PL181981B1

PL181981B1 - Extracts from shark cartilage exhibiting antiangiogenic activity and favourably influencing regression of neoplasms and method of obtaining them

Info

Publication number: PL181981B1
Application number: PL95317076A
Authority: PL
Inventors: Eric Dupont; Paul Brazeau; Christina Juneau
Original assignee: Aeterna Lab Inc
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 2001-10-31
Also published as: FI964327A0; HUT76554A; IS4379A; HU9602975D0; FI964327A7; DE69528258D1; NZ284407A; SI0759765T1; CN1541656A; CZ290520B6; CA2188793A1; BR9507552A; ES2182900T3; US5985839A; RO114868B1; CN1147305C; DK0759765T3; ATE224198T1; CZ314196A3; WO1995032722A1

Abstract

1. Sposób otrzymywania wyciagu z chrzastki rekina o wlasciwosciach przeciwno- wotworowych przeciwangiogennych w nie-denaturujacym roztworze wodnym, zawierajacy rozpuszczalne w wodzie komponenty, skladajacy sie z nastepujacych etapów: a) zredukowanie wielkosci chrzastki rekina do rozmiaru czasteczki mniejszego niz lub równego okolo 500 µ m; b) oddzielenie tych komponentów od tego roztworu, w wyniku czego otrzymuje sie mieszanine czasteczek 1 surowy plynny wyciag: 1 c) oddzielenie surowego, plynnego wyciagu od tych czasteczek znamienny tym, ze etap a) redukcji rozmiaru czasteczki jest prowadzony przez homogenizacje chrzastki we wspo- mnianym roztworze, etap c) poprzedza etap d) kolejnego oddzielenia surowego plynnego wyciagu az do otrzymania koncowego plynnego wyciagu zawierajacego czasteczki chrzastki majace mase czasteczkowa nizsza lub równa okolo 500000. PL PL

Description

Chrząstka jest nieunaczynioną tkanką i była badana jako potencjalny środek zawierający czynniki przeciwangiogenne. Jest też tkanką która jest stosunkowo odporna na rozwój nowotworów. Nowotwór związany z chrząstką chrzęstniakomięsak, jest najmniej unaczynionym guzem wśród guzów litych. Angiogeneza (rozwój naczyń) jest jednym z ważnych czynników w rozwoju guza. Odrębne lite masy guza pojawiająsię jeśli komórki guza potrafią wywoływać stan iż przylegająca sieć naczyń krwionośnych rozprzestrzenia się tak, by zaspokoić wymagania pokarmowe nowotworu. Dlatego też czynniki związane ze stymulacjąangiogenezy były badane ze względu na ich rolę w rozwoju guza, badano także czynniki antyangiogenne jak również leki posiadające działanie hamujące angiogenezę, jako narzędzia do kontroli wzrostu guzów lub powodowania ich regresji.

Stwierdzono, ze chrząstka łopatki u cieląt zwiera substancję, która hamuje unaczyniame guzów htych (Langner i wsp. 1976). Ze względu na jej zachęcające działanie jako czynnika przeciwnowotworowego, szukano źródeł dających większe ilości chrząstki.

Rekiny to zwierzęta stanowiące potencjalne źródło tego rodzaju inhibitora angiogenezy ponieważ ich szkielet wewnętrzny złożony jest wyłącznie z chrząstki (6% masy ciała w porównaniu z 0,6% u cieląt). Interesującą cechą rekinów jest też ich niska podatność na nowotwory. Proponowano wiele hipotez tłumaczących to niskie prawdopodobieństwo rozwoju nowotworów u rekinów. Marchaloms i wsp. (1990) stwierdzili, obecność przeciwciał IgM zdolnych do atakowania dowolnego czynnika obcego. McKinnay i wsp. (1990) wykazali, że rekiny zawierają makrofagi zdolne do odróżnienia normalnych komórek od komórek nowotworowych i do niszczenia tych ostatnich. Rosen i Woodhead (1980) postulowali, że rzadkość występowana nowotworów u Elasmobrancha (grupy do której należą rekiny i raje) może wynikać z wysokiej mocy jonowej ich tkanek, która jest odpowiednikiem wysokiej temperatury ciała. Autorzy ci uważają że w tych warunkach układ odpornościowy prowadzi nadzór immunologiczny z wydajnościąbliską 100%. Moore i wsp. (1993) wykryli, że rekiny wytwarzają aminosterol o właściwościach przeciwbakteryjnych przeciwpierwotniaczych. Ostatecznie, Lee i Langer (1983) i Folkman i Klagsbrun (1987) wykazali, że rekiny produkują substancję, która hamuje tworzenie nowych naczyń. Lee i Langer (op. cit.) wyizolowali tę substancję przez jej ekstrakcję z chrząstki rekina w warunkach denaturujących (ekstrakcja guanidyną). Te proces ekstrakcji jest jednak bardzo długi (41 dni) i w efekcie mogą powstawać ekstrakty zawierające zdenaturowane czynniki. Substancja czynna izolowana z cieląt ma masę cząsteczkową 16 kilodaltonów (kd), ta sama grupa naukowców nie podała jednak dokładnej masy cząsteczkowej substancji izolowanej z rekinów. Definiowana jest ona tylko jako substancja o masie cząsteczkowej większej od 3500 daltonów. Oikawa i wsp. (1990) zastosowali tę samą procedurę ekstrakcji jak opisana przez Lee i Langera ale trwająca znacznie krócej (2 dni zamiast 41 dni). Substancja wyizolowana z chrząstki rekina przez Oikawa i wsp. ma masę cząsteczkowąw zakresie od 1000 do 10000 daltonów. Schinitsky (USP 4.473.551) opisał wodny wyciąg ze sproszkowanej chrząstki rekina który ma właściwości przeciwzapalne sam lub w połączeniu z glukozą. Nie było żadnych sugestii w tym patencie by składnik tego

181 981 ekstraktu miał właściwości przeciwangiogenne lub przeciwnowotworowe. Kuetner i wsp. (USP 4.746.729) wyizolowali inhibitor elastazy białych krwinek obojętnochłonnych o różnokształtnych jądrach komórkowych (PMN) z chrząstki wołu. Inhibitor ten uzyskano z wodnego wyciągu chrząstki, z którego usunięto cząsteczki o masie cząsteczkowej większej od 50000 daltonów. Frakcjonowane na Sephacryl S-200 dało liczne frakcje, z których połączono frakcje 10-40 kD wykazaniu przez nie aktywności przeciwelastazowej. Czynny składnik ma punkt izoelektryczny 9,5 i może mieć masę cząsteczkową około 15000 daltonów. Kuetner i wsp. (USP 4.042.457) wykazali także, że chrząstka wołowa ma składnik o masie cząsteczkowej mniejszej od 50000 daltonów mający aktywność hamującą proliferację bez wpływu na wzrost komórek śródbłonka. Spilburg i wsp. (USP 4.242.582) wyizolowali dwie glikoproteiny o masie cząsteczkowej 65 kD i pl 3.8 z chrząstki wołowej (ekstrakcja guanidyną), które wykazują działanie przeciwtrypsynowe i zdolność do hamowania wzrostu komórek śródbłonka.

Chrząstka cielęca i z rekina zawierają wiele aktywności biologicznych takich jak aktywność hzozymu, aktywność stymulująca wzrost komórek, aktywność hamująca kolagenazy typu I i IV, elastazę oraz proteazy takie jak trypsyna, chymotrypsyna i plazmina.

Sposoby otrzymywania wyciągów i frakcji z chrząstki rekina sąjuż znane. Niektóre z nich dają sproszkowaną surową chrząstkę bez jakiejkolwiek ekstrakcji (USP 5.075.112), inne stosują czynniki denaturujące takie jak guanidyna (USP 4.243.582) lub reakcje enzymatyczne by pozbyć się struktur mięśniowych, nerwowych czy naczyniowych otaczających chrząstkę oraz organiczne rozpuszczalniki by usunąć tłuszcze (USP 3,478.146,4.350.682 i 4.656.137) oraz by uzyskać wyciąg z chrząstki, podczas gdy inne wytwarzają po prostu wodne wyciągi (w wodzie (USP 4.473.551) lub roztworach soli (USP 4.746.729)) przez usunięcie materiału, który nie uległ solubilizacj i. W śród tych ostatnich zatrzymywano konkretne frakcj e o konkretnych masach cząsteczkowych do dalszych badań i oczyszczania (p. dyskusja powyżej).

