF2的同时给药的话,通过两者的协同作用,与以往相比可以获得更好的效果。本发明人构建了SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体。SIV载体是以猴免疫缺陷病毒作为骨架的载体,由于可能使导入的外源基因在宿主内持续表达,在慢性疾病的治疗中,能够提供特别适当的药物传输。在RCS大鼠视网膜色素变性疾病模型的网膜下腔进行上述载体给药,并对其效果进行了探讨。载体给药4周后,摘取大鼠后眼部分,对PEDF以及FGF2的表达量进行了测定,证实SIV-hPEDF、SIV-hFGF2载体给药可以致使hPEDF以及hFGF2基因表达。另外,在计数残存视细胞数量时,可以观察到单独给药组也有视细胞保护效果,同时给药组比单独给药组有更显著的视细胞保护效果。进而,通过视网膜电图对视网膜的功能进行了评价,表明单独给药组,同时给药组这两组都有功能维持的作用,但是同时给药组的效果与单独给药组相比具有更加显著的效果。而且,在载体给药8周后以及12周后,也表明SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2载体的同时给药有显著的神经保护效果。本发明人从上述结果首次发现,PEDF以及FGF2的同时给药对视网膜色素变性疗效有更高的效果。PEDF以及FGF2的同时给药不仅仅对视网膜色素变性,而且对伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗也是有效的。也就是说,本发明是通过FGF2以及PEDF的同时给药对伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患进行治疗的,并就以下的发明进行更加具体的说明。
一种伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患治疗用药品,其特征是:与药学可使用的介质一起,包含下述(a)到(d)的任意一种。
(a)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor:PEDF)基因以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2:FGF2)基因
(b)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor:PEDF)蛋白质以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2:FGF2)蛋白质
(c)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor:PEDF)基因以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2:FGF2)蛋白质
(d)色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor:PEDF)蛋白质以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2:FGF2)基因
项[1]中记述的药品,其特征是:包含带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的药品,该PEDF基因以及FGF2基因分别由不同的重组猴免疫缺陷病毒载体带有,或者由一个重组猴免疫缺陷病毒载体带有。
项[2]中记述的药品,其特征是:包含带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体。
项[2]中记述的药品,其中,包含带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体。
项[2]到[4]的任意一项中记述的药品,其中,猴免疫缺陷病毒载体包含cPPT序列和/或WPRE序列。
项[2]到[5]的任意一项中记述的药品,其中,猴免疫缺陷病毒载体用VSV-G进行假型化。
项[2]到[6]的任意一项中记述的药品,其中,猴免疫缺陷病毒载体是来源于agm株。
伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用试剂盒,其特征是:包含带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物、以及包含带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物。
伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用试剂盒,其特征是:内含包含带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的混合物。
项[1]到[7]的任意一项中记述的药品或者权利要求[8]或者[9]中记述的试剂盒,其特征是:伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患是指视网膜色素变性,青光眼、视网膜脱落、视网膜缺血性疾病中的任意一种。
伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗方法,其特征是:用PEDF以及FGF2或者编码它们的基因进行给药。
项[11]中记述的治疗方法,其特征是:用带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行给药。
项[12]中记述的治疗方法,其特征是:用带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体以及带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行视网膜下腔给药。
项[11]中记述的治疗方法,其特征是:用带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行给药。
项[14]中记述的治疗方法,其特征是:用带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体进行视网膜下腔给药。
伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法,其特征是:包括利用包含在序列号:1所记述的碱基序列中插入PEDF基因的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的工艺。
项[16]中记述的方法,其特征是:包括利用包含序列号:2所记述的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的工艺。
伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法,其特征是:包括利用包含在序列号:1所记述的碱基序列中插入FGF2基因碱基序列的基因转移载体制备带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的工艺。
项[18]中记述的方法,其特征是:包括利用包含序列号:3所记述的碱基序列的基因转移载体制备带有FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的工艺。
伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗用药品的制造方法,其特征是:包括利用含在序列号:1所记述的碱基序列中插入PEDF基因以及FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备带有PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体的工艺。
项[16]到[20]中的任意一项中记述的方法,其特征是:包括向导入有包含序列号:4所记述的碱基序列的包装载体的包装细胞导入该基因转移载体的工艺。
发明的具体实施方式
本发明涉及一种利用色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derivedfactor:PEDF)以及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2:FGF2)治疗伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的药品。本发明人着眼于PEDF和FGF2的凋亡抑制作用的靶细胞的不同,对于伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患,PEDF或者FGF2的同时给药比它们任意的单独给药都有更加显著的效果。
在本发明的药品中所包含的PEDF和FGF2,即可以是蛋白质,也可以是基因。人类PEDF(hPEDF)蛋白质的氨基酸序列用序列号:5,人类FGF2(hFGF2)蛋白质的氨基酸序列用序列号:6来表示。另外hPEDF的cDNA序列用序列号:7,hFGF2蛋白质的cDNA序列用序列号:8来表示。
包含在本发明的医药品中的PEDF基因和FGF2基因可以用实验室常规方法进行制备。例如:可以将序列号:7或者序列号:8中记述的碱基序列的一部分或者全部作为探针,通过人视网膜色素上皮细胞的cDNA文库进行制备。或者将序列号:7或者序列号:8中记述的碱基序列的一部分作为引物,用人视网膜色素上皮细胞的mRNA作为模板,使用常用的核酸扩增法可进行制备。从上述基因制备本发明的药品的情况下,即使DNA的状态不错,但是最优选的是处于插入载体状态的。PEDF基因以及FGF2基因可以分别由不同的载体带有,也可以同时由一个载体带有。作为药品使用的载体种类,只要是完全符合安全的载体是没有限制的,但最好是慢病毒载体,最优选的是猴免疫缺陷病毒载体。
病毒的生命周期大致分为感染和增殖两个阶段。其特征在于,一般来说病毒载体利用病毒的感染系统,可将基因高效地导入宿主细胞内。为确保安全性,去除了多数病毒载体的增殖系统,使其缺失自我复制能力,防止在导入的细胞内增殖。
对载体粒子的结构做一简单的说明,载体粒子中有被称作衣壳的蛋白质外壳。衣壳是由gag基因产物的结构蛋白质构成的。其衣壳的外侧有称作被膜的膜结构。被膜具有决定所感染细胞种类的功能。在衣壳中,存在2份载体基因组RNA拷贝和pol基因产物的逆转录酶。病毒载体一旦感染宿主细胞,载体基因组RNA就会通过自己的上述逆转录酶进行逆转录,之后整合进宿主染色体,成为前病毒DNA,而具有感染能力。
一般来说病毒载体可以通过包装载体和基因转移载体进行制备。包装载体携带有除去了包装信号的病毒DNA。病毒DNA含有病毒蛋白质序列。将包装载体导入宿主后,在宿主细胞(包装细胞)中,由于没有包装信号,形成空的病毒颗粒。另一方面,基因转移载体携带有整合进宿主染色体DNA所必需的来源于病毒的基因序列及要导入的外源基因。将这个基因转移载体导入到包装细胞后,由基因转移载体提供的载体基因组DNA被整合进宿主染色体,通过转录形成载体基因组RNA。该载体基因组RNA被包埋进包装细胞产生的病毒颗粒中,生成具有导入核酸分子进入宿主内部能力的病毒颗粒。
在本发明中的“病毒载体”是指缺乏自我复制能力,具有将核酸分子导入宿主内部的能力的病毒颗粒。“重组”病毒载体是指通过基因重组技术构建的病毒载体。利用编码病毒基因组的DNA和包装细胞构建的病毒载体包含在重组病毒载体中。
本发明中的“猴免疫缺陷病毒(SIV)载体”是指在病毒颗粒中的核酸分子内,作为病毒载体功能所必需的序列为SIV基因组由来序列的载体。本发明中的“作为病毒载体功能所必需的序列”是指从5’端开始顺次为5’LTR的R区域、U5区域,包装信号(
),RRE,3’LTR的启动子区域以外的U3区域,R区域序列。从5’LTR区域开始到包装信号的碱基序列表示为序列号:9,RRE序列表示为序列号:10,缺失3’LTR的启动子区域的U3区域到R区域的碱基序列表示为序列号:11。本发明中的SIV载体只要与上述定义相符也可加以改造,例如,“作为病毒载体功能所必需的序列”只要来自SIV,其他来自SIV的序列或者来自SIV以外的序列也可以包含在内。作为可包含的最适序列来讲,例如可以列举后面记述的cPPT(centralpolypurine tract),内部启动子(CMV),WPRE(woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element)。
在本发明中,猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus;SIV)包括有SIV的所有株以及其亚型。作为SIV单离株来说,可以例举出SIVagm,SIVcpz,SIVmac,SIVmnd,SIVsm,SIVsnm,SIVsyk等来,但并不仅仅于这些病毒株。
猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus,SIV)是作为猴子的HIV样病毒被发现的,与HIV一起构成灵长类慢病毒(Primates Lentivirus)群(井户荣治,速水正宪,サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染·病原性.蛋白质核酸酵素:Vol..39,No.8.1994)。进而这个群又大致分类为四个群:1)包含成为人类获得性免疫缺陷综合症(acquired immune defciencysyndrome,AIDS)病因的HIV-1和从黑猩猩分离的SIVcpz的HIV-1群,2)从白顶白眉猴(Cercocebus atys)分离的SIVsmm和猕猴(Macaca mulatta)分离的SIVmac,以及对人类感染频率较低的,具有病原性的HIV-2(Jaffar,S.et al.,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.,16(5),327-32,1997)构成的HIV-2群,3)由非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)分离出来的SIVagm为代表的SIVagm群,4)由山魈(Papio sphinx)分离出来的SIVmnd为代表的SIVmnd群组成。