Podsumowując, wiadomo, że chrząstka rekina zawiera składnik (lub składniki) przeciwangiogenne, na ogół badane w teście kiszonki rogówki królika lub w teście kosmówki omoczniowej (CAM). Dotychczas badano całą sproszkowaną chrząstkę na guzach in vitro, na ksenograftach ludzkiego czerniaka przeszczepionego do myszy „nudę” (USP 5.075.112) oraz badanego w CAM pod kątem swego działania przciwangiogennego. Jednak nie było danych o bezpośrednim wpływie wyciągu z chrząstki na komórki nowotworowe.

Angiogeneza jest nie tylko związana z rozwojem nowotworów. Wiele chorób lub stanów wpływających na różne systemy fizjlogiczne (wskazane w nawiasach) zależy od angiogenezy, m. in. artretyzm i płytki miażdżycowe (kości i więzadła), retinopatia cukrzycowa, jaskra neowaskulama, unaczynianie jaglicy i przeszczepów rogówki (oko), łuszczyca, twardzina skóry, naczyniaki krwionośne i blizny hipertroficzne (skóra) zrosty naczyniowe i naczyniako-włókniaki (układ krwionośny). Tak więc każdy nowy czynnik przeciwangiogenny mógłby znaleźć zastosowanie w leczeniu tych chorób jak i w terapii nowotworów. Pomimo, iż znanym jest cenne oddziaływania takie jak przeciwangiogenna aktywność znaleziona została w chrząstce rekina, jesteśmy przekonani, że wyciąg o wyższych parametrach wydajności dla tych wartości aktywności może być przedmiotem dalszego rozwoju. Dlatego też staramy się udoskonalić ten proces.

Przedmiot wynalazku

Obecny wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania wyciągów mających właściwości przeciwangiogenne (zmniejszające powierzchnię naczyń krwionośnych obserwowanych in vivo na eksperymentalnie wywołanych nowotworach), aktywność powodującą regresję nowotworów in vivo oraz wykazujących bezpośredni efekt hamujący na linie komórek nowotworowych. Wyciągi te pochodzą z chrząstki rekinów zwanych psem morskim lub czarnym psem morskim (Squalus acanthias). Proces tren nie wymaga żadnego denaturującego rozpuszczalnika czy produktu i nie wymaga stosowania żadnego enzymu. Polega na uzyskaniu homogenatu całej chrząstki w wodnym roztworze o obojętnym pH, korzystnie w czystej wodzie, następnie homogenat jest odwirowywany a osad i supematant zatrzymywane do dalszej obróbki. Osad jest liofilizowany i badany pod kątem aktywności przeciwnowotworowej i przeciwangiogennej in vivo i in vitro z lub bez dodatku supematantu. Wykazano, że supematant ma właściwości przeciwangiogenne i powo

181 981 dujące regresję guzów in vivo. Następnie badano skład supematantu stosując kilka różnych sposobów. Frakcjonowanie tego supematantu doprowadziło do zdefiniowania niektórych z jego składników czynnych. Frakcje następnie badano pod kątem ich bezpośredniego działania in vitro na linie komórek rakowych. Zakłada się więc, że niefrakcjonowany supematant posiada in vitro taką aktywność. Liofilizacja znacząco niszczy aktywność tych frakcji i należy podkreślić, ze jasno rozróżnia się wyciągi stałe i płynne i ich frakcje.

Sposób według wynalazku polega na otrzymywaniu płynnego wyciągu chrząstki i jego płynnych frakcji użytecznych w leczeniu chorób angiogenezozależnych lub rozrostowych.

Wynalazek dotyczy też stosowania wyciągów z chrząstki w leczeniu chorób zależnych od angiogenezy. Wstępne badania kliniczne wykazały skuteczność preparatów farmaceutycznych zwierających stężony niefrakcjonowany płynny wyciąg w poprawianiu stanu pacjentów cierpiących na choroby związane z angiogenezą. Wśród nich uzyskano pozytywne efekty dla chorób dermato logicznych takich jak łuszczyca a także dla jednego przypadku raka prostaty. Trądzik, jeszcze jedna choroba dermatologiczna nie uważana za zależną od angiogenezy, też był leczony z zadziwiającym powodzeniem. Aktywności otrzymanego według wynalazku wyciągu są wyraźnie wyższe niż znane ze stanu techniki. Co więcej w wyciągu z, chrząstki po raz pierwszy stwierdzono, eo zasługuje na podkreślenie, bezpośredniąprzeciwnowotworowąaktywność. Uzyskane wyższe wartości potwierdzone sposobem według wynalazku podkreślają ich cechy różnicujące, w stosunku do stanu techniki: wyciąg jest homogenizowany w roztworze wodnym a składniki o wysokim ciężarze cząsteczkowym są odzyskiwane z supematantu.

Według wynalazku sposób otrzymywania wyciągu z chrząstki rekina w niedenaturującym roztworze wodnym, zawierający rozpuszczalne w wodzie komponenty chrząstki, składający się z następujących etapów:

a) zredukowanie wielkości chrząstki rekina do rozmiaru cząsteczki mniejszego niż lub równego około 500μιη,

b) oddzielenie tych komponentów od tego roztworu, w wyniku czego otrzymuje się mieszaninę cząsteczek i surowy płynny wyciąg: i

c) oddzielenie surowego, płynnego wyciągu od tych cząsteczek polega na tym, że etap a) redukcji rozmiaru cząsteczki jest prowadzony przez homogenizacje chrząstki we wspomnianym roztworze, etap c) poprzedza etap d) kolejnego oddzielenia surowego płynnego wyciągu aż do otrzymania końcowego płynnego wyciągu zawierającego cząsteczki chrząstki mające masę cząsteczkową niższą lub równą około 500000.

Końcowy płynny wyciąg może być zagęszczony w taki sposób, że otrzymuje się końcowy płynny wyciąg wzbogacony cząsteczkami chrząstki o masie cząsteczkowej zawartej pomiędzy około 1000 i około 500000.

Docelowy wyciąg może także być następnie frakcjonowany, w celu otrzymania frakcji, które zawierać mogą rozmaite odmienne cząsteczki. Frakcjonowanie takie może być prowadzone za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), po czym otrzymana frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej zawartej pomiędzy około 1000 i około 2500.

Etap frakcjonowania może być także przeprowadzony za pomocą rozdziału na Rotoforze i elektroforezy, przy czym frakcja płynna zawiera otrzymane: cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 29000 i punkcie izoelektrycznym około 5.3 do około 6.26., lub cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 35000 i punkcie izoelektrycznym około 7.64 do około 7.94 lub cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 48000 i punkcie izoelektrycznym około 7.29 do około 7.94 lub cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 60000 i punkcie izoelektrycznym około 5.30 do około 6.26.

Etap frakcjonowania może być także prowadzony drogą kombinacji rozdziału na Rotoforze i FPLC, w którym to przypadku otrzymana frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej zawartej pomiędzy około 70000 i około 120000., lub cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej zawartej pomiędzy około 60000 i około 70000., lub cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 35000 i około 46000., lub cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 29000., lub cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej pomiędzy około 1000 i około 2500.

181 981

W prowadzonym według wynalazku powyższym sposobie nie-denaturujący wodny roztwór składa się z wody, a poszczególne etapy postępowania są przeprowadzane w temperaturze 4°C.

Sposób polega dodatkowo na tym, że etap a) i b) przeprowadza się w czasie około 30 minut.

W powyższym, sposobie chrząstka rekina i nie-denaturujący wodny roztwór stosowane są w proporcjach około 1 kg mokrej chrząstki na 1-2 litrów roztworu.

Dodatkowo zgodnie ze sposobem etap rozdziału c) przeprowadza się przez wirowanie.

Krótki opis rysunków

Obecny wynalazek będzie łatwiejszy do zrozumienia na podstawie tych konkretnych przykładów, które są uzupełnione przez rysunki, ich celem jest zilustrowanie wynalazku raczej niż ograniczenie jego zakresu:

Rysunek 1 pokazuje hamującą aktywność wzrastających dawek chrząstki rekina (wyciąg stały) w stosunku do komórek ZR75-1 i MCF-7.

Rysunek 2 pokazuje krzywe odpowiedzi na dawkę ilości komórek MCF-7 mierzonych na podstawie ilości ich DNA w obecności wzrastających stężeń estradiolu w obecności dwóch stężeń liofilizatu chrząstki lub bez niego.

Rysunki 3a i 3b pokazują porównanie przekrojów przez wątrobę szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i supematantu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Rysunki 4a i 4b pokazują porównanie przekrojów przez nerkę szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i supematantu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Rysunki 5a i 5b pokazują porównanie przekrojów przez płuca szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i supenatantu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Rysunki 6a i 6b pokazują porównanie przekrojów przez gruczoł mleczny szczurów z rakiem sutka, którym podano przez zgłębnik kombinację liofilizatu i supematantu chrząstki oraz szczurów, którym podano tylko wodę.

Rysunek 7 jest histogramem sporządzonym na podstawie rys. 6a i 6b ilustrującym wpływ wyciągu z chrząstki na powierzchnię naczyń krwionośnych w guzie.

Rysunek 8 przedstawia profil elektroforetyczny w warunkach niedenaturujących frakcji płynnych rozdzielonych na Rotofor, standardy masy cząsteczkowej pokazane są z lewej, za nimi jest próbka surowego filtratu przed frakcjonowaniem dla porównania z wyizolowanymi frakcjami.

Rysunki 9a i 9b ilustrująznacznąpoprawę stanu dwóch pacjentów cierpiących na łuszczycę, jeden z nich z zrogowaceniem (9a), drugi bez (9b) leczonych lokalną aplikacją preparatu zawierającego skuteczną ilość stężonego wyciągu z chrząstki (dolne zdjęcia) porównane z ich stanem wyjściowym (górne zdjęcia).

Opis wynalazku

Chrząstkę uzyskano ze zdrowych rekinów (pies morski i czarny pies morski) po ich złapaniu. Tkankę mięśniową i łączną usuwano przez drapanie skalpelami i nożyczkami styrylizowanyrm w etanolu. Chrząstkę następnie pakowano pod próżnią do torebek plastikowych i zamrażano w -20°C do dalszego użycia.

Przygotowanie liofilizowanej chrząstki

Chrząstkę rozmrażano do 4°C. Chrząstkę następnie przepuszczano trzy razy przez pory maszynki do siekania mięsa przemytej etanolem wraz z równą ilością (waga/objętość) wody, która była oczyszczona poprzez odwrotnąosmozę i filtrowanie przez filtr 0,1 um, by otrzymać pierwszą mieszaninę. Zamiast wody można by stosować wiele roztworów wodnych przy zachowaniu oboj ętnego pH by uniknąć lizy czy denaturacj i składników chrząstki.

Mieszaninę następnie homogenizowano poprzez mieszanie z maksymalną prędkością w przemysłowym homogenizatorze w 4°C przez 10 minut. Na tym etapie wielkość cząstek jest mniejsza od 500 um. Mieszaninę wirowano przy 13600 x g przez 15 minut w 4°C. Powstający osad liofilizowano przez 24 do 48 godzin. Ta pierwsza frakcja będzie określana dalej jako liofihzat lub wyciąg stały.

181 981

Supematant filtrowano przez filtr Whatman 24 um by pozbyć się cząsteczek mogących wpływać na zachowanie kolumny ultrafiltracyjnej. Przefiltrowany materiał poddawano następnie ultrasączemu w 4°C na kolumnie o przepływie stycznym o porowatości 500000 daltonów. Supematant filtrowano w sposób sterylny na filtrze 0.22 um, i rozdzielono do sterylnych butelek do dalszego używania. Ta frakcja będzie dalej nazywana supernatantem lub wyciągiem płynnym.

Alternatywna procedura o większej sprawności została opracowana by otrzymywać hofihzat i supematant. Etap wirowania przy 13600 x g przez 15 minut a następnie zgrubne sączenie na filtrach Whatman zostało zastąpione wirowaniem w wirówce CEPA wyposażonej w nylonową kieszeń o porowatości 30 uM, przy 3000-4000 x g, Preparat 20 kg/201 może być wirowany w ten sposób w ciągu 30 minut dostarczając 21 litrów supematantu. Otrzymana objętość płynu jest jeszcze wyższa niż wyjściowa objętość wody, co oznacza, że zbiera się część zawartości wody z samej chrząstki. Liofihzat i supematant mogą mieć następujący skład:

Lipidy Białka Wilgoć Sód

Liofilizat

- 7,35%’

- 46,2%²

- 20,4%

Potas Wapń Magnez

Cynk i żelazo

-4,16 mg/g²

- 2,64 mg/g

- 114 mg/g

- 1,49 mg/g

- ślady

Lipidy Białka Wilgoć Sód

Supematant

-0,10%'

- 8 mg/ml²

- 98,8%

Potas Wapń Magnez

Cynk i żelazo

-33,6 mg/100 g³

-39,2 mg/lOOg - 2,0 mg/100 g - 1,1 mg/100 g - ślady ^1,2 Mierzone zgodnie z wytycznymi podanymi w AAOAC Official (1984) sekcje 16.219-22012.055, odpowiednio ² Mierzone zgodnie z procedurą SAA.

Zawartość białka oznaczana jest metodą Ki ej dahla; która w istocie mierzy azot organiczny (N). Organiczny azot jest przeliczany na odpowiadające białko przez zastosowanie następującego równania:

Zawartość białka (mg/ml) = %N x 6.25

100

Ponieważ węglowodany nie są wykrywalne, można założyć, że są obecne w ekstrakcie ale w formie proteoglikanów lub mukopolisacharydów. Jest możliwe, że związki te są wliczone do mierzonego poziomu wilgoci. Liofilizat zawiera niespodziewany poziom wilgoci, który był mierzony poprzez grupy OH. Ponieważ 20% zawartość wodyjest zbliżona do procentu węglowodanów normalnie odzyskiwanych z chrząstki podczas gdy wilgotność hofilizatu powinna być zbliżona do 0%, hipoteza ta powinna zostać sprawdzona.

181 981

Sterylność była kontrolowana stosując specyfikację USP XXII przez:

1) Laboratoire de genie sanitaire du Quebec Inc.

1090,1 ' Escarbot, Centre Industriel St. Mało, Quebec GIN 4J4; oraz

2) Northview Laboratories Inc.

1880 Holste Road, Northbrook, IL, 60062 USA

Rejestracja FDA nr 14-18028.

Oznaczenie aktywności:

Liofilizat

Oznaczenia in vitro

Oznaczenia te przeprowadzono na zależnych od hormonów liniach komórkowych MCF-7 i ZR75-1 (odpowiednio numery ATCC(R) 22-HTB i 1500-CRL).

Komórki ZR75-1:

Pożywka podstawowa RPMI:

g RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (Sigma R8755), 17,875 g Hepes (wolny kwas, SigmaHO763), 0,55 g pirogronianu sodowego (Sigma P5280) i 10gNaHCO₃ zmieszano w5 litrach czystej wody i doprowadzono pH do 7,40 za pomocą NaOH.

Jeśli ten roztwór nie jest używany od razu musi być chroniony od światła by chronić związki wrażliwe na światło. Roztwór przesączono, rozlano do sterylnych kolb 500 ml i przechowywano w 4°C nie dłużej niż trzy miesiące.

Pożywka do utrzymywania hodowli komórkowych

Do pożywki podstawowej RPMI dodawano 10% (obj/obj) FBS (bydlęca surowica płodowa), 100 U penicyliny G i 50 ug siarczanu streptomycyny (Sigma PO906) na ml pożywki, 2 mM L-glutaminę (Sigma G1517) i 1 nm, E₂ (β-estradiol Sigma E8875).

Pożywka doświadczalna

Podstawową pożywkę RPMI uzupełniano 5% FBSA (bydlęca surowica płodowa absorbowana na dekstranie-węglu drzewnym), 2 mM L-glutaminą, 100 U penicyliny G i 50 ug siarczanu streptomycyny na ml pożywki oraz 50 ng insuliny (Sigma). Do tej pożywki dodawano wzrastające stężenia liofilizatu opisanego powyżej oraz różne stężenia estradiolu (od 10'¹² do 10’⁵ M).

Komórki MCF-7

Pożywka podstawowa DME-F 12:

Pożywka DME-F12 (bez kwaśnego węglanu i czerwieni fenolowej, Sigma) była rekonstytuowana zgodnie z zaleceniami producenta w czystej wodzie. Na 1 litr dodawano 1.2 g kwaśnego węglanu sodu i doprowadzano pH do 7,40 przez dodanie NaOH/HCl. Roztwór ten sączono, rozlewano do sterylnych kolb 500 ml i przechowywano w 4°C nie dłużej niż trzy miesiące.

Pożywka do utrzymywania hodowli komórkowych

Do pożywki podstawowej DME-F 12 dodawano 10% (obj/obj) FBS (bydlęca surowica płodowa), 100 U penicyliny G i 50 ug siarczanu streptomycyny (Sigma PO906) na ml pożywki, 2 mM L-glutaminę (Sigma G1517) i 1 nm, Ej (estradiol).

Pożywka doświadczalna

Podstawową pożywkę DME-F12 uzupełniano 5% FBSA (bydlęca surowica płodowa absorbowana na dekstranie-węglu drzewnym), 2 mM L-glutaminą 100 U penicyliny G150 ug siarczanu streptomycyny na ml pożywki oraz 50 ng/ml insuliny (Sigma). Do tej pożywki dodawano lifilizat i estradiol tak jak opisano dla komórek ZR75-1.