其中,SIVagm以及SIVmnd没有自然宿主的病原性报道(Ohta,Y.et al.,Int.J.Cancer,15,41(1),115-22,1988;Miura,T.et al.,J.Med.Primatol.,18(3-4),255-9,1989;速水正宪,日本临床,47,1,1989),特别是在本实施例中使用的SIVagm中的一种TYO-1株,据报道即使是在自然宿主中,对食蟹猴(Macaca facicularis),猕猴(Macaca mulatta)的感染实验中也为表现出病原性(Ali,M.et al,Gene Therapy,1(6),:367-84,1994;Honjo,S.et al.,J.Med.Primatol.,19(1),9-20,1990)。由于没有关于SIVagm对人类感染,致病的报道,对人类的病原性不得而知,一般来说,灵长类的慢病毒有很高的种特异性,从自然宿主致使其他种类感染,致病的病例很少,并且具有其致病频率低或者进程缓慢的倾向。(Novembre,F.J.et al.,J.Virol.,71(5),4086-91,1997)。因此,以SIVagm、特别是SIVagm TYO-1株为基础制备的病毒载体同以HIV-1以及其他慢病毒为基础制备的载体相比,安全性更高,最适合在本发明中使用。SIVagm TYO-1株的基因组碱基序列用序列号:12来表示。
本发明的猴免疫缺陷病毒载体可以拥有其它逆转录病毒的基因组RNA序列的一部分。例如,具有人类免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus;HIV),猫免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus:FIV)(Poeschla,E.M.et al.,Nature Medicine,4(3),354-7,1998),山羊关节炎脑炎病毒(Caprine Arthritis Encephalitis Virus:CAEV)(Mselli-Lakhal,L.et al.,Arch.Virol.,143(4),681-95,1998)等其他慢病毒基因组序列的一部分与猴免疫缺陷病毒基因组一部分相置换而成的嵌合序列的载体也包含在本发明的猴免疫缺陷病毒载体中。
带有本发明的色素上皮衍生因子(Pigment epithelium derived factor:PEDF)基因的重组猴免疫缺陷病毒载体(SIV-PEDF载体)是指携带PEDF基因的重组SIV载体。另外带有本发明的FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体(SIV-FGF2载体)是指携带FGF2基因的重组SIV载体。还有带有本发明的PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体是指携带PEDF基因和FGF2基因两种基因的重组SIV载体。本发明的SIV-PEDF载体只要符合上述定义,是与种类以及结构无关的,最优选的例子可例举利用包含在序列号:1中记述的碱基序列中插入PEDF基因碱基序列的基因转移载体来制备SIV载体,更优选的例子可例举利用包含序列号:2中记述的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体。同样,本发明的SIV-FGF2载体只要符合上述定义,是与种类以及结构无关的,最优选的例子可例举利用包含在序列号:1中记述的碱基序列中插入PEDF基因碱基序列的基因转移载体制备SIV载体,更优选的例子可例举利用包含序列号:3中记述的碱基序列的基因转移载体制备SIV载体。另外同样,带有本发明的PEDF基因以及FGF2基因的重组猴免疫缺陷病毒载体只要符合上述定义,是与种类以及结构无关的,最优选的例子可例举利用包含在序列号:1中记述的碱基序列中插入PEDF基因以及FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备SIV载体。
带有SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的本发明的PEDF基因和/或FGF2基因的SIV载体可以进行VSV-G假型化。VSV-G假型化是指,使载体的被膜包含水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus;VSV)的表面糖蛋白质VSV-G蛋白而言的。VSV-G蛋白可以是来源于任意VSV株的蛋白。例如,可以使用来自Indiana血清型毒株(J.Virology 39:519-528(1981))的VSV-G蛋白,但不仅局限于此。另外,VSV-G蛋白可以是天然蛋白质的衍生物,通过一个或者多个氨基酸发生置换、缺失、和/或增加等得到的修饰蛋白。VSV-G假型化载体可以在病毒产生时通过与VSV-G蛋白共存来制备。例如,通过VSV-G表达载体的转染,来自整合入宿主染色体DNA的VSV-G基因的表达诱导,或者通过使VSV-G在包装细胞内进行表达,经由这个细胞产生的病毒颗粒可以被VSV-G假型化。由于VSV-G蛋白质是一种糖蛋白会形成一种稳定的3聚体,存在于细胞膜上,因此纯化过程中不会引起载体粒子的破坏,可以用离心进行高浓度的浓缩(Yang,Y.et al.,HumGene Ther:Sep,6(9),1203-13.1995)。
SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的带有本发明的PEDF基因和/或FGF2基因的SIV载体可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如,作为这种蛋白质,最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定,可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白等。作为这种逆转录病毒的兼嗜性病毒被膜蛋白,例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外,也可以使用来自MuMLV 10A1的被膜蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux,R.K.et al.,J.Virol.70:5701-5705(1996))。另外,作为疱疹病毒科的蛋白,可以举出例如,单纯性疱疹病毒的gB,gD,gH,gp85蛋白,EB病毒的gp350,gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白,可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。