Przygotowanie FBSA

Bydlęcą surowicę płodową mieszano z 1% (waga/obj) węglan drzewnym (zasadowy węgiel do odbarwiania). Do roztworu surowicy-węgla drzewnego dodawano roztwór dekstranu T70 aby uzyskać stężenie O,l%(obj/obj). Mieszaninę wytrząsano przez noc w 4°C. Po odwirowaniu w 4°C przez 30 minut przy 10000 x g surowicę dekantowano, ponownie mieszano z takimi samymi proporcjami węgla drzewnego i dekstranu, mieszano w temperaturze pokojowej przez

181 981 trzy godziny i ponownie wirowano. Następnie surowicę inaktywowano termicznie w 56°C przez 20 minut, przesączano sterylnie i rozporcjowywano do sterylnych stożkowych probówek Falcona.

Komórki ZR75-1 i MCF-7 hodowano do osiągnięcia gęstości 20000 komórek na studzienkę w płytkach z 24 studzienkami lub 150000 komórek na studzienkę przy płytkach z 6 studzienkami, i badano w obecności lub nieobecności różnych stężeń liofilizatu przygotowanego jak opisano powyżej. Wszystkie doświadczenia wykonywano w trzech powtórzeniach. Pożywki usuwano i wymieniano co dwa dni. Komórki hodowano w inkubatorze pod ciągle nawilżaną atmosferą zawierającą 5% CO₂ w 37°C przez 17,7, 3 lub 3 dni, co odpowiadało czterem kolejnym doświadczeniom. Mierzono zahamowanie wzrostu komórek przez bezpośrednie liczenie komórek lub mierzenie całkowitej zawartości DNA studzienki.

Stężenie hofilizatu	Hamowanie komórek (%)
MCF-7	ZR75-1
1 eksperyment 17 dni 1 mg/ml	1 5	2 00
5 mg/ml	14 33	33 6
10 mg/ml	62.66	90 8
2 eksperyment. 7 dni 1 mg/ml	3.73	0.97
5 mg/ml	15.7	29.0
10 mg/ml	68.37	66 0
3 eksperyment 3 dni 50 mg/ml	95.8	95 00
100 mg/ml	94.6	98.00
4 eksperyment 3 dni 10 mg/ml	34.4	51.5
20 mg/ml	62.5	70.5
50 mg/ml	95 8	95
100 mg/ml	94.6	98

Podane powyżej procenty zahamowania wzrostu komórkowego pokazują, że liofilzat może w sposób zależny od dawki hamować wzrost komórek tych dwóch linii komórkowych.

Rysunek 1 pokazuje, że dawki 50 i 100 mg/ml hofilizatu wyraźnie powodująhipoplazję w tych liniach komórkowych po trzech dniach podawania.

Rysunek 2 pokazuje, że w obecności 10'¹² do 10'⁹ M esradiolu, komórki traktowane reagują tak jak komórki kontrolne ponieważ nie ulegają stymulacji przez te dawki hormonu. Jednak powyżej stężeń 1 nM komórki kontrolne sąsilnie stymulowane, a stężenia DNA osiągają3,75 ug w obecności 10’⁷ M estradiolu (w porównaniu 0,69 ug w kontroli bez estradiolu) W komórkach traktowanych 30 i 50 mg/ml hofilizatu poziom DNA mierzony przy maksymalnej stymulacji wynosi odpowiednio 1,9 i 1,8 ug. Rysunek 2 pokazuje, że stała powinowactwa (Km) komórek traktowanych w stosunku do estradiolu) est 3 do 16 razy wyższa niż wartość Km komórek kontrolnych, w obecności odpowiednio 30 i 50 mg/ml. Oznacza to, że wyższe stężenia estradiolu sąkonieczne dla uzyskania takiego samego wzrostu komórek w obecności liofilizowanego stałego wyciągu z chrząstki. Tak więc wyciąg ten obniża maksymalną odpowiedź (90% hamowania odpowiedzi) i zwiększa stałą powinowactwa traktowanych komórek w stosunku do estradiolu.

Oznaczenia in vivo

400 40-dniowych samic szczura rasy Sprague-Dawley (kupionych od Charles River Co., St. Constant, Quebec) adaptowano do ich otoczenia przez 12 dni. Po tym okresie podawano 20 mg DMBA/ lml oleju kukurydzianego (9,10 dimetylo-l,2-benzantracen, kupiony od Sigma Chemical Corporation) z pomocą zgłębnika. Trzy miesiące po tej procedurze u 240 szczurów rozwinął

181 981 się rak sutka, i zostały one podzielone na dwie grupy. Pierwsza grupa składa się z 5 podgrup szczurów. Szczury z grup eksperymentalnych dostawały codziennie dawkę wzrastających stężeń liofilizatu w 3 ml wody przez osiem tygodni podczas gdy grupa kontrolna dostawała taką samą objętość wody. Druga grupa była złozona z 4 podgrup szczurów. Szczury z grup eksperymentalnych otrzymywały codzienną dawkę liofilizatu w 3 ml wody (około 25 mg białka) z lub bez supematantu, przez dziesięć tygodni podczas gdy grupa kontrolna otrzymywała tę samą objętość wody. Tylko jedna podgrupa z drugiej grupy szczurów traktowanych stężeniem 3000 mg/kg/dzień liofilizatu i 3 ml supematantu dostawała także śródotrzewnowy (i.p.) zastrzyk mniejszej dawki supematantu (około 8 mg białka w 1 ml wody).

Szczury ważyły 151-175gna początku obu eksperymentów i otrzymywały karmę i wodę do picia ad libitum. Pierwsza grupa szczurów miała guzy o przeciętnej średnicy 0,9 cm podczas gdy druga grupa szczurów miała guzy o przeciętnej średnicy 0,6 cm. Wyniki można podsumować w następujący sposób:

Dzienne dawki wyciągu chrząstki podawanego przez zgłębnik	% zahamowania wzrostu guza (zmniejszenie średnicy guza w porównaniu z kontrolą)
1 doświadczenie ’ czas trwania 8 tygodni
500 mg/kg/dzień	2%
1000 mg/kg/dzień	4%
3000 mg/kg/dzień	14%
5000 mg/kg/dzień	15%
2 doświadczenie - czas trwania 10 tygodni
3000 mg/kg/dzień	12%
3000 mg/kg/dzień + 3 ml supematantu	18%
3000 mg/kg/dzień + 3 ml supematantu + 1 ml zastrzyku i p. supematantu	20%

Wyniki te wykazują, że liofiłizat zawiera czynny składnik, który jest wchłaniany w przewodzie pokarmowym i który wpływa na wielkość guza. Efekt ten mógłby być bezpośrednim działaniem na komórki guza łub wynikiem działania przeciwangiogennego.

Wyniki te także pokazują, że supematant ma aktywność, która powoduje dodatkowe zmniejszenie guza o około 5% nawet gdy supematant jest bardzo rozcieńczony (ilość białka obecnego w 3 ml supematantu to około 25 mg).

Histopatologia

Dla oceny toksyczności aktywnych cząsteczek wyciągu z chrząstki, zwierzęta użyte w opisanych powyżej doświadczeniach in vivo zostały zabite przez dekapitację i do analizy wzięto następujące tkanki: wątrobę, płuca, nerki, serce, mózg, mięśnie i gruczoł mleczny. Tkanki te pozbawiano tłuszczu a następnie utrwalano je dwa dni wpłynie Bouina. Po odwodnieniu w etanolu, utrwalone tkanki zatapiano w parafinie. Otrzymywano przekroje tkanek, umieszczano na szkiełkach, barwiono hematoksyliną i obserwowano pod mikroskopem.

Badania histopatologiczne wykazały, że nie ma szkodliwych efektów przy stosowaniu najwyższych dawek samego liofilizatu (dane nie przedstawione) lub przy stosowaniu liofilizatu w połączeniu z supematantem (p. Rys. 3a i 3b, 4a i 4b, oraz 5a i 5b).

Sugeruje to, że liofiłizat i supematant mają wybiórczą aktywność powodującą zmniejszenie wielkości guza.

W zrakowaciałym gruczole mlecznym (p. Rys. 6a 16b) zaobserwowano znaczne zmniejszenie powierzchni naczyń krwionośnych. Efekt przeciwnaczyniowy aktywnych cząsteczek jest więc potwierdzony przez uzyskane wyniki, które sąpodsumowane na następnym rysunku i histogramie:

Rysunek 7 pokazuje, że gdy stosowana była kombinacja liofilizatu (p.o.) z supematantem (p.o. + i.p.) (p. Rys. 6a i 6b) zaobserwowano zmniejszenie powierzchni naczyń krwionośnych o 55%.