对于本发明的重组猴免疫缺陷病毒载体来说,可以对LTR(long terminalrepeat)进行改造。LTR为逆转录病毒特征性序列,位于病毒基因组的两端。5′LTR作为启动子发挥作用,促进来自前病毒的mRNA转录。因此,如果将包装在病毒颗粒内带有编码病毒RNA基因组的基因转移载体的5′LTR的启动子活性的部分置换为其它的强有力的启动子的话,可增加基因转移载体的mRNA转录量,提高包装效率,使载体滴度提高。进而,例如慢病毒的情况下,已知5′LTR的转录活性被病毒蛋白tat促进,将5′LTR置换成不依赖tat蛋白的启动子时,可以从包装载体中删除tat。另外,感染细胞并侵入细胞内的病毒RNA发生逆转录后,形成使两端的LTR结合在一起的环状结构,结合部位与病毒的整合酶偶联,而被整合进细胞的染色体中。由前病毒转录的mRNA是从5′LTR内的转录起始点开始至下游3′LTR的polyA序列,5′LTR的启动子部分未被包装在病毒内。因此,即使置换启动子,插入靶细胞染色体的部分也不发生变化。综上所述,5′LTR的启动子的置换实现了更高的滴度与更高安全性的载体制备。因此,可以进行基因转移载体的5′端启动子的置换,提高被包装载体的滴度。
另外,删除部分3′LTR的序列,通过制备防止靶细胞载体全长mRNA转录的自我失活型载体(Self Inactivating Vector:SIN载体),可以提高其安全性。侵染到靶细胞染色体的慢病毒的前病毒形成3′LTR的U3部分与5′端结合的形式。因此,基因转移载体的转录产物在逆转录后,处于整合进靶细胞染色体的状态,U3定位于5′端,在此与来自基因转移载体的转录产物具有同样结构的RNA可以被转录。假设在靶细胞内有慢病毒或者其类似蛋白质存在的情况下,转录的RNA被再次包装,有可能对其他细胞进行再次感染。另外通过3′LTR的启动子,位于病毒基因组的3′端的来自宿主的基因有可能被表达(Rosenberg,N.,Jolicoeur,P.,Retoroviral Pathogenesis.Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,475-585,1997)。这种现象在逆转录病毒载体中已经被视为一种问题,作为回避方法,开发了SIN载体(Yu,S.F.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(10),3194-8,1986)。通过使基因转移载体上的3′LTR的U3部分缺失,令靶细胞内没有5′LTR及3′LTR的启动子,就不会发生全长RNA及宿主基因的转录。然后,只有来自内部启动子的目的基因进行转录,以实现安全性提高,以及载体表达提高。这样的载体最适用于本发明。SIN载体的构建可以按照常规方法或者本发明人的专利申请:国际公开号WO2002/101057(专利文献1)的实施例1-4中记述的方法等进行。
使用逆转录病毒载体等在其基因组中包含LTR序列的病毒载体进行基因治疗的问题之一是导入的基因表达逐渐下降。原因之一是这些载体一旦被整合进宿主基因组中,由于宿主的作用机理造成其LTR被甲基化,导入基因的表达受到抑制。(Challita,P.M.and Kohn,D.B.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2567,1994)。自我失活(SIN)型载体一旦被整合进宿主基因组就会丢失大部分LTR序列,优点是不受LTR甲基化引起的基因表达钝化的影响。本发明人通过将基因转移载体的3′LTR的U3区域置换为其他启动子序列制备的自我失活型载体,在导入进灵长类ES细胞之后,已证实可以维持两个月以上的稳定表达(专利文献1)。这样,通过改造LTR U3区域进行自我失活设计的SIN载体特别适用于本发明。具体来说,3′LTR的U3区域的1或者多个碱基通过置换,缺失,和/或增加等进行改造的载体归属于本发明。这个U3区域既可以仅为缺失,或者也可以为在该区域内插入其它的启动子。作为这样的启动子来说,例如可以列举出CMV启动子、EF1启动子、或者CAG启动子等。
另外,最优选的设计为通过LTR以外的启动子转录编码本发明载体的PEDF基因以及FGF2基因。例如,如上所述,将LTR U3区域置换成非LTR启动子的情况下,最优选的是,通过这种改造的LTR驱动PEDF基因或者FGF2基因的表达。或者如实施例所示,在与LTR区域不同的位置上加入非LTR启动子,通过连接其下游PEDF基因或者FGF2基因,可以诱导非LTR依赖的PEDF基因或者FGF2基因的表达。本发明人,通过构建非LTR启动子驱动的外源基因表达的SIV载体表明在ES细胞中的外源基因可以长期稳定地表达(专利文献1)。同样,在PEDF基因或者FGF2基因的上游连接非LTR启动子,由该启动子导致的PEDF基因或者FGF2基因转录的载体特别适用于本发明。作为非LTR启动子来说,例如可列举出CMV启动子,EF1启动子,或者CAG启动子,尤其是CMV启动子最好。在本实施例中使用的CMV启动子的碱基序列用序列号:13来表示。这样的载体,尤其是在上述自我失活(SIN)型载体构建中会发挥较高的效果。
以HIV载体为首的慢病毒载体,在宿主基因组带有全部HIV前病毒的情况下,有报道指出外源载体和内源性前病毒之间会发生重组,担心会不会出现可复制的病毒。这在将来实际给HIV感染患者使用HIV载体时确实是一个很大的问题。这次使用的SIV载体由于几乎没有与HIV相同的序列,是删除掉80%以上的病毒来源序列的不可复制病毒,因此这种危险性极小,与其他慢病毒载体相比安全性很高。本发明的SIV-PEDF载体和SIV-FGF2载体是一定程度之上删除了上述“作为病毒载体功能所必需的序列”以外的SIV基因组序列的载体,最优选的是这个载体中来源自SIV基因组序列的40%以上,或者是50%以上,或者是60%以上,或者是70%以上,更优选的是80%以上被删除掉的不可复制病毒。
在逆转录病毒的产生中,使宿主细胞中具有包装信号的基因转移载体DNA发生转录,在gag,pol蛋白以及被膜蛋白质存在的情况下,形成病毒颗粒。包装细胞内的gag,pol蛋白可以使用包装载体进行提供。被膜蛋白也可由包装载体进行提供,也可以由其他载体进行提供。例如实施例所示,可以由VSV-G表达载体进行提供。
本发明的基因转移载体最基本地要具有5’LTR,包装信号序列,PEDF基因和/或FGF2基因,以及3’LTR序列。LTR序列可以进行上述的SIV载体改造的LTR改造。另外,也可以加入上述的cPPT序列,CMV序列,RRE序列等。基因转移载体DNA中编码的包装信号序列为了能维持该序列形成的结构功能,最好尽可能长地被加入进去,另一方面,为了抑制该载体DNA上的包装信号与供给gag,pol蛋白的包装载体之间发生重组出现的野生型病毒的频率,需要将这些载体间的重复序列控制在最小限度范围内。因此,在基因转移载体DNA的构建中,为了使包装效率以及安全性二者都得到满足,最好使用包含有尽可能短的包装所必需的序列,。
例如,使用来自SIVagm的包装载体的情况下,由于来自HIV的基因转移载体未被包装,因此,作为用于基因转移载体DNA的包装信号来源,只受SIV的限制。但是,使用来自HIV的包装载体的情况下,由于来自SIV的基因转移载体也会被包装,使重组病毒的出现频率下降,所以可以将来自不同慢病毒的基因转移载体和包装载体进行组合并形成载体粒子。如此制备的SIV载体也包括在本发明的载体中。在这种情况下,最优选的是灵长类慢病毒之间产生的组合(例如,HIV和SIV)。
在基因转移载体DNA中,最好将gag蛋白改造为非表达。病毒gag蛋白对于生命体来说,被作为异物识别,有可能表现出抗原性。另外,也有可能影响到细胞的功能。要使gag蛋白不表达,可以通过gag起始密码子的下游碱基的增加或者缺失等进行框移改造。另外,最好是在gag蛋白的编码区域产生部分缺失。一般来说,在病毒的包装中,gag蛋白的编码区域的5′端是必要的。因此,在基因转移载体中,最好是使gag蛋白质的C末端的编码区域缺失。在不对包装效率产生很大影响的范围内,尽可能大范围地删除gag编码区域。另外,最好将gag蛋白的起始密码子(ATG)置换成ATG以外的密码子。置换的密码子应适宜地选择对包装效率没有影响的。具有依此构建的包装信号的基因转移载体DNA,通过导入到适当的包装细胞中,就可以进行病毒载体生产了。产生的病毒载体比如可以从包装细胞的培养上清中进行回收。
进而,在基因转移载体DNA中,最好进行以提高PEDF基因以及FGF2基因的导入效率以及表达效率的改造。比如进行提高导入效率的改造例子,可以列举cPPT序列的导入。cPPT原本是存在于SIV基因组的一个序列。在HIV病毒中很久以前就有报道(P.Charneau et al.:J.Virol 65:2415-2431,1991),报道指出,在HIV载体中导入cPPT后,载体基因组向细胞核的移动加快,基因导入效率提高(A.Sirven et al.:Blood 96:4103-4110,2000)。在本实施例中使用的cPPT碱基序列用序列号:14来表示。另外作为提高表达效率的改造例子,可以列举WPRE序列的导入。WPRE是具有提高基因表达效率功能的因子(US Patent 6284469:RNA export element and methods ofuse)。有报道指出在其它的慢病毒载体中,同时导入cPPT和WPRE两个因子,最终可以进一步提高各自的效果(SC.Barry et al.:Hum.Gene Ther.12:1103-1108,2001)。在本实施例中使用的WPRE碱基序列用序列号:15来表示。带有SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的本发明的PEDF基因和/或FGF2基因的SIV载体中,cPPT可以采用与常见的慢病毒载体的定位一样的定位。例如、cPPT可以定位在启动子与外源基因之间,或者定位在RRE序列的上游,最好是定位在驱动PEDF转录的上述非LTR启动子的上游。WPRE可以定位在PEDF或者FGF2基因的下游。作为这种基因转移载体最好的具体实例,可以例举出使用包含在序列号:1中记述的碱基序列中插入PEDF基因的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体,使用包含在序列号:1中记述的碱基序列中插入FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体,以及使用包含在序列号:1中记述的碱基序列上插入PEDF基因和FGF2基因的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体;更好的例子为,使用包含序列号:2中记述的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体,使用包含序列号:3中记述的碱基序列的基因转移载体制备的SIV载体。
在本发明中,包装载体可以使用删除了对PEDF基因和/或FGF2基因的导入非必需序列的载体。作为非必需序列,可以列举出被称作修饰基因的vif,vpr和调控基因的tat,rev。有报道指出修饰基因产物在载体中是非必需的(V.Kim et al.:J.Virol 72:811-816,1998),近年来,为了提高安全性,经常使用删除了修饰基因的载体。另外,tat也可删除,rev可用其它质粒移走,使安全性进一步提高,是开发中的所谓第三代载体。从包装载体中去除掉rev的情况下,可以另外构建rev表达载体,在SIV-PEDF载体和SIV-FGF2载体等的带有本发明的PEDF基因和/或FGF2基因的SIV载体制备中可以使用该rev表达载体。SIVagm TYO-1株的rev碱基序列用序列号:16来表示。按上述方法构建的包装载体,例如,可以进行包括启动子序列、病毒核心蛋白质序列(gag)、逆转录酶序列(pol)、polyA序列在内的构建,如实施例所示,上述构建也可以再加上RRE序列。另外rev表达载体可以将调控该序列的启动子放置在rev序列的上游、将polyA序列放置在rev序列的下游进行构建。
作为用于包装细胞的细胞来说,通常来讲只要是用于病毒生产的细胞株都可以。考虑到应用于人类的基因治疗,细胞来源以人类的或者猴子的较为适宜。可以用作包装细胞使用的人类细胞株,例如包括293细胞,293T细胞,293EBNA细胞,SW480细胞,u87MG细胞,HOS细胞,C8166细胞,MT-4细胞,Molt-4细胞,HeLa细胞,HT1080细胞,TE671细胞等。来源于猴子的细胞株,例如,COS1细胞,COS7细胞,CV-1细胞,BMT10细胞等。
SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等本发明的带有PEDF基因和/或FGF2基因的SIV载体实质上可以进行完全纯化。纯化方法包括过滤器过滤,离心分离,以及柱层析纯化等已知的纯化/分离方法来进行。例如将载体悬液通过0.45μm的过滤器进行过滤后,42500×g、90分钟,4℃下进行离心,可以对载体进行沉淀和浓缩。
另外如上所述,本发明的药品可以利用PEDF蛋白质和FGF2蛋白质进行制备,PEDF蛋白质和FGF2蛋白质其cDNA用有关人员常用的方法进行制备,可以将该cDNA插入到适当的表达载体,导入进宿主细胞进行表达。这些cDNA可以分别由不同的载体带有,也可以同时由一个载体带有。cDNA的制备如上述所示。表达载体可以选择适宜的宿主细胞进行。