181 981

Zmniejszenie wielkości nowotworu może być spowodowane poważnym zmniejszeniem jego unaczyniama, bezpośrednim wpływem na komórki nowotworowe, lub przez kombinację obu tych zjawisk. Przeciwangiogenne działanie wyciągów przedstawiono powyżej. Bezpośredni wpływ może być związany z działaniem na komórki hormono-zależne, co wymaga jeszcze potwierdzenia in vivo.

Ponieważ wyżej wymienione wyniki pokazały, że supematant ma dodatkowy efekt oprócz i ponad działanie liofilizatu na komórki ZR75-1, dalej badano jego składniki.

Otrzymywanie płynnych frakcji zawierających czynne cząsteczki

Zebrano chrząstkę rekina i preparowano tak jak opisano powyżej z pominięciem etapu zagęszczania. Po odwirowaniu, odrzucono osad i supematant preparowano tak jak opisano powyżej do etapu jałowego sączenia przez filtr 0,22 um.

Supematant będzie dalej nazywany surowym przesączem, tzn. produktem po ultrasączemu.

Tak otrzymany surowy przesącz przepuszczano przez FPLC (Szybka Cieczowa Chromatografia Białek).

Warunki FPLC

Kolumna: Hiload 26 mm x 60 cm Sephacryl S-300

System FPLC: od firmy Pharmacia

Wszystkie próbki sączono przez filtr 0,22 um przed naładowaniem kolumny. Do elucji stosowano roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS) przesączony i odgazowany przez 15 minut. Objętość nakładanej próbki na ogół wynosiła 3,2 ml (do 13 ml). Tempo przepływu wynosiło 1 ml/minutę. Zbierano frakcje po 10 ml. Wyeluowane związki wykrywano badając absorpcję w ultrafiolecie (280 nm). Uzyskano krzywą kalibracji stosując zestaw do kalibracji MW-GF-1000 firmy Sigma, próba do kalibracji miała tę samąobjętość co nałożona próbka do analizy (3,2 ml). Objętość elucji próbki dedukowano z wykresu masy cząsteczkowej związków z zestawu do kalibracji w zależności od ich objętości elucji od której odejmowaną objętość pustą kolumny. Objętość pustą uzyskiwano przez wstrzyknięcie Dextran Blue o m. cz. 2 000 000. Aktywność frakcji testowano na komórkach ZR75-1. Interesujące frakcje identyfikowano i ich właściwości sprawdzano w dalszych badaniach (opisanych poniżej).

Dodatkową charakterystykę składników czynnych przesączu przeprowadzano na aparacie Rotofor (Biorad 170-2950; p. opis izoelektroogniskowania poniżej) i na filtrach Amicono o rożnych wartościach odcięcia by uzyskać frakcje o masie cząsteczkowej między 10-30 kD, 30-100 kD i ponad 100 Kd.

Izoelektroogniskowanie

Preparat z chrząstki rekina (46 ml przesączu 1 kg/1) dializowano przez noc wobec 4 htrów czystej wody zawierającej 5% glicerol w temperaturze 4°C stosując membranę Spectra porę #7 MWCO 3500 kD (Spectrum 132110). Dializowany roztwór zmieszano z 2,75 ml amfolitów (Pharmacia #80-1125-87) pH 3,5-10 i 0,5 g CHAPS (Sigma C3023; 3-((cholamidopropylo)-dimetyloamino)-l-propano-siarczan). Objętość uzupełniano do 55 ml czystą wodą. Roztwór nakładano na Rotofor. Izoelektroogniskowanie przeprowadzano w 4°C przy stałej mocy 12 watów (zasilacz 3000 XI firmy Biorad 165-0544) przy stałym krążeniu wody w celu zapewnienia utrzymania temperatury. Na początku rozdziału napięcie wynosiło 380 woltów a natężenie 31 mA. Po stabilizacji natężenia (na 14 mA) napięcie wynosiło 870 V. Izoelektroogniskowanie zakończono i zebrano 20 frakcji.

Frakcja	Objętość	pH
1	2	3
1	3,7	3,56
2	2,1	4,01
3	2,2	4,18
4	2,3	4,31

181 981 ciąg dalszy

1	2	3
5	2,2	4,63
6	2,1	5,03
7	2,5	5,30
8	2,1	5,50
9	2,4	5,81
10	2,5	6,26
11	2,3	7,00
12	2,4	7,29
13	2,4	7,64
14	2,5	7,94
15	2,3	8,32
16	2,5	8,62
17	2,4	8,94
18	2,9	9,30
19	3,1	9,88
20	3,6	10,71

Identyfikacji tych białek dokonano przez określenie ich masy cząsteczkowej w elektroforezie na żelu (Laemmli, U.K. (1970) Naturę (Lond.) 227: 680).

Frakcje te rozcieńczono czterokrotnie buforem do nakładania próbek (p. Laemmli) i próbki 8 ul poddawano elektroforezie w warunkach nieredukujących. Rysunek 8 pokazuje profil elektroforę tyczny każdej frakcji i materiału przed izoelektroogniskowaniem.

Wszystkie frakcje umieszczano w sposób sterylny w butelkach stosując wyciąg typu laminar i przepuszczając je przez sterylny filtr Millipack-60 o porach 0,22 pm.

Zawartość białek we frakcji oznaczano metodą Lowr/ego. Roztwory lkg/21 (wyrażone jako waga surowej chrząstki na litr przesączu) testowano na komórkach ZR75-1 w różnych stężeniach w pożywce hodowlanej. Wyniki można streścić w następujący sposób:

1. test

Przesącz liofilizowano i przepuszczano przez FPLC. Nie wykryto aktywności hipoplazyjnej (dane nie przestawione).

2. test

Testy przeprowadzone na frakcjach z Rotofora. Identyfikacja białek.

Zidentyfikowane frakcje	Punkt izoelektryczny	Wartość środkowa	Masa cząsteczkowa
7-8-9-10	5,30-6,26	5,78	29±lkD
7-8-9	5,30-6,26	5,68	60±lkD
12-13-14	5,30-6,26	7,62	48±lkD
13-14	5,30-6,26	7,79	35±lkD

i. test przeprowadzony dla frakcji FPLC

Frakcje Masa cząsteczkowa

6i7 1-2,5KD

181 981

4. test przeprowadzony na 100 ul frakcjach uzyskanych na sączkach molekularnych Amicon

Badane stężenie	Masa cząsteczkowa	Hamowanie hodowli komórek ZR75-1
100 ug/ml	MW>100kD	64%
100 ug/ml	30 kD<MW< 100 kD	114%
100 ug/ml	10kD<MW<30kD	127%
400 ug/ml	MW<10kD	149%

Frakcje FPLC 6 i 7 zawierajączynne składniki o bardzo niskiej masie cząsteczkowej: 1 do 2,5 kD.

Efekt hipoplastyczny frakcji może być do 33000 razy wyższy od obserwowanego dla liofihzatu. Powyższe wyniki wykazują że liofilizacja w znaczący sposób niszczy i/lub hamuje aktywność białek zawartych w eluacie podczas gdy takie niszczenie me zachodziło przy liofilizacji stałego wyciągu.

Dalsza identyfikacja czynnych składników eluatu

Czynne frakcje (badane na komórkach ZR75-1) są odzyskiwane w następujących zakresach mas cząsteczkowych, określonych przy innym typie oczyszczania wychodząc z tego samego przesączu (1 kg/1) na kolumnie Superose-12 o średnicy 10 mm i długości 30 cm stosując opisane powyżej procedury FPLC i Rotoforu. Wybrano tempo przepływu 1 ml/minutę. Zebrano 45 frakcji po 1 ml.

Frakcje 20-21	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 70.000 do 120 000
Frakcja 22	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 60 000 do 70.000
Frakcje 29-32	aktywność w zachodzących na siebie frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 70 000 do 120 000
Frakcje 34-35	aktywność we frakcjach odpowiadających masie cząsteczkowej 29 000
Frakcje 38-39	aktywność odpowiadająca masie cząsteczkowej 1500 do 2500

Specyficzność

Aby ocenić specyficzność działania na komórki guza, przesącz otrzymany po ultrafiltrowaniu testowano na innych komórkach pochodzących z mezenchymy - ludzkich fibroblastach TENON (HTF), które są normalnymi fibroblastami.