本发明的药品可以用于伴随眼组织细胞凋亡变性的疾患的治疗以及预防。例如可以用于视网膜色素变性,青光眼,视网膜脱落,视网膜缺血性疾患的治疗及预防,特别是适用于视网膜色素变性的治疗及预防。上述SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体等的带有PEDF基因和/或FGF2基因的SIV载体根据需要与药学可使用的所希望的载体材料或者介质进行适当的组合,可以作为上述疾患的药品。“药学可使用的介质”是指可以与载体共同给药,所述介质对基因的导入没有统计学意义上的抑制的材料。具体来讲,例如可以考虑使用灭菌水,生理盐水、培养基,血清,生理盐水的磷酸盐缓冲液(PBS)等适当的组合。此外,其它的还可以含有稳定剂、杀菌剂等。本发明的药品的形态为PEDF蛋白以及FGF2蛋白或者为存在于同一介质中的SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体的混合物,可以作为一种药品使用。将SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体作为一个混合物时,可以将各个载体在确保如下所述的给药量的范围内进行配合。或者分别将SIV-PEDF载体以及SIV-FGF2载体作为混合物进行制备,也可以作为含有两种混合物的治疗用试剂盒使用。PEDF以及FGF2的基因、蛋白质都可以作为同样的试剂盒使用。将PEDF蛋白以及FGF2蛋白作为本发明的药品时的介质材料以及形态与使用载体时的情况是相同的。
将含有本发明的SIV-PEDF以及SIV-FGF2的治疗药品进行给药的情况下,只要能获得抑制视网膜凋亡变性的效果,对给药途径没有特别要求,最好是视网膜下腔给药,玻璃体内给药,前房内给药,更优选的是视网膜下腔给药。包含本发明的SIV-PEDF和SIV-FGF2的药品的给药量(每一个眼球用量),例如可以是2.5×105TU-2.5×108TU,最优选用量是5.0×105TU-5.0×107TU。
另外,在本说明书中引用的全部前期技术文献都作为参考编入本说明书中。
实施例
以下依据实施例对本发明进行更具体的说明。最重要的是,本发明并不局限于以下的实施例。
实施例1 VSV-G假型SIV载体的构建
载体的构建使用了如图1中所示的4种质粒(基因转移载体,包装载体,rev表达载体,VSV-G表达载体)。关于其中基因转移载体,包装载体,及rev表达载体这3种,它们是通过改造原始型载体质粒(PCT/JP00/03955)而制备的。关于VSV-G表达载体使用没有经过改造的原有型载体。
在质粒制备时,使用了市场上出售的各种试剂盒。限制性内切酶使用New England Biolabs公司的产品,质粒DNA的提取,纯化,回收使用QIAGEN的试剂盒(QIAquick PCR purification kit,QIAquick NucleotideRemoval kit,QIAquick Gel extraction kit,Plasmid Maxi kit)。PCR使用TaKaRa的EX Taq酶,使用的引物对外委托厂商(SIGMA GENOSYS JAPAN)合成。DNA末端的脱磷酸化使用Takara的碱性磷酸酶(来自E.coli C75)。连接时使用Takara的DNA Ligation kit ver.2,转化使用TOYOBO的DH5αCOMPETENT high感受态细胞。
1-1.基因转移载体的改造
向原始型基因转移载体中导入cPTT(中心多嘌呤管道,central polypurinetract)以及WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控因子,woodchuck hepatitis virusposttranscriptional regulatory element),以改造基因转移载体的性能(图2A,B)。使用的原始型基因转移载体为非病原性的非洲绿猴免疫缺陷病毒的克隆株SIVagm作为基本载体,顺次具有5’LTR区域,RRE,CMV(巨细胞病毒,cytomegalovirus)启动子,EGFP(增强型绿色荧光蛋白,enhancedgreen fluorescent protein)基因,3’LTR。该原始型基因转移载体是由本发明人构建出来的载体,并已对构建方法等进行了报道(专利文献2)。该原始型基因转移载体的碱基序列用序列号:17来表示。
具体的载体改造方法如下。首先,用限制性内切酶Sac II酶切原始型的基因转移载体,样品进行电泳,去除CMV启动子和EGFP基因后,进行自我连接。其次,为了消除质粒的Not I位点,用Not I酶切上述载体,将酶切末端用T4 DNA聚合酶进行平滑化处理,并进行自我连接。
接下来,将上述载体用限制性内切酶Sac II酶切,进行BAP处理,将酶切末端脱磷酸化处理。以原始型的基因转移载体作为模板,用引物1F(序列号:18)和1R(序列号:19)进行PCR反应,将PCR产物用Sac II酶切,制备在CMV启动子(序列号:13)的末端添加上Sac II位点的片断。将该CMV启动子片断连接到BAP处理的上述载体的Sac II位点。
将载体依次用Not I、BamH I进行酶切,在其酶切位点将两种合成的寡聚DNA2F(序列号:20)和2R(序列号:21)进行退火制备好的接头连接上,以改变限制性内切酶的位点。将载体用限制性内切酶Sac II酶切,进行BAP处理,将酶切末端脱磷酸化处理。
为了得到导入用的cPTT片断(序列号:14),以含有SIVagmTYO1基因组(序列号:12)的质粒pSA212作为模板,用引物3F(序列号:22)和3R(序列号:23)进行PCR反应。将该PCR扩增片断的末端用SAC II酶切,制备成在cPPT的两端添加有SAC II位点的片断。将cPPT片断连接到BAP处理的上述载体的Sac II位点上。
将载体用BamH I酶切,进行BAP处理,将酶切末端脱磷酸化处理。为了得到导入的WPRE片断,以装有WPRE cDNA(序列号:15)的质粒作为模板,用引物4F(序列号:24)和4R(序列号:25)进行PCR反应。将得到的PCR扩增产物的末端用BamH I和Bgl II酶切,制备成在WPRE的末端添加有限制性内切酶位点的片断。将上述WPRE片断连接在载体的BamH I位点上,最终得到无携带基因的改造型基因转移载体(序列号:1)。
制备携带基因片断,并加入到上述的改造型基因转移载体Not I部点上。EGFP片断以装有EGFP cDNA(序列号:26)的质粒作为模板,用引物5F(序列号:27)和5R(序列号:28)进行PCR反应,用Not I酶切进行制备。FGF2片断以装有hFGF2 cDNA(序列号:8)的质粒作为模板,用引物6F(序列号:29)和6R(序列号:30)进行PCR反应,用Not I酶切进行制备。PEDF片断以装有hPEDF cDNA(序列号:7)的质粒作为模板,用引物7F(序列号:31)和7R(序列号:32)进行PCR反应,进行pGEM-TEasy vector载体(Promega公司)的TA克隆,用Not I酶切进行制备。
另外,在构建含有cPPT,WPRE的质粒的同时,为了确认cPPT,WPRE的效果,分别制备了单独加入有cPPT或者单独加入有WPRE的基因转移载体。
1-2.包装载体的改造
在原始型包装载体中除了gag,pol之外,还包括所谓的修饰基因vif,vpr和调控基因tat,rev。然而,已知修饰基因产物在载体中是非必须的(V.Kim etal.:J.Virol 72:811-816,1998),近年来,为了提高安全性,使用删除了修饰基因的载体。另外,tat也被删除,rev通过其它的质粒移去,而更加安全了,开发了被称作第三代的载体,目前,载体的第三代化成为当务之急。因此即使在本发明中,从原始型包装载体(序列号:33)中去除辅助的基因(vif,vpr,tat),将rev转移至别的质粒,提高了安全性(图3)。方法基本上为以前所报道的HIV载体的方法(T.Dull.et al.:J.Virol 72:8463-8471,1998)。
具体来讲,首先,将包装载体的质粒用限制性内切酶Not I酶切,接着用EcoT22I酶切。样品进行电泳,除去EcoT22I-Not I片断,回收片断较大的载体片断和作为pol基因一部分的EcoT22I-EcoT22I片断。
将这两种合成寡聚DNA1F(序列号:34)和1R(序列号:35)进行退火而制备的接头连接于上述载体的EcoT22I-Not I位点。接下来将载体用EcoT22I酶切,进行BAP处理,将酶切末端脱磷酸化处理,在BAP处理的EcoT22I位点加入回收好的pol基因的EcoT22I片断。
将上述载体进行Not I酶切,进行BAP处理,将酶切末端脱磷酸化处理。为了得到RRE片断,将原始型的包装载体(序列号:33)作为模板,用引物8F(序列号:36)和8R(序列号:37)进行PCR反应,进行pGEM-TEasy vector载体(Promega公司)的TA克隆。用Not I将RRE片断切出。连接RRE片断于脱磷酸化处理的载体Not I位点,最终得到改造型包装载体(序列号:4)。
1-3.rev表达载体的构建
rev蛋白目前为止依靠原始型的包装载体供给,随着上述包装载体改造,将rev蛋白以其它的表达质粒的形式进行供给,并重新构建了表达载体。Rev在基因组上的内含子被分成为两部分,将它们连接在一起加入到表达质粒中(图4A,B)。
首先,以原始的包装载体作为模板,通过PCR制备成两条片断。5’端的片断使用引物1F(序列号:38)和1R(序列号:39),3’端的片断使用引物2F(序列号:40)和2R(序列号:41)进行扩增。回收两种PCR片断,混合,作为PCR的模板,使用引物1F和2R进行扩增,得到以连接两个片断为目的的rev基因断片(序列号:16)。将PCR扩增的rev片断TA克隆到pGEM-T Easy vector载体。接下来,将该载体用EcoR I酶切,回收添加有EcoR I位点的rev片断。另一方面,将蛋白表达pCI载体(Promega公司)用EcoR I酶切,对酶切位点进行BAP处理。将回收的rev片断和pCI表达载体连接起来,作为rev表达载体备用。
实施例2 对携带有cPPT,WPRE的SIV载体的功能评价
为了调查cPPT和WPRE的导入效果,除了cPPT和WPRE同时携带外,还生产出cPPT单独携带,WPRE单独携带的载体,与原始型的对照进行比较。所使用的全部基因转移载体都携带EGFP。包装载体使用原始型(序列号:33)。
2-1.SIV载体的制备
将来自人类胎儿肾细胞的细胞株293T细胞按照每一个15cm塑料培养皿大约1×107(次日密度为70-80%)进行接种,在20ml含10%胎牛血清的D-MEM培养基(Gibco BRL)中进行24小时培养。24小时培养后,将培养基用10ml的OPTI-MEM培养基进行置换(Gibco BRL),作为转染细胞备用。
按照每一个培养皿基因转移载体为6μg、包装载体3μg、VSV-G表达载体1μg溶解在1.5ml的OPTI-MEM培养基后,加入40μl的PLUS Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌,在室温下放置15分钟。基因转移载体使用cPPT和WPRE同时携带、cPPT单独携带、WPRE单独携带或者原始型(cPPT和WPRE都不携带)的载体。在其中加入1.5ml的OPTI-MEM培养基稀释的60μl的LIPOFECTAMINE Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌,在室温下放置15分钟。
将上述的DNA复合物滴加到15cm培养皿的细胞上,小心振荡混匀,在37℃,5%CO2的孵育器中进行3小时的孵育。孵育后,在培养皿中加入13ml的含20%胎牛血清的D-MEM培养基进行培养。转染的次日,用新鲜的含10%胎牛血清的D-MEM培养基30ml换液后进行培养。转染2天后,回收上清,用0.45μm的过滤器过滤,作为载体悬液备用。
2-2.SIV载体的滴度测定
SIV载体滴度包括由表达所携带基因的蛋白的细胞数目计算出的功能滴度(Functional titer:TU/ml)和由载体粒子数目计算出的数值(Particle titer颗粒滴度:颗粒/ml)。因为cPPT和WPRE的性能评价要在一致的颗粒滴度条件下对细胞进行感染和评价,因此,如下所示用斑点印迹法对颗粒滴度进行了测定。
首先,用市场上出售的试剂盒(QIAGEN公司的QIAamp Viral RNA minikit)从上述生产的载体悬液抽取RNA。其次,利用狭隙杂交装置在HybondN+滤膜(Amersham公司)上对RNA加样。同时通过定量曲线计算出所用质粒DNA的摩尔数量。另外,RNA的处理方法按照滤膜产品附带提供的实验步骤进行。将DNA加热并迅速冷却。将滤膜用碱固定后,进行杂交。杂交使用罗氏公司DIG标记的信号检测系统。探针利用DIG标记的NTP进行制备,杂交后的操作使用DIG Easy Hyb,DIG Wash and Block Buffer Set试剂盒(罗氏公司)。利用anti-DIG AP conjugate antibody抗体(罗氏公司)以及CSPD(罗氏公司),进行化学发光,用鲁米诺图像分析仪(富士写真胶卷:LAS-1000)对信号进行检测定量。
2-3.SIV载体对细胞的基因导入及评价
测定好颗粒滴度的4种载体如下所示通过变化MOI(感染复数,multiplicity of infection)对细胞进行感染,进行FACS分析。将293T细胞按照每1孔为1×106个接种到6孔塑料培养板上,在37℃、5%CO2下培养过夜。次日,用血球计数板计算培养板每1孔的细胞数量,除去培养板的培养基,分别加入用新鲜的含10%胎牛血清的D-MEM培养基2ml稀释的载体,使MOI(颗粒/细胞)为0.3、1.5、7.5、15。感染1天后,将细胞的培养基用2ml的新鲜培养基进行交换。感染2天后,在荧光显微镜下观察通过载体进行基因导入的EGFP,测定EGFP阳性细胞的比例,并测定荧光强度(作为EGFP蛋白量水平的数值)。