B.In vitro

a. Pacjenci

Stosowano tylko HTF od dwóch pacjentów (jeden z nich był chory na jaskrę neowaskulamą NVG, a drugi na pierwotnąjaskrę o otwartym kącie przesączania, POAG).

b. Przyrządzanie subkultur i hodowanie HTF

Każdą konfluentnąhodowlę pasażowano przez płukanie i odczepianie 0,5 ml 0,05% trypsyny/0,5 mM EDTA (Gibco 610-5300 AG) przez 5-10 minut w 37°C. Następnie dodawano 1,5 ml pożywki DME/F-12 zawierającej 15% FBS w celu unieczynnienia trypsyny/EDTA.

Dysocjację komórek robiono przez mieszanie i przeniesienie do butelek 25 cm³ do których dodawano dodatkową pożywkę zawierającą 10% FBS. Po uzyskaniu konfluencji, HTF przenoszono do butelek 75 cm³ i w końcu do butelek 180 cm³. Po uzyskaniu dostatecznej ilości komórek niektóre komórki stosowano do doświadczeń opisanych poniżej, a inne zamrażano równocześnie by zachować komórki z tego samego pasażu do kolejnych doświadczeń.

c. Protokoły doświadczalne

Po osiągnięciu konfluencji, komórki pochodzące od jednego pacjenta rosnące w dwóch lub trzech takich samych butelkach typu T o pojemności 180 cm³ dysocjowano według opisanej powyżej procedury. Po krótkim odwirowaniu przy niskiej prędkości liczono je stosując licznik ZMI Coulter 216013 wyposażony w 256-Channelyzer.

181 981

Dla wszystkich opisanych poniżej eksperymentów in vitro zaszczepiano około pięćdziesiąt tysięcy komórek do 1 ml pożywki DME/F-12 zawierającej 1%FBS do każdej płytki 16mmipłytki z 12 studzienkami. Siedemnaście godzin po zaszczepieniu dodawano 1 ml świeżej takiej samej pożywki uzupełnionej 1% FBS (kontrolne „absolutne”). Zależnie od protokołu doświadczalengo (p. powyżej i poniżej) do pożywki z 1% FBS dodawano - lub nie dodawano - czynniki wzrostowe (GF) lub przesącz 1 kg/21 (masa chrząstki/objętość wody) i sączono w sposób jałowy. W tym dniu (dzień 0) liczono próbki komórek by określić wydajność wzrostu (powinna być nie mniejsza od 95%).

Czterdzieści osiem godzin po rozpoczęciu doświadczeń komórki płukano i dysocjowano stosując powyżej opisanąprocedurę i ponownie liczono. Liczbę komórek wyrażano jako procent uzyskanej liczby w kontrolach „absolutnych”.

Każda kontrola „absolutna” czyh pozytywna zawierająca odpowiednio 1% lub 5% FBS i każda grupa doświadczalna uzupełniona 1% FBS i poszczególnymi czynnikami wzrostowymi lub przesączem chrząstki składa się z trzech powtórzeń.

Każdy eksperyment przeprowadzano na komórkach jednego lub dwóch pacjentów równocześnie i powtarzano przynajmniej dwa razy.

Stymulację wzrostu fibroblastów przez czynniki wzrostowe (GF) lub przesącz chrząstki porównywano ze stymulacją przez 5% FBS.

W tych doświadczeniach GFy, świński PDGF (pPDGF) i ludzki zrekombinowany bFGF (hr bFGF - dar dla Dr P. Brazeau od Farmitalia Carlo Erba, Mediolan, Włochy) były dodawane w stężeniach 10 do 100 ng/ml w 1% FBS, odpowiednio. Czterdzieści osiem godzin po rozpoczęciu doświadczenia komórki dyspergowano Trypsyną-EDTA i liczono w liczniku Coultera. Wszystkie wartości trzech powtórzeń (kolumny 1,213) podane poniżej odpowiadają jednej dwudziestej zliczeń na studzienkę.

Pacjent B: jaskra

HTF

Dzień 1 Dzień 0 Dzień 1 Dzień 2 płeć: męska wiek: 53 lata liczba komórek na kieszonkę 46170 DME/F12 - 1% FBS - 1% Pen. Strep.

liczba komórek na kieszonkę 65214 DME/F12 - 1% FBS - 1% Pen. Strep.

liczba komórek na kieszonkę 62548 DME/F 12 - 1% FBS - 1% Pen. Strep.

liczba komórek na kieszonkę

	Próba/płytka	1	2	3	średnia	SEM	% wzrostu kontroli
1	2	3	4	5	6	7
Płytka # 1	1	DME/F 12 Dzień 0 1% FBS	3019	2862	2853	65214	71
	2	Dzień +1 1% FBS	2711	2923	2693	62548	1655
	3	Dzień +1 1%FBS	2284	2400	2191	51333	1655	100
	4	Dzień +1 5% FBS	3084	2834	3115	67446	1627	131 **

181 981 ciąg dalszy

	1	2	3	4	5	6	7
Płytka # 2 FDGF	5	DME/F12 Kontrola (1%FBS)	2558	2181	2216	51931	2199	100
	6	1 ng/ml 1%FBS	2425	2580		56056	1228	108
	7	10 ng/ml 1%FBS	4080	3975	4282	92116	1648	177 ♦ ♦♦
	8	100 ng/ml 1%FBS	4625	4356	4450	100285	1442	193 ♦♦♦
Płytka # 3 b-FGF	9	DME/F12 Kontrola (1%FBS)	2915	2533	2502	59360	2429	100
	10	1 ng/ml 1% FBS	2744	2554	2761	60174	1213	101
	11	10 ng/ml 1%FBS	3606	3143	3193	74234	2683	125
	12	100 ng/ml 1%FBS	4064	3033	3026	75585	6307	127
Płytka # 4 Chrząstka 1 kg/21	13	DME/F12 Kontrola (1%FBS)	2826	2566	2486	58822	1877	100
(przesączona)	14	1 μΐ/ml 1%FBS	2729	2576	2575	58837	936	100
	15	10 μΐ/ml 1% FBS	2643	2493	2584	57643	798	98
16	100 μΐ/ml 1% FBS	2918	2883	2766	58483	2461	99

** P<0,02 *♦♦ P<0,01 Według testu Studenta-Fischera

Podczas gdy czynniki wzrostowe takie jak PDGF (czynnik wzrostowy płytek krwi) i bFGF (zasadowy czynnik wzrostowy fibroblastów) wykazują stymulujące działanie na HTF, nie stwierdzono żadnego efektu, negatywnego czy pozytywnego, gdy komórki te są hodowane w obecności przesączu chrząstki (1 kg/21). Sugeruje to, że przesącz ma efekt hipoplastyczny, który j est specyficzny w stosunku do komórek nowotworowych bez wykrywalnego wpływu na komórki normalne. Ten sam wyciąg z chrząstki nie miał także wpływu na inny typ fibroblastów ludzkich, HSF (ludzkie fibroblasty skóry - dane nie przedstawione). Choć nie było to badane, zakłada się, że liofihzat także nie wykazuje efektów w stosunku do normalnych komórek.

Z powyższych rezultatów wynika co następuje, okazało się otrzymany supematant lub płynny wyciąg posiada zarówno antyagiogenną bogatą aktywność jak też bezpośrednią aktywność przeciwnowotworową prowadzące w całości do korzystnego efektu przeciwnowotworowego. Ten sam rodzaj aktywności, aczkolwiek w niższych stężeniach, został stwierdzony w hofihzacie lub stałym wyciągu, co pozwala myśleć, że są to resztki aktywności pozostałe po ekstrakcji w wodzie.

181 981

Próby kliniczne

Przed przystąpieniem do wstępnych prób klinicznych surowy przesącz uzyskany po ultrasączeniu został zatężony 2 i 20 razy dając wzbogacony czynny przesącz. Te poziomy stężeń uzyskano na kolumnie do sączenia o przepływie stycznym o porowatości 1000 daltonów, co obniżyło objętość eluatu 2120 razy. Zatężony przesącz przepuszczono przez filtr milliopore o wielkości porów 0,22 um. Gdy chrząstkę obrabiano alternatywną metodą wirowania (stosując wirówkę CEPA, z membranąo porach 30pm) uzyskano dziesięciokrotne zatężenie co dało stężony wyciąg mający prawie taki sam poziom białek jak powyższy wyciąg zatężony 20 razy, np. 12 mg/ml (ulepszona metoda) zamiast 14 mg/ml (metoda na skalę laboratoryjną). Jałowy 10x stężony przesącz rozporcjonowano po 7 ml (około 85 mg białka) do jałowych butelek, zamrażano w -80°C przez noc a następnie przechowywano w -20°C do momentu wykorzystania. Główna różnica pomiędzy przesączem surowym i stężonym polega na stężeniu białek. Należy zauważyć, że metoda stosowana do oznaczenia stężenia białek mierzy związki azotowe a nie tylko białka (metoda Kjeldahla). Może to tłumaczyć dlaczego stężenie białek nie wzrasta proporcjonalnie do poziomu zatężenia objętości, co na ogół stwierdza się gdy stężenie białka jest oznaczone metodą Lowiyego. Zakłada się, że etap zatężania pozwala na przenikanie wody jak i związków azotowych o niskiej masie cząsteczkowej.