2-4.载体功能评价的结果
以原始型基因转移载体作为对照,生产了cPPT单独携带、WPRE单独携带、cPPT和WPRE同时携带的4种载体。载体设计的模式图如图5-(a)所示。
在测定生产出来的载体颗粒滴度的时候,未发现4种载体粒子产量的差异。用载体粒子数对MOI(每一个细胞所感染的载体粒子数)进行统一,对293T细胞进行基因导入,在荧光显微镜下进行观察,MOI:15的情况下,如图5-(b)所示,不含cPPT和WPRE的原始型的对照(-cPPT,-WPRE)中,EGFP阳性细胞的数量少,荧光弱。cPPT单独携带(+cPPT,-WPRE)时EGFP阳性细胞的数量增加。WPRE单独携带(-cPPT,+WPRE)时EGFP阳性细胞的数量与对照相比仅稍有增加,但EGFP蛋白的荧光增强。cPPT和WPRE同时携带(+cPPT,+WPRE)时,两个因子发挥了协同效果,细胞数量、荧光强度二者都比cPPT、WPRE单独携带时有大幅度的增加,得到了超出预期的结果。
在用FACS调查EGFP阳性细胞比例时(图6),所有的基因插入比例均呈MOI依赖性的增加,而且cPPT和WPRE同时携带与对照相比,导入效率大约上升了10倍。也就是说,实际上的功能滴度(产量)上升了10倍。
另外,在调查EGFP阳性细胞的平均荧光强度时,(图7),表明cPPT和WPRE同时携带的比WPRE单独携带的要高出很多,细胞基础的蛋白表达量也大幅度增加。
实施例3 携带治疗基因的SIV载体的大量制备及浓缩
如图1所示,以改造型基因转移载体、包装载体、rev表达载体、以及VSV-G表达载体4种质粒为基础,如下制备SIV载体。携带PEDF和FGF2的治疗基因的载体以每20个15cm培养皿为单位进行生产。
按照每一个15cm的塑料培养皿大约1×107(次日密度为70-80%)接种293T细胞,在20ml的含10%胎牛血清的D-MEM培养基中进行24小时培养。24小时培养后,将培养基用10ml的OPTI-MEM培养基进行置换,用于转染。按照每一个培养皿基因转移载体为10μg,包装载体5μg、rev表达载体2μg,VSV-G表达载体2μg溶解在1.5ml的OPTI-MEM培养基后,加入40μl的PLUS Reagent试剂(Invitrogen公司)进行搅拌,在室温下放置15分钟。在其中加入用1.5ml的OPTI-MEM培养基稀释的60μl的LIPOFECTAMINE Reagent进行搅拌,在室温下放置15分钟。将该DNA复合物滴加到上述的15cm培养皿的细胞中,小心振荡混匀,在37℃,5%CO2的孵育器中进行3小时的孵育。在上述培养皿中加入13ml含20%胎牛血清的D-MEM培养基进行培养。
转染后的次日,用新鲜的30ml含10%胎牛血清的D-MEM培养基进行交换培养。转染两天后,回收上清,加入20ml新鲜培养基。回收的上清用0.45μm的过滤器进行过滤,在4℃下保存。转染三天后,回收上清,用0.45μm的过滤器进行过滤,与前一天回收的载体混合,利用高速离心机进行浓缩操作。将回收的载体悬液加入到经过灭菌处理的试管中分装,在42500G,4℃下进行1小时的离心。这种离心操作重复二次,将载体悬液浓缩成500倍-1000倍。载体作为沉淀物进行沉淀,沉淀物在含5%胎牛血清的PBS中进行溶解。浓缩后的载体进行小量分装后,在-80℃下进行保存,一部分被用来进行颗粒滴度测定。颗粒滴度的测定如前述方法同样进行。
实施例4 SIV-hPEDF,SIV-hFGF2同时给药时的视细胞变性抑制效果的探讨
视网膜色素变性是治疗困难的遗传性疾患,目前尚无有效的治疗方法。本发明人进行了SIV载体对小动物视网膜的导入特性和长期毒性试验、以及以疾病模型动物(RCS大鼠)为对象的SIV-PEDF给药的效果判定试验(Gene therapy 10,1503-1511,2003)并得到了良好的结果。由于考虑到神经营养因子PEDF,FGF2的靶细胞不同。因此对这两种神经营养因子的同时给药的神经保护效果进行了探讨。
SIV-hFGF2以及SIV-hPEDF为利用上述方法所构建的。
将SIV-hPEDF,SIV-hFGF2,SIV-EGFP(对照)的各载体悬液按照载体浓度:total 2.5×107TU/ml进行制备。将3周龄的RCS大鼠分成SIV-hPEDF单独给药组,SIV-hFGF2单独给药组,SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2同时给药组,SIV-EGFP给药组四个组,进行视网膜下腔给药。通过上述载体的视网膜下给药,PEDF以及FGF2基因被导入到视网膜色素上皮细胞,并在此分泌出神经保护因子,作用于神经细胞。
载体导入4周后,观察各动物组,探讨载体给药的影响。PEDF以及FGF2作用的视细胞、内颗粒层等神经细胞层以及视网膜色素上皮细胞位于视网膜内。但是,单独摘取视网膜较为困难。因此,摘取了大鼠的后眼部分。后眼部分包含视网膜、脉络膜和巩膜三层膜。通过ELISA法分别对摘取的后眼部分的hPEDF,hFGF2蛋白量进行了测定。载体导入4周后的眼球后眼部分,表现出hPEDF的表达在SIV-hPEDF给药组中有增高的趋势。另外,hFGF2的表达在SIV-hFGF2单独给药组以及同时给药组中有增高的趋势,并证实了SIV-hPEDF、SIV-hFGF2载体给药所引起的hPEDF以及hFGF2基因表达(图8)。
接下来,在载体导入4周后,8周后以及12周后,制备了最大切片面积标本,对视网膜的10个位置(A1-A10)上每100μm范围内的视细胞的细胞核数目进行了计数。SIV-hPEDF、SIV-hFGF2各单独组,以及同时给药组中,载体注射部位附近的3个位置的(A1-A3)视网膜组织中,残存视细胞具有统计学意义,在同时给药组中,证实比单独组有更高的神经保护效果(图9)。另外,载体导入8周后以及12周后,SIV-hPEDF以及SIV-hFGF2的同时给药引起显著的神经保护效果也得到证实(图10以及图11)。
进而,进行了作为功能性评价的电生理学的探讨(视网膜电图:ERG)。视网膜电图是记录对光刺激的视网膜电位变化的检查方法,视网膜发挥功能的情况下,会得到高的振幅。a波来自视细胞,b波主要来自米勒细胞和双极细胞。SIV-hPEDF,SIV-hFGF2的两个单独给药组中,与SIV-EGFP组相比,a,b波两者都得到了有显著统计学意义的高振幅结果。而且,在同时给药组中,得到了高振幅的a,b波,证实同时给药组可以获得更好的神经保护效果。(图12以及图13)。
另外,追加实验组中进行了组织学探讨,未能观察到SIV-hPEDF、SIV-hFGF2的同时给药有明显的炎症、增殖、以及新生血管的结果(无数据表示)。