Stężony przesącz stosowano do leczenia chorób należących od angiogenezy. W praktyce przebadano dwie choroby zależne od angiogenezy: pierwsza to choroba dermatologiczna (łuszczyca), druga - to nowotwór (rak prostaty).

Wśród chorób dermatologicznych wybrano przypadki łuszczycy. Wśród badanych przypadków łuszczycy należy zauważyć różnicę pomiędzy przypadkami z komplikacją hiperkeratozy i przypadkami bez komplikacji. Na składnik kerotyczny tej choroby nie wpływa stężony przesącz chrząstki jako taki podczas gdy, przeciwnie, komponent angiogenny jest celem wyboru dla tej mieszaniny składników. Poniżej podane przykłady zilustrująi potwierdzą to twierdzenie.

Pacjent cierpiący na raka prostaty dobrowolnie spróbował 10 razy stężony przesącz z chrząstki. Pacjent ten przeszedł serię kolejnych konwencjonalnych terapii, które przejściowo przynosiły poprawę. Niedawno rozpoczął pobieranie ekstraktu chrząstki po nawrocie jego nowotworu.

Wyniki pokazane poniżej są bardzo zachęcające i uważane są za zapowiadające użyteczność surowego przesączu i jego frakcji w leczeniu wszystkich chorób zależnych od angiogenezy, a nie tylko dla specyficznych przebadanych przypadków. O ile choroba ma komponentę angiogermą, uważa się że ekstrakt chrząstki według wynalazku będzie skuteczny w tym aspekcie o ile jest w preparacie zawierającym jego skuteczną ilość i o ile ten preparat jest w odpowiedniej formie do właściwego podawania. Tak więc będzie docenione, że niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do następnych składników ponieważ ekspert w tej dziedzinie byłby w stanie otrzymać liczne preparaty, w których wybór byłby sterowany przez sposób podawania i docelową chorą tkankę. Preparaty mogą być podawane różnymi drogami: np. lokalne, doustne, podjęzykowo, doodbytniczo, dożylnie, domięśniowo, przez dyfuzję itp.

Łuszczyca

Sporządzono następujący preparat dermatologiczny i badano jego skuteczność u osób chorych na łuszczycę·

- Emulgade™ CLB 29% (waga /waga)

- 20x surowy przesącz 69,5% (waga/waga)

- Gennaben™!! 1% (w/w) i

- Lavandula angustifolia 0,5% (waga/waga)

Emulgade™ (mieszanina estrów stearynianowych, alkoholi tłuszczowych i niejonowych emulgatorów - kupiony od Henkel Canada Ltd.) podgrzano do 65-70° przy mieszaniu. Grzanie wyłączono nie przerywając mieszania. Gdy mieszanina osiągnęła temperaturę 45°C dodano olejek Lavandula angustifolia i środek konserwujący Germaben™ (diazomdylomocznik 30%, metyloparaben 11%, propyloparaben 3% i glikol propylenowy 56% - kupiony od Sutton Laboratories, NJ, USA). Gdy temperatura mieszaniny osiągnęła 30°C dodano wyciąg z chrząstki. Tak

181 981 otrzymany preparat był gładkim, metłustym kremem; przez zmienianie procentu Emulgade™ można uzyskać inne formy preparatów dermatologicznych o różnej lepkości, zgodnie z zaleceniami producenta (mleko, emulsja, maść). Inne nośniki lub zarobki mogłyby być stosowane by uzyskać pasty, żele czy inne formy preparatów działających przez skórę.

Powyższy preparat podawano dwa razy dziennie przez dwanaście tygodni grupie dziesięciu pacjentów (aplikacja lokalna) cierpiących na łuszczycę którzy reagowali na stosowane terapie konwencjonalne, ale po pewnym czasie stali się na nie oporni. Do tych badań wybrano pacjentów z podobnym i symetrycznym rozwojem łuszczycy na obu kończynach bocznych. Próby prowadzono metodą podwójnej ślepej - ani dermatolog ani pacjenci nie wiedzieli, która chora strona była traktowana preparatem zawierającym wyciąg z chrząstki a która preparatem kontrolnym. Uderzającąpoprawę zaobserwowano u pięciu pacjentów, których łuszczyca nie miała komplikacji hiperkeratozy, fotografie części ciała dwóch pacjentów pokazano na Rys. 9a i 9B. Na Rys 9a pokazano, że pacjent chory na łuszczycę z hiperkeratozą jednak wykazuje bardzo znaczną poprawę, zmniejszenie rumienia, bez świądu, po tylko jednym miesiącu leczenia. Jednak pozostała znaczna hiperkeratoza. Zdjęcia drugiego pacjenta na łuszczycę bez komplikacji hiperkeratozy (Rys. 9b) pokazują znacznie lepsząpoprawę po leczeniu przez 3 miesiące. Ponieważ łuszczyca wydaje się być chorobą wieloczynnikową, zakłada się, że odpowiedź pacjentów zależy od znaczenia czynnika angiogennego w powstaniu i utrzymywaniu tego stanu. Jest prawdopodobne, że byłoby możliwe uzyskanie lepszych wyników jeśli ten typ preparatu byłby uzupełniany innymi środkami terapeutycznymi działającymi na inne związane z chorobą czynniki (środki keratohtyczne, środki przeciwzapalne, antyhistaminowe, immunosupresory itp.).

To uzupełnianie może przejąć formę poprawienia preparatu by zawierał skuteczne ilości np środka keratohtycznego. Mogłoby też być osiągnięte przez oddzielne podawania takiego komplementarnego środka terapeutycznego razem lub naprzemiennie ze stosowaniem obecnego lokalnie stosowanego preparatu. Co więcej, komplementarny lek nie musi być podawany na tej samej drodze.

Powyższy preparat nie wykazał żadnych efektów ogólnoustrojowych (efekt ogranicza się do traktowanej preparatem kończyny) i nie wykazał żadnych efektów ubocznych mimo wysokich proporcji w wyciągu chrząstki.

Trądzik

Choć wynalazcy nie słyszeli aby trądzik klasyfikowano jako chorobę o składniku angiogennym, było jednak interesujące przebadanie płynnego wyciągu chrząstki u pacjentów cierpiących na tę chorobę, przyrządzono więc następujący preparat żelowy:

Carbopol™	1,2%
Czysta woda	77,2%
NaOH	0,3%
Fenoksetol™	0,3%
Tween 80™	0,3%
2 x wyciąg z aloesu	20,0%
40 x wyciąg z aloesu	0,5%
Wyciąg 2x chrząstki zawiera 9-12 mg/ml białek. Preparat ten daje uderzającąpoprawę

wyglądu skory pacjentów cierpiących na mniej lub bardziej ostre formy trądziku (trądzik zapalny i trądzik torbielowaty; dane nie przedstawione).

Te zadziwiające wyniki mogąbyć efektem działania przeciwnaczyniowego (co by wskazywało na komponentę angiogenną trądziku) lub też wynikiem działania składników czynnych o innym efekcie niż przeciwnaczyniowy. Należy tu przypomnieć, że ten sam wyciąg ma przynajmniej jedno działanie inne niż przeciwangiogenne: w liniach komórek nowotworowych wykazano bezpośredni efekt hipoplastyczny.

Nowotwory.

Pacjent cierpiący na raka prostaty spróbował 10-krotnego koncentratu. W 1986 r. zdiagnozowano u niego gruczolakorak. W tym czasie rozpoczęto radioterapię. W 1991 poziom PSA (antygen prostaty w surowicy) wynosił 138 pg/l, podczas gdy gómy limit normy wynosi 4 pg/l.

181 981

Pacjent został poddany zupełnie innemu typowi terapii poprzez kastrację połączoną z terapią przeciwandrogenową (Euflex™). To leczenie było skuteczne przez trzy lata, po czym poziom PSA zaczął znowu rosnąć. Od czerwca 1994 pacjent spożywa 10x przesącz (codzienna dawka podjęzykowa około 75 mg białka/ 7 ml wody destylowanej, odpowiadająca około 1-1,5 mg na kg masy ciała/dzień. Choć znaczna część tej dawki jest połykana, jest ona prawdopodobnie wchłaniana w przewodzie pokarmowym, o ile można polegać na wynikach opisanych powyżej dla zwierząt traktowanych DMBA. Poziomy PSA spadły z 12 do 0,9 pg/ml (ostatnie wyniki uzyskano w grudniu 1994). Ten sposób podawania dawki może też być modyfikowany zależnie od drogi podawania, biodostępności składników czynnych i pożądanej agresywności, z którą ma być kontrolowana patologia. W tym czasie sprawdzono brak toksyczności u szczurów (patrz przykłady powyżej) i u ludzi (dane nie przedstawione).

W drugim doświadczeniu in vivo przeprowadzonym na szczurach traktowanych DMBA, dawka płynnego wyciągu była około 190-220 mg białek na kg masy ciała, co prawdopodobnie miało wielki wpływ na zmniejszenie powierzchni naczyń krwionośnych nowotworu (55% w kombinacji ze znacznie większą dawką liofilizatu). Zakłada się więc, że dawka około 1 do około 200 mg/kg masy ciała dziennie jest rozsądnym zakresem dawek średnich (ED₅₀) dla leczenia nowotworów przez zmniejszenie lub wyłączenie angiogenezy.

Wyniki te pokazują wielki potencjał płynnego wyciągu chrząstki w leczeniu chorób zależnych od angiogenezy. Ilość wyciągu chrząstki jak i jego preparat może być zmieniany by spełnić konkretne wymagania. Zakłada się, że frakcje surowego przesączu, które zawierają składnik czynny też będą skuteczne. Te frakcje oczekują na dalszą charakterystykę.

Można zauważyć, że o ile chodzi o zawartość białka preparaty do miejscowego stosowania na skórze mogą zawierać szeroki zakres dawek wyciągu z chrząstki. Na przykład w dwóch specyficznie badanych kategoriach stosunek ostatecznego stężenia białka w preparatach stosowanych do leczenia łuszczycy i trądziku był 4-5 podczas gdy stosunek rozcieńczenia przesączu wynosił 35. Dla wszystkich przewidywanych aplikacji w chorobach zależnych od angiogenezy (od kropli do oczu przez preparaty dermatologiczne i preparaty do terapii nowotworów) zakłada się, że minimalne końcowe stężenie surowego przesączu może być bardzo niskie (poniżej 0,1 mg/ml). Ten niższy zakres dawki zależy od dostępności i przenikania aktywnych składników czynnych do miejsca działania jak i od skutecznego wyłapywania tych składników i czułości czy odpowiedzi tkanki na inhibitory angiogenezy. Górna granica ostatecznego stężenia białka w preparatach do pewnych zastosowań nie jest obecnie znana. Najwyższe badane końcowe stężenia wynosiły około 9 mg/ml białek w preparatach do leczenia łuszczycy i około 12 mg/ml w dawce jednostkowej 7 ml podawanej w przypadku raka prostaty. Ponieważ surowy przesącz nie może być liofilizowany bez utraty aktywności, uważa się, że najwyższa dawka zależy od granicznego stężenia, które można uzyskać w surowym przesączu, np. do otrzymania stężonego syropu.

Podane powyżej wyniki badań klinicznych stanowią dowód, że wyciąg otrzymany sposobem według wynalazku posiada rzeczywistą kliniczną przydatność w przypadku ludzi.

Wymagany materiał - Chłodziarki - Przyrządy chirurgiczne - Maszynka do siekania mięsa - Torby foliowe

- Przemysłowy homogenizator (waring blender z trzema prędkościami nabyty od firmy Fischer Scientyfic)

- System czyszczenia wody (odwrotna osmoza i sączenie przez pory 0,1 pm; Continental water System, model PRE 2202, nr serii 91089, Modulab Bioscience RQ/Polishing System kupiony od Fischer Scientific, Montreal, Quebec). System ten dostarcza wodę niepirogenną wysokiej jakości.

- Bardzo dokładna waga Mettler, seria AE nabyta od Fischer Scientific

- Wirówka Sorvall RC-285 kupiona od DuPont, Kanada

181 981

- Wirówka CEPA

- Kieszonka nylonowa o porach 30μτη

- Autoklaw (automatyczny sterylizator parowy Sanyo, model MAC 350 P)

- Pojemniki 500 ml Nalgene sterylizowane w 132°C przez 10 minut i suszone przez 35 minut

- Stożkowe filtry o porach 24 μτη Whatman Reeve Angel

- Kolumna do ultrasączenia (odcięcie masy cząsteczkowej: 500 kDaltonów oraz (1 kD gdy to dotyczy); powierzchnia: 25 stóp kwadratowych; przepływ: 130 1/minutę; ciśnienie wpływu: 30 psi; ciśnienie wypływu: 5 psi; nabyty od Koch Membranę Systems Inc., Wilmington, MA, USA)

- Higieniczna pompa wirnikowa (Monarch Industries, model ACE-S100 typ A) dla zapewnienia przepływu 130 1/min.

- Sterylny wyciąg (wyciąg o przepływie laminamym NuAIre nabyty od Ingram& Bell)

- Millipack-60 jałowe filtry 0,22 um

- Jałowe przezroczyste lub bursztynowe butelki szklane

- Koncentrator DC-10 Amicon

- Rotofor Biorad 170-2950

- Filtry Amicon SIOY10, SIOY30 i SIOY100 o wartościach odcięcia 10,30 i 100 kD, odpowiednio

- FPLC Pharmacia 216007 (komputer Pharmacia 216014)

- Hilstand S-300 26 mm/60 cm (Pharmacia)

- Superose S-12 10 mm/30 cm (Pharmacia)

- Liofilizator Labconco 10273 A

Wynalazek został opisany powyżej, i winno zostać docenione, że byłoby możliwe w ramach wiedzy i umiejętności eksperta w tej dziedzinie, bez zbaczania z pouczeń podanych w tym głoszeniu, wprowadzenie modyfikacji przez zastąpienie pewnych elementów tego wynalazku ich praktycznymi ekwiwalentami co dałoby taki sam efekt. Te ewidentne warianty są też objęte niniejszym zgłoszeniem

Claims

1. Sposób otrzymywania wyciągu z chrząstki rekina o właściwościach przeciwnowotworowych przeciwangiogennych w nie-denaturującym roztworze wodnym, zawierający rozpuszczalne w wodzie komponenty, składający się z następujących etapów:

a) zredukowanie wielkości chrząstki rekina do rozmiaru cząsteczki mniejszego niż lub równego około 500pm;

c) oddzielenie surowego, płynnego wyciągu od tych cząsteczek znamienny tym, że etap a) redukcji rozmiaru cząsteczki jest prowadzony przez homogenizacje chrząstki we wspomnianym roztworze, etap c) poprzedza etap d) kolejnego oddzielenia surowego płynnego wyciągu aż do otrzymania końcowego płynnego wyciągu zawierającego cząsteczki chrząstki mające masę cząsteczkową niższą lub równą około 500000.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że nie-denaturujący wodny roztwór składa się z wody, a poszczególne etapy postępowania są przeprowadzane w temperaturze 4°C.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap a) i b) przeprowadza się w czasie około 30 minut.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że chrząstka rekina i nie-denaturujący wodny roztwór są w proporcjach około 1 kg mokrej masy chrząstki na 1-2 litrów roztworu.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap rozdziału c) przeprowadza się przez wirowanie.

6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że ponadto obejmuje on etap e) zatężania końcowego płynnego wyciągu, dając stężony płynny wyciąg wzbogacony cząsteczkami chrząstki o masie cząsteczkowej zawartej pomiędzy około 1000 i około 500000.

7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje etap e) frakcjonowania końcowego płynnego wyciągu dla uzyskania płynnych frakcji tego płynnego wyciągu.

8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), przy czym otrzymana frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej zawartej pomiędzy około 10001 około 2000.

9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i elektroforezy, przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 29000 i punkcie izoelektrycznym około 5.3 do około 6.26.

10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i elektroforezy, przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 35000 i punkcie izoelektrycznym około 7.64 do około 7.94.

11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i elektroforezy, przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 48000 i punkcie izoelektrycznym około 7.29 do około 7.94.

12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i elektroforezy, przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 60000 i punkcie izoelektrycznym około 5.30 do około 6.26.

13. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i elektroforezy, przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 70000 i około 120000.

14. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), przy czym otrzymana frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej zawartej pomiędzy około 60000 i około 70000.

181 981

15. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 35000 i około 46000.

16. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocą rozdziału na Rotoforze i szybkiej chromatografu cieczowej białek (FPLC), przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej około 29000.

17. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap frakcjonowania przeprowadza się za pomocąrozdziału na Rotoforze i szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), przy czym frakcja płynna zawiera cząsteczki chrząstki o masie cząsteczkowej pomiędzy około 1000 i około 2500.

18. Sposób według zastrz. 1 albo 6 albo 7, znamienny tym, że etapy sposobu sąprowadzone w temperaturze około 4°C